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Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR PURIFYING PROTEINS FROM A MICROALGAE EXTRACT
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/197760
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for purifying proteins comprising a purification step that uses centrifugal partition chromatography, referred to as CPC, from a microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous two-phase solvent system.

Inventors:
CHOLLET, Sébastien (25 rue des Halles, SAINT NAZAIRE, 44600, FR)
MARCHAL, Luc (41 rue Parmentier, SAINT NAZAIRE, 44600, FR)
MASSE, Anthony (44 av Claude Monet, GUÉRANDE, 44350, FR)
Application Number:
FR2019/050811
Publication Date:
October 17, 2019
Filing Date:
April 08, 2019
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSITE DE NANTES (1 Quai de Tourville, NANTES, 44000, FR)
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (3 rue Michel Ange, PARIS, 75016, FR)
International Classes:
C12P21/00; B01D15/18; B01D15/22; B01D15/30; C07K1/20; C07K14/405; G01N30/42; G01N30/46
Domestic Patent References:
WO2016030643A12016-03-03
Foreign References:
US20100178674A12010-07-15
KR20110119071A2011-11-02
FR2791578A12000-10-06
Other References:
YANG LIU ET AL: "Aqueous two-phase countercurrent distribution for the separation of c-phycocyanin and allophycocyanin from Spirulina platensis", FOOD AND BIOPRODUCTS PROCESSING, vol. 90, no. 2, 1 April 2012 (2012-04-01), GB, pages 111 - 117, XP055530375, ISSN: 0960-3085, DOI: 10.1016/j.fbp.2011.08.002
TANHIA HERNANDEZ-MIRELES ET AL: "Improved recovery of B-phycoerythrin produced by the red microalga Porphyridium cruentum", JOURNAL OF CHEMICAL TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 81, no. 6, 1 June 2006 (2006-06-01), pages 989 - 996, XP055531359, ISSN: 0268-2575, DOI: 10.1002/jctb.1503
X. LUO ET AL: "Vortex Fluidic Device-Intensified Aqueous Two Phase Extraction of C-Phycocyanin from Spirulina maxima", ACS SUSTAINABLE CHEMISTRY & ENGINEERING, vol. 4, no. 7, 3 June 2016 (2016-06-03), US, pages 3905 - 3911, XP055531380, ISSN: 2168-0485, DOI: 10.1021/acssuschemeng.6b00756
FRANCINE SILVA ANTELO ET AL: "Purification of C-phycocyanin from Spirulina platensis in aqueous two-phase systems using an experimental design", BRAZILIAN ARCHIVES OF BIOLOGY AND TECHNOLOGY, vol. 58, no. 1, 1 February 2015 (2015-02-01), pages 1 - 11, XP055531381, DOI: 10.1590/S1516-8913201502621
ZHONGMING XU ET AL: "Separation of Peptides and Proteins by Countercurrent Chromatography", CURRENT PROTEOMICS, vol. 10, no. 4, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 322 - 333, XP055531372, DOI: 10.2174/1570164610666131212000236
NAZIM MEKAOUI ET AL: "Advances in countercurrent chromatography for protein separations", BIOANALYSIS, vol. 4, no. 7, 1 April 2012 (2012-04-01), London, UK, pages 833 - 844, XP055530591, ISSN: 1757-6180, DOI: 10.4155/bio.12.27
ALAIN BERTHOD ET AL: "Elution-Extrusion Countercurrent Chromatography. Use of the Liquid Nature of the Stationary Phase To Extend the Hydrophobicity Window", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 75, no. 21, 1 November 2003 (2003-11-01), US, pages 5886 - 5894, XP055530571, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/ac030208d
LIANHONG YIN ET AL: "Orthogonal test design for optimization of suitable conditions to separate C-phycocyanin from Spirulina platensis by high-speed counter-current chromatography using reverse micelle solvent system", JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE., vol. 34, no. 11, 18 April 2011 (2011-04-18), DE, pages 1253 - 1260, XP055531352, ISSN: 1615-9306, DOI: 10.1002/jssc.201000892
LIU Y. ET AL., FOOD AND BIOPRODUCTS PROCESSING, vol. 90, no. 2, pages 111 - 117
ARAFAT M. GOJA ET AL., J BIOPROCES BIOTECHNIQ, vol. 4, 2013, pages 1
Attorney, Agent or Firm:
CORNUEJOLS, Christophe (IPSIDE, 4 rue de Kerogan, Quimper cedex, 29337, FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Procédé de purification d’au moins une protéine comprenant une étape de purification mettant en oeuvre une colonne de chromatographie de partage centrifuge, dite colonne CPC (1 , 19), à partir d’un extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant :

- un système aqueux de solvants à deux phases contenant de 8 à 15% en masse de polyéthylène glycol de masse molaire de 2000 à 8000 g. mol 1, voire 3500 à 6500 g. mol 1 , et 10 à 17% en masse de K2HPO4/KH2PO4 à pH 7 ;

- une phase mobile de la CPC ; et

- une phase stationnaire de la CPC.

2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le procédé met en oeuvre les étapes suivantes :

a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient (2);

b) une injection du mélange obtenu à l’étape a) dans la colonne CPC (1 , 19) par mise en route d’une première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;

c) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration;

d) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration. 3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, dans lequel la colonne CPC (1 , 19) comporte au plus 50 cellules sensiblement sphériques.

4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, dans lequel ledit procédé met en oeuvre deux colonnes de chromatographie CPC (1 et 19), une première colonne CPC (1 ) et une deuxième colonne CPC (19), qui fonctionnent de manière séquentielle.

5. Procédé selon la revendication 4, mettant en oeuvre les étapes suivantes : a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient (2) ;

b1 ) une injection d’un premier volume du mélange obtenu à l’étape a) dans la première colonne CPC (1 ) par mise en route d’une première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;

c1 ) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;

d1 ) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration ;

e1 ) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt ;

b2) une injection d’une deuxième volume du mélange obtenu à l’étape a) dans la seconde colonne CPC (19) par mise en route de la première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;

c2) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route de la deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans le deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;

d2) une extrusion par mise en route de la troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le second sens de migration ; e2) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt.

Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel ledit procédé comporte au moins une étape de filtration d’au moins une phase choisie parmi la phase stationnaire et la phase mobile par filtration membranaire.

Procédé selon les revendications 5 et 6 prises ensembles, dans lequel un premier filtre membranaire (12) filtre la phase stationnaire récupérée à l’étape e1 ) et e2) pour améliorer la purification de la substance d’intérêt qui est isolée ; un deuxième filtre membranaire (14) filtre la phase stationnaire éluée à partir du premier filtre membranaire (12) en vue de son recyclage ; et un troisième filtre membranaire (18) filtre la phase mobile récupérée en sortie de colonne en vue de son recyclage.

Procédé selon l’une des revendications 5 à 7, dans lequel l’injection dans les deux colonnes CPC (1 ,19) d’au moins un des liquides choisis parmi l’extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, est contrôlé par des vannes trois voies, désignées première, troisième et quatrième vannes trois voies (4, 8, 17).

Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel les phases mobile et stationnaire en sortie de colonne CPC (1 , 19) sont séparées séquentiellement par une vanne quatre voies (1 1 a) et une quatrième vanne trois voies (1 1 b).

Description:
Procédé de purification de protéines à partir d’extrait de microalques

La présente invention est du domaine des extraits de microalgues marines, et concerne en particulier une fraction protéinique isolée à partir d’une microalgue rouge et son procédé d’obtention. Les phycobiliprotéines peuvent être obtenues en quantités importante à partir des algues ou des microalgues. Les phycobiliprotéines sont de quatre types : l’allophycocyanine, la phycocyanine, la phycoérythrine et la phycoérythrocyanine. De telles protéines sont récupérées après désintégration cellulaire et des étapes de séparation solide-liquide. Le surnageant obtenu qui contient la phycobiliprotéine peut être isolé et/ou purifié en utilisant une technique de capture (absorption) sur résine échangeuse d’ions, au moins une précipitation isoélectrique éventuellement couplée à des extractions liquide/liquide mettant en oeuvre des systèmes aqueux bi-phasiques, comme cela est décrit par exemple dans la demande US2010/0178674. Il est également connu d’isoler ce type de protéine grâce à des composés organiques tels que l’acide salicylique, comme cela est décrit dans la demande WO2016030643. Cependant de telles techniques de précipitation et/ou d’absorption à l’échelle industrielle, demandent de manipuler des volumes en eau conséquents et des quantités de sels très importantes, ce qui requiert la mise en service d’installations complexes à contrôler et à maintenir en fonctionnement, et impacte fortement l’environnement.

D’autres méthodes ont été développées pour l’extraction de telles protéines à partir des algues ou des microalgues. Une de ces méthodes alternatives consiste à isoler des protéines en mettant en oeuvre des systèmes aqueux à deux phases tels que l’ATPS (acronyme anglo-saxon pour le terme anglais : « aqueous two phase System »), lequel peut comprendre du PEG 6000 (polyéthylène glycol de masse molaire : 6000 g. mol 1 ) et un tampon phosphate dans un milieu à pH 7. L’article Liu Y. et al. , Food and Bioproducts Processing, vol.90(2) Apr. page 111-117 décrit un tel système d’ATPS pour l’extraction de phycobiliprotéines à partir de la microalgue spirulina platensis par la méthode de distribution à contre-courant (connue sous l’acronyme anglo-saxon : CCD - « contercurrent distribution »). Une telle méthode dite CCD comporte de nombreuses étapes, notamment des extractions multi-étagées (dix niveaux de séparation), et les puretés des protéines obtenues restent médiocres.

Une autre technique employée pour la purification des protéines à partir d’une algue est la technique dite de chromatographie de partage centrifuge (CPC) qui est une chromatographie liquide-liquide sans support solide. La demande KR201 101 19071 décrit une telle méthode de CPC pour l’isolation de fucoxanthine à partir d’un extrait d’algue.

La présente invention vise à améliorer les techniques de l’art antérieures en vue d’extraire et de purifier des phycobiliprotéines avec un rendement supérieur à 70% et un haut degré de pureté, de manière simple, rapide et en mettant en oeuvre un procédé qui s’inscrive dans une démarche de développement durable.

La présente invention concerne à cet effet un procédé de purification d’au moins une protéine comprenant une étape de purification mettant en oeuvre une colonne de chromatographie de partage centrifuge (colonne CPC) à partir d’un extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases (ATPS), lesdites deux phases constituant une phase mobile de la CPC et une phase stationnaire de la CPC.

Le terme « chromatographie de partage centrifuge » (CPC) désigne la technique de chromatographie sans support solide, basée sur le principe des coefficients de partage de différents solutés dans un milieu comprenant deux liquides non miscibles constituant un système bi-phasique liquide/liquide, et sur la mise en contact des deux liquides tout en les séparant un très grand nombre de fois par une agitation et un déplacement d’une des phases provoquées par une force centrifuge. Une telle chromatographie CPC est décrite dans la demande FR 2 791 578.

Le terme « ATPS » désigne un système aqueux de solvants à deux phases, des exemples de tels systèmes sont décrit dans l’article de Arafat M. Goja et al. J Bioproces Biotechniq 2013, 4:1. Le système ATPS mis en oeuvre dans le cadre de l’invention est avantageusement un système comprenant du polyéthylène glycol (PEG), tel que le système aqueux de solvants à deux phases contient de 8 à 15% en masse de polyéthylène glycol de masse molaire de 2000 à 8000 g. mol 1 , voire 3500 à 6500 g. mol 1 , et 10 à 17% en masse de K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 à pH 7. L’ATPS comprend en outre un tampon pour maintenir un pH=7, il s’agit de du tampon phosphate de potassium (K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 ). Plus avantageusement, le procédé selon l’invention met en oeuvre l’utilisation du système ATPS contenant de 8 à 15% (w/w) de PEG 6000 et 10 à 17% (w/w) de K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 (pH7). Dans ce cadre, le système ATPS mis en oeuvre comprend du polyéthylène glycol de masse molaire de 6000 g. mol 1 qui est qualifié de PEG 6000.

Dans la suite de la présente demande les polyéthylènes glycol de masse molaire de 1000, 2000 et 8000 g. mol 1 seront également qualifiés respectivement de PEG 1000, PEG 2000 et PEG 8000.

Les inventeurs ont montré de manière inattendue que le système de solvants à deux phases ATPS utilisés en réalisant une chromatographie CPC permettait d’obtenir une protéine extraite d’une microalgue avec un rendement et un degré de pureté sans précédent. Une CPC réalisée dans de telles conditions s’est avérée particulièrement efficace et rapide à exécuter pour la purification d’une phycobiliprotéine. Ce procédé permet d’avoir des cycles courts de purification à partir de l’extrait, tout en fonctionnant avec des volumes de liquides très réduit. Le rendement global en protéine extraite est supérieur à 70% et les protéines obtenues ne sont pas, ou très faiblement, dénaturées.

Avantageusement, le procédé selon l’invention met en oeuvre les étapes suivantes :

a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient ;

b) une injection du mélange obtenu à l’étape a) dans la colonne CPC par mise en route d’une première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;

c) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration;

d) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration.

Le procédé décrit ci-dessus comprend une étape d. de pompage en configurant le pompage dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de deuxième sens de migration (mode ascendant (AM) versus mode descendant (DM)). Ce mode de fonctionnement de la chromatographie CPC est qualifié de mode double (« dual mode ») et permet d'alterner les phases stationnaire et mobile en cours de séparation. Il est ainsi possible de rendre mobile la phase stationnaire et inversement de rendre stationnaire la phase mobile. Cette étape permet la récupération par extrusion de la protéine d’intérêt, et permet également le reconditionnement d’une partie de la colonne avec de la phase stationnaire recyclée injectée dans la colonne.

Les inventeurs ont montré qu’un tel procédé permet de séparer finement des phycobiliprotéines d’autres molécules de structure et/ou de masse très proches.

Avantageusement, la colonne de CPC comprend des cellules de géométrie sensiblement sphériques. Cette configuration des cellules permet d’optimiser le rendement de purification des phycobiliprotéines. Le volume interne de l’ensemble des cellules est avantageusement tel que la rétention en phase stationnaire soit comprise entre 50 et 80%, voire 65 et 70%.

La rétention en phase stationnaire se défini comme suit : Sf = [Volume de phase stationnaire dans les cellules (en mL)] / [Volume des cellules (en mL)] x 100, c'est-à-dire

Cette configuration des cellules permet de favoriser la décantation du système à deux phases (ATPS) et donc d’atteindre de meilleures rétentions en phase stationnaire que les systèmes fonctionnant avec des cellules ayant d’autres géométries, telles que les cellules dites « twin cells ». De préférence, le nombre de cellules est inférieur ou égal à 50. Les inventeurs ont montré que l’utilisation de la CPC dans les conditions selon l’invention permettait d’utiliser des colonnes relativement courtes de moins de 50 cellules tout en restant efficace : ce qui facilite les manipulations et réduit les volumes d’éluant nécessaires.

Avantageusement, le procédé selon l’invention met en oeuvre deux colonnes de chromatographie CPC, une première colonne CPC et une deuxième colonne CPC, qui fonctionnent de manière séquentielle. Le fonctionnement séquentiel implique de monter deux colonnes, une première et une deuxième colonne, en parallèle.

Les séquences sont avantageusement calibrées afin de réaliser une purification en continue :

- lorsque les étapes b) et d) sont réalisées dans la première colonne, permettant ainsi la récupération de la phase stationnaire enrichie en phycobiliprotéines (à l’étape n-1 du procédé en continu) puis à la réalisation d’une nouvelle injection, l’étape c) est réalisée dans la seconde colonne en effectuant ainsi la purification de la protéine capturée : des impuretés pouvant être entraînées par la phase mobile (la durée des étapes b) et d) étant égale à celle de l’étape c)) ; et

- les étapes d), puis b) sont réalisées dans la seconde colonne pendant que dans la première colonne est réalisée l’étape c) ; et ainsi de suite...

Grâce à ce fonctionnement séquentiel, une production en continue est réalisable. La préparation de volumes important en protéines purifiées à l’échelle industrielle est accessible, grâce à un tel procédé.

Le procédé selon l’invention en mode séquentiel met en oeuvre avantageusement les étapes suivantes :

a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient ;

b1 ) une injection d’un premier volume du mélange obtenu à l’étape a1 ) dans une première colonne CPC par mise en route d’une première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;

c1 ) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;

d1 ) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration ;

e1 ) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt ;

b2) une injection d’un deuxième volume du mélange obtenu à l’étape a) dans la seconde colonne CPC par mise en route de la première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;

c2) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route de la deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans le deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;

d2) une extrusion par mise en route de la troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le second sens de migration ;

e2) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt.

Avantageusement, le procédé selon l’invention comprend au moins une étape de filtration d’au moins une des deux phases choisies parmi la phase stationnaire (enrichie en BPE) et la phase mobile (à recycler), par filtration membranaire. Le procédé selon l’invention comprend plus avantageusement au moins trois étapes de filtration membranaire pour filtrer une fois la phase mobile et deux fois la phase stationnaire enrichie en BPE. Un tel processus de filtration sur membrane, qualifié de procédé membranaire, permet de récupérer les protéines avec un degré de pureté amélioré, et de pouvoir recycler le système de solvant bi-phasique. De l’eau purifiée est ajoutée lors de cette étape pour la réalisation de la filtration et afin de récupérer le maximum de matière. L’eau purifiée est de préférence une eau déminéralisée par distillation, filtration et/ou électrodialyse. Avantageusement, les filtres à membrane mis en œuvre procédé selon l’invention sont configurés de la manière suivante : dans lequel un premier filtre membranaire filtre la phase stationnaire récupérée aux étapes e1 ) et e2) pour améliorer la purification de la substance d’intérêt qui est isolée ; un deuxième filtre membranaire filtre la phase stationnaire éluée à partir du premier filtre membranaire en vue de son recyclage ; et un troisième filtre membranaire filtre la phase mobile récupérée en sortie de colonne en vue de son recyclage. Les membranes mise en œuvre sont de préférence des membranes aptes à faire de l’ultrafiltration ou de la nanofiltration, telle que la gamme commercialisée par la société NADIR®.

Avantageusement, l’injection dans les deux colonnes CPC mise en œuvre selon le procédé de l’invention d’au moins un des liquides choisis parmi l’extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, est contrôlé par des vannes trois voies, désignées première, deuxième et troisième vannes trois voies.

Avantageusement, les liquides choisis parmi l’extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, débouchent dans une première vanne quatre voies en amont de la première colonne CPC et dans une deuxième vanne quatre voies en amont de la deuxième colonne CPC. Les modes d’élution des phases mobile et stationnaire dans les colonnes CPC sont contrôlées séquentiellement par ces deux vannes quatre voies, désignée première et deuxième vannes quatre voies. La première et la deuxième vanne quatre voies débouchent respectivement sur les canalisations de collecte des première et deuxième colonnes CPC.

Avantageusement, les phases mobile et stationnaire en sortie de colonne CPC sont séparées séquentiellement par une vanne quatre voies et une quatrième vanne trois voies. PARTIE EXPERIMENTALE :

I. Préparation de l’extrait contenant la protéine d’intérêt : une phycobiliprotéine, la B-phycoérythrine (BPE) - (figure 1)

Un extrait de microalgue porphyridium cruentum concentré - conservé une nuit au frigo - est décongelé par centrifugation.

1 g d’extrait de microalgue décongelée est repris dans 10 ml_ de la phase inférieur de l’ATPS (phase mobile dans la suite du procédé) contenant 1 1 .6% (w/w) PEG 6000 et 13% (w/w) K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 (pH=7) : quand cela n’est pas indiqué, c’est ce système qui est utilisé dans tout le reste de la partie expérimentale.

L’ensemble est inséré dans un flacon de 15 mL (un flacon plastique de 15 mL de la société Fisherbrand®) et ensuite placé 15 minutes dans un bain ultrason connu sous le nom commercial VWR® Ultrasonic Cleaner.

Ensuite le mélange issu de la sonication est centrifugé à 3900 rpm (tours par minutes) pendant 20 mn dans une centrifugeuse de type Mikro 22R™, de la société Hettich zentrifugen™.

L’acronyme « rpm » signifie « rotation per minute » en anglais, sa traduction française étant « tours par minute ».

Le surnageant est ensuite passé sur une colonne CPC dans les conditions détaillées au point II. de la présente partie expérimentale.

Des essais ont également été conduits avec respectivement du PEG à 1000, 2000 et 8000 (polyéthylène glycol de masse molaire : 1000, 2000 et 8000 g. mol -1 ).

II. a tests préliminaires en vue de l’évaluation du meilleurs système d’ATPS. L’extrait qui doit être purifié par CPC a été évalué dans des tubes à essai pour identifier le meilleur des systèmes pour la purification de la phycobiliprotéine.

La préparation de l’extrait en vue de la capture ou des tests préliminaires (essais en vials) est réalisée de la manière suivante :

• Décongeler l’extrait de microalgue concentré par centrifugation.

• Mettre 1g d’extrait de microalgue dans 10 mL de l’un des quatres système ATPS - système 1 à 4, voir ci-après - (les deux phases pour les essais en vials).

Pour le cas de l’extraction avant les essais de capture, la phase saline a été uniquement utilisée.

• Passer 15 minutes au bain ultrason.

• Centrifuger à 3900 rpm pendant 20min sur la centrifugeuse (ref. grosse centrifugeuse). Pour l’extrait de spiruline, il faut centrifuger dans la petite centrifugeuse à 13000 rpm 2 fois 20min.

• Une fois l’extraction réalisée, on mesure le spectre UV-visible entre 250 et 800 nm de chacune des phases pour les systèmes étudiés.

La mesure du spectre UV-visible se fait de la manière suivante :

• Dans deux cellules en quartz, introduire 0,1 mL (ou 0,2 mL selon le facteur de dilution recherché) de phase supérieure ou inférieure de la fiole témoin et compléter à 2 mL avec un co-solvant (ici on utilise l’eau déminéralisé).

• Réaliser la mesure de la ligne de base dans une gamme caractéristique correspondant au soluté à analyser.

• Laisser une des deux cellules dans l'appareil en tant que référence.

• Dans l'autre fiole, après l'avoir vidée et rincée à l’eau déminée, introduire 0,1 mL (ou 0,2 mL) de phase à analyser et compléter à 2 mL avec le co solvant.

• Passer cet échantillon au spectromètre et réaliser l’acquisition du spectre entre 250 et 800 nm.

L’indice de pureté sera évalué pour les longueur d’onde caractéristique de phycobiliprotéines (550nm pour la BPE) et la longueur d’onde caractéristique des protéines totales (280nm) Système 1 : 14.3% (w/w) PEG 1000 et 16% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) Système 2 : 14.3% (w/w) PEG 2000 et 16% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) Système 3 : 1 1.6% (w/w) PEG 6000 et 13% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) Système 4 : 1 1.6% (w/w) PEG 8000 et 10% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7)

Les résultats obtenus sont montrés sur le tableau 1 :

Tableau 1.

Les meilleurs indices de pureté ont été obtenus avec le PEG 6000, avec un indice de pureté qui reste supérieur à 1 ,20 dans le cas des PEG 2000 et PEG 8000. Les résultats obtenus pour les coefficients de partage des protéines totales entre la phase supérieure et la phase inférieure de l’ATPS sont montrés sur la colonne de droite du tableau 1. : le PEG 6000 est plus sélectif que les autres PEG de plus faibles poids moléculaires. Pour le système 4 comprenant du PEG 8000, la viscosité de la phase supérieure est supérieure à 80 cP (mPa.s), ce qui limite son utilisation en CPC. En effet, l’élution en mode ascendant paraît inenvisageable car la séquence de purification nécessite un dual mode.

II. b Principe de purification de la BPE sur colonne de chromatographie de partage centrifuge (CPC) selon l’invention La colonne utilisée contient 36 cellules sphériques et est montée sur un visual CPC. Le visual CPC est un outil permettant la visualisation de l’hydrodynamique dans les cellules. Le processus se décompose en deux parties, une partie chromatographie et une partie visualisation.

La partie chromatographie comporte tous les composants d’un appareil de chromatographie de partage centrifuge :

Une pompe AP100 commercialisé par la société Armen Instrument™, permettant la mise en mouvement des différentes phases du système.

- Les connectiques utilisées sur cet appareil sont des connectiques 1/8è basse pression en PTFE commercialisé par la société UpChurch®.

- Une vanne rhéodhyne quatre voies permettant de sélectionner le mode d’élution ascendant ou descendant (c'est-à-dire AM ou DM).

La colonne du visual étudiée est reliée au système par l’intermédiaire de deux joints tournants commercialisé par la société Armen™.

Le signal UV/visible est enregistré par un détecteur spectra 100 (Thermo séparation, San José, US).

La colonne est en polycarbonate et possède un volume de 48 mL (soit 1 ,3 mL par cellule).

La colonne est pré-équilibrée à 65-70 % de rétention en éluant la phase saline (qui comporte le système tampon phosphate) à 35 mL/mn et 1600 rpm (tours par minutes) à travers la phase comportant le PEG en mode descendant pendant 2 mn 30 à 3 mn.

L’extrait à traiter est ensuite injecté en mode descendant à 20 mL/min et 1600 rpm. La capture est alors réalisée dans la colonne. La capture consiste en un transfert de la (ou des) molécule(s) cible(s) vers la phase stationnaire pour laquelle ils ont une forte affinité (coefficient de partage KD > 5).

Une élution de phase mobile fraîche est réalisée à 20 mL/min et 1600 rpm afin d’enlever les molécules ayant moins d’affinités pour la phase stationnaire (KD < 5). La récupération de la protéine cible est réalisée en mode ascendant (AM), c'est- à-dire qu’on active le « dual mode », en éluant à 20 ml_/mn et 1600 rpm. L’ensemble du procédé de purification sur CPC est montré sur la figure 2. Les rétentions des systèmes 2 et 3 d’ATPS ont été mesurées et sont reportées dans le tableau 2 (les conditions opératoires correspondant aux mesures reportées dans le tableau 2 sont de 10 à 40 mL/min en débit avec une accélération centrifuge de 155 x g) : Tableau 2.

Les meilleurs résultats ont été obtenus pour le système 3 qui a été retenu et sera utilisé dans toute la suite de la partie expérimental, puisqu’il ressort sans ambiguité du tableau 2 (notamment à 20 mL/min) que le système intégrant le PEG 6000 permet d’obtenir une rétention de la phase stationnaire plus importante que celui intégrant le PEG 2000.

III. Procédé de filtration membranaire

La récupération de la BPE et la régénération des phases (PEG et sels) est réalisée par filtration membranaire. La membrane choisie pour la filtration est une membrane (ou filtre membranaire) pour ultrafiltration (UF) commercialisée sous la référence RM UH050 P1016 par la société NADIR®, et possédant un seuil de coupure à 50 kDa. Une membrane pour nanofiltration (NF) commercialisée par la société NADIR® peut être utilisée alternativement ou en combinaison.

La figure 4 illustre l’ensemble du procédé qui intègre les étapes de filtration membranaire. IV. purification sur colonne CPC

Une première colonne 1 est mise en fonctionnement et y est injecté l’extrait de microalgues dispersé dans l’ATPS à partir d’un premier récipient 2 (voir point I. de la présente partie expérimentale, A sur la figure 4). Une première pompe 3 est branchée d’une part en amont sur le premier récipient 2, et en aval sur une première vanne trois voies 4 pour réaliser l’injection (B sur la figure 4). Une première vanne quatre voies 5 est placée en aval de la première colonne 1 pour le mode descendant. Après un lavage réalisé par élution de la phase mobile à partir d’un deuxième récipient 6 par une deuxième pompe 7 dans la colonne 1 et alimentation au travers d’une deuxième vanne trois voies 8, laquelle pompe 7 est placée en aval du deuxième récipient 6, une extrusion est effectuée dans les conditions détaillées au point II : pour cela le mode ascendant est mis en oeuvre et la phase stationnaire contenue dans le cinquième récipient 15 (présenté plus loin) est éluée dans la colonne 1 via la troisième pompe 16 (présentée plus loin). (C sur la figure 4).

En sortie, la phase stationnaire et la phase mobile sont récupérées séparément au cours de la séquence, respectivement dans un troisième récipient 9 et un quatrième récipient 10, grâce à une deuxième vanne quatre voies 1 1 a et une troisième vanne trois voies 1 1 b.

La phase stationnaire récupérée dans le troisième récipient 9 est traitée par procédé membranaire par passage dans un premier filtre membranaire 12 dans les conditions décrites au point III. (E sur la figure 4), pour obtenir ;

- la BPE purifiée, d’une part, laquelle est collectée dans un cinquième récipient 13 ; et

- une phase stationnaire à nettoyer par un autre traitement mettant en oeuvre un passage dans un deuxième filtre membranaire 14 (F sur la figure 4) : la phase stationnaire filtrée est collectée dans un cinquième récipient 15 en aval duquel sont branchés une troisième pompe 16 et une troisième vanne trois voies 17 dont une des sorties débouche sur une canalisation d’entrée de la première colonne 1 CPC pour l’alimenter en continue en phase stationnaire recyclée. La phase mobile récupérée dans le quatrième récipient 10 est traitée également par procédé membranaire par passage dans un troisième filtre membranaire 18 dans les conditions décrites au point III. (D sur la figure 4), ce qui permet de régénérer la phase mobile conditionnée dans le deuxième récipient 6 pour l’alimenter en continue en phase mobile recyclée, tel qu’expliqué ci-avant.

La figure 4 montre de manière schématique la succession des étapes du procédé de purification selon l’invention, et pour lesquelles les grandes étapes A, B, C, D, E et F ont été reprises en lien avec la figure 3.

Les pompes et/ou les vannes sont pilotées par un automate qui permet de réapprovisionner les colonnes en phases mobile et stationnaire en fonction des niveaux mesurés à l’aide de capteurs.

V. purification sur deux colonnes CPC en mode séquentiel

De manière à augmenter la cadence et le rendement, une deuxième colonne CPC 19 est montée en parallèle de la première colonne 1 comme illustré sur la figure 4. Un tel montage permet un fonctionnement en continu, avec un remplissage en phase mobile et/ou stationnaire optimal dans au moins une des deux colonnes, ce qui représente un gain en productivité conséquent comme cela est montré au point VI. Grâce à cette méthode, les inventeurs ont montrés que le rendement matière était bien supérieur à 70%, sans qu’il y ait de précipitation indésirable de protéine, et une absence de dénaturation permettant d’avoir accès à des protéines dont la structure et la fonction sont entièrement préservées au regard de la protéine native. L’indice de pureté mesurée (représente le ratio : absorbance spécifique de la protéine à 550 nm / absorbance à 280 nm) est compris entre de 3,5 à 4,2 et une productivité en BPE purifiée de 4,2 g/h/L stat (gramme de BPE purifiée par heure par litre de phase stationnaire engagé dans la colonne) ; les résultats sont montrés à la figure 5 par un graphique contenant en abscisse le volume collecté en mL et en ordonnée l’indice de pureté (550/220). La première et une troisième vannes quatre voies 5 et 21 sont placées en amont des deux colonnes CPC, pour permettre le choix du mode d’élution dans les deux colonnes et pouvoir contrôler finement le fonctionnement synchrone/asynchrone des deux colonnes CPC.

Les pompes et/ou les vannes sont pilotées par un automate qui permet de réapprovisionner les colonnes en phase mobile et stationnaire en fonction des niveaux mesurés à l’aide de capteurs.

VI. Mesure de la pureté et du rendement pour le mode à deux colonnes CPC en fonctionnement séquentiel et en mode capture (« dual mode »)

Les inventeurs ont montré que l’utilisation d’un mode séquentiel avec une réinjection de 70 mL d’extrait par séquence (une séquence correspond à l’enchaînement des étapes schématisé sur la figure 4) permet, sur cette chaîne de procédés, d’obtenir une pureté constante en sortie (voir figure 5) et un rendement en BPE supérieur à 70%.

La figure 5 reporte la mesure de l’indice de pureté (550/280) en fonction du volume collecté en mL, par un nuage de points (matérialisé par les carrés) indiqué par l’accolade « A » correspondant aux fractions collectées lors de sept séquences. L’accolade « B » montre un nuage de quatre points correspondant à la mesure de l’indice de pureté du contenu restant dans la colonne.