L'invention concerne un procédé de purification et de renaturation d'une protéine. Elle se rapporte plus particulièrement à un procédé de purification d'une protéine recombinante accumulée sous forme de corps d'inclusion insolubles par des cellules procaryotes ou eucaryotes. Ce procédé comprend en particulier une étape de renaturation, et permet de conduire cette dernière à haute concentration de protéine.

Il existe un très grand nombre de systèmes d'expression (combinaison cellule hôte/vecteur de gène) spécifiques pour chaque protéine ou famille de protéines recombinantes. Le choix du système d'expression est essentiellement guidé par les modifications que la protéine doit subir pour être biologiquement active.

Jusqu'au milieu des années 90, la bactérie, et plus particulièrement Escherichia coli (E. coli), était l'hôte de choix pour produire une protéine recombinante. E. coli a été très étudiée depuis les années 60, si bien que c'est un des organismes actuellement les mieux connus. L'ensemble de ces connaissances en biochimie, génétique et biologie moléculaire a été exploité pour exprimer des protéines en grande quantité. Cette bactérie a plusieurs propriétés intéressantes vis- à-vis de l'expression de protéines : elle est facile à manipuler, elle pousse vite dans des milieux relativement peu coûteux et les souches de laboratoires sont inoffensives. De plus tous les laboratoires de biologie moléculaire utilisent E. coli pour d'autres expériences (clonage, séquence...). Cette facilité en a fait le système d'expression le plus populaire. Par contre la production de protéines recombinantes dans les bactéries mène fréquemment à des protéines inactives, agrégées sous une forme solide appelée corps d'inclusion. Ceux-ci sont denses et peuvent se trouver soit dans le cytoplasme soit dans l'espace périplasmique de la cellule.

Actuellement, avec le développement des technologies de cultures cellulaires, environ 70 à 80 % des protéines d'intérêt sont produites dans des cellules animales. La plupart des anticorps recombinants humains ou humanisés sont produits dans des cellules-hôtes de ce type (Brekke & Leset, 2003). En effet, malgré une vitesse de croissance beaucoup plus lente et une grande fragilité notamment vis-à-vis de l'agitation, les cellules animales ont la propriété de glycosyler les protéines qu'elles synthétisent. En tant que modification post-traductionnelle, cette glycosylation est nécessaire à l'activité biologique de molécules comme les anticorps thérapeutiques.

Pour remphr leur fonction, les protéines doivent adopter une conformation tridimensionnel^ précise. S'etat natif, acquise au cours du repliement cellulaire. Cependant, de nombreuses protéines recombinantes ne sont pas produites dans leur état natif, mais s'agrègent dans un élat le plus souvent biologiquement inactif, que l ^' on appelle corps d ^' inclusion. Le phénomène d'agrégation decπt ci-avant conduit à une réduction importante de productivité et de rendement pour ces systèmes d'expression, car il rend nécessaires des étapes de traitement supplémentaires clans le processus. De plus, contrairement à ce qui est couramment admis, la formation des corps d'inclusion n ^' est pas l ^' apanage des systèmes bactériens mais s'observe également chez certaines cellules eucaryotes.

Ces corps d'inclusion ont cependant l'avantage de représenter une forme concentrée et relativement pure de la molécule-cible. De plus, la forme dénaturée et insoluble des protéines qui les composent les rend moins susceptibles à une dégradation par les protéases libérées lors de l'étape de lyse cellulaire.

Ce mode de production est donc toujours fréquemment rencontré dans des développements industriels. Des exemples connus concernent par exemple certains procédés de fabrication de la somatropine (hormone de croissance bovine), de l'insuline, de l'érythropoïétine (EPO) ou du TPA (Tissue Plasminogen Activator), un agent thrombolytique. Mais dans la pratique, toute protéine recombinante exprimée dans une bactérie telle que E. coli est susceptible d'y former des corps d'inclusion si son taux d'expression est suffisamment élevé. Cette problématique n'est donc pas spécifique à certaines familles de protéines. Ces corps d'inclusion, granules de protéines agrégées parfois visibles en microscopie optique, facilitent grandement la purification de la protéine. Par contre ils doivent ensuite être solubilisés, le plus souvent en présence d'un agent chaotropique, ce qui provoque leur dénaturation quasi-complète. C'est pourquoi la solubilisation doit impérativement être suivie d'une étape de repliement (ou renaturation) in vitro. Cette dernière étape est empirique, nécessite une mise au point fastidieuse spécifique pour chaque protéine, et son rendement est souvent faible. Ainsi la principale difficulté de ce genre de procédé est de convertir une protéine inactive et insoluble en une protéine active et soluble avec le plus haut rendement possible et de la manière la plus économique possible. Un autre point important est qu'aucune variation du procédé ne doit apparaître lors de la mise à l'échelle industrielle ; ce procédé doit être facilement automatisable et être générique pour une large gamme de protéines similaires afin que la technologie ne doive pas être réinventée à chaque fois. La Figure 1 montre une séquence d'étapes couramment utilisées pour l'isolation des corps d'inclusion, leur solubilisation et la renaturation de la protéine-cible.

La demande internationale de brevet WO9202540, déposée au nom de

BioEurope, décrit précisément un de ces procédés de purification, avec cependant une approche différente de celle décrite à la Figure 1. Cette demande chvuigue un procède de purification d'une protéine sécrétée sous forme de corps d'inclusion insolubles par une bactérie, caractérisé en ce que : a ) on récoite, après broyage des cellules microbiennes el cenlπfugaϋon, LÎΠ culot («. peilet ») ou fraction solide réunissant les fragments cellulaires et ies corps d'inclusion susmentionnés, b) on met le culot en suspension dans une solution de substance hydrosoiubie pouvant être gehfiée. c) on injecte goutte à goutte le mélange des particules soudes du cuiot et de ia solution de substance hydrosoiubie, dans une solution de geiificaîion. par exemple une solution contenant des cations muitivaients, réalisant ainsi S'encapsuSation des particuies solides du culot dans ia substance gélifiée, d) on met les peilets encapsulés en suspension dans une solution de dissolution contenant au moins un agent chaotropique et éventuellement un agent réducteur, e) on obtient ia protéine dénaturée et purifiée en solution, ies débris cellulaires et autres composes insolubles restant prisonniers de la matrice gélifiée. Cette approche permet donc de séparer de façon simple et efficace les cυrps d inclusion (soit le produit d'intérêt) des fragments cellulaires, une étape impoi tante ot difficile à maîtriser mais souvent occultée dans les descriptions de la littérature. Un inconvénient majeur de cette approche réside dans le fait qu'on va solubiliser d'autres composés en même temps que les corps d'inclusion, réduisant ainsi la pureté du produit ainsi récupéré par rapport à l'isolation directe de corps d'inclusion solides. La renaturation devra donc se faire en présence de quantités plus ou moins importantes de contaminants, qui peuvent avoir un impact négatif sur les rendements de renaturation. De plus cette demande internationale ne va pas au-delà de la solubilisation des corps d'inclusion, et ne traite en aucune manière des moyens d'obtenir une protéine native à partir du matériel dénaturé, si ce n'est par les méthodes classiques de dilution.

La protéine est ensuite renaturée par suppression des agents dénaturants dans son environnement ; ceci est réalisé en diluant le milieu ayant servi à la dissolution des corps d'inclusion. Pdr ailleurs, bon nombre de protéines ne peuvent être ronatureos do la sorte ot Io résultat obtenu ne permet pas toujours uno utilisation ultérieure efficace de ces protéines recombinantes En effet il est connu que les protemes obtenues par ce genre de procède le sont avec un très bon degré de purification suffisdnt pour certaines expériences (en particulier pour des immunisations) Cependant d autres utilisations, thérapeutiques notamment, requièrent l'obtention d'une protéine solubie purifiée et ayant recouvre sa conformation tridimensionnelle originale

La demande internationale de brevet WO9402625, déposée au nom d'Immunex Corporation, ne propose pas non plus de procédé de renaturation efficace et fiable. En effet, cette demande décrit un procédé d'isolation d'un polypeptide de recombinaison produit sous forme d'un composant d'une fraction insoluble dans une cellule hôte transformée, consistant à emprisonner les cellules hôtes (avant ou après la lyse de celles-ci) dans une matrice poreuse; à briser, si cela n'avait pas déjà été fait, la membrane des cellules hôtes pour permettre la diffusion des protéines solubles contenues dans lesdites cellules; à laver les cellules hôtes emprisonnées pour en extraire les protéine solubles, tout en laissant la fraction insoluble dans la matrice poreuse; et à mettre en contact la fraction insoluble dans la matrice poreuse avec un agent chaotropique afin d'isoler le polypeptide de recombinaison de la fraction insoluble. Là encore, les aspects liés à la renaturation et au rendement de cette dernière étape ne sont pas décrits dans l'invention.

Les deux demandes de brevet citées plus haut, bien qu'utilisant des matériaux et une approche similaires, ne traitent pour l'essentiel que de la solubilisation facilitée d'une protéine recombinante à partir de corps d'inclusion, tout en maintenant les résidus solides prisonniers dans une matrice de type hydrogel. La phase de renaturation de la protéine recombinante ainsi solubilisée, pourtant critique et le plus souvent limitante en termes de coûts et de temps, n'y est pour ainsi dire pas abordée.

La méthode la plus fréquemment utilisée pour réaliser une renaturation est la dilution, qui consiste à diluer la protéine soluble mais dénaturée à l'aide d'un tampon de renaturation. C'est une méthode simple, mais qui peut conduire à des difficultés lors d'applications commerciales. En effet, elle requiert la manipulation de grands volumes de tampon pour la dilution, ce qui rend nécessaire une étape ultérieure de concentration et augmente le coût du procédé [De Bernardez Clark, 1998]. La dilution est cependant nécessaire pour la renaturation en solution car les hautes concentrations de protéine favorisent l'agglomération, caractérisée par une cinétique de 2 ^eme ordre {Schlegl et al., 2005), au détriment du processus parallèle et concurrent de renaturation, qui suit quant à lui une cinétique de 1 ^er ordre.

Différentes approches ont été proposées afin de permettre la renaturation de protéines à haute concentration. Parmi elles on peut citer les techniques où l'on cherche à réduire la mobilité de la protéine pendant le processus ; ceci doit permettre de limiter le phénomène d'agrégation, qui implique que les molécules de protéine se rencontrent. On peut citer dans cette catégorie les approches décrites par Ferré et al. (2005), Middelberg (2002), ou Lanckriet & Middelberg (2004). La protéine est en général adsorbée sur une colonne chromatographique, ce qui limite sa mobilité, pendant que l'agent dénaturant est éliminé. Un inconvénient majeur de cette approche est que la protéine dénaturée, même si elle porte la même charge globale, ne s'adsorbe souvent pas de la même façon sur la phase stationnaire que la protéine native. Une solution possible à ce problème consiste à utiliser des protéines portant un marqueur (communément appelé « tag » en anglais) de type (His)6 par exemple, et de les adsorber sur une colonne d'affinité de type « IMAC » (Immobilized Métal Affinity Chromatography) porteuse d'ions de métaux de transition tels que Cu ² , Co ² , Ni ² ou Zn ²⁺ et pour lesquels l'histidine a une forte affinité (Hutchinson & Chase, 2006). D'autres marqueurs d'affinité comme l'intéine, la glutathione-S-transférase, la MBP (maltose binding protein) ou le CBP (calmodulin binding peptide) sont également utilisés, avec leurs avantages et inconvénients respectifs. Le (His)6 par exemple a, de par sa petite taille, la propriété d'être fonctionnel aussi bien sous conditions natives que dénaturantes. Dans une autre approche, on utilise de hautes pressions hydrostatiques afin de favoriser le repliement des protéines recombinantes vers leur structure native même à hautes concentrations. Le principe et des exemples d'applications de cette technologie développée et exploitée par la compagnie BaroFold, Inc. sont décrits dans des publications {Randolph et al., 1999 et 2002) ainsi que dans une série de demandes de brevets (AU 2007202306, WO 2007062174). Si cette méthode a démontré son efficacité dans de nombreux cas d'applications, les équipements permettant d'atteindre des pressions de plusieurs kbar sont cependant extrêmement coûteux et les temps de séjour dans la machine peuvent atteindre 24h.

Par conséquent, compte tenu de l'état de la technique décrit plus haut, il existe toujours un besoin pour un procédé efficace à grande échelle de renaturation d'une protéine recombinante, préférablement à haute concentration.

L'invention décrite ci-après permet de travailler à large échelle, avec une haute concentration de protéines, avec des matériaux peu coûteux, dans des conditions facilement reproductibles et avec un rendement important. L'utilisation de hautes concentrations de protéines permet ainsi de réduire les volumes et donc de faciliter leur manipulation. La présente invention concerne principalement un procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes, caractérisé en ce que : a) on récolte les corps d'inclusion sous la forme d'un culot après la lyse des cellules procaryotes ou eucaryotes et la centrifugation, b) on met le culot en présence d'une solution dénaturante contenant au moins un agent dénaturant et/ou un agent réducteur et/ou un agent détergent, afin de dissoudre les protéines contenues dans le culot à haute concentration, c) on dissout un polymère gélifiant dans la solution dénaturante, d) on met en contact la solution dénaturante comprenant le polymère gélifiant avec un bain provoquant la gélification du polymère gélifiant dissout, conduisant ainsi à l'encapsulation des protéines dénaturées et de l'agent dénaturant et/ou de l'agent réducteur et/ou de l'agent détergent dans la solution ainsi gélifiée, e) on permet à l'agent dénaturant et/ou à l'agent réducteur et/ou à l'agent détergent (qui sont des molécules de relativement faibles poids moléculaires) de diffuser à travers la solution ainsi gélifiée comprenant les protéines dénaturées encapsulées beaucoup plus rapidement que ces dernières, entraînant ainsi une renaturation progressive de ces protéines dénaturées tout en limitant leur agrégation (du fait d'une mobilité fortement réduite), f) on met les capsules contenant la protéine renaturée en présence d'une solution permettant la dissolution du gel, g) on obtient la protéine renaturée et purifiée en solution à une concentration élevée

L'invention concerne aussi un kit et un appareil pour la mise en œuvre du procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes

La Figure 1 représente un schéma classique d'isolation, solubilisation et renaturation de protéines recombinantes accumulées dans une cellule-hôte sous forme de corps d'inclusion. La Figure 2 représente la cinétique de relargage du chlorure de guanidiniun (GdnCI) et de l'ovalbumine hors de billes de 3 mm de diamètre préparées avec différentes concentrations d'alginate. Température = 22 ⁰ C.

La Figure 3 représente la cinétique de relargage du chlorure de guanidiniun

(GdnCI) et de l'ovalbumine hors de billes de 5 mm de diamètre préparées avec différentes concentrations d'alginate. Température = 22 ⁰ C.

La Figure 4 montre l'influence de la vitesse d'agitation sur la cinétique de libération du chlorure de guanidinium à partir de billes de 5 mm de diamètre préparées avec de l'alginate 2%. Température = 22 ⁰ C.

Par protéine recombinante, on entend une protéine produite par des cellules (eucaryotes ou procaryotes) dont l'ADN (acide désoxyribonucléique) a été modifié par recombinaison génétique. L'emploi d'un vecteur d'expression (en général un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rôle de transporteur génétique du gène d'intérêt codant pour la protéine recherchée est le moyen le plus souvent utilisé pour modifier l'ADN des cellules servant à la production de la protéine recombinante. Toute protéine susceptible d'être produite par des cellules (eucaryotes ou procaryotes) et dont l'ADN (acide désoxyribonucléique) a été modifié par recombinaison génétique est concernée par cette invention.

Par protéine on entend une macromolécule composée par une ou plusieurs chaîne(s) (ou séquence(s)) d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. En général, on parle de protéine lorsque la chaîne contient plus de 50 acides aminés. Dans le cas contraire, on parle de peptides et de polypeptides. Par conséquent, la présente invention considère aussi un procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante de moins de 50 acides aminés ou peptides (selon la définition donnée plus haut) accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes.

En général, la protéine recombinante est produite par des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes. Les cellules procaryotes sont dépourvues de noyau cellulaire et sont généralement unicellulaires. Elles comprennent les bactéries, les cyanobactéries, les archéobactéries. Leur matériel génétique est de l'acide désoxyribonucléique (A.D.N ou ADN) circulaire diffus dans le cytoplasme de la cellule. Les cellules procaryotes sont considérées comme plus primitives sur le plan de l'évolution et elles possèdent généralement un nombre de gènes inférieur aux cellules eucaryotes.

Les cellules eucaryotes, quant à elles, sont caractérisées principalement par le fait qu'elles possèdent un noyau composé d'une double membrane entourant l'ADN. Ces cellules regroupent tous les organismes compris dans quatre grands règnes du monde vivant : les animaux, les champignons, les plantes et les protistes.

II n'existe pas, pour le moment, de règle absolue permettant de prédire la stabilité, la solubilité, l'activité et la conformation d'une protéine recombinante (hétérologue) exprimée par une cellule eucaryote ou procaryote du type E. coli. Le principal problème rencontré est la formation de corps d'inclusion insolubles dans le cytoplasme de ces cellules hôtes. En effet chez E. coli l'expression importante de protéines hétérologues entraîne souvent l'apparition de granules appelés corps d'inclusion insolubles qui sont visibles en microscopie à contraste de phase. Ils contiennent généralement la protéine recombinante surexprimée ainsi que des acides nucléiques et quelques protéines bactériennes. Ces corps d'inclusion insolubles peuvent être assez facilement isolés permettant ainsi d'obtenir la protéine recombinante avec un bon degré de purification, suffisant pour certaines expériences (en particulier pour des immunisations classiques). Cependant d'autres approches comme par exemple les traitements thérapeutiques à l'aide de peptides ou d'anticorps, requièrent l'obtention d'une protéine soluble purifiée et se présentant sous une conformation native, ou le plus proche possible de cette conformation.

En effet la proieme recombinante e&l produite sous forme de corps d'inclusion insolubles Classiquement on va d'abofd concentrer les cellules buoaryofes ou procaryotos à partir du milieu do culture de ces ooϋuios, par conîπfugaîion ou ultrafiltration. La présente invention concerne donc avantageusement la renaturation de toutes protéines recombinantes (hormones, facteurs de croissance, anticorps...) qui ont tendance à, ou sont susceptibles de, former des corps d'inclusion lors des processus de purification connus. En règle générale, plus une protéine est insoluble (de part sa conformation) et plus elle aura tendance à former des corps d'inclusion dans des cellules procaryotes ou eucaryotes.

On obtient ensuite la lyse des cellules eucaryotes ou procaryotes en rompant la membrane plasmique de ces cellules par l'action d'un agent physique, chimique ou biologique, menant ainsi à la mort de la cellule.

De manière préférentielle, on utilisera le broyage mécanique (p. ex. dans un moulin à billes, un homogénéisateur à haute pression ou une « french press ») ou la sonication (traitement par ultrasons) mais des agents chimiques tels que les détergents (anioniques, cationiques, neutres), les solvants organiques, les bases ou acides forts ou des préparations enzymatiques sont également envisageables.

Etape a) Les corps d'inclusion sont ensuite réoolîe& par cenlπfugaϋon Lors de cette ϋentFifugdtiυn, le bumagednt contient !es constituants boiubies de la bactcπo Mais la fraction particulaπo ainsi recuoiiho, oncoro appelée cuiot contient outre les coi ps d'inclusion insolubles renfermant les piotemes recombinantes, des cellules non ly&ees. de& débris cellulaires et des contaminants protéiques, solubies υu non

Optionnellement, le culot est lavé, au préalable à l'étape de dissolution, avec une solution tampon aqueuse afin d'éliminer les contaminants solubles. Des solutions tampons couramment employées sont, suivant le pH désiré, de type acétate, citrate, phosphate, Tris, ou Glycine et tout autre tampon que l'homme du métier jugera utile d'employer

Etape b) : Ce culot est ensuite mis en présence d'une solution dénaturante contenant au moins un agent dénaturant et/ou un agent réducteur et/ou un agent détergent, afin de dissoudre les protéines contenues dans le culot. La solution dénaturante comprend au moins un agent dénaturant sélectionné parmi les agents chaotropiques connus de l'homme du métier comme l'urée ou le chlorure de guanidinium, ces exemples n'étant pas limitatifs. Le rôle de cet agent dénaturant est de provoquer la dissociation des protéines en altérant leur configuration spatiale ou leur conformation. La solution peut contenir également au moins un agent réducteur, choisi parmi le groupe non-limitatif comprenant le β-mercaptoéthanol, la glycine, le dithiothreitol (DTT), le dithioéryhtritol (DTE) ou la glutathione. Cet agent a pour fonction principale l'ouverture le maintien des résidus cystéine sous forme réduite, minimisant ainsi le risque de formation de ponts disulfure intramoléculaires non- natifs, voire la formation de ponts disulfure indésirables entre molécules de protéine. Un agent préféré est la glutathione. Les concentrations communément employées sont faibles, habituellement entre 0.2 et 10 mM, mais préférablement entre 0.5 et 5 mM. Les concentrations communément employées pour le DTT sont plus élevées, de l'ordre de 10 mM (entre 5 et 50 mM le plus souvent).

La solution peut aussi contenir un agent détergent connu de l'homme du métier et pouvant être sélectionné parmi le groupe non-limitatif comprenant des détergents anioniques, neutres, cationiques ou zwitterioniques. De préférence l'agent détergent sera sélectionné parmi le groupe non exhaustif comprenant le Triton X100, le CHAPS, le dodécyl maltoside, le DTAB, le CTAB.

Ces trois agents (dénaturant, réducteur et détergent) peuvent se trouver ensemble dans la même solution ou seuls ou par groupe de deux.

Une fois la protéine recombinante solubilisée, on peut, si nécessaire, la séparer facilement par filtration ou centrifugation des débris cellulaires et autres particules insolubles résultant de l'étape de lyse.

De façon alternative on peut procéder à la lyse des cellules et récupérer (après centrifugation et/ou filtration et lavage) la matière solide insoluble. Cette fraction solide contient les débris cellulaires et les corps d'inclusion. On peut dissoudre ces derniers en mettant en contact le culot de centrifugation avec une solution dénaturante contenant au moins un agent dénaturant et/ou un agent réducteur et/ou un agent détergent, afin de dissoudre les protéines contenues dans le culot à haute concentration, et isoler par centrifugation et/ou filtration le surnageant contenant la molécule-cible dénaturée,

Etape c) : Dans l'étape suivante, on dissout un polymère gélifiant dans la solution dénaturante. Cette dissolution sera réalisée sans générer de bulles d'air. Le cas échéant, ces dernières peuvent être éliminées par exemple par centrifugation ou en plaçant la solution sous vide. Parmi les polymères gélifiants les plus couramment rencontrés on peut citer, entre autres exemples, l'alginate, le carraghénane, le chitosan, la pectine, l'amidon (modifié ou non), la gélatine, le sulfate de cellulose, la carboxyméthyl-cellulose, la gomme de xanthane, la locust bean gum, la gomme de gellane ou l'agar agar.

A part ces polysaccharides, la gélatine et d'autres protéines ont elles aussi des propriétés intéressantes vis-à-vis de la formation de gels plus ou moins perméables.

Des polymères synthétiques donnant lieu à la formation d'un hydrogel sont également utilisables, pour autant qu'on puisse désagréger le gel à la fin du processus de renaturation, que ce soit par dissolution ou dégradation du polymère.

Les polymères dits intelligents, qui ont la propriété de changer de phase selon la température sont une autre possibilité de confinement de la protéine dénaturée.

Le carraghénane (ou carraghénine) est un polysaccharide extrait d'algues rouges servant d'agent d'épaississement et de stabilisation dans l'industrie alimentaire. Il porte le code E407 de la classification des additifs alimentaires. Les carraghénanes permettent de former des gels à chaud (jusqu'à 60 ⁰ C) et présentent donc un intérêt par rapport aux gélatines animales traditionnelles.

Un polysaccharide plus particulièrement préféré selon la présente invention est l'alginate. L'alginate est un polymère formé de deux monomères liés ensemble : le mannuronate ou acide mannuronique et le guluronate ou acide guluronique. La proportion et la distribution de ces deux monomères sont déterminantes pour une large part des propriétés physiques et chimiques de l'alginate.

Les alginates peuvent former des gels durs et thermostables utilisés comme additifs alimentaires (E400 à E405) permettant la reconstruction des aliments (jambon, cordons bleus, poisson pané ...). Des billes d'alginates peuvent également être utilisées en médecine pour encapsuler des médicaments ou des substances biologiques fragiles (enzymes, microorganismes, cellules animales ou humaines). En général la concentration d'alginate utilisée selon l'invention est comprise entre 1 et 10%, préférablement entre 2 et 5%.

Ces concentrations peuvent aussi être avantageusement appliquées aux autres polymères gélifiants. En général la concentration sera comprise entre 1 et 10%, préférablement entre 2 et 5%.

On notera de façon générale que la composition ainsi que les propriétés de solubilité et viscosité de ces différents polysaccharides gélifiants dépendent dans une large mesure de leur provenance, de l'état de la matrice dont ils ont été extraits ainsi que des étapes du processus de leur fabrication. Ainsi la composition (distribution des résidus manuronate et guluronate), le poids moléculaire, la viscosité et les propriétés gélifiantes d'un alginate peuvent varier de façon conséquente entre plusieurs fournisseurs, voire entre plusieurs lots de production d'un même fournisseur. C'est pourquoi les concentrations citées plus haut le sont à titre indicatif et devront être ajustées par l'homme de l'art.

Le choix et la concentration de la matrice d'encapsulation seront faits par l'homme du métier en fonction de la taille et de la charge de la protéine ainsi que de son activité. Une meilleure rétention peut par exemple être obtenue par l'encapsulation d'une protéine positivement chargée (à un pH inférieur à son point isoélectrique) au sein d'une matrice porteuse de charges négatives.

De plus, il est envisagé la possibilité d'ajouter au sein de la matrice d'encapsulation ou dans les solutions environnantes tout composé susceptible de faciliter ou d'accélérer la renaturation de la molécule-cibles. De nombreux exemples sont cités dans la littérature scientifique et sont connus de l'homme du métier. On peut citer brièvement et de façon non-exhaustive les systèmes oxydo-réducteurs comme la glutathione réduite/oxydée (GSH/GSSG), certains acides aminés tels que l'arginine, la proline, des polyols comme le glycérol ou le polyéthylène-glycol, des sucres comme le saccharose ou des polymères comme l'héparine, un glycosaminoglycane. Des concentrations usuelles pour la glutathione (oxydée ou réduite) sont de l'ordre de 0.5 à 5 mM, de préférence aux environs de 1-2 mM. Pour les acides aminés tels que la glycine ou la proline on travaille communément à des concentrations entre 50 mM et 1 M, et de préférence aux environs de 400 mM. Le glycérol est souvent employé à des concentrations voisines de 5%, le sulfate d'ammonium vers 200 mM. Le glucose, pour finir, est souvent ajouté au milieu de renaturation à concurrence de quelques % (5%, usuellement).

Etape d) : La solution dénaturante comprenant le polymère gélifiant est ensuite mise en contact avec un bain provoquant la gélification du polymère gélifiant dissout, conduisant ainsi à l'encapsulation des protéines dénaturées et de l'agent dénaturant et/ou de l'agent réducteur et/ou de l'agent détergent dans la solution ainsi gélifiée.

En général la mise en contact entre la solution dénaturante et le bain provoquant la gélification du polymère est effectuée en laissant tomber goutte à goutte la solution dénaturante dans le bain provoquant ainsi la gélification du polymère. Cependant, toute autre technique permettant d'obtenir des capsules ou billes de polymère convient à la réalisation de la présente invention. Le diamètre des billes ainsi obtenues peut se situer typiquement entre 1 et 10 mm, mais une extrusion sous forme de spaghetti ou une gélation en bloc ou sous toute autre forme est aussi envisageable. Les essais réalisés par le demandeur de la présente invention ont montré que des billes de grosse taille (4-5 mm de diamètre) ne constituaient pas un handicap dans la mesure où l'agent dénaturant pouvait encore s'en échapper assez rapidement et où la protéine-cible, quant à elle, était mieux retenue par des billes de 4-5 mm que par des billes plus petites.

Préférablement, si le polymère gélifiant est de l'alginate alors le bain provoquant la gélification du polymère est constitué d'une solution de sels de calcium. Le plus couramment employé est le chlorure de calcium entre 2 et 10%, encore plus préférablement aux alentours de 5% mais selon les applications et le mode de fabrication des capsules on pourra utiliser d'autres dérivés du calcium (lactate de calcium par exemple). Le carraghénane peut être gélifié soit par refroidissement (gel thermique), soit par interactions ioniques entre le polysaccharide et des ions potassium (K+). Les sels de potassium (KCI le plus souvent) sont utilisés dans les bains gélifiants à des concentrations entre 2 et 10%, encore plus préférablement aux alentours de 5%. Le chitosan, qui est soluble en milieu légèrement acide, peut quant à lui être gélifié soit par changement de pH (on extrude la solution de chitosan dans un bain de NaOH entre 0.1 et 1.0 M, de préférence aux environs de 0.5 M) soit à l'aide de tripolyphosphate de sodium. Les pectines avec un faible degré de méthylation (low methoxy pectins) peuvent être solidifiées à l'aide de solutions de calcium aux mêmes concentrations que pour l'alginate. Le sulfate de cellulose est quant à lui gélifié par complexation avec d'autres polyélectrolytes comme le chlorure de poly-(diallyldimethylammonium chloride) (p-DADMAC) en concentrations équivalentes. La gélatine et l'agar agar forment des gels thermiques et sont solidifiés par refroidissement comme l'alginate.

II existe de nombreuses méthodes permettant de solidifier des solutions de ces polymères. Le choix de l'approche la plus pertinente sera conditionné par la stabilité de la protéine à renaturer et sera basé sur les connaissances et l'expérience de l'homme de l'art. Dans certains protocoles on complète la solidification des billes en réticulant les gels formés à l'aide de réactifs comme le glutaraldéhyde. Cette approche n'est pas souhaitable dans le cadre de la présente demande, dans la mesure où elle implique une dégradation de ces matrices à la fin du processus, afin de libérer la protéine renaturée.

En général c'est la nature du polymère gélifiant qui déterminera celle du bain provoquant la gélification du polymère. Aussi chaque couple polymère/bain gélifiant sera à déterminer précisément par l'homme du métier selon ses connaissances usuelles.

Il en est de même avec la concentration du composant présent dans le bain de gélification ; cette concentration est directement dépendante de la concentration du polymère gélifiant et sera également à déterminer précisément par l'homme du métier selon ses connaissances usuelles. Etape e) : Dans l'étape suivante, on permet à l'agent dénaturant et/ou à l'agent réducteur et/ou à l'agent détergent de diffuser à travers la solution ainsi gélifiée comprenant les protéines dénaturées encapsulées, entraînant ainsi une renaturation progressive de ces protéines dénaturées tout en limitant leur agrégation. En effet et de manière surprenante, les inventeurs de la présente invention ont remarqué que l'utilisation d'un polymère gélifiant pour encapsuler les protéines dénaturées et en solution dans la solution dénaturante permettait d'obtenir un taux de renaturation élevé de la protéine recombinante dénaturée tout en limitant l'agrégation de ces mêmes protéines.

Cette renaturation progressive est obtenue par une combinaison favorable de deux effets :

1 ) on permet d'une part à l'agent dénaturant et/ou à l'agent réducteur et/ou à l'agent détergent, qui sont des molécules de relativement petites tailles, de diffuser à travers la matrice gélifiée, réduisant ainsi la concentration de ces substances à des valeurs permettant la renaturation de la protéine.

2) D'autre part, en limitant fortement la mobilité de la protéine au sein de la matrice pendant l'étape de renaturation, on l'empêche de former des agrégats, ce qui conduit à des rendements de renaturation supérieurs à ceux observés avec toute autre technique connue malgré la haute concentration de protéine.

La diffusion de l'agent dénaturant et/ou de l'agent réducteur et/ou de l'agent détergent à travers la solution ainsi gélifiée comprenant les protéines dénaturées encapsulées est réalisée en mettant en contact lesdites protéines dénaturées encapsulées, en général sous forme de capsules ou billes, en présence d'eau, préférablement distillée ou d'un tampon fournissant à la protéine des conditions de pH favorables à sa stabilité. Le volume d'eau distillée est en général 10 à 30 fois, préférablement 20 fois, plus grand que le volume de billes. Une légère agitation peut être appliquée pour permettre une diffusion plus rapide et plus homogène. Au fur et à mesure de l'élimination de l'agent dénaturant, la molécule-cible se trouvera donc placée dans des conditions favorables à sa renaturation et limitant sa tendance à l'agglomération. Ce procédé de renaturation permet d'obtenir d'excellents résultats. La température peut être maintenue à une valeur connue de l'homme du métier et garantissant la stabilité de la protéine pour la durée de cette étape.

Etape f) :

Après cette étape de renaturation in silico, on met les capsules contenant les protéines dénaturées en présence d'une solution permettant la dissolution du gel.

Cette dernière est choisie parmi des solutions de citrate de sodium, d'EDTA ou de fluorure de sodium, soient des composés connus de l'homme du métier et permettant de complexer le calcium, conduisant ainsi à la désagrégation du réseau d'alginate.

De manière préférentielle, l'on utilise une solution de citrate de sodium tamponné à une des concentrations suivantes : 100 mM, 200 mM, 300 mM ou 50OmM, avec une préférence pour une concentration à 200 mM.

Ces concentrations peuvent aussi être avantageusement appliquées aux autres composés à la base de la solution permettant la dissolution du gel. En général la concentration de la solution permettant la dissolution du gel sera comprise entre (environ) 100 mM et 500 mM.

Celle-ci sera conduite sur une durée de 30 à 180 minutes (préférablement 60 min) et à une température entre 5 et 40 ⁰ C (préférablement 10-25 ⁰ C).

En général, il est préférable de réaliser cette étape de dissolution du gel dans de petits volumes de solution, afin d'obtenir au final une concentration moyenne à élevée de protéine recombinante renaturée et purifiée dans la solution.

Etape g) : On obtient ensuite la protéine sous forme renaturée et purifiée en solution concentrée.

La présente invention comprend aussi un appareil pour la mise en œuvre du procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes tel que décrit supra.

La présente invention comprend aussi un kit pour la mise en œuvre du procédé de purification et de renaturation d'une protéine recombinante accumulée sous forme d'un corps d'inclusion insoluble par des cellules procaryotes ou eucaryotes tel que décrit supra. Ce kit peut comprendre, entre autres, i) l'agent dénaturant et/ou l'agent réducteur et/ou l'agent détergent en général sous forme de solutions, ii) un polymère gélifiant, iii) les composés pour la préparation du bain provoquant la gélification dudit polymère gélifiant, iv) les composés pour la préparation d'une solution de dissolution du gel et, optionnellement, v) des cellules procaryotes ou eucaryotes nécessaires à l'expression de la protéine recombinante. Le kit peut également comprendre un vecteur d'expression (plasmidique ou autre) nécessaire à l'expression de la protéine recombinante d'intérêt.

Les exemples suivants ont pour but de démontrer la faisabilité de la présente invention et ne sauraient limiter l'invention à ces seules descriptions.

Le premier exemple ci-après est une preuve de concept qui démontre qu'une protéine emprisonnée dans une matrice d'alginate diffuse beaucoup plus lentement que l'agent dénaturant qui y est également encapsulé. La modèle choisi pour la protéine est l'ovalbumine, d'un poids moléculaire de 45 kDa environ, et de point isoélectrique 4.6.

Le second exemple montre un essai de renaturation d'α-amylase de B. amyloliquefaciens (poids moléculaire 55 kDa, point isoélectrique aux environs de 5.2) à haute concentration (10 mg/ml) réalisé de deux manières différentes :

• Dans la première l'agent dénaturant (chlorure de guanidinium) a été éliminé par dialyse, l'enzyme restant en solution à l'intérieur de la chambre de dialyse.

L'activité de l'amylase a été mesurée avant dénaturation et après la dialyse.

• Dans la seconde approche l'enzyme dénaturée (10 mg/ml) et l'agent dénaturant (3.0 M) ont été encapsulés dans une matrice d'alginate. Les capsules ainsi formées ont été immergées dans une solution tampon, ce qui a permis une élimination rapide de l'agent dénaturant. Les billes ont ensuite été récupérées et dissoutes par complexation du calcium à l'aide de citrate. L'activité de l'amylase a été mesurée avant dénaturation et après le traitement de renaturation.

Tous les essais décrits ci-après ont été réalisés à température ambiante (22°C).

Exemple 1 : Preuve de concept - mesures des vitesses de diffusion de la BSA et du chlorure de guanidinium hors d'une matrice d'alginate.

Produits chimiques et réactifs

Alginate de sodium, Lot # KLTV 45184A, lnotech AG, Basel (Suisse) Chlorure de calcium dihydrate (CaCl2-2H2θ), Fluka Chemicals, Buchs (Suisse). Chlorure de Guanidinium, Sigma Aldrich, Buchs (Suisse) Ovalbumine 5x cristallisée, Fluka Chemicals, Buchs (Suisse) Tri-sodium Citrate dihydrate, Panreac Chemicals, Barcelona (Espagne)

Description de l'essai

Dans un tampon Tris 10 mM à pH 7.0 on a dissout de l'ovalbumine à raison de 10 mg/ml, du chlorure de guanidinium (GdnCI) à raison de 3.0 mol/l ainsi que de l'alginate de sodium à des concentrations variant entre 2 et 5%. La solution a ensuite été dégazée et les bulles d'air éliminées par centrifugation et/ou sous vide.

On a ensuite laissé tomber goutte à goutte ce mélange dans une solution tampon Tris 10 mM à pH 7.0 contenant 5% de CaCI ₂ ainsi que de l'ovalbumine et du GdnCI aux mêmes concentrations qu'avant (10 mg/ml et 3.0 mol/l, respectivement) afin d'éviter les pertes pendant le stockage des billes. Des billes d'alginate d'un diamètre de 5 mm environ ont ainsi été formées.

Pour le début de l'essai les billes, d'un volume total de 10 ml, ont été récupérées et égouttées à l'aide d'une passoire avant d'être plongées dans un récipient contenant 190 ml d'une solution tampon Tris 10 mM à pH 7.0. La suspension était agitée à l'aide d'un barreau magnétique. On a mesuré dès ce moment la migration du chlorure de guanidinium et de l'ovalbumine hors de la matrice d'alginate vers la solution extérieure. Le dosage du

GdnCL a été fait en continu par conductimétrie. La concentration de l'ovalbumine dans le liquide a quant à elle été déterminée par des prises d'échantillons régulières et par la mesure de l'absorbance de la solution à 280 nm.

Deux tailles de billes ainsi que différentes concentrations d'alginate et des vitesses d'agitation variables ont été testées lors de ces essais.

Résultats

Les résultats des essais décrits ci-avant sont montrés à la Figure 2. On peut y voir que 20 minutes suffisent pour éliminer la quasi-totalité de l'agent dénaturant contenu dans des billes de 3-4 mm de diamètre, et ce quelle que soit la concentration d'alginate utilisée pour la fabrication des billes (entre 2 et 5%), La Figure 3 montre exactement les mêmes tendances pour des billes plus grosses, de 5 mm de diamètre. On constate également pour les deux tailles de billes que l'ovalbumine, du fait de sa taille, ne diffuse quant à elle que beaucoup plus lentement hors de la matrice d'alginate. La Figure 2 met aussi en évidence l'influence de la concentration en alginate sur la vitesse de libération des composants : première constatation, un gel à 5% d'alginate ne semble pas retenir plus fortement l'agent dénaturant qu'un gel à 2% ; ceci n'est pas trop surprenant vu la petite taille de la molécule de GdnCI. L'ovalbumine par contre, avec un poids moléculaire de 45 kDa, est libérée nettement moins rapidement d'un gel à 5% d'alginate que d'un gel à 2%. Le réseau plus « serré » du gel à 5% retient donc mieux la protéine étudiée ici.

D'autres essais, dont les résultats sont reportés à la Figure 4, ont également montré que la vitesse d'agitation n'avait pour ainsi dire pas d'impact sur la vitesse de migration des différents composants, notamment du chlorure de guanidinium, vers l'extérieur des billes. Tous les résultats ci-dessus désignent clairement le transport à l'intérieur des billes comme l'étape limitante du processus.

Ces résultats démontrent aussi sans équivoque que des billes de faible diamètre ne sont pas exigées pour mener à bien l'application décrite ici. En conséquence, la présente invention ne requiert pas l'emploi d'une technologie sophistiquée pour la génération de gouttelettes monodisperses de faible diamètre telles que décrites dans la littérature sur la microencapsulation.

Les observations reportées ici démontrent donc amplement la validité du concept proposé, à savoir la migration rapide de l'agent dénaturant hors des billes d'alginate ainsi que la rétention de la majeure partie de la protéine à l'intérieur de celles-ci pendant ce laps de temps.

Exemple 2 : Renaturation de l'α-amylase de B. amyloliquefaciens à haute concentration - comparaison de la méthode par dialyse et par diffusion de l'agent dénaturant hors d'une matrice d'alginate.

Produits chimiques et réactifs Alginate de sodium, Lot # KLTV 45184A, lnotech AG, Basel (Suisse) α-amylase de Bacillus amyloliquefaciens, 839 unités/mg _SO iιde , Sigma-AIdrich, Buchs (Suisse).

Chlorure de Guanidinium, Sigma Aldrich, Buchs (Suisse) Chlorure de calcium dihydrate, Fluka Chemicals, Buchs (Suisse) Tri-sodium Citrate dihydrate, Panreac chemicals, Barcelona (Espagne) Phadebas® kit for amylase assay, Magie AB, Lund (Suède)

Mesure de la concentration de chlorure de guanidinium (GdnCI)

La concentration de l'agent dénaturant a été mesurée par conductimétrie, comme décrit dans l'essai 1.

Mesure d'activité de l'α-amylase.

L'activité de l'α-amylase (et donc la concentration d'enzyme native) a été déterminée lors des différents essais à l'aide d'un kit commercial Phadebas® commercialisé par la maison Magie AB, Lund (Suède). Celui-ci consiste en un amidon modifié, sur lequel a été greffé un colorant qui se solubilise au fur et à mesure de la dégradation du substrat par l'amylase. Les mesures ont été réalisées selon le protocole général suivant :

• Trois tablettes de substrat (insoluble) étaient dispersées dans 32 ml de tampon phosphate 0.1 M pH 7.0 contenant également 0.5 mM de chlorure de calcium. La suspension était maintenue sous agitation afin d'en garantir l'homogénéité.

• 2 ml de suspension étaient ensuite prélevés et placés dans un tube à essais. On y ajoutait ensuite 0.5 ml de solution d'enzyme (à la dilution appropriée) avant de mettre en route le chronomètre et de placer le mélange sous agitation, à température ambiante. • Après 10 minutes d'incubation on ajoutait 0.5 ml de NaOH 0.5 M sous bonne agitation, afin de stopper la réaction.

• La suspension résultante était ensuite filtrée sur membrane de 0.45 μm à l'aide d'une seringue et l'absorbance du surnageant mesurée à 620 nm (couleur bleue due au colorant solubilisé) contre un échantillon de contrôle négatif où la solution d'enzyme était remplacée par du tampon phosphate.

• La différence d'absorbance ainsi mesurée était, en tenant compte des dilutions éventuelles, directement proportionnelle à la concentration d'enzyme active dans l'échantillon.

Description de l'essai

Cet essai a pour but de comparer les rendements de renaturation à haute concentration d'α-amylase obtenus soit par dialyse, soit par la méthode proposée dans la présente invention.

Dans la première l'enzyme concentrée (10 mg/ml) se trouve en solution et est donc libre de former des agrégats. Dans la seconde l'enzyme se trouve immobilisée dans un gel permettant sa renaturation mais limitant sa mobilité, de telle sorte que l'agrégation est fortement inhibée.

Dans la seconde approche l'enzyme dénaturée (10 mg/ml) et l'agent dénaturant (3.0 M) ont été encapsulés dans une matrice d'alginate. Les capsules ainsi formées ont été immergées dans une solution tampon, ce qui a permis une élimination rapide de l'agent dénaturant, comme démontré dans l'essai 1. Les billes ont ensuite été récupérées et dissoutes par complexation du calcium à l'aide de citrate. L'activité de l'amylase a été mesurée avant dénaturation et après le traitement de renaturation.

Dénaturation de l'α-amylase et renaturation par dialyse

Environ 5 ml d'une solution à 10 mg/ml d'α-amylase de B. amyloliquefaciens ont été dénaturés à température ambiante pendant 12 h en présence de 3.0 M de chlorure de guanidinium (GdnCI). L'activité résiduelle de l'enzyme a été mesurée avant et après dénaturation. Les résultats sont consignés dans le Tableau 1.

Une quantité équivalant à 2 ml de la solution d'enzyme dénaturée a ensuite été transférée dans une cassette de dialyse dont le seuil de coupure nominal est de 10 kDa. La cassette a ensuite été mise en suspension dans 3.0 litres de tampon phosphate agités à l'aide d'un barreau magnétique, et laissée pendant 12 heures. L'équilibre des concentrations une fois atteint, l'agent dénaturant se trouvait dilué 1 '50O fois, ce qui correspond à une concentration résiduelle de 2 mM.

On a noté qu'après une longue dénaturation de 12 h, il ne restait plus que 8 % d'activité relative. Lors de la renaturation par dialyse, un précipité est apparu dans la cassette. Après les 12 heures de dialyse, l'échantillon a été récupéré, mélangé et son activité mesurée. Celle-ci s'est révélée être très faible, atteignant 4 % de l'activité initiale. Il semble donc que l'agrégation des protéines a engendré une perte notable de l'activité. Le problème de la dialyse est que la concentration en enzyme reste élevée dans la cassette (10 mg/ml). Ainsi, la tendance à l'agrégation est forte et la renaturation par dialyse apparaît comme une méthode inappropriée dans ce cas de figure.

L'activité de l'enzyme a été mesurée à chaque étape de l'expérience et est reportée dans le Tableau 1 ci-après. On y trouve la concentration d'enzyme C _am yiase en mg de protéine par ml, l'activité enzymatique par unité de volume A _VO ι, l'activité spécifique A _sp ec (en unités par mg de protéine) et finalement l'activité relative A _re ι exprimée en % de l'activité de l'enzyme native. Toute l'expérience s'est déroulée à température ambiante.

Tableau 1 : Activité de l'α-amylase à chaque étape de la renaturation par dialyse

Dénaturation de l'α-amylase et renaturation dans une matrice d'alqinate

Le but est d'encapsuler l'enzyme dénaturée à haute concentration dans une matrice d'alginate en présence du chlorure de guanidinium, de permettre à ce dernier de diffuser rapidement hors des billes avant de les récupérer et de les plonger dans une solution de citrate de sodium pour dissoudre le gel et récupérer une enzyme concentrée et active.

On a pesé 200 mg d'α-amylase, avant de les transférer dans un flacon jaugé de 20 ml. Environ 10 ml de tampon phosphate 0.1 M pH 7.0 contenant 0.5 mM de CaCb- ont été transférés dans le jaugé pour dissoudre l'enzyme. Après dissolution de l'enzyme, on a ajouté 5.732 g de chlorure de guanidinium (correspondant à 3.0 M une fois dissouts dans 20 ml) à la solution d'enzyme et complété le volume jusqu'à un total de 19.5 ml environ. On a ensuite laissé le mélange 16h à température ambiante afin de dénaturer l'enzyme le plus complètement possible.

A la fin de l'étape de dénaturation on a transféré la solution d'enzyme dans un bêcher de 50 ml et ajouté 0.8 g d'alginate afin d'obtenir une solution à 4% de ce dernier. On a agité doucement avec une spatule afin de dissoudre l'alginate sans générer trop de bulles d'air. Le cas échéant, ces dernières peuvent être efficacement éliminées par centrifugation ou en plaçant la solution sous vide. L'alginate une fois dissout on a rempli une seringue de 10 ml avec le mélange, que l'on a laissé tomber goutte à goutte dans 490 ml d'une solution de CaCI ₂ 5%. Les billes ainsi formées ont été laissées pendant 1 h sous agitation modérée. Ce laps de temps est assez long pour permettre l'élimination complète de l'agent dénaturant et permettre la renaturation de l'enzyme, tout en étant assez court pour garantir une bonne rétention de cette dernière.

Les 10 ml de billes ont ensuite été récupérées à l'aide d'une passoire et transférées dans 90 ml de citrate de sodium 500 mM à pH 5.0 afin de dissoudre l'alginate et de récupérer l'enzyme soluble et renaturée.

L'activité de l'enzyme ainsi renaturée a finalement été mesurée et comparée à l'activité récupérée après dialyse à la même concentration de 10 mg/ml. Les résultats sont consignés dans le Tableau 2.

Tableau 2 : Renaturation de l'enzyme par encapsulation dans une matrice d'alginate

On constate pour cet essai un rendement de renaturation de 65%. A conditions expérimentales identiques cette valeur est très similaire aux rendements habituellement obtenus en diluant 50 fois une solution contenant 1 mg/ml d'enzyme et 3.0 M de chlorure de Guanidinium. Ce résultat a par contre été atteint à une concentration d'enzyme 50 fois supérieure représentant ainsi des économies substantielles pour les étapes de purification suivantes où l'enzyme devra être à nouveau concentrée. Références

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