本申请要求于 2012 年 02 月 10 日提交中国专利局、 申请号为 201210029818.7、发明名称为 "一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法"的 中国专利申请的优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请中。 技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种纯化 固相合成利拉鲁肽粗肽 的方法。 背景技术

糖尿病（ Diabetes Mellitus, DM )是一种全球性的高发病， 据世界卫 生组织最新公布数据显示， 2007年全球糖尿病患者人数已达 1.8亿，且发 病率仍逐年增加。 据流行病学统计， 我国 2010年糖尿病患者近 9200万。 由于糖尿病设计全身各个系统，甚至诱发许多 致使性并发症，严重影响人 的劳动能力， 并威胁人的生命安全， 对人们的健康形成极大的危害。糖尿 病主要分为 I型和 II型， 后者占糖尿病患者总数的 90%以上。

利拉鲁肽是一种长效治疗 II型糖尿病的胰高血糖素样肽 1 ( GLP-1 ) 类似物， 属于 GLP-1受体激动剂， 是首个为 II型糖尿病治疗开发的人高血 糖素样多肽 -1 ( GLP-1 )类似物。 由诺和诺德公司开发研制， 并于 2010年 1月 25日获得 FDA批准上市， 于 2011年 3月 4日获 SFDA批准在中国上市。 利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降 血糖药物， 不仅作用时间 长,而且充分保留了天然 GLP-1的多项生理活性,可安全有效降糖并可 能对多种心血管危险因素有保护作用，为 2型糖尿病的治疗带来了新 的选择。 临床治疗效果令人鼓舞。

该药品在我国完全依赖进口， 药品价格昂贵。诺和诺德公司通过基因 重组技术生产。多肽固相化学合成因其可定向 合成且溶剂用量少等优点而 成为多肽和蛋白质药物研究、生产领域中的一 个重要技术手段。但化学合 成产生的杂质因其性质相近使分离纯化难度大 而导致纯化技术成为瓶颈 之一， 使其产业化带来困难。 目前有报道利拉鲁肽纯化方法为 RP-HPLC方法（ Journal of Medicinal Chemistry 43 , 1664-1669, 2000 ) , 采用氰丙基柱（ Zorbax 300SB-CN ) , 流动相为标准的 TFA/乙腈体系， 柱温为 65度， 乙腈的浓度梯度为 60分 钟内 0~100% , 分离出 目标产物， 纯化收率为 35% ; 中国专利 200610110898.3和中国专利 200510107588采用同样的纯化方法， 纯化收 率为 28%。

利拉鲁肽由于肽链长且因其棕榈酰基存在导致 疏水性大强而纯化难 度大。 本发明提出了一种可纯化固相化学合成得到的 利拉鲁肽纯化方法， 产品纯度高且收率好且易于产业化。 发明内容

有鉴于此，本发明提供一种纯化固相合成利拉 鲁肽粗肽的方法。该方 法将固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液 获得粗肽溶液后，通过四步

HPLC纯化获得利拉鲁肽， 纯度好， 收率高。

为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种固相合成的利拉鲁肽粗肽的 纯化方法，包括如下步 骤：

步骤 1 : 取固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液中 获得粗肽溶 液；

步骤 2: 取所述粗肽溶液， 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 以含有

0.1 ~ 0.2%三氟醋酸的异丙醇水溶液为 Α相， 含有 0.1 ~ 0.2%三氟醋酸的 乙腈为 B相， 梯度为 20 ~ 40% B→40 ~ 60% B, 进行第一 HPLC纯化， 线 性梯度洗脱， 收集目的峰获得第一馏分；

步骤 3: 取所述第一馏分， 以氰基硅烷键合硅胶为固定相， 以质量浓 度为 0.05 ~ 0.15%高氯酸的水溶液为 A相， 质量浓度为 0.05 ~ 0.15%高氯 酸的乙腈为 B相， 梯度为 40% B→70% B, 进行第二 HPLC纯化， 线性梯 度洗脱， 收集目的峰获得第二馏分；

步骤 4: 取所述第二馏分， 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 以质量 浓度为 0.01 ~ 0.06%氨水的水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度为 30% B→60% B, 进行第三 HPLC纯化， 线性梯度洗脱， 收集目的峰获得 第三馏分；

步骤 取所述第三馏分经减压旋蒸浓缩、 冷冻干燥， 即得。

多肽固相合成中， 杂质主要为短的寡核苷酸片段、 盐及各种保护基。 其中， 缺省肽和消旋肽为主要的去除杂质。 在本发明中， 固相合成粗肽纯 度为 杂质最大含量为 。

作为优选， 乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为 10 ~

作为优选， 异丙醇水溶液中异丙醇与水的体积比为 15 ~ 35： 65 ~ 作为优选，步骤 2、步骤 3或步骤 4中，第一 HPLC纯化、第二 HPLC 纯化或第三 HPLC纯化的流速为 55 ~ 2000ml/min。

作为优选，步骤 2、步骤 3或步骤 4中，第一 HPLC纯化、第二 HPLC 纯化或第三 HPLC纯化的流速为 55 ~ 500ml/min。

作为优选， 步骤 或步骤 中线性梯度洗脱时间为 40min。

作为优选， 步骤 4中线性梯度洗脱时间为 30min。

作为优选， 步骤 5中减压旋蒸浓缩后浓度为 50 ~ 70 mg/ml。

作为优选，所述固相合成为在活化剂系统的存 在下， 由树脂固相载体 和 N端 Fmoc保护的甘氨酸偶联得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基 酸， 其中赖氨酸侧链采用 Alloc保护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通 过固相合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护 基和树脂得到利拉鲁肽粗肽。

本发明提供一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的 方法。该方法将固相合 成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液获得粗肽溶 液后， 通过四步 HPLC 纯 化获得利拉鲁肽， 收率为 61.1 - 64.4%, 纯度为 98.2 ~ 98.7%。 具体实施方式

本发明公开了一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽 的方法，本领域技术人 员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的，它们都被视为包 括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较 佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围 内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。

本发明提供的固相合成的利拉鲁肽的纯化方法 中所用试剂均可由 市场购得。

下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 实施例 1

固相合成利拉鲁肽， 粗肽纯度为 50%。

样品处理：

将 2.2g固体粗肽用 10%乙腈 /90%水（ V/V ), 超声使样品完全溶 解后用滤膜过滤， 收集滤液备用。

第一步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm x 250 mm 。 流动相： A相： 0.1%三氟 乙酸 85%水 /15%异丙醇溶液水溶液； B 相： 0.1%三氟醋酸的乙腈， 流速： 55 ml/min, 梯度： 40% B— 60% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 2.2g 。

纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 2.2g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第二步纯化样品。

第二步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.15%高氯 酸的水溶液为 A 相， 0.15%高氯酸的乙腈为 B 相， 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 1.2g 。

纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 1.2g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。

第三步 HPLC脱盐纯化：

色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和 长度为： 50 mm 250 mm 。 0.01%氨水的水溶液为 A 相， 色谱纯 乙腈为 B相， 梯度： 30% B— 60% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 l .Og 。

纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 1.0g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 50 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.6%的活性药物利拉鲁肽0.858, 纯化总收率为 64.4%。 实施例 2

固相合成利拉鲁肽： 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 N 端 Fmoc保护的甘氨酸偶联得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照 利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其 中赖氨酸侧链采用 Alloc保护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通过固相 合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护基和树 脂得到利拉鲁肽粗肽。 粗肽纯度为 60%。

样品处理：

将 2.5g固体粗肽用 20%乙腈 /80%水（ V/V ), 超声使样品完全溶 解后用滤膜过滤， 收集滤液备用。

第一步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.2%三氟 乙酸 75%水 /25%异丙醇溶液水溶液； B 相： 0.2%三氟醋酸的乙腈， 流速： 80 ml/min, 梯度： 35% B— 55% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 2.5g 。 纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 2.5g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 25 mg/ml 后作第二步纯化样品。

第二步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 50 mm x 250 mm 。 流动相： A相： 0.1%高氯酸 的水溶液为 A相， 0.1%高氯酸的乙腈为 B相， 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 1.4g 。

纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 1.4g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。

第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 0.04%氨水的 水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度： 30% B— 60% B , 检测波 长： 275 nm。 进样量为 1.18g 。

纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 1.18g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 60 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.4%的活性药物利拉鲁肽0.928, 纯化总收率为 61.3%。 实施例 3

固相合成利拉鲁肽， 粗肽纯度为 58%。

样品处理：

将 3.0g固体粗肽用 30%乙腈 /70%水（V/V ), 超声使样品完全溶 解后用滤膜过滤， 收集滤液备用。

第一步 HPLC纯化： 纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.2%三氟 乙酸 65%水 /35%异丙醇溶液水溶液； B 相： 0.2%三氟醋酸的乙腈， 流速： 70 ml/min, 梯度： 30% B— 50% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 3.0g 。

纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 3.0g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 10 mg/ml 后作第二步纯化样品。

第二步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.05%高氯 酸的水溶液为 A 相， 0.05%高氯酸的乙腈为 B 相， 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 1.53g 。

纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 1.53g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 15 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。

第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 0.06%氨水的 水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度： 30% B— 60% B , 检测波 长： 275 nm。 进样量为 1.24g 。

纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 1.24g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 70 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.7%的活性药物利拉鲁肽 l . lg, 纯化总收率为 61.1 %。 实施例 4 固相合成利拉鲁肽： 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 N 端 Fmoc保护的甘氨酸偶联得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照 利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其 中赖氨酸侧链采用 Alloc保护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通过固相 合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护基和树 脂得到利拉鲁肽粗肽。 粗肽纯度为 53%。

样品处理：

将 25g粗肽用 20%乙腈 /80%水溶液溶解， 超声使样品完全溶解 后用滤膜过滤， 收集滤液备用。

第一步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 150 mm x 250 mm 。 流动相： A 相： 0.1%三氟 醋酸的 20%异丙醇 /80%水溶液； B相： 0.1 %三氟醋酸的乙腈， 流速： 500 ml/min,梯度： 30% B— 50% B,检测波长： 275 nm。进样量为 25g 。

纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 25g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第二步纯化样品。

第二步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 150 mm x 250 mm 。 流动相： A相： 0.15%高氯 酸的水溶液， B相： 0.15%高氯酸的乙腈， 流速： 500 ml/min, 梯 度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 12.25g 。

纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 12.25g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。

第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 150 mm X 250 mm 。 0.05%氨水 的水溶液为 A相， 色语纯乙腈为 B相， 流速： 500 ml/min, 梯度： 30% B— 60% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 10.7g 。

纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 10.7g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 50 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.4%的活性药物利拉鲁肽 9.2g, 纯化总收率为 61.3%。 实施例 5

固相合成利拉鲁肽， 粗肽纯度为 56%。

样品处理：

将 90g粗肽用 30%乙腈 /70%水溶液溶解， 超声使样品完全溶解 后用滤膜过滤， 收集滤液备用。

第一步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 300 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.15%三 氟醋酸的 20%异丙醇 /80%水溶液； B相： 0.15%三氟醋酸的乙腈， 流 速： 2000 ml/min, 梯度： 30% B— 50% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 90g。

纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 90g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 25 mg/ml 后作第二步纯化样品。

第二步 HPLC纯化：

纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 300 mm x 250 mm。 流动相： A相： 0.15%高氯酸 的水溶液， B相： 0.15%高氯酸的乙腈， 流速： 2000 ml/min, 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 46g 。

纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 46g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。

第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 300 mm X 250 mm。 0.05%氨水的 水溶液为 A相， 色语纯乙腈为 B相， 流速： 2000 ml/min, 梯度： 30% B— 60% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 40. lg 。

纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 40.1g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超 过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 50 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.2%的活性药物利拉鲁肽 34.0g, 纯化总收率为 62.9%。

以上对本发明所提供的纯化固相合成利拉鲁肽 粗肽的方法进行了详 上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方 法及其核心思想。 应当指 出， 对于本技术领域技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可 以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和 修饰也落入本发明权利要求 的保护范围内。

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