Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen Kontrolle mindestens einer spezifischen Eigenschaft mindestens einer Stammzelle, insbesondere ein Verfahren zur Qualitätskontrolle für die Pluripotenz von pluripotenten Stammzellen (PSCs).

Stand der Technik

Pluripotente Stammzellen (PSCs) lassen sich in alle Zellen des menschlichen Körpers differenzieren. Dabei unterscheidet man embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die durch die Überexpression bestimmter Transkriptionsfaktoren aus differenzierten Zellen reprogram miert werden. Pluripotente Stammzellen werden von der pharmazeutischen Industrie für die Medikamentenentwicklung verwendet und in klinischen Studien getestet. Die Qualitätskontrolle von pluripotenten Stammzellen und die quantitative Nachverfolgung früher Differenzierungsprozesse stellt jedoch eine große Hürde dar.

Pluripotente Stammzellen zeichnen sich dadurch aus, dass sie sich in die drei embryonalen Keimblätter Endoderm, Mesoderm und Ektoderm differenzieren können. Um die Pluripotenz zu bestätigen, werden die Zellen in der Regel entweder mit spezifischen Kulturmedien auf diese Linien ausgerichtet oder mit ungerichteten Multilineage-Differenzierungstests in Embryoidkörpern (EBs) oder Teratomen verifiziert (International Stem Cell, 2018). Markergene können dann hinsichtlich ihrer Genexpression oder auf Proteinebene ausgewertet werden (Gifford et al., 2013; O'Shea et al., 2020). Das sogenannte „ScoreCard-Panel“, das auf quantitativen Reverse-Transkriptions-PCR-Messungen (RT-qPCR) von 96 Genen basiert, kann zur Bestimmung der frühen keimschichtspezifischen Differenzierung verwendet werden (Bock et al., 2011 ; Tsankov et al., 2015). Pluripotenz kann auch auf der Grundlage von Genexpressionsprofilen durch den sogenannten „PluriTest™“, d.h. eine bioinformatische Analyse von Transkriptomen undifferenzierter Zellen, vorhergesagt werden (Muller et al., 2011 ). Sie spiegelt die transkriptomischen Merkmale von PSCs wider, sagt aber nichts über die Fähigkeit zur Differenzierung in bestimmte Keimschichten aus (Bouma et al., 2017).

DNA-Methylierung (DNAm) spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Differenzierung und manifestiert sich während der Embryonalentwicklung (Bock et al., 2011 ). Sie tritt insbesondere an Cytosin-Guanin-Dinukleotiden (CpG- Stellen) auf, wobei diese epigenetischen Modifikationen zelltypspezifisch sein können (Roadmap Epigenomics et al., 2015). Da jede Zelle zwei DNA-Kopien besitzt, eignet sich DNAm gut für die Anwendung von Entfaltungsalgorithmen zur Schätzung der Zusammensetzung verschiedener Zelltypen. Dieser Ansatz wurde bereits für den sogenannten „Epi-Pluri-Score“ genutzt, eine Signatur, mit der pluripotente und nicht-pluripotente Zellen anhand von DNAm- Veränderungen an drei spezifischen CpG-Stellen unterschieden werden können (Lenz et al., 2015). Allerdings wurde diese Signatur nur aufgrund von somatischen Zellen und reprogram mierten iPSC ausgewählt und kann somit keine frühen Differenzierungsveränderungen und keimblatt-spezifischen Veränderungen nachweisen.

Das Differenzierungspotenzial in verschiedenste Zelltypen gilt als essenzielles Qualitätsmerkmal von iPSCs und wird häufig mit aufwendigen und ethisch fragwürdigen Teratom-Assays im Mausmodell überprüft. Immunphänotypische und auf Genexpression basierende Verfahren lassen sich hingegen schwer quantifizieren und standardisieren. Ein quantitativer, robuster und skalierbarer Test, mit dem die Keimschicht-assoziierten Zellfraktionen in der frühen Differenzierung abgeschätzt werden können, ist noch nicht verfügbar. Aktuelle Methoden zum Nachweis der Pluripotenz von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen sind häufig nicht standardisierbar, zeitintensiv, und/oder mit relativ hohen Kosten verbunden. Für die pharmazeutische Industrie, die iPSCs für die Herstellung therapeutischer Produkte verwendet oder als Zelltherapeutikum in klinischen Studien testen lässt, ist eine robuste und schnelle Qualitätskontrolle des Ausgangsmatenals unabdingbar. Zurzeit können diese Kriterien jedoch von keinem kommerziellen Verfahren in vollem Umfang erfüllt werden.

Beschreibung der Erfindung

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das eine standardisierbare, skalierbare, robuste und schnelle Qualitätskontrolle von Stammzellen ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:

- Isolieren mindestens eines Nukleinsäuremoleküls der Stammzelle;

- Bestimmen des jeweiligen Methylierungsgrads von mindestens einer spezifischen Region des Nukleinsäuremoleküls, wobei die spezifische Region mindestens ein CpG-Dinukleotid umfasst;

- Ermitteln mindestens eines Kontrollwerts aus dem bestimmten Methylierungsgrad; und

- Vergleichen des Kontrollwerts mit mindestens einem Referenzwert, wobei das Ergebnis des Vergleichs die spezifische Eigenschaft der Stammzelle unmittelbar anzeigt.

Im Unterschied zu den bekannten bzw. kommerziell-erhältlichen Verfahren, beruht die erfindungsgemäße Lösung auf der epigenetischen Analyse genomischer DNA. DNA-Methylierung (DNAm) weist im Vergleich zur Genexpression eine wesentlich geringere Variabilität auf, wodurch sich die erhaltenen Ergebnisse gut standardisieren und vergleichen lassen. Das vorteilhafte erfindungsgemäße Verfahren basiert also auf epigenetischen Eigenschaften der DNA und ist somit auch retrospektiv für bereits isolierte Proben geeignet. Da DNA relativ stabil ist, können die Proben für die Untersuchungen problemlos bei Raumtemperatur versendet und im Hoch-Durchsatzverfahren gemessen werden. Zudem besteht neben der qualitativen Pluripotenzanalyse auch die Möglichkeit, dass das erfindungsgemäße Verfahren einem Anwender ermöglicht, das Differenzierungspotential der Zellen abzuschätzen. Dies ist insbesondere für die Entwicklung von optimierten industriell-verwendbaren iPS- Zelllinien von besonderem Interesse. In Verbindung mit der Differenzierung der iPSCs liefert das erfindungsgemäße Verfahren dem Anwender zusätzlich Informationen über die Differenzierbarkeit der analysierten Stammzellen in die drei Keimblätter, was als wesentliches Qualitätsmerkmal für pluripotente Stammzellen gilt. Diese Informationen können mittels Pyroseqenzierung, oder vergleichbaren Methoden für die gezielte DNA-Methylierungsmessung, bereits nach wenigen Tagen Kultivierung verlässlich generiert werden. Im Gegensatz zu Teratom-Assays sind dazu vorteilhafterweise keine Tierversuche notwendig.

Im Gegensatz zu den bereits bekannten epigenetischen Signaturen (z.B. „Epi- Pluri-Score“), die durch den Vergleich von pluripotenten Zellen mit somatischen Zellen etabliert wurden, sind die erfindungsgemäßen Signaturen anhand von frühen Differenzierungsstadien während der Entwicklung in Endo-, Meso- und Ektoderm ausgewählt worden. Zusätzlich zu den eigens generierten Datensätzen, wurden öffentlich zugängliche Methylierungsdaten von iPSCs, embryonalen Stammzellen (ESCs) und terminal differenzierten Zellen verwendet, um spezifische CG-Dinukleotide (CpG-Sites) zu identifizieren, an denen während der Differenzierungsprozesse in die jeweiligen Keimblätter spezifische Veränderungen in der DNA-Methylierung auftraten. Den vier Kategorien pluripotente Stammzellen (PSCs), Endoderm (ENDO), Mesoderm (MESO) und Ectoderm (ECTO) konnten jeweils drei spezifische CpGs zugeordnet werden, die deutliche Unterschiede in den DNAm-Graden (Grade der DNA-Methylierung), im Vergleich zu iPSC Referenzwerten, aufweisen. Da die epigenetischen Signaturen von Endoderm und Mesoderm zu Beginn der Entwicklung nur schwer zu trennen sind, wurde zusätzlich die Kategorie Endomesoderm (ENDOMESO) eingeführt. Für die Wahl der CpG-Sites für PSCs wurden Methylierungswerte von differenzierten und undifferenzierten Zellen von drei eigens reprogrammierten iPSC-Klonen verwendet und die Unterschiede in der DNA-Methylierung analysiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert also auf der Methylierung von mindestens einem CpG-Dinukleotid, das frühzeitige und charakteristische Änderungen im Rahmen der Differenzierung in Endoderm, Mesoderm und Ektoderm aufweist. Dabei ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren sowohl (1 ) die Bestimmung eines ersten Kontrollwerts, der auf dem Methylierungsgrad (DNAm-Grad) von mindestens einem CpG, vorzugsweise mindestens zwei oder drei CpGs, basiert und eine zuverlässig Unterscheidung zwischen pluripotenten und somatischen Zellen ermöglicht („Pluripotenz-Score“), als auch (2) die Bestimmung eines zweiten Kontrollwerts, der auf dem Methylierungsgrad (DNAm-Grad) von jeweils mindestens einem CpG, vorzugsweise jeweils mindestens drei CpGs, pro Keimblatt basiert und eine zuverlässige Validierung der Differenzierung in jedes der drei Keimblätter ermöglicht („Differenzierungs- Score“). Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit in vorteilhafter Weise beispielsweise zur Qualitätskontrolle für die Pluripotenz von (humanen) induzierten pluripotenten Stammzellen durch die Analyse der Methylierung an drei spezifischen CG-Dinukleotiden eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich aber auch auf embryonale Stammzellen angewandt werden. Darüber hinaus kann die Differenzierbarkeit von Stammzellen in die drei Keimblätter (Endo-, Meso- und Ektoderm) bereits in frühen Phasen einer Differenzierung abgeschätzt werden. Die erfindungsgemäße Lösung ermöglicht somit beispielsweise sowohl eine Validierung der Pluripotenz von reprogrammierten Zellen als auch die Validierung der Differenzierung bzw. Differenzierbarkeit in alle drei Linien und der Zusammensetzung der Keimblätter in frühen Zellaggregaten, insbesondere sogenannten Embryoid Bodies (EBs). Das erfindungsgemäße Verfahren kann folglich zur effizienten, zuverlässigen, sensitiven, standardisierbaren, skalierbaren, robusten und schnellen qualitativen Kontrolle von pluripotenten Stammzellen und daraus abgeleiteten Zellprodukten verwendet werden, um Kosten in Forschung und Entwicklung sowie industrieller Herstellung zu senken und den technologischen Fortschritt zu beschleunigen. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde bisher erfolgreich an öffentlichen Datensätzen sowie an einer Auswahl eigener Zellpräparate getestet.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die spezifische Eigenschaft das pluripotente Differenzierungspotenzial der Stammzelle umfasst. Zur qualitativen Kontrolle dieser spezifischen Eigenschaft kann der Kontrollwert beispielsweise aus der Summe mehrerer bestimmter Methylierungsgrade ermittelt werden. In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist bei dieser Ausführungsform vorgesehen, dass das CpG-Dinukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den CpG-Dinukleotiden cg00661673, cg00933813 und cg21699252. Die Bestimmung der Methylierung eines oder mehrerer dieser CpGs ermöglicht in vorteilhafter Weise eine zuverlässige Unterscheidung zwischen pluripotenten und somatischen Zellen und somit die qualitative Kontrolle des pluripotenten Differenzierungspotenzials einer Stammzelle („Pluripotenz-Score“).

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist ferner vorgesehen, dass die spezifische Eigenschaft die keimblatt-spezifische Differenzierung der Stammzelle umfasst. Zur qualitativen Kontrolle dieser spezifischen Eigenschaft kann der Kontrollwert beispielsweise aus der Summe der bestimmten Methylierungsgrade abzüglich der entsprechenden gemittelten Methylierungsgrade undifferenzierter Stammzellen ermittelt werden, wobei die Werte der bestimmten Methylierungsgrade im Fall von hypomethylierten CpG- Dinukleotiden invers berücksichtigt werden.

In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist bei dieser Ausführungsform vorgesehen, dass das CpG-Dinukleotid zur Bestimmung der Differenzierung in Richtung der unterschiedlichen Keimblätter jeweils zumindest eines der folgenden CpG-Dinukleotide umfasst:

- Endoderm: cg20548013, cg14521421 und cg08913523;

- Mesoderm: cg14708360, cg08826152 und cg11599718;

- Ektoderm: cg01907071 , cg18118164 und cg13075942;

- Endoderm/Mesoderm: cg23385847, cg24919344 und cg11147278.

Die Bestimmung der Methylierung jeweils eines oder mehrerer dieser CpGs pro Keimblatt ermöglicht in vorteilhafter Weise eine zuverlässige Validierung der Differenzierung einer Stammzelle in jedes der drei Keimblätter und somit die qualitative Kontrolle der Differenzierbarkeit von Stammzellen in die drei Keimblätter (Endo-, Meso- und Ektoderm) bereits in frühen Phasen einer Differenzierung („Differenzierungs-Score“). In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist auch vorgesehen, dass die Stammzellen pluripotente Stammzellen (PSCs), induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), embryonale Stammzellen (ESCs) und/oder direkt reprogram mierte Zellen, die durch direkte Konversion in andere Zelltypen abgeleitet wurden, sind.

Die Aufgabe wird ferner durch die Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, welches zumindest eines der CpG-Dinukleotide cg00661673, cg00933813 und cg21699252 umfasst, zur Bestimmung des pluripotenten Differenzierungspotenzials mindestens einer Stammzelle gelöst.

Die Aufgabe wird darüber hinaus auch durch die Verwendung mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, welches zumindest ein CpG-Dinukleotid umfasst, zur Bestimmung der keimblatt-spezifischen Differenzierung mindestens einer Stammzelle gelöst, wobei das CpG-Dinukleotid zur Bestimmung der Differenzierung in Richtung eines der unterschiedlichen Keimblätter aus einer der folgenden Gruppen ausgewählt ist:

- Endoderm: cg20548013, cg14521421 und cg08913523;

- Mesoderm: cg14708360, cg08826152 und cg11599718;

- Ektoderm: cg01907071 , cg18118164 und cg13075942;

- Endoderm/Mesoderm: cg23385847, cg24919344 und cg11147278.

Die Identifizierungsnummer “cg...” bezieht sich im Sinne der Erfindung auf die Position des jeweiligen CpG-Dinukleotids auf dem „Illumina HumanMethylation450 BeadChip“ bzw. dem „Illumina EPIC BeadChip“.

Die Analyse der DNA-Methylierung (DNAm) kann beispielsweise mittels Pyrosequenzierung oder MassArray kostengünstig und im Hoch- Durchsatzverfahren für die spezifischen Regionen (z.B. DNA-Bereiche) erfolgen. Alternativ sind auch weitergehende Untersuchungstechniken wie Sequenzierungs- und Microarray-basierte Verfahren möglich.

Die Erfindung betrifft ferner beispielsweise ein Kit mit einer Zusammenstellung geeigneter Referenz-DNAs, Primer Sets, sowie optional Anleitungen und Auswertesoftware. Die Aufgabe wird also auch durch Kit gelöst, insbesondere ein Kit zur Bestimmung des pluripotenten Differenzierungspotenzials mindestens einer Stammzelle und/oder zur Bestimmung der keimblatt-spezifischen Differenzierung mindestens einer Stammzelle, vorzugsweise zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, das mindestens einen Oligonukleotid-Primer (vorzugsweise Oligonukleotid-Primer-Paar, z.B. ein „Primer Set“, siehe unten Tabellen S3 und S4) zur Amplifizierung und/oder Sequenzierung zumindest von mindestens einem CpG-Dinukleotid mindestens einer Nukleotid-Sequenz, die mindestens eine spezifische Region im Sinne der Erfindung umfasst, und mindestens eine Referenz-Nukleinsäure umfasst. Das erfindungsgemäße Kit kann beispielsweise mindestens ein erfindungsgemäßes künstliches Nukleinsäure-Molekül und optional mindestens eine Pufferlösung und/oder mindestens ein Reagenz zur Durchführung mindestens eines Verfahrens, das aus der Gruppe bestehend aus DNA-Amplifikation, Bisulfit-Behandlung von DNA, DNA-Sequenzierung, vorzugsweise Pyrosequenzierung von DNA, MassArray- Analyse, „Deep Sequencing“ von Bisulfit-convertierter DNA, Durchflusszytometrie basierte Bead-assays und SNP-Genotypisierung ausgewählt ist, umfassen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht das Abdecken der folgenden Parameter für die Qualitätskontrolle von iPSCs:

1 ) Die Validierung der Reprogrammierung von somatischen Zellen in pluripotente Stammzellen,

2) eine Abschätzung der Differenzierungskapazität von Stammzellen,

3) die Detektion von ungewollten differenzierten Zellen, während die iPSCs unter pluripotenten Kulturbedingungen kultiviert werden, und

4) der Nachweis der Differenzierungsprozesse in Endoderm, Mesoderm und Ektoderm.

Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Abbildungen bzw. Figuren, Tabellen und Beispiele beispielhaft näher erläutert.

Kurze Beschreibung der Abbildungen Abbildung 1 : Keimschicht-spezifische DNA-Methylierung während der 2D- iPSC-Differenzierung.

(A) Multidimensionale Skalierung (MDS) der Top 10.000 variabelsten CpGs aus eigenen (Datensatz 1 ) und öffentlichen DNAm-Profilen (Datensatz 2) (Daily et al., 2017). Grau dargestellt sind PSC-Linien aus Datensatz 2 ohne entsprechende differenzierte Proben. Die Namen von drei PSC-Ausreißerproben sind abgebildet.

(B) Streudiagramme der mittleren Beta-Werte (DNAm-Grade) an einzelnen CpG- Stellen für paarweise Vergleiche. Hervorgehoben sind CpGs mit einer mittleren Differenz von > 0,2 in den Beta-Werten und farbig, wenn ihre angepassten p- Werte < 0,05 sind.

(C) Ein direkter Vergleich der DNAm-Profile von Endoderm und Mesoderm zeigt, dass es nur geringe Unterschiede zwischen diesen differenzierten Zelltypen in Datensatz 2 gibt.

(D) Hauptkomponentenanalyse (PCA) der RNA-seq-Profile von Proben aus eigenen (Datensatz 1 ) und öffentlichen Daten (Datensatz 2) (Daily et al., 2017). Die Namen von drei PSC-Ausreißerproben sind abgebildet.

(E) Genexpression der kanonischen Keimschicht-Markergene (zehn für jede Linie) in Proben aus eigenen (Datensatz 1 ) und öffentlichen Datensätzen (Datensatz 2). Die Heatmap zeigt den Z-Wert („Z-Score“) der vst-transformierten Lesezahlen.

Abbildung 2: Ableitung eines neuen Pluripotenz-Scores auf der Grundlage der DNAm von drei CpGs.

(A) Die DNAm-Profile von pluripotenten Stammzellen (PSC) wurden mit allen anderen differenzierten Zelltypen (Endoderm, Mesoderm und Ektoderm) verglichen, um drei CpG-Kandidaten zu identifizieren. Die Differenz der mittleren Beta-Werte (DNAm-Grade) wird gegen die kombinierte Varianz innerhalb der Gruppen aufgetragen. Die Parabel ist Teil des Auswahlprozesses (mittlerer Parabelparameter beispielhaft dargestellt).

(B) DNAm-Grade der drei Kandidaten-CpGs und der Pluripotenz-Score der verbleibenden Proben aus Datensatz 2.

(C) DNAm-Grade an den drei Kandidaten-CpGs und der Pluripotenz-Score in verschiedenen iPSC-abgeleiteten Zelltypen (Datensatz 3; ergänzende Tabelle S1 ).

(D) DNAm-Grade an den drei Kandidaten-CpGs und der Pluripotenz-Score für eine Sammlung verschiedener somatischer Zelltypen (Datensatz 4; ergänzende Tabelle S1 )(Schmidt et al., 2020).

(E) DNAm-Grade an den drei Kandidaten-CpGs und der Pluripotenz-Score für iPSC-Proben (GSE59091 ) (Butcher et al., 2016), die in hohe Differenzierungskapazität (HDC) und niedrige Differenzierungskapazität (LDC) in Richtung Endoderm gruppiert wurden. Die primären Spenderproben (Fibroblasten und endotheliale Vorläufer) sind zum Vergleich dargestellt. Die P- Werte wurden mit dem Wilcoxon-Test berechnet (** p < 0,01 ).

Abbildung 3: Auswahl der keimschichtspezifischen CpG-Stellen.

(A) Auswahl der Kandidaten-CpGs für Endoderm (ENDO), Mesoderm (MESO), Ektoderm (ECTO) und Endomesoderm (ENDOMESO) im Auswahlsatz. Der mittlere Parabelparameter ist beispielhaft dargestellt und die ausgewählten Kandidaten-CpGs sind angegeben.

(B) Die Heatmap zeigt die Differenzierungs-Werte („Differenzierungs-Scores“) der CpG-Stellen für die verbleibenden Proben aus Datensatz 2. Die Werte („Scores“) sind die Summe der Differenzen der DNAm-Grade zu den Referenz- Stammzellen (für hypomethylierte CpGs wurde 1 - DNAm berechnet); weiß bedeutet keine Veränderung im Vergleich zu Stammzellen, rot bedeutet eine Veränderung in Richtung spezifischer Methylierung und blau umgekehrt.

(C) Ergebnisse der Dekonvulation (entweder mit ENDO und MESO in der oberen Reihe oder mit ENDOMESO in der unteren Reihe), basierend auf einem Ansatz der nicht-negativen kleinsten Quadrate.

(D) Differenzierungsscores für iPSC-abgeleitete Zellen, die in verschiedene Zelltypen differenziert wurden (Datensatz 3; ergänzende Tabelle S1 ; formatiert analog zu (B)).

(E) Ergebnisse der Dekonvulation für Datensatz 3 (Formatierung analog zu (C)).

Abbildung 4: Pluripotenz- und Differenzierungswerte in Embryoidkörpern.

(A) Pluripotenz-Score der EBs vor (Tag 0), nach 4 Tagen, nach 7 Tagen und nach 17 Tagen der Differenzierung.

(B) Differenzierungswerte für dieselben Proben zeigen, dass die meisten, aber nicht alle CpGs linienspezifische DNAm-Veränderungen aufweisen. Die Scores sind die Summe der Unterschiede der DNAm-Grade zu den Referenzstammzellen (für hypomethylierte CpGs wurde 1 - DNAm berechnet).

(C) Ergebnisse der Dekonvulation mit ENDO- und MESO-CpGs (in der oberen Reihe) oder mit ENDOMESO-CpGs (in der unteren Reihe).

(D) Differenzierungsergebnisse und Dekonvolutionsergebnisse für EBs nach 17 Tagen Kultur (Daily et al., 2017). Die Proben sind nach dem Anteil des Ektoderms in den Dekonvolutionsergebnissen geordnet.

(E) Die Heatmap zeigt die Z-Scores der Genexpressionssignaturen für Endoderm (279 Gene), Mesoderm (425 Gene) und Ektoderm (516 Gene) in den entsprechenden EBs. Diese Signaturen wurden aus einem öffentlichen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatensatz für D8-EBs abgeleitet (Han et al., 2018). Insgesamt zeigten EBs mit ektodermaler Ausrichtung in unseren epigenetischen Scores auch eine höhere Expression ektodermaler Genexpression.

Abbildung 5: Gezielte Assays ausgewählter CpGs, gemessen mit Pyrosequenzierung.

(A) Mit Pyrosequenzierung gemessene Pluripotenz-Scores der Proben. Die Methylierungswerte der drei CpGs sind auch einzeln dargestellt. Hier werden iPSCs mit gerichteter Differenzierung in Richtung Endoderm (ENDO), Mesoderm (MESO) und Ektoderm (ECTO) sowie EBs vor, nach 5 Tagen und nach 15 Tagen spontaner Differenzierung in Suspensionskultur (DO, D5 bzw. D15) verwendet. Darüber hinaus wurden drei Knockout (KO)-iPSC-Linien verwendet (2 YAP ^/_ und PRDM8' ^/_ ).

(B) Differenzierungsscores für diese Proben, gemessen mit Pyrosequenzierung. Die Scores sind die Summe der Unterschiede der DNAm-Grade zu den Referenzstammzellen (für hypomethylierte CpGs wurde 1 - DNAm gerechnet). Die Ergebnisse der Dekonvolution mit ENDO und MESO oder den ENDOMESO- CpGs sind ebenfalls dargestellt.

(C) RT-qPCR-Ergebnisse der keimschichtspezifischen Gene. Die Heatmap zeigt die ddCT-Werte im Vergleich zu den Stammzellen. (D) ScoreCard-Ergebnisse. Dargestellt sind die kombinierten Genexpressions- Scores für jede Keimschicht im Vergleich zum Referenzstandard für ausgewählte iPSC-Linien.

Abbildung S1 : Dreistufige Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (in Verbindung mit Abbildung 1)

(A) Trilineage-Differenzierungsprotokolle, die für eigene iPSCs (Datensatz 1 ; STEMdiff Trilineage Differentiation Kit; Stemcell Technologies) und im öffentlichen Datensatz (Datensatz 2; GSE85828) verwendet wurden (Daily et al., 2017).

(B) Immunfluoreszenzfärbung exemplarischer differenzierter Zellen (Protokolldatensatz 1 ), gefärbt mit Antikörpern gegen OCT4 (Stammzellen), GATA6 (Endoderm), Brachyury (Mesoderm) und PAX6 (Ektoderm). Zellkernfärbung mit DAPI.

Abbildung S2: Heatmap der am stärksten differenziell methylierten CpGs (bezogen auf Abbildung 1)

Dargestellt sind die 50 signifikantesten CpGs (sortiert nach der Differenz der mittleren Beta-Werte) aus den Vergleichen von Keimschichten und pluripotenten Stammzellen. Die Heatmap enthält überlappende CpGs insbesondere für ENDO und MESO in den öffentlichen Daten (GSE85828).

Abbildung S3: Überschneidung von Änderungen der DNA-Methylierung in verschiedenen Datensätzen (in Verbindung mit Abbildung 1)

(A) Venn-Diagramme zeigen die Anzahl der signifikanten hypo- und hypermethylierten CpGs, die sich während der Differenzierung in Richtung Endoderm (ENDO), Mesoderm (MESO) und Ektoderm (ECTO) überschneiden. Diese Analyse wurde für Datensatz 1 und Datensatz 2 parallel durchgeführt. Die Überlappung zwischen den Datensätzen ist in Klammern angegeben.

(B) Um die Beziehung zwischen den DNAm-Profilen der differenzierten Proben abzuschätzen, wurde ein paarweiser Vergleich der differentiell methylierten Sonden in den Datensätzen 1 und 2 durchgeführt (für hypo- und hypermethylierte Stellen, getrennt). Das Chancenverhältnis („Odds Ratio“) des Fisher-Exact-Tests gibt die Wahrscheinlichkeit an, die gemeinsamen differentiell methylierten CpGs zu erhalten, wenn man die Gesamtprobengröße (alle CpGs) berücksichtigt. Das hohe Chancenverhältnis zwischen ENDO und MESO aus Datensatz 2 deutet darauf hin, dass sich die Änderungen der DNA- Methylierung in diesen Proben stark überschneiden.

Abbildung S4: Unterschiedlich exprimierte Gene zwischen den Keimschichten (bezogen auf Abbildung 1)

(A) Venn-Diagramme zeigen die Anzahl der signifikanten Veränderungen der Genexpression während der Differenzierung in Endoderm, Mesoderm und Ektoderm. Diese Analyse wurde für Datensatz 1 und Datensatz 2 getrennt durchgeführt. Die Überschneidung zwischen den Datensätzen ist in Klammem angegeben.

(B) Integrative Analyse der Veränderungen von DNA-Methylierung und Genexpression. Es werden nur CpGs in Promotorregionen (TSS1500, TSS200) berücksichtigt. Jeder Punkt steht für ein Gen-CpG-Paar (sowohl Gene als auch CpGs können dupliziert sein). Farbige Punkte zeigen Paare mit einem signifikanten Unterschied in der DNAm und den Veränderungen der Genexpression während der Differenzierung.

C) Heatmap des paarweisen Chancenverhältnisses („Odds Ratio“) zwischen Genen mit unterschiedlicher Expression in den verschiedenen Differenzierungsmodalitäten (Fisher-Exact-Test). In Datensatz 2 überschneiden sich die Veränderungen der Genexpression während der endodermalen und mesodermalen Differenzierung erheblich.

Abbildung S5: Vergleich verschiedener Signaturen für Pluripotenz (in Verbindung mit Abbildung 2)

(A) Die PluriTest-Analyse wurde mit dem Online-Tool PluriTest (https://www.pluritest.org/) durchgeführt. RNA-seq FASTAQ-Dateien wurden zur Vorverarbeitung, zum Alignment und zur automatischen Analyse unter Verwendung des proprietären Algorithmus auf die Website hochgeladen. Die Ergebnisse zeigten, dass die meisten Stammzellen, Mesoderm- und Endoderm- Proben einen ähnlichen Pluripotenz-Score aufwiesen. PluriTest war nicht in der Lage, zwischen ihnen zu unterscheiden und die Vorhersagen stimmten nicht mit der pluripotenten Wolke der empirischen Dichtekarte überein. Darüber hinaus hatten zwei von drei iPSC-Linien aus Datensatz 1 und die Ausreißer-Zelllinie SC12-040 Scores, die als fehlgeschlagen angezeigt wurden.

(B) Die Epi-Pluri-Score-Analyse basiert auf DNAm an drei spezifischen CpGs. Eines dieser CpGs war innerhalb des Pluripotenz-assoziierten Gens POU5F1 (auch bekannt als OCT4) lokalisiert. Außerdem wurde der Unterschied in den DNAm-Graden der CpGs in ANKRD46 und C14orf115 bestimmt und als Epi- Pluri-Score zusammengefasst (Lenz et al., 2015). Die Punkte im Hintergrund beziehen sich auf DNAm-Profile (alle Illumina HumanMethylation27 BeadChip- Plattform) von 264 pluripotenten bzw. 1.951 nicht-pluripotenten Zellpräparationen (Lenz et al., 2015). Insbesondere Epi-Pluri-Score stufte alle Zellpräparate als pluripotent ein, während frühe Differenzierungsereignisse durch einen Anstieg der DNAm in POU5F1 verfolgt werden können. Für die drei iPSC-Proben, die zuvor als Ausreißer identifiziert wurden, sind die Proben-IDs erneut hervorgehoben (GSM2285159, Datensatz 2). Insbesondere die Probe SC12-040 wurde eindeutig als nicht-pluripotent eingestuft, und diese Probe fiel auch in den MDS- und PCA-Plots (Abbildung 1A, C) aus dem Rahmen und wies offenbar auch einen aberranten Karyotyp auf (Salomonis et al., 2016).

(C) Die DNA-Methylierungsgrade werden für die undifferenzierten und differenzierten Zellen des Auswahlsatzes für die drei CpGs angegeben, die für den Pluripotenz-Score ausgewählt wurden. Jedes der CpGs konnte pluripotente und nicht-pluripotente Zellen unterscheiden. Durch die Integration der drei Werte in den Pluripotenz-Score wurde der Unterschied zwischen PSC und differenzierten Zellen noch deutlicher.

Abbildung S6: Identifizierung von Gensignaturen für Keimschichten in EBs (in Verbindung mit Abbildung 4)

(A) Um Marker-Gene für die endodermale, mesodermale und ektodermale Differenzierung in der spontanen Differenzierung zu identifizieren, wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten von EBs am achten Tag der spontanen Differenzierung verwendet (Han et al., 2018). Die UMAP-Darstellung (Uniform Manifold Approximation and Projection) der Daten zeigte, dass die Zellen in drei verschiedene Cluster unterteilt werden konnten.

(B) Die UMAP-Darstellung der normalisierten Expressionsniveaus für Endoderm-Marker (GATA6, AFP), Mesoderm-Marker (HAND1 , SNAI1 ) und Ektoderm-Marker (PAX6, OTX2) zeigt, dass diese Cluster tatsächlich mit den jeweiligen Keimschichten assoziiert waren. Die gleichen Ergebnisse wurden auch bei der Gen-Ontologie-Analyse beobachtet (nicht dargestellt). Für jeden dieser Cluster wurden anschließend Gene ausgewählt, die signifikant stärker exprimiert werden als in den anderen Clustern: für das Endoderm 279 Gene, das Mesoderm 425 Gene und das Ektoderm 516 Gene (ergänzende Tabelle S2).

Abbildung S7: Pyrosequenzierungstests für erfindungsgemäße CpGs (bezogen auf Abbildung 5)

(A) Vergleich von DNAm-Graden, die mit Pyrosequenzierung und der Illumina EPIC BeadChip-Technologie gemessen wurden.

(B) Referenzwerte auf der Grundlage der Pyrosequenzierung für die Deconvolution der Keimschichten. Dargestellt sind die Mittelwerte der drei Zelllinien aus der gerichteten 2D-Differenzierung.

Beschreibung beispielhafter und vorteilhafter Ausführunqsformen der Erfindung

Die Erfindung betrifft unter anderem die Qualitätskontrolle von induzierten pluripotenten Stammzellen. Für die Validierung des pluripotenten Zustands ist es dabei von entscheidender Bedeutung, das Potenzial zur dreigliedrigen Differenzierung in Richtung Endoderm, Mesoderm und Ektoderm zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß eine Kombination aus ortsspezifischen DNA-Methylierungs-(DNAm)-Tests eingesetzt, die als Biomarker für die frühe Keimschichtspezifikation dienen. CG-Dinukleotide (CpGs) wurden mit charakteristischer DNAm im pluripotenten Zustand und nach der Differenzierung in Endoderm, Mesoderm und Ektoderm identifiziert. Auf dieser Grundlage wurde ein „Pluripotenz-Score“ abgeleitet, der auf die Differenzierungsfähigkeit hinweist, sowie linienspezifische „Differenzierungs-Scores“, um beispielsweise entweder eine gerichtete Differenzierung oder eine selbstorganisierte multilineare Differenzierung in Embryoidkörpern zu überwachen. Darüber hinaus wurden Pyrosequenzierungstests für eine schnelle und kostengünstige Analyse entwickelt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit in vorteilhafter Weise für die Qualitätskontrolle pluripotenter Zellen und zur Abschätzung der linienspezifischen Bindung während der ersten Differenzierungsereignisse verwendet werden.

Es wurden daher charakteristische DNAm-Signaturen für jede der drei Keimschichten identifiziert, d.h. es wurden drei CpGs mit charakteristischer DNAm für undifferenzierte pluripotente Zellen, Endoderm, Mesoderm, Ektoderm und Endomesoderm auswählt. Auf dieser Grundlage wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt: ein Instrument, das aus einem „Pluripotenz-Score“, der auf das Differenzierungspotenzial hinweisen kann, und stammbaumspezifischen Signaturen besteht, um die Anteile früher Zellschicksalsentscheidungen in Differenzierungsversuchen abzuschätzen.

Veränderungen der DNA-Methylierung während der gerichteten Keimschichtspezifikation

Es wurden drei Linien von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Richtung Endoderm, Mesoderm und Ektoderm differenziert, um ihre DNAm- Profile mit den Infinium-EPIC-BeadChips zu analysieren (ergänzende Abb. S1 ; Datensatz 1 ). Darüber hinaus wurden 114 DNAm-Profile von iPSCs und embryonalen Stammzellen (ESCs) verwendet, die mit unterschiedlichen Protokollen differenziert wurden (Datensatz 2; 450K BeadChip-Plattform, ergänzende Tabelle S1 ) (Daily et al., 2017). Die multidimensionale Skalierung (MDS) zeigte, dass iPSCs, die sich in Richtung Ektoderm ausdifferenziert hatten, sich in Clustern separierten, während Zellen, die sich in Richtung Endoderm und Mesoderm ausdifferenziert hatten, scheinbar enger verbunden waren (Abb. 1A). Die linienspezifischen DNAm-Veränderungen wurden zunächst für beide Datensätze getrennt analysiert (für Datensatz 2 nur PSCs mit entsprechenden Daten für die Keimschichtdifferenzierung) (Daily et al., 2017). Viele CpGs zeigten eine signifikante Hyper- oder Hypomethylierung während der Differenzierung in Richtung Endoderm, Mesoderm oder Ektoderm (Abb. 1 B, DNAm-Differenz > 20 %, angepasste p-Werte < 0,05; ergänzende Abb. S2). Bemerkenswert ist, dass Datensatz 2 eine sehr hohe Überlappung von DNAm-Veränderungen in Richtung Mesoderm und Endoderm zeigte (ergänzende Abb. S3). Ein direkter Vergleich der DNAm-Profile von Endoderm und Mesoderm bestätigte, dass ihre epigenetischen Veränderungen in Datensatz 2 sehr ähnlich waren (Abb. 1 C). Entsprechende RNA-Sequenzierungsdaten ergaben insgesamt konsistente Veränderungen der Genexpression während der Differenzierung der drei Entwicklungsstadien (Abb. 1 D). Viele Gene werden während der Differenzierung zum Endoderm, Mesoderm und Ektoderm signifikant hoch- oder herunterreguliert (> 2-fach; angepasster p-Wert < 0,05; ergänzende Abb. S4A). In der Tendenz zeigten Gene mit Hypomethylierung in Promotorregionen eine hochregulierte Genexpression und umgekehrt (ergänzende Abb. S4B). In Analogie zu den DNAm-Daten gab es in Datensatz 2 eine starke Überlappung der differentiellen Genexpression während der Differenzierung zum Endoderm und Mesoderm (ergänzende Abb. S4C). Kanonische Marker für die mesodermale Differenzierung waren in Datensatz 1 besonders hochreguliert (Abb. 1 E). Diese Ergebnisse zeigen, dass je nach Differenzierungsschema die Unterschiede zwischen Endoderm und Mesoderm nur marginal sind, was bei der Identifizierung keimschichtspezifischer Signaturen berücksichtigt werden muss.

Entwicklung einer epigenetischen Signatur für den pluripotenten Zustand

Die etablierten Qualitätskontrollmaßnahmen für pluripotente Zellen sollten in der Lage sein, frühe Differenzierungsereignisse zu erkennen. Die zuvor beschriebenen Verfahren PluriTest (Muller et al., 2011 ) und Epi-Pluri-Score (Lenz et al., 2015) wurden jedoch speziell zur Unterscheidung von pluripotenten und somatischen Zelltypen entwickelt, während unklar blieb, ob diese Tests auch die transkriptomischen/epigenetischen Veränderungen während der frühen Differenzierung zu den drei Keimblättern zuverlässig erfassen würden. Daher wurde die PluriTest-Analyse auf die RNA-seq-Profile der Datensätze 1 und 2 angewendet (ergänzende Abb. S5A). Bemerkenswert ist, dass die PluriTest- Ergebnisse aller Proben - sogar der pluripotenten iPSC und ESCs - nicht mit den pluripotenten Proben der Referenzkohorte übereinstimmten, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass der Test ursprünglich für eine Microarray- Plattform entwickelt wurde, die inzwischen nicht mehr verwendet wird. Darüber hinaus wiesen die differenzierten Endoderm- und Mesoderm-Zellen ähnliche PluriTest-Ergebnisse auf wie die nicht differenzierten pluripotenten Zellen. Analog dazu stufte Epi-Pluri-Score die DNAm-Profile aller Proben als pluripotent ein, selbst derjenigen, die für einige Tage in Richtung Endoderm, Mesoderm und Ektoderm differenziert waren (ergänzende Abb. S5B). Zusammengenommen konnten PluriTest und Epi-Pluri-Score frühe Differenzierungsereignisse nicht zuverlässig erfassen.

Für die Entwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde daher ein neuer Pluripotenz-Score erstellt, der auf den frühen DNAm-Veränderungen während der Differenzierung zum Endoderm, Mesoderm und Ektoderm basiert. Relevante CpGs wurden mit dem R-Paket CimpleG (Manuskript in Vorbereitung) nach hohen Unterschieden in der mittleren Methylierung und geringer Varianz innerhalb der Gruppen ausgewählt (Schmidt et al., 2020). Als Auswahlset wurden die undifferenzierten und differenzierten Proben der drei iPSC-Linien aus unserem Datensatz 1 und drei zufällig ausgewählte PSC-Linien aus Datensatz 2 verwendet, um ein Gleichgewicht zwischen den Studien zu erreichen (Abb. 2A). Die drei wichtigsten Kandidaten-CpGs waren: cg00661673, assoziiert mit dem Gen Palladin (PALLD)', cg00933813, nicht assoziiert mit einem spezifischen Gen; und cg21699252, assoziiert mit MYCN Opposite Strand (MYCNOS). Die DNAm- Grade an diesen Stellen wurden zu einem Pluripotenz-Score kombiniert (Summe der DNAm-Grade und 1 - DNAm-Grad für die hypomethylierten Stellen), mit dem PSC und differenzierte Zellen im Auswahlsatz klar unterschieden werden konnten (ergänzende Abb. S5C). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, als die verbliebenen Proben des Datensatzes 2 für die erste Validierung verwendet wurden. Bemerkenswerterweise konnte der Pluripotenz-Score auch drei Proben unterscheiden, die bei der Analyse der Genexpressions- und DNAm-Profile Abweichungen zeigten (Abb. 2B). Darüber hinaus konnte der Pluripotenz-Score PSCs und früh differenzierte Zellen in einer völlig unabhängigen Sammlung pluripotenter und iPSC-abgeleiteter Zelltypen korrekt unterscheiden (Datensatz 3; ergänzende Tabelle S1 ; Abb. 2C). Als Nächstes wurden somatische Zellen untersucht und es stellte sich heraus, dass der Pluripotenz-Score bei primären Zelltypen durchweg sehr niedrig war (549 DNAm-Profile, zusammengestellt aus 21 Studien (Schmidt et al., 2020); Datensatz 4; Abb. 2D). Schließlich wurde der erfindungsgemäße Pluripotenz-Score mit DNAm-Profilen von PSCs verglichen, die die Kriterien für Pluripotenz erfüllten, aber entweder eine höhere Differenzierungskapazität (HDC) oder eine geringere Differenzierungskapazität in Richtung Endoderm (LDC; GSE59091 , Datensatz 5) aufwiesen (Butcher et al., 2016). Bemerkenswerterweise war der Pluripotenz-Score bei HDC signifikant höher als bei LDC pluripotenten Zellen (p-value = 0,009; Abb. 2E), was darauf hindeutet, dass die Signatur nicht nur frühe Differenzierungsschritte erkennt, sondern auch ein Qualitätsmaß für das pluripotente Differenzierungspotenzial darstellen könnte.

Auswahl von keimschichtspezifischen CpG-Stellen

Da der erfindungsgemäße Biomarker auch die spezifische Differenzierung in Richtung Endoderm, Mesoderm oder Ektoderm widerspiegeln sollte, wurden auch Kandidaten-CpGs für jede Keimschicht ausgewählt. Zu diesem Zweck wurde der gleiche Auswahlsatz wie für den Pluripotenz-Score verwendet und für jeden differenzierten Zelltyp die gleiche Auswahlmethode angewendet (Abb. 3A). Auf dieser Grundlage wurden die drei wichtigsten CpGs für das Endoderm (ENDO) ausgewählt: cg20548013, assoziiert mit Phosphatase und Aktinregulator

1 (PHACTR1)', cg14521421 , assoziiert mit DENN domain containing 2B (DENND2B); und cg08913523 (kein Gen); für Mesoderm (MESO) die CpGs cg14708360 (kein Gen); cg08826152, assoziiert mit Adenosinrezeptor A2B (ADORA2B); und cg11599718, assoziiert mit vacuolar protein sorting-associated protein 37B (VPS37B): für Ektoderm (ECTO) die CpGs cg01907071 , assoziiert mit dem Gen thrombospondin type 1 domain containing 4 (THSD4)', cg18118164, assoziiert mit Ephrin A5 (EFNA5)', und cg13075942, assoziiert mit RAD51 Paralog B (RAD51B). Da Endoderm und Mesoderm insbesondere in Datensatz

2 eng miteinander verwandt waren, wurden auch Kandidaten-CpGs für eine Kombination aus Endoderm und Mesoderm (ENDOMESO) ausgewählt: cg23385847, assoziiert mit dem Gen Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase IV (CAMK4)', cg24919344 (kein Gen); und cg11147278 (kein Gen).

Diese CpG-Kandidaten wurden anschließend in den übrigen Proben des Datensatzes 2 validiert. Da die CpGs eine zelltypspezifische Hypo- oder Hypermethylierung aufweisen, wurden die komplementären DNAm-Grade (1 - DNAm) für hypomethylierte Stellen verwendet, um Differenzierungswerte zu ermitteln, die mit der Differenzierung zunehmen. Diese Werte wurden als Differenz zum mittleren DNAm-Grad der undifferenzierten Proben berechnet (Abb. 3B). Alternativ wurde der Anteil der stammbaumspezifischen Differenzierung in der Zellpopulation durch Dekonvolution mit einem Ansatz der nicht-negativen kleinsten Quadrate (NNLS) geschätzt - was jedoch durch die Tatsache erschwert wird, dass nach einer frühen Keimschichtspezifikation und nicht nach einem definierten Endpunkt der Differenzierung gesucht wird, sowie durch die Diskrepanz der Ergebnisse zwischen verschiedenen Keimschichtdifferenzierungsprotokollen. Wie auch immer, der Dekonvulationsansatz klassifizierte die meisten Proben korrekt in die Kategorien PSC, ENDO, MESO, ECTO und ENDOMESO (Abb. 3C). Die drei Ausreißer- PSC-Proben konnten wiederum durch höhere Differenzierungswerte unterschieden werden. Darüber hinaus klassifizierten die individuellen DNAm- Grade sowie der Dekonvulationsansatz die meisten aus iPSC gewonnenen Zellen, die in verschiedene Zelltypen differenziert wurden, korrekt (Datensatz 3; Abb. 3D, E).

DNA-Methylierungsveränderungen in Embryoidkörpern

Um festzustellen, ob das erfindungsgemäße Verfahren auch die keimschichtspezifischen epigenetischen Veränderungen während der spontanen Differenzierung erfassen würde, wurden EBs erzeugt und DNAm-Profile vor (Tag 0), an Tag 4 und an Tag 7 nach der Aggregation analysiert (EB-Datensatz 1 ; ergänzende Tabelle S1 ). Wie erwartet, verändern sich die drei CpGs, die für den undifferenzierten Zustand spezifisch sind, bereits innerhalb von 4 Tagen nach der ungerichteten EB-Differenzierung, was sich in einem schnellen Rückgang des Pluripotenz-Scores widerspiegelt (Abb. 4A), was wiederum darauf hindeutet, dass die meisten Zellen den pluripotenten Zustand verlassen haben. Außerdem wiesen die Differenzierungs-Scores (Abb. 4B) auf eine Differenzierung in den drei Keimschichten hin. Die ENDOMESO-assoziierte CpG-Stelle cg2338547 wies in diesem Datensatz jedoch nicht die erwartete Hypermethylierung auf, was zu einer Diskrepanz in den Vorhersagen der Dekonvolution führte (Abb. 4C).

Außerdem wurden öffentliche DNAm-Profile von EBs an Tag 17 verwendet (EB- Datensatz 2; ergänzende Tabelle S1 ) (Daily et al., 2017). Die Differenzierungs- Scores und Dekonvolutionsergebnisse zeigten erneut eine Verstärkung der linienspezifischen epigenetischen Muster. Die starken Veränderungen in den MESO-CpGs dominierten die Dekonvolutionsergebnisse. Insbesondere zeigten die Ergebnisse, dass sich einige der EBs mehr in Richtung ektodermaler oder endodermaler Abstammung differenzierten (Abb. 4D). Dieser Befund könnte die unterschiedliche Tendenz der einzelnen iPSC-Linien widerspiegeln, sich bevorzugt in die eine oder andere Zelllinie zu differenzieren. Es wurden dann die verfügbaren Genexpressionsdaten der EBs vom 17. Tag verwendet (Daily et al., 2017), um festzustellen, ob sich die linienspezifische Tendenz auch im Transkriptom widerspiegelt. Zu diesem Zweck wurden zunächst Gensignaturen identifiziert, die für die verschiedenen Keimblätter während der spontanen Differenzierung charakteristisch sind. Öffentliche Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten, die von EBs am achten Tag stammen, wurden entsprechend den Keimschichten geclustert (ergänzende Abb. S6) (Han et al., 2018). Auf dieser Grundlage wurden Genlisten ausgewählt, die am deutlichsten mit dem Endoderm, Mesoderm und ektodermalen Cluster assoziiert sind (ergänzende Tabelle S2). Tatsächlich wurden die ektodermalen Signaturen in EBs, für die das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls eine ektodermale Ausrichtung vorhersagte, insgesamt stärker exprimiert (Abb. 4E).

Gezielte Assays mit Pyrosequenzierung

Anschließend wurden Pyrosequenzierungs-Assays für die gezielte Analyse der relevanten CpGs entwickelt, um das erfindungsgemäße Verfahren ohne Illumina BeadChip-Analyse anwenden zu können. Als die Proben aus der gerichteten Differenzierung erneut analysierten wurden, zeigten die DNAm-Grade nur geringe Abweichungen zwischen den Pyrosequenzierungs- und EPIC- BeadChip-Messungen (ergänzende Abb. S7A). In jedem Fall wurden die Pyrosequenzierungsergebnisse verwendet, um die Referenzmatrix für die Dekonvulation anzupassen (ergänzende Abb. S7B). Um diesen Test weiter zu überprüfen, wurden erneut EBs erzeugt und für 5 oder 15 Tage kultiviert. Es wurden auch eigene iPSC-Linien mit PRDM8-Knockout (PRDM8’ ^/_ ), die nachweislich eine geringere Neuronendifferenzierung aufweisen, verwendet (Cypris et al., 2020). Darüber hinaus wurden hauseigene iPSC-Linien mit YAP1 - Knockout (YAP ^/_ ) verwendet, die sich kaum in Richtung Ektoderm differenzierten (Zeevaert et al, Manuskript in Vorbereitung), wobei dieser Phänotyp kürzlich auch von anderen beschrieben wurde (Stronati et al., 2022). Die Pyrosequenzierungsmessungen für das erfindungsgemäße Verfahren konnten eindeutig nicht differenzierte pluripotente Zellen von entweder gerichteter Differenzierung oder EBs unterscheiden (Abb. 5A). Darüber hinaus zeigten die Differenzierungsergebnisse deutlich, dass die EBs von PRDM8 ^/_ und YAP ^/_ nicht die typische Ektoderm-assoziierte DNAm aufweisen. Die Dekonvolutionsergebnisse für diese Knockout-Linien zeigten dementsprechend geringere Anteile an Ektoderm (Abb. 5B). Um diese Ergebnisse weiter zu überprüfen, wurde ferner die Genexpression von Keimschicht-assoziierten Genen in diesen Proben mittels RT-qPCR analysiert: OCT4 für pluripotente Zellen, GATA6 für Endoderm, Brachyury für Mesoderm und PAX6 für Ektoderm (Abb. 5C). Darüber hinaus wurden ScoreCard-Tests für ausgewählte Proben durchgeführt (Abb. 5D). Insgesamt stimmten die Vorhersagen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Ergebnissen der RT-qPCR und der ScoreCard für die Knockout-Zelllinien überein.

Mögliche weitere Ausführungsformen der Erfindung

Qualitätsmessungen von iPSC-Linien können für verschiedene Ziele verwendet werden: 1 ) zur Überwachung der anfänglichen Reprogrammierung somatischer Zellen, 2) zur Bestimmung der Differenzierungsfähigkeit nicht-differenzierter Zellen und 3) zur Verfolgung der Differenzierung, um letztlich das pluripotente Differenzierungspotenzial zu validieren (Steeg et al., 2021 ).

Die anfängliche Überwachung der Reprogrammierung stützt sich häufig auf die mikroskopische Beurteilung der Koloniemorphologie oder die Hochregulierung einzelner Marker durch Immunfluoreszenz oder RT-qPCR, aber diese Ansätze sind schwer zu quantifizieren und es fehlen standardisierte Schwellenwerte. Eine umfassendere Genexpressionssignatur, wie PluriTest (Muller et al., 2011 ) kann ein robusteres Maß für eine erfolgreiche Reprogrammierung liefern. Als jedoch das Online-Tool PluriTest unter Verwendung des proprietären Algorithmus für die Vorverarbeitung von RNA-seq-Ergebnissen angewendet wurde, waren die nicht differenzierten iPSCs nicht eindeutig mit dem hervorgehobenen Bereich für Pluripotenz in der empirischen Dichtekarte assoziiert und frühe Differenzierungsereignisse wurden nicht zuverlässig erkannt. Unser zuvor beschriebener Epi-Pluri-Score kann eine gute Alternative zur Validierung der Reprogrammierung in den pluripotenten Zustand sein (Lenz et al., 2015). In der Tat konnte er SC12-040 eindeutig erkennen, von dem angenommen wurde, dass es einen problematischen Karyotyp hat und offensichtlich nicht einer normalen pluripotenten Zelllinie ähnelt. Bislang gab es jedoch keinen epigenetischen Biomarker, mit dem sich frühe keimschichtspezifische Entscheidungen über das Zellschicksal nachweisen ließen. Im Rahmen der Erfindung wird hier nun ein Verfahren beschrieben, das - im Gegensatz zu den oben genannten Ansätzen - speziell für die Erkennung früher Differenzierungsereignisse entwickelt wurde. Obwohl die Signatur nicht mit somatischen Zellen entwickelt wurde, konnte sie zuverlässig zwischen somatischen und pluripotenten Zellen unterscheiden. Bemerkenswert ist, dass der Pluripotenz-Score bei iPSCs mit hoher Differenzierungskapazität insgesamt höher war als bei Zellen mit geringer Differenzierungskapazität in Richtung Endoderm (Butcher et al., 2016), was darauf hindeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Abschätzung der Differenzierungskapazität von nicht differenzierten iPSCs verwendet werden kann. Somit könnte das erfindungsgemäße Verfahren ein Indikator für das Differenzierungspotenzial von iPSCs sein, die sich bereits unter pluripotenten Kulturbedingungen befinden. In Zukunft wird es wichtig sein, weiter zu zeigen, dass diese Signaturen Aspekte des Differenzierungspotenzials zuverlässig erfassen und Schwellenwerte besser zu definieren.

Bislang ist für die Validierung des Potenzials zur Differenzierung in drei Abstammungslinien eine vorgelagerte Differenzierung mit gerichteter oder spontaner Differenzierung für die anschließende Analyse erforderlich. Der Teratomtest ist eine Methode zur Prüfung der Pluripotenz, bei der PSCs in eine immundefiziente Maus transplantiert werden, wo sie spontan Keimzelltumore mit immunphänotypischen Merkmalen aller Keimblätter bilden (International Stern Cell, 2018). Dieser Test wirft Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes auf, die Analyse dauert mehrere Monate und ist kostspielig. Außerdem ist die Teratombildung sehr variabel und kann kaum quantifiziert werden (Dolgin, 2010; Muller et al., 2010; Tsankov et al., 2015). Der ScoreCard-Test basiert auf einem gerichteten oder spontanen Differenzierungsschema und verwendet eine relativ große Auswahl an Referenzgenen. In Analogie dazu könnte das erfindungsgemäße Verfahren frühe Abstammungsentscheidungen bei gerichteter Differenzierung verfolgen. Darüber hinaus könnte es dazu verwendet werden, die zelluläre Zusammensetzung in EBs abzuschätzen. Die vorhergesagten ektodermalen Fraktionen korrelierten mit den Genexpressionsprofilen und den Ergebnissen der Dekonvolution. Darüber hinaus konnten iPSC-Linien mit beeinträchtigter ektodermaler Differenzierung, wie PRDM8 ^/_ und YAP ^/_ , identifiziert werden. Die Handhabung und der Versand von DNA-Proben ist einfacher als der von RNA-Proben. Das erfindungsgemäße Verfahren basiert nur auf 12 CpGs (bei ENDOMESO 15 CpGs). Solche kleinen Signaturen sind ein Kompromiss, da sie anfälliger für individuelle Ausreißer sein können als Signaturen, die Hunderte von CpGs integrieren. Andererseits können solche zielgerichteten Assays kostengünstig und robust gemessen werden, unabhängig von spezifischen Microarray-Plattformen oder bioinformatischen Tools. Dies ist wichtig, wenn solche Assays für die klinische Validierung therapeutischer zellulärer Produkte eingesetzt werden sollen, was sogar eine Zulassung als In-vitro-Diagnostikum erfordern kann (Wagner, 2022).

Die Erfindung war mit verschiedenen Herausforderungen verbunden:

1 ) Die Anzahl der verfügbaren Datensätze war begrenzt;

2) Es war unerwartet, dass das gerichtete Differenzierungsschema mit verschiedenen Protokollen zu ganz unterschiedlichen DNAm- und Genexpressionsprofilen führte - es war sogar schwierig, Endoderm und Mesoderm in Datensatz 2 zuverlässig zu unterscheiden. In Zukunft sollten weitere Datensätze mit alternativen Differenzierungsschemata erstellt werden, um spezifische DNAm-Veränderungen für Endoderm und Mesoderm besser identifizieren und validieren zu können;

3) Die DNAm-Veränderungen während der gerichteten Differenzierung mit Differenzierungsmedien spiegeln nicht unbedingt die spontane Differenzierung in EBs wider. Eine Sortierung der Zellen wäre von Vorteil, um die Signaturen für die spontane Differenzierung weiter anzupassen; und

4) Für die Validierung des Dekonvolutionsansatzes gibt es keinen Datensatz mit quantitativen Daten für die Abstammungszuordnung in EBs. Spezifische DNAm- Muster wurden bereits erfolgreich für die Dekonvolution von Zellpopulationen verwendet, z. B. für die Zusammensetzung von Leukozyten-Untergruppen (Frobel et al., 2018; Houseman et al., 2012; Sontag et al., 2022) oder sogar von komplexen Geweben (Moss et al., 2018; Schmidt et al., 2020) - aber alle diese Anwendungen wurden auf ausdifferenzierte Zellen angewandt. Im Gegensatz dazu ähnelt der Differenzierungsprozess von iPSCs eher einem Kontinuum ohne einen festen Endpunkt, wenn die frühe Keimschichtdifferenzierung abgeschlossen ist. Die Dekonvolutionsergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens können daher nicht die absolute Zusammensetzung der verschiedenen Zelltypen widerspiegeln, sondern liefern vielmehr einen Ersatzmarker, um frühe Entscheidungen über das Zellschicksal abzuschätzen.

Insgesamt bietet die Erfindung weitere Einblicke in epigenetische Veränderungen bei frühen Entscheidungen über das Zellschicksal. Kandidaten-CpGs für die Bewertung von PSC im pluripotenten Zustand und für die Erfassung früher Zellschicksalsentscheidungen in Richtung Endoderm, Mesoderm und Ektoderm wurden ermittelt. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet verschiedene Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Qualitätskontrolle von iPSCs. Eine solche Analyse kann auch zur Optimierung der Kulturbedingungen verwendet werden, um einen größeren Anteil der Zellen im pluripotenten Zustand zu erhalten oder die Differenzierung in bestimmte Keimschichten besser zu steuern.

Experimentelle Verfahren

Zellkultur und gezielte Differenzierung

Vier humane iPSC-Linien wurden aus aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stromazellen (iPSC 102, iPSC 104, iPSC 106) (Goetzke et al., 2018) oder dermalen Fibroblasten (TF11-C2.3) (Willmann et al., 2013) durch Reprogrammierung mit episomalen Plasmiden erzeugt. Alle Proben wurden nach Information und schriftlicher Zustimmung gemäß den von der Ethikkommission für die Verwendung von humanen Testpersonen an der Universität Aachen genehmigten Richtlinien entnommen (Genehmigungsnummer: EK128/09). Die iPSC-Linien wurden auf mit Vitronectin (0,5 pg/cm ² ) beschichtetem Gewebekultur-Plastik in StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland) kultiviert. Die gerichtete Differenzierung in Richtung endodermaler, mesodermaler und ektodermaler Abstammung wurde mit dem STEMdiff Trilineage Differentiation Kit (Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada; ergänzende Abb. S1A) induziert.

Bildung von Embryoidkörpern

Es wurden selbstablösende iPSCs wie zuvor beschrieben erzeugt (Elsafi Mabrouk et al., 2022). Kurz gesagt, Vitronectin wurde im Mikrokontaktverfahren gedruckt (Durchmesser 600 pm) und iPSCs wuchsen und organisierten sich selbst auf diesen Substraten. Nach etwa 6 Tagen, wenn sich mehr als 50 % der Kolonien ablösten, wurden die schwimmenden Aggregate geerntet und als Tag 0 für weitere Differenzierungsschritte betrachtet. Alternativ dazu wurden Spin- EBs wie zuvor beschrieben erzeugt (Ng et al., 2005). Die ungerichtete Multilineagendifferenzierung von EBs wurde in Ultralow-Attachment-Platten (Coming, NY, USA) mit Differenzierungsinduktionsmedium (EB-Medium) durchgeführt, das Knockout DMEM/F12, 20 % KnockOut-Serumersatz, 2 mM GlutaMAX Supplement, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 0,1 mM b- Mercaptoethanol (alle von Gibco, Carlsbad, USA) enthält. Für die Langzeitkultur der EBs über 15 Tage wurden die EBs nach dem 7. Tag von den Platten mit ultraniedriger Anhaftung auf mit 0,1 % Gelatine beschichtete Platten übertragen. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt.

Immunfärbung

Die Zellen wurden 20 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd fixiert und anschließend 30 Minuten lang mit PBS mit 1 % Rinderserumalbumin und 0.1 % Triton X-100 (Bio-Rad, München, Deutschland) behandelt und dann über Nacht bei 4°C mit primären Antikörpern gegen OCT4 (Klon C-10; Santa Cruz, Dallas, Texas, USA), GATA6 (Klon D61 E4; Cell Signaling, Danvers, USA), Brachyury (R&D Systems, Minneapolis, USA) und PAX6 (Klon AD2.35; Santa Cruz, Dallas, USA) inkubiert. Die Färbung mit sekundären Antikörpern erfolgte bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit Esel-Anti-Ziege (Alexa Fluor 488), Ziege-Anti- Kaninchen (Alexa Fluor 594) und Ziege-Anti-Maus (Alexa Fluor 594); alle von Invitrogen (Waltham, USA). Die Proben wurden 15 Minuten lang mit DAPI (10 ng/mL) gegengefärbt und mit einem Axioplan 2 - Fluoreszenzmikroskop von Zeiss abgebildet.

Erstellung von DNA-Methylierungsprofilen

Genomische DNA wurde mit dem NucleoSpin Tissue Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) isoliert und mit einem NanoDrop 2000 - Spektralphotometer (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) quantifiziert. 1 ,2 pg DNA wurden bisulfitiert und mit Illumina EPIC BeadChip Microarrays bei Life & Brain (Bonn, Deutschland; Datensatz 1 ) analysiert. Zusätzlich wurden 114 DNA- Methylierungsprofile von iPSC und iPSC-abgeleiteten Zellen (PSC, ENDO, MESO, ECTO und EB), die auf Illumina HumanMethylation450 BeadChips vom Progenitor Cell Biology Consortium (PCBC) des National Heart, Lung and Blood Institute (Datensatz 2; ergänzende Tabelle S1 ) (Daily et al., 2017) aus dem Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; GSE85828) erstellt wurden, verwendet. Zum Vergleich wurden DNAm-Profile von iPSC-abgeleiteten Zellen, die zu verschiedenen Zelltypen differenziert wurden (Datensatz 3; ergänzende Tabelle S1 ), verwendet. Für die somatischen Zellen wurde eine Auswahl von DNAm-Profilen, die für frühere Arbeiten der Erfinder in vielen Studien zusammengestellt wurden (Datensatz 4; ergänzende Tabelle S1 ) (Schmidt et al., 2020), verwendet. Darüber hinaus wurden DNAm-Profile von iPSCs mit hoher Differenzierungskapazität (HDC) oder geringer Differenzierungskapazität in Richtung Endoderm (LDC; GSE59091 ; Datensatz 5; für Proben mit Replikaten wurden immer die Mittelwerte über alle entsprechenden Replikate verwendet) verwendet (Butcher et al., 2016).

Die IDAT-Dateien der Illumina BeadChips wurden geladen und mit minfi (Aryee et al., 2014) in R (4.1.3) vorverarbeitet. Proben geringer Qualität wurden entfernt (Schwellenwert: Summe der Mediane der methylierten und unmethylierten Kanäle < 20) und die verbleibenden Proben wurden mit ssNoob normalisiert (Triche et al., 2013). Für Proben, für die keine IDAT-Dateien verfügbar waren, wurden bereits vorhandene Beta-Werte verwendet oder die Beta-Werte aus den Signalintensitäten generiert. CpG-Stellen auf XY-Chromosomen, Nicht-CG- Sonden und SNP-assoziierte CpGs wurden für die weitere Analyse nicht berücksichtigt. Außerdem wurden nur CpGs berücksichtigt, die auf den Plattformen 450K und EPIC BeadChip vertreten waren. Das R-Paket limma (3.48.0) wurde für die Berechnung der Benjamini-Hochberg-bereinigten p-Werte und der MDS-Plots verwendet. Relevante DNAm-Veränderungen wurden definiert als mindestens 20 % Unterschied in den mittleren Beta-Werten und ein bereinigter p-Wert < 0,05. Der exakte Test von Fisher wurde mit dem R-Paket GeneOverlap durchgeführt. Die R-Pakete ggplot2, ggrepel, ggbeeswarm, reshape2, ggExtra, ggsignif, cowplot, gprofiler2, ComplexHeatmap und VennDiagram wurden für die grafische Darstellung verwendet.

Auswahl von epigenetischen Biomarkern

Die Auswahl der Marker-Kandidaten-CpGs basiert auf einer früheren Arbeit der

Erfinder (Schmidt et al., 2020) und ist nun als R-Paket CimpleG verfügbar (https://github.com/CostaLab/CimpleG). Es wurden CpG-Stellen mit großen Unterschieden in den mittleren Beta-Werten und geringen Varianzen innerhalb der Gruppen ausgewählt (Methode: "CimpleG_parab"). Der Pluripotenz-Score basiert auf der Summe der DNAm an den drei pluripotenz-assoziierten CpGs cg00661673, cg00933813 und cg21699252. Da alle diese CpGs in pluripotenten Zellen eine geringere DNAm aufweisen, wurden zur intuitiveren Anwendung die komplementären Prozentsätze berechnet:

Pluripotenz-Score = (1 - DNAm ^cg00661673 ) + (1 - DNAm ^cg00933813 ) + (1 - DNAm ^cg21699252 )

Der Entfaltungsansatz basiert auf nicht-negativer Matrixfaktorisierung, wie in einer früheren Arbeit der Erfinder beschrieben (Frobel et al., 2018; Schmidt et al., 2020). Als Referenzmatrix wurden entweder die mittleren DNAm-Grade aus dem Selektionsset oder die Pyrosequenzierungsdaten verwendet.

Transkriptomische Analyse

Die RNA-Sequenzierung wurde von der Firma Life & Brain (Bonn, Deutschland) mit dem NovaSeq 6000 Sequenzer (100 bp/read) durchgeführt. Die FASTA- Dateien wurden mit FastQC überprüft und die Adaptersequenzen wurden mit Trimmomatic getrimmt. Das Alignment der Reads wurde mit STAR (hg38 genome build) durchgeführt. Alternativ dazu wurden die Zählmatrizen vom Webportal des Progenitor Cell Biology Consortium (PCBC) heruntergeladen (https://www.synapse.Org/#ISynapse:syn2822494). Die Daten wurden mit der varianzstabilisierenden Transformation (VST) aus dem DESeq2-Paket in R normalisiert (Love et al., 2014). Die differenzielle Genexpressionsanalyse wurde mit demselben Paket unter Verwendung eines Wald-Tests durchgeführt (Benjamini-Hochberg angepasster P-Wert < 0,05, absolute Fold Change > 2). Um DNAm- und Genexpressionsdaten zu korrelieren, wurden die Illumina BeadChip-Annotation verwendet und die Daten durch Abgleich mit RefSeq- Transkripten zusammengefügt, wobei nur CpGs in Promotorregionen (TSS1500 und TSS200) berücksichtigt wurden.

Zur Identifizierung von Gensätzen, die für die Keimblätter charakteristisch sind, wurde ein zuvor veröffentlichter Einzelzell-RNA-seq-Datensatz menschlicher Embryoidkörper verwendet (Han et al., 2018). Alle Läufe für Tag 8 EBs wurden zusammengeführt und die Zählungen normalisiert. Das Seurat-Paket (v4) wurde zur Qualitätskontrolle und zum Herausfiltern von Zellen mit abnormalen Merkmalszahlen verwendet (Hao et al., 2021 ). Die Zellen wurden mit dem Algorithmus der nächsten Nachbarn geclustert und repräsentative Marker der einzelnen Cluster wurden mit MAST identifiziert (Finak et al., 2015). Gene mit einem bereinigten p-Wert < 0,05 und einer Fold Change > 1 ,5 wurden als Marker für die Keimblätter betrachtet (ergänzende Tabelle S2). Die Identität jedes Clusters wurde mittels gprofiler2 mit Hilfe von GO-Terms annotiert, die mit Markergenen assoziiert sind (Kolberg et al., 2020).

Für den PluriTest-Assay wurde das Online-Tool PluriTest verwendet (https://www.pluritest.org/). RNA-seq FASTAQ-Dateien wurden auf die Website hochgeladen, wo sie mit einem proprietären Algorithmus automatisch vorverarbeitet, ausgerichtet und analysiert wurden. Der daraus resultierende Pluripotenz-Score und der Novelty-Score wurden entsprechend aufgezeichnet.

Pyrosequenzierung

Genom ische DNA (500 ng) wurde über Nacht mit dem EZ DNA Methylation Kit (Zymo) bisulfitiert und in 20 pL Elutionspuffer eluiert. Primer (Metabion) wurden mit der PyroMark Assay Design 2.0 Software (Qiagen; ergänzende Tabelle S3) entworfen. Die Zielsequenzen wurden mit dem PyroMark PCR Kit (Qiagen) mit 2,5 mM Mg ²⁺ und einer Primerkonzentration von 0,3 pM amplifiziert. Die Pyrosequenzierung wurde mit einem Q96 ID Pyrosequenzer (Qiagen) durchgeführt.

Semi-quantitative Reverse-Transkriptase PCR

Die Gesamt-RNA wurde mit dem NucleoSpin RNA Plus Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) isoliert, mit einem NanoDrop ND-1000 Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, USA) quantifiziert und mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Waltham, USA) in cDNA umgewandelt. Die semiquantitative RT-PCR (qPCR) wurde mit dem Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Waltham, USA) und genspezifischen Primern in einem StepOnePlus Gerät (Applied Biosystems, Waltham, USA) durchgeführt. Primer für OCT4, GATA6, Brachyury, PAX6 und das Haushaltsgen GAPDH sind in der ergänzenden Tabelle S4 aufgeführt. Die ScoreCard-Analyse wurde mit dem TaqMan hPSC ScoreCard 96-well Kit (Thermo Fischer Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Statistik

Alle statistischen Analysen wurden in R durchgeführt. Für die Analyse der differentiellen Genexpression (DEseq2, Wald-Test) und der Methylierung (Limma, moderierter t-Test) wurden die p-Werte nach dem Benjamini-Hochberg- Verfahren angepasst. Alle angepassten p-Werte, die kleiner als 0,05 waren, wurden als signifikant angesehen. Für den Vergleich der Pluripotenz-Scores von LDC- und HDC-iPSCs wurde ein Wilcoxon-Test mit dem R-Paket ggsignif durchgeführt.

Verfügbarkeit von Daten und Codes

Die erzeugten RNA-seq- und Methylierungsdaten sind im Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) verfügbar.

Tabelle S1 : “BeadChip” - Datensätze (siehe Anlage)

Tabelle S2: Genlisten für jedes Keimblatt (siehe Anlage)

Table S3: Pyrosequenzierungs-Primer _

NAME _ DNA-SEQUENZ _ cgSCl For GGTTGGAGTGTATTGGTGTAA cgSCl Rev Biotin- AATCCCAACCTTTAT AC AT ATT AATTCTT cgSCl Seq GTTGAGATTATAGGTGTGA cgSC2 For AGGTTGGTTATGAATTTTTGGTTTTAAGTA cgSC2 Rev Biotin- ATACCCTACCTTCCTTTCATTTATATTC cgSC2 Seq TTGGGATTATAGGTGTG cgSC3 For GATGTTGAGGGTTAGGGGGTAATT cgSC3 Rev Biotin- CCTAAAACTCTAAAAATCTTTCTCCCTAAA cgSC3 Seq TGAAGGTTTTTTTAGTTTTGA cgEl For GAATAGTATATGGTTGGTTGGGAAAGT cgEl Rev Biotin- CCAAAAAAAAAAAATACCTTTACTATCACT cgEl Seq AGGAGTTATTTTATTATATTGGAG cgE2 For GGGATGTTGTGGATGGTAAAA cgE2 Rev Biotin- ACTCCCACATCTAAACACCTAA cgE2 Seq AGGGGTGTGGGAAGT cgE3 For GGGAGAGGGATTTATTATTAGGT cgE3 Rev Biotin- ACCCCCTCCTTCAACTATAAT cgE3 Seq GGTTTGAGAAAGAAGTTAG cgMl For AGGGTAAGGTTGTTTTGTTTAGTTTAT cgMl Rev Biotin- TCATACCTTTAAAACCCACAACTAAAAT cgMl Seq ATTAGGGTTTTGGTTTTATT cgM2 For TGAGTTTGGTTAGTTTAGTTATAGGT cgM2 Rev Biotin- CATCCCTAAAACAAACAAAAAACAATT cgM2 Seq ATTTGTTGTTGAGGTTTTTAATA cgM3 For ATGGTTTGGTATAGAAAGTTTATGG cgM3 Rev Biotin- ATACTTTCATCTCTTCTAATACCTTTAAC cgM3 Seq GTTTTGTGGGTGGGG cgEMl For GAATAAGATATGGTTTTTGGATTTGAGTA cgEMl Rev Biotin- AAATTTTCCTCTCCTACATCTCTCA cgEMl Seq GTGTTATAAGGTTTTGTTAGTT cgEM2 For Biotin- AGTTTTTTGATTATAAAAGGTATAGAGTGT cgEM2 Rev ACTCAAAAAAATCACCATAAATCACTATC cgEM2 Seq ACAACTAAACTTCTTTATCATATAT cgEM3_C For TGTTAGTAAATGGGGAAGATATAAAAGTT cgEM3_C

Biotin- AATTCCTACCCAACTCAAACTCATCTA Rev cgEM3_C Seq GAGTTGATTTTGAAAGGT cgECl For GGGGTTTTGAAAGTAAATGTGT cgECl Rev Biotin- TTCCAACTCACTAAAAAACACTTC cgECl Seq AGTAAATGTGTTGAAAGTT cgEC2 For AGTGGGAGTAAATGAGTTTAGT cgEC2 Rev Biotin- CAATTTCAAAATCTCCATCTCAAAATATCA cgEC2 Seq TTTTAGGGTAAGAAAATATAGATAG cgEC3 For GGGAGATTTTAGTTTTTTTTGTAGGG cgEC3 Rev Biotin- CCCAATATTATAATTCTTAACACCTCTCAT cgEC3 Seq AGTTTTTTTTGTAGGGATTTT

Tabelle S4: RT-qPCR - Primer

NAME DNA-SEQUENZ

OCT4 For GGGGGTTCTATTTGGGAAGGTA

OCT4 Rev ACCCACTTCTGCAGCAAGGG

GATA6 For CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT

GATA6 Rev GTCGAGGTCAGTGAACAGCA

Brachyury For CAGTGGCAGTCTCAGGTTAAGAAGGA

Brachyury Rev CGCTACTGCAGGTGTGAGCAA

PAX6 For TCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAG

PAX6 Rev GGTGGGTTGTGGAATTGGTTGGTAGA

GAPDH For GAAGGTGAAGGTCGGAGTC

GAPDH Rev GAAGATGGTGATGGGATTTC Literatur

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Tabelle SI:

Sample_Name Array_Typ< Data_TypeStem_Cell_Sample_GiGSM GSE Dataset iPSC 102 ECTO EPIC IDAT iPSC ECTO GSM6276770 GSE207119 Training iPSC 102 ENDO EPIC IDAT iPSC ENDO GSM6276771 GSE207119 Training iPSC 102 MESO EPIC IDAT iPSC MESO GSM6276772 GSE207119 Training iPSC 102 undifferentiated EPIC IDAT iPSC SC GSM6276773 GSE207119 Training iPSC 104 ECTO EPIC IDAT iPSC ECTO GSM6276774 GSE207119 Training iPSC 104 ENDO EPIC IDAT iPSC ENDO GSM6276775 GSE207119 Training iPSC 104 MESO EPIC IDAT iPSC MESO GSM6276776 GSE207119 Training iPSC 104 undifferentiated EPIC IDAT iPSC SC GSM6276777 GSE207119 Training iPSC 106 ECTO EPIC IDAT iPSC ECTO GSM6276778 GSE207119 Training iPSC 106 ENDO EPIC IDAT iPSC ENDO GSM6276779 GSE207119 Training iPSC 106 MESO EPIC IDAT iPSC MESO GSM6276780 GSE207119 Training iPSC 106 undifferentiated EPIC IDAT iPSC SC GSM6276781 GSE207119 Training

DF-852 4 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM 1427320 GSE59091

DF-852 5 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427321 GSE59091

DF-627 2 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427322 GSE59091

DF-627 3 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427323 GSE59091

DF-700 1 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427324 GSE59091

DF-700 2 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427325 GSE59091

DF-700 3 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427326 GSE59091

DF-700 4 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427327 GSE59091

DF-700 5 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427328 GSE59091

FF-832 1 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427329 GSE59091

FF-832 2 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427330 GSE59091

FF-832 3 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427331 GSE59091

FF-832 4 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427332 GSE59091

FF-832 5 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427333 GSE59091

FF-832 6 450K matrix Fibroblast somatic cells GSM1427334 GSE59091

DF-IPSC-447-39-E 450K matrix IPSC LDC GSM1427335 GSE59091

EB-IPSC-685-68-S 450K matrix IPSC LDC GSM1427336 GSE59091

DF-IPSC-283-79-E 450K matrix IPSC HDC GSM1427337 GSE59091

DF-IPSC-983-15-E 450K matrix IPSC HDC GSM1427338 GSE59091

EB-IPSC-447-64-S 450K matrix IPSC HDC GSM1427339 GSE59091

EB-IPSC-283-78-S 450K matrix IPSC HDC GSM1427340 GSE59091

EB-IPSC-844-53-S 450K matrix IPSC HDC GSM1427341 GSE59091

Sample_Name Array_Type Data_Type Stem_Cell_type Sample_Gr GSM GSE iPSC 102 EB DO EPIC IDAT iPSC EB GSM6276782 GSE207119 iPSC 102 EB D4 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276783 GSE207119 iPSC 102 EB D7 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276784 GSE207119 iPSC 106 EB DO EPIC IDAT iPSC EB GSM6276785 GSE207119 iPSC 106 EB D4 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276786 GSE207119 iPSC 106 EB D7 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276787 GSE207119 iPSCC2.3 EB D0 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276788 GSE207119 iPSCC2.3 EB D4 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276789 GSE207119 iPSCC2.3 EB D7 EPIC IDAT iPSC EB GSM6276790 GSE207120

Sample_Name Array_Type Data_Type Stem_Cell_type Sample_Group GSM GSE

SC12-005 EB [9934089035_R05C01] 450K IDAT iPSC EB GSM2285204 GSE85828

SC11-006 EB [9341679025_R01C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285157 GSE85828

SC12-006 EB [9934089035_R04C01] 450K IDAT IPSC EB GSM2285202 GSE85828

SC11-007 EB [9422493126_R03C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285184 GSE85828

SC11-013 EB [9934089038_R03C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285213 GSE85828

SC11-014 EB [9934089038_R01C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285209 GSE85828

SC11-016 EB [9422493126_R05C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285188 GSE85828

SC11-017 EB [9341679025_R03C01] 450K IDAT IPSC EB GSM2285160 GSE85828

SC12-025 EB [9341679022_R04C01] 450K IDAT IPSC EB GSM2285151 GSE85828

SC12-031 EB [9422493050_R06C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285178 GSE85828

SC12-035 EB [9934089035_R06C01] 450K IDAT IPSC EB GSM2285206 GSE85828

SC14-066 EB [9934089035_R03C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285201 GSE85828

SC14-067 EB [9934089035_R02C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285199 GSE85828

SC14-069 EB [9934089038_R06C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285219 GSE85828

SC14-070 EB [3999442133_R01C02] 450K IDAT IPSC EB GSM2285107 GSE85828

SC14-072 EB [9934089038_R06C01] 450K IDAT IPSC EB GSM2285218 GSE85828

SC14-073 EB [9934089038_R05C01] 450K IDAT IPSC EB GSM2285216 GSE85828

H9 EB [9341679025_R04C02] 450K IDAT ESC EB GSM2285163 GSE85828

Tabelle S2: 54

Gene Name P value Iog2-fold pct.l pct.2 Adjusted P Average change value expression

APOA1 1,9467E-165 6,309623763 0,982 0,456 3,0559E-161 21,45099814

APOA2 3,6757E-155 6,140853514 0,978 0,346 5,7702E-151 7,275942372

APOB 1,4744E-137 5,807369232 0,916 0,28 2,3144E-133 3,407861862

AFP 4,86485E-69 5,17736088 0,647 0,165 7,63684E-65 1,431108204

FGA 2,03937E-75 5,161873598 0,578 0,079 3,2014E-71 0,823676369

IGFBP6 l,20688E-89 4,56480445 0,895 0,213 l,89456E-85 1,037321937

MTTP 5,07529E-71 4,529145641 0,804 0,114 7,96718E-67 0,727654915

CST1 9,92504E-85 4,513582066 0,793 0,173 l,55803E-80 0,772975026

S100A14 l,41023E-73 4,355984535 0,738 0,098 2,21378E-69 0,533827453

RBP4 4,3316E-34 4,314065394 0,305 0,051 6,79974E-30 0,398533459

APOM l,63756E-43 4,272837206 0,633 0,084 2,57064E-39 0,572671668

LINC00261 l,17904E-82 4,266571092 0,938 0,131 l,85085E-78 0,62982646

APOC1 8,4151E-170 4,058940748 0,978 0,641 1,321E-165 3,103037205

DPP4 l,21405E-67 3,986337221 0,731 0,071 l,90581E-63 0,370974924

S100A16 3,516E-58 3,904456126 0,891 0,31 5,51941E-54 1,784345901

FN1 l,0462E-108 3,819836508 1 0,784 l,6424E-104 20,88973054

GPX2 l,34496E-24 3,724270876 0,455 0,052 2,11131E-20 0,350105478

ALDH1A1 l,68565E-37 3,560395714 0,633 0,079 2,64614E-33 0,327158914

GSTA2 7,34627E-42 3,448474892 0,567 0,043 l,15322E-37 0,220345079

HNF4A 3,03722E-48 3,354580338 0,629 0,054 4,76783E-44 0,213903237

CUBN 3,00346E-39 3,344895334 0,542 0,054 4,71484E-35 0,220027161

CA4 l,04256E-17 3,294929731 0,469 0,075 1,6366E-13 0,39200605

SLC7A7 2,12233E-39 3,292366328 0,716 0,155 3,33163E-35 0,407406901

CDKN1C 2,51013E-55 3,267563123 0,949 0,448 3,9404E-51 1,844362981

GSTA1 6,6673E-20 3,20479552 0,407 0,029 l,04663E-15 0,19971716

FOXA2 l,85323E-52 3,194028787 0,738 0,068 2,9092E-48 0,210031079

MYL3 2,94744E-16 3,093849543 0,411 0,054 4,62689E-12 0,241963029

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HABP2 8,90617E-33 3,024664397 0,52 0,029 l,39809E-28 0,142008524

RASSF6 l,06872E-21 2,988549446 0,418 0,035 1,67768E-17 0,167401689

MYOF 5,00359E-30 2,871303498 0,865 0,233 7,85463E-26 0,646128815

PPFIBP2 2,29445E-28 2,856286413 0,851 0,214 3,60183E-24 0,537451419

ANKRD1 l,4019E-16 2,823545598 0,451 0,143 2,2007E-12 0,425516127

DENND2C l,77096E-23 2,797868601 0,698 0,155 2,78005E-19 0,379145467

LCP1 l,70955E-12 2,796287793 0,418 0,095 2,68365E-08 0,36142237

SAT1 7,7862E-79 2,792006593 0,971 0,717 l,22228E-74 2,825867931

CCKBR l,56113E-24 2,693681628 0,713 0,267 2,45066E-20 0,845957267

HLA-DRB1 7,22183E-19 2,682945231 0,604 0,164 1,13368E-14 0,464752564

RSP03 l,61207E-26 2,667513497 0,909 0,359 2,53064E-22 1,759270042

S100A10 3,69111E-73 2,66415085 0,996 0,855 5,79431E-69 10,38969204

EPSTI1 9,08507E-19 2,657512498 0,564 0,079 1,42617E-14 0,199734288

MGST2 6,69648E-28 2,645282833 0,804 0,213 l,05121E-23 0,398584136

VIL1 1,19692E-17 2,642148939 0,404 0,054 1,87893E-13 0,156076671

PDZK1 3,53389E-25 2,627709987 0,513 0,03 5,5475E-21 0,115214577

HSPA12A l,52016E-14 2,594787105 0,498 0,08 2,38634E-10 0,246603748

TMEM144 1,14616E-19 2,589926897 0,425 0,07 1,79924E-15 0,155790967

SERPINE2 l,74387E-59 2,589202091 0,978 0,67 2,73752E-55 2,343752228

PLA2G12B 2,14411E-17 2,567042854 0,382 0,016 3,36582E-13 0,087783834

F0LR1 l,50735E-10 2,551944745 0,367 0,057 2,36624E-06 0,203715352

RNASE1 2,1543E-07 2,542024501 0,222 0,031 0,003381821 0,161777234 BMP2 l,24523E-25 2,529440206 0,829 0,264 1,95475E-21 0,595774921 VTN 3,50692E-30 2,515092887 0,593 0,063 5,50516E-26 0,129156015 FLRT3 6,12893E-30 2,513916772 0,96 0,439 9,62119E-26 1,773337685 SGIP1 6,02136E-17 2,493011632 0,378 0,065 9,45234E-13 0,143770783 F10 2,37709E-14 2,465882146 0,356 0,033 3,73156E-10 0,115564935 EPCAM 6,84207E-47 2,448538745 0,985 0,598 l,07407E-42 2,252605003 F2 2,88386E-12 2,401001234 0,291 0,019 4,52708E-08 0,079772596 REEP6 3,29646E-20 2,380766917 0,698 0,217 5,17478E-16 0,452463962 HPX 5,7959E-10 2,37197752 0,269 0,028 9,09841E-06 0,107984145 APOE 2,3524E-160 2,371458536 1 0,92 3,6927E-156 2,29465315 GSN 2,01202E-36 2,367030398 0,905 0,429 3,15847E-32 0,812729138 CAMK2D l,53733E-27 2,366459753 0,895 0,341 2,4133E-23 0,706232367 HNF1A-AS1 2,00034E-15 2,352595114 0,36 0,021 3,14013E-ll 0,077737923 CST3 5,90747E-55 2,351865137 0,949 0,589 9,27354E-51 1,004622482 BMP6 l,91109E-22 2,320215644 0,469 0,031 3,00003E-18 0,08199699 LGALS3 2,40316E-15 2,317880296 0,56 0,168 3,77248E-11 0,304448314 APE LA 3,60215E-30 2,296553727 0,815 0,4 5,65466E-26 0,804959824 ANXA3 4,99581E-25 2,288253006 0,815 0,339 7,84243E-21 0,639803046 TMEM37 1,3637E-12 2,27498192 0,545 0,139 2,14074E-08 0,32184307 SLC22A3 3,49513E-13 2,235857244 0,415 0,06 5,48665E-09 0,128221555 UGT3A1 8,43611E-09 2,235750702 0,338 0,075 0,00013243 0,18911798 SMIM10L2A l,94658E-25 2,23026946 0,644 0,198 3,05575E-21 0,246359053 AMOT l,25852E-20 2,213174975 0,876 0,355 1,97563E-16 0,945320706 GJB1 9,61006E-10 2,193662949 0,295 0,01 l,50859E-05 0,063052609 MLXIPL 2,06107E-ll 2,177673529 0,244 0,043 3,23547E-07 0,093203878 AK4 8,46743E-32 2,172550723 0,869 0,449 l,32922E-27 0,889393971 CFTR 1,18619E-11 2,158837209 0,375 0,048 l,86208E-07 0,115676768 FRZB 7,25331E-19 2,143898451 0,873 0,382 1,13862E-14 1,181134177 SYTL5 1,52587E-13 2,122822935 0,713 0,184 2,3953E-09 0,341501965 TTN 3,7603E-18 2,120934944 0,745 0,402 5,90291E-14 1,114766012 IGSF1 4,75304E-18 2,113016475 0,571 0,251 7,46133E-14 0,350626365 CELF4 6,95691E-18 2,109567142 0,444 0,059 l,0921E-13 0,099088698 HPGD 5,64942E-09 2,096875998 0,298 0,035 8,86846E-05 0,102051572 FAM184A 9,40777E-16 2,087671338 0,647 0,211 1,47683E-11 0,371173733 DNAJC22 2,57742E-13 2,082513103 0,367 0,04 4,04603E-09 0,087961316 B4GALT4 7,32303E-22 2,067800711 0,745 0,299 1,14957E-17 0,382755769 SLC2A3 2,83614E-73 2,037813258 1 0,935 4,45217E-69 6,248630879 ANKRD55 6,23479E-09 2,034814383 0,342 0,054 9,78737E-05 0,121356488 NQO1 3,69002E-33 2,025987193 0,869 0,604 5,79259E-29 1,761741139 SULF2 2,92036E-18 2,024955843 0,756 0,288 4,58438E-14 0,472341167 FZD4 1,82967E-15 2,023475783 0,713 0,186 2,87221E-11 0,267255344 EFHD1 l,22449E-10 2,00903374 0,516 0,095 l,92221E-06 0,182393655 TMEM135 l,89025E-21 2,00322147 0,775 0,305 2,96732E-17 0,402752425 SERPINF1 4,70462E-14 2,00084925 0,615 0,227 7,38531E-10 0,392605903 SPTLC3 l,58573E-09 1,996346213 0,429 0,052 2,48928E-05 0,115984079 FTL 2,495E-230 1,986689679 1 1 3,9166E-226 72,48120121

STEAP1 5,99742E-12 1,979325543 0,393 0,104 9,41474E-08 0,154163274 CLDN19 l,4577E-10 1,964211207 0,316 0,079 2,2883E-06 0,113695763 LINC01356 3,19518E-16 1,962965489 0,742 0,429 5,01579E-12 1,952068923 AMHR2 2,27032E-06 1,956505952 0,316 0,06 0,035639461 0,157987036 LAMA1 l,37535E-32 1,955589293 0,978 0,65 2,15902E-28 2,380849969 GLYCTK 2,56402E-10 1,951862084 0,327 0,064 4,02499E-06 0,112684628 FLNB 4,1162E-28 1,950522003 0,811 0,506 6,46161E-24 0,814190319 CHST9 3,04709E-13 1,948878085 0,582 0,199 4,78333E-09 0,310516825 MPC2 9,50366E-26 1,945976242 0,92 0,609 1,49189E-21 2,583135218 S100A13 4,9035E-48 1,942584526 0,956 0,648 7,69751E-44 0,813012896 SLC22A18 3,81957E-08 1,938243203 0,298 0,09 0,000599596 0,1632273 PTGR1 2,13563E-35 1,937821497 0,851 0,482 3,35251E-31 0,492723367 GAMT 4,02103E-23 1,924778141 0,836 0,461 6,31222E-19 0,875238006 LIFR l,80796E-17 1,923996423 0,891 0,381 2,83814E-13 1,009789341 S0X17 l,85027E-08 1,898957181 0,262 0,049 0,000290455 0,090678771 B4GALT1 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TRAK2 6,17817E-10 1,340883982 0,495 0,292 9,69849E-06 0,291229616 DDIT3 6,35812E-09 1,335954212 0,487 0,194 9,98097E-05 0,164462437 PNPLA3 6,01672E-07 1,329634052 0,327 0,115 0,009445047 0,113986109 RASGEF1B 8,18127E-07 1,311738608 0,331 0,103 0,012842964 0,09815616 SLC3A2 9,09916E-26 1,308924252 0,967 0,875 1,42839E-21 3,857162947 EPS8L2 7,16792E-11 1,305527444 0,476 0,226 l,12522E-06 0,152052678 LRRC1 l,34923E-06 1,305251333 0,455 0,173 0,021180187 0,185256014 APLP2 l,35526E-40 1,299334845 0,996 0,954 2,12749E-36 3,661156703 ARHGAP26 5,21474E-09 1,298665928 0,545 0,263 8,18609E-05 0,245335336 SHISA5 3,73253E-24 1,297856036 0,942 0,771 5,85933E-20 1,908558873 HACD1 7,1641E-08 1,287295049 0,665 0,334 0,00112462 0,552238664 GPC3 l,06916E-12 1,284894258 0,887 0,616 l,67837E-08 2,013388232 FGF13 l,28699E-06 1,279355177 0,433 0,194 0,020203203 0,233608274 FGFR1 7,38806E-37 1,276773417 0,989 0,926 l,15978E-32 3,125570496 UACA 3,70923E-14 1,272360451 0,956 0,659 5,82275E-10 2,033436176 FBXO17 l,5626E-07 1,270589067 0,615 0,243 0,002452965 0,302623099 SLC7A5 1,38646E-11 1,26354318 0,542 0,233 2,17646E-07 0,145099049 PATJ 2,26105E-ll 1,263176989 0,789 0,421 3,54939E-07 0,502756059 MCC l,26299E-08 1,250690188 0,702 0,345 0,000198264 0,442954908 COL4A1 2,06673E-13 1,248037448 0,989 0,632 3,24435E-09 1,703912578 GALM l,70287E-06 1,241833416 0,604 0,282 0,02673162 0,425991722 STX3 l,07052E-12 1,238849453 0,898 0,516 l,6805E-08 0,869509703 NENF 2,59216E-10 1,23414168 0,705 0,533 4,06917E-06 1,097639258 FRMD4A 2,51107E-06 1,231620536 0,498 0,254 0,03941878 0,30971493 HLA-B l,267E-07 1,225019092 0,578 0,294 0,001988931 0,390250318 ALDH6A1 8,79934E-09 1,217730785 0,716 0,351 0,000138132 0,439526332 RBM47 l,31586E-10 1,211764265 0,589 0,327 2,06564E-06 0,250021855 MAGEH1 2,48385E-07 1,209471532 0,596 0,239 0,003899152 0,255021468 ASPH 5,40456E-12 1,208505212 0,753 0,434 8,48408E-08 0,480060883 PCDH7 4,37647E-07 1,205191633 0,84 0,384 0,006870176 0,896227313 MOSPD1 4,61618E-07 1,203789793 0,535 0,29 0,007246475 0,401687872 FRAS1 2,8709E-09 1,200399582 0,724 0,448 4,50674E-05 0,645495154 CD99 2,26757E-22 1,194702096 0,96 0,774 3,55964E-18 1,278261287 CDH2 1,46882E-14 1,191904716 0,982 0,654 2,30576E-10 1,690101225 GPX3 2,10752E-09 1,189243717 0,6 0,339 3,30838E-05 0,323343444 TNNC1 3,32499E-12 1,188685002 0,422 0,048 5,21958E-08 0,030366038 KDM4C 3,69748E-07 1,187836834 0,327 0,124 0,005804304 0,090331396 GSTO1 1,72117E-19 1,185336326 0,982 0,817 2,70189E-15 3,382338224 CAMK2N1 2,16882E-07 1,180900406 0,662 0,24 0,003404614 0,28700461 FLRT2 2,01352E-06 1,17792784 0,778 0,366 0,031608222 0,687992434 BINI 4,17577E-12 1,176914152 0,825 0,493 6,55512E-08 0,582904962 GLUL 5,45296E-24 1,172961542 0,931 0,851 8,56006E-20 2,049673681 ESRP1 l,07489E-08 1,164961539 0,633 0,318 0,000168736 0,344798657 CIB1 3,79772E-11 1,152753959 0,869 0,574 5,96165E-07 1,207412999 PORCN l,61821E-08 1,134886644 0,302 0,109 0,000254027 0,064619453 VAMP8 2,11702E-08 1,134491432 0,698 0,438 0,00033233 0,628865951 SERPINB6 l,83303E-07 1,129004014 0,68 0,409 0,002877484 0,720554415 SLC25A44 l,29685E-06 1,116954414 0,495 0,288 0,020358009 0,308030652 FUR 1,63953E-11 1,105408984 0,836 0,527 2,57374E-07 0,620546657 DAB2 l,38453E-06 1,100173489 0,927 0,454 0,021734405 1,239959842 DST 4,25458E-19 1,08366835 0,985 0,886 6,67884E-15 3,613538471 SPATS2L 1,32881E-11 1,079432706 0,855 0,579 2,08596E-07 0,88373632

LLGL2 4,9066E-07 1,077756289 0,68 0,345 0,007702383 0,390104816

CLDN7 2,8516E-10 1,07493501 0,545 0,234 4,47645E-06 0,134453729

SNCA 4,67812E-07 1,072586649 0,429 0,169 0,007343705 0,112027009

COL18A1 8,7906E-20 1,071973805 0,993 0,816 1,37995E-15 1,255852831

ZFP36L2 5,36801E-14 1,066244711 0,92 0,676 8,4267E-10 1,048696936

COL4A6 l,50601E-07 1,065747664 0,782 0,467 0,002364142 0,828802395

SLC7A8 l,05058E-12 1,06091137 0,695 0,472 l,6492E-08 0,370180275

CKB 5,08912E-17 1,059408863 0,945 0,817 7,98891E-13 2,818433635

NFE2L2 9,21837E-08 1,046941946 0,753 0,443 0,0014471 0,53414311

MYL12B 5,14276E-19 1,041167931 0,967 0,861 8,07311E-15 3,37533087

PPP1R14A 1,13127E-13 1,036173078 0,356 0,113 l,77587E-09 0,041550274

CAPN1 l,3158E-08 1,035613614 0,727 0,442 0,000206555 0,552434031

TMED9 8,28662E-10 1,025173862 0,811 0,485 l,30083E-05 0,436495914

COL9A2 4,00668E-07 1,018274329 0,571 0,321 0,006289688 0,285858098

SLC48A1 1,1487E-11 1,013923636 0,669 0,446 l,80324E-07 0,280101495

NAB1 2,62044E-07 1,009396586 0,68 0,386 0,004113567 0,486823025

HMOX1 l,69648E-06 1,007884464 0,28 0,054 0,026631353 0,037591187

ISG15 l,47616E-07 1,004423196 0,644 0,515 0,002317269 1,069928363

TM7SF2 l,09501E-06 1,004371455 0,625 0,403 0,017189454 0,61174873

F0XP1 6,7488E-08 1,002517178 0,789 0,53 0,001059426 0,858016838 pct.l Fraction of endoderm cells expressing marker genes pct.2 Fraction of other cells expressing marker genes

Gene Name P value Iog2-fold pct.l pct.2 Adjusted P Average change value expression

COL3A1 2,6664E-170 4,07387832 0,956 0,388 4,1856E-166 3,866056568

LUM 7,3571E-140 3,942986352 0,915 0,314 1,1549E-135 2,829044581

APLNR 2,4056E-151 3,810485096 0,975 0,315 3,7763E-147 2,668094957

IGFBP3 2,5626E-114 3,730621401 0,858 0,297 4,0228E-110 2,246348223

HAPLN1 1,85E-147 3,71009579 0,972 0,4 2,9041E-143 3,87102293

POSTN 2,11678E-79 3,623453225 0,657 0,228 3,32293E-75 1,215448898

COL6A3 1,319E-114 3,391207463 0,787 0,215 2,0706E-110 0,692160798

LRRC32 4,3895E-81 3,323399633 0,688 0,151 6,89064E-77 0,640747146

RSPO2 9,30106E-76 3,319808804 0,676 0,162 l,46008E-71 0,71466252

HAND1 1,1212E-111 3,315597741 0,985 0,276 l,7601E-107 2,353707762

C0BLL1 4,68089E-97 3,257334099 0,779 0,234 7,34806E-93 0,835500994

DNAH2 l,18569E-73 3,21272246 0,66 0,155 l,86129E-69 0,594463805

ACTC1 2,8971E-104 3,197592265 0,937 0,511 4,5478E-100 4,699476701

ALPK2 3,97178E-81 3,177949396 0,704 0,18 6,2349E-77 0,605465434

MYL4 7,29751E-72 3,132116997 0,746 0,177 l,14556E-67 0,723387863

BMP4 4,2735E-102 3,110421506 0,896 0,305 6,70856E-98 1,177296498

HAS2 2,6865E-99 3,106547193 0,818 0,277 4,21732E-95 0,792039048

PMP22 3,04648E-57 3,011511302 0,667 0,217 4,78236E-53 0,841166775

COL5A2 2,4182E-104 3,009679109 0,836 0,304 3,796E-100 0,84772544

RGS4 6,6765E-68 3,000111226 0,716 0,187 l,04808E-63 0,738846043

COL5A1 2,4678E-121 2,952935417 0,918 0,386 3,8739E-117 1,020138159

FREM1 7,85152E-90 2,93241756 0,786 0,2 l,23253E-85 0,517967657

BMPER 3,09619E-61 2,931596394 0,657 0,15 4,8604E-57 0,479340811

CDH11 3,9001E-100 2,923401645 0,899 0,318 6,12242E-96 0,943181189

KDR 5,32622E-96 2,917149726 0,824 0,447 8,36109E-92 1,262620143

COL1A1 3,7594E-126 2,911059259 0,93 0,422 5,9015E-122 1,0073861

ART5 2,16554E-46 2,902132362 0,57 0,264 3,39946E-42 0,943925025

CLSTN2 9,80384E-52 2,901140428 0,391 0,079 l,53901E-47 0,219800777

SYNE1 1,32264E-61 2,863887869 0,504 0,172 2,07628E-57 0,349579217

DSC3 6,12155E-62 2,852987737 0,352 0,104 9,60961E-58 0,189091331

FAM89A l,00952E-77 2,850752913 0,782 0,197 l,58474E-73 0,577439464

PRRX1 l,34407E-67 2,837837726 0,76 0,196 2,10992E-63 0,640692167

TGFBI 2,61629E-57 2,812490877 0,496 0,166 4,10705E-53 0,327947887

DCN 2,15798E-49 2,805048253 0,299 0,074 3,3876E-45 0,169350721

SLC40A1 4,22974E-57 2,761865108 0,591 0,148 6,63984E-53 0,39225967

SEMA6D l,16351E-70 2,728412701 0,754 0,252 l,82647E-66 0,603254396

HOXB5 6,52969E-57 2,726936275 0,463 0,077 l,02503E-52 0,208209186

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WNT5A 7,38245E-62 2,606849564 0,682 0,161 l,1589E-57 0,351819268

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MYL7 4,81213E-37 2,512914 0,771 0,202 7,55409E-33 1,130013214

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2,196120545 0,321 0,081 2,32033E-30 0,138168733 IL6ST 4,48513E-61 2,18975949 0,899 0,418 7,04076E-57 1,195628402 CYP26A1 l,74369E-36 2,174348876 0,496 0,225 2,73724E-32 0,355674972 SOX6 9,61465E-31 2,152234021 0,444 0,165 l,50931E-26 0,290553499 FLNC 7,94557E-51 2,146084818 0,808 0,293 l,2473E-46 0,546583104 COL6A2 l,53624E-90 2,141445225 0,814 0,327 2,41159E-86 0,303586077 GATA6 2,27013E-36 2,129953448 0,762 0,21 3,56366E-32 0,623860369 AHNAK 4,80569E-55 2,128644042 0,968 0,468 7,54397E-51 2,890607086 ATP7B l,04309E-34 2,123887658 0,522 0,201 l,63744E-30 0,327569721 ANGPT2 1,47475E-16 2,119163555 0,299 0,089 2,31506E-12 0,203271783 HTRA1 7,80379E-32 2,111941079 0,544 0,195 l,22504E-27 0,358926305 PDGFRA 2,11606E-38 2,084850173 0,84 0,306 3,32179E-34 1,176176382 FENDRR l,33244E-23 2,081934463 0,24 0,039 2,09167E-19 0,10530039 CGNL1 l,7995E-63 2,06897596 0,871 0,543 2,82485E-59 1,345293982 CEP85L 2,57098E-29 2,052890384 0,519 0,214 4,03592E-25 0,381109632 HOXB3 3,22204E-33 2,050773258 0,496 0,127 5,05796E-29 0,207883748 MFAP4 9,00312E-32 2,049783303 0,314 0,085 l,41331E-27 0,117520396 ANXA1 l,01344E-19 2,044653955 0,519 0,166 l,5909E-15 0,435549772 RGS5 3,06996E-59 2,044566339 0,877 0,511 4,81922E-55 1,44931897 NID2 4,80683E-33 2,028949858 0,377 0,089 7,54576E-29 0,135333055 SMARCA2 8,75414E-30 2,025319198 0,466 0,165 l,37423E-25 0,25161745 CAB39L 7,5756E-25 2,015469707 0,318 0,106 l,18922E-20 0,167219437 KIFAP3 l,30678E-34 2,010667758 0,663 0,285 2,05138E-30 0,613172723 PLAT 7,73861E-20 2,009704746 0,355 0,153 1,21481E-15 0,3015844 ACKR3 l,3137E-28 2,005739448 0,522 0,157 2,06224E-24 0,309599475 HOPX 3,49074E-26 2,003611823 0,243 0,045 5,47977E-22 0,090630273 ARHGAP28 l,71689E-39 1,997036161 0,72 0,338 2,69517E-35 0,739993732 TGFBR3 l,18387E-30 1,990021907 0,512 0,204 l,85844E-26 0,364971632 LGR4 l,26253E-57 1,986933662 0,826 0,441 l,98192E-53 0,734314313 GLIPR2 6,7968E-32 1,984213309 0,732 0,299 l,06696E-27 0,921136013 BAMBI l,06414E-55 1,981696087 0,978 0,569 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3,40958E-07 0,121666326 KIAA1217 4,04608E-12 1,169598869 0,425 0,347 6,35154E-08 0,512216679 DACT1 8,04207E-13 1,16397839 0,437 0,225 l,26244E-08 0,254773733 PPFIBP1 5,75595E-14 1,161525648 0,575 0,38 9,0357E-10 0,48827743 AKAP12 l,79304E-35 1,161166671 0,933 0,83 2,81472E-31 2,909902875 LPGAT1 l,90562E-ll 1,160068012 0,49 0,271 2,99144E-07 0,34610082 CA2 4,09762E-09 1,157012294 0,336 0,252 6,43245E-05 0,254434661 FOSB 2,8256E-15 1,147777936 0,792 0,505 4,43563E-11 1,600144192 RBMS3 3,56049E-10 1,144794533 0,34 0,157 5,58926E-06 0,168098503 CTSL 7,44001E-18 1,144728916 0,67 0,426 1,16793E-13 0,573162648 TCF4 4,45136E-45 1,143846924 0,969 0,856 6,98775E-41 2,328548336 CAP2 8,36742E-13 1,142368605 0,557 0,333 l,31352E-08 0,491378868 GNG2 9,37196E-19 1,14216593 0,544 0,309 1,47121E-14 0,225480978 TMEM51 5,86427E-09 1,142087426 0,355 0,224 9,20573E-05 0,290499446 CBLB 2,47285E-12 1,136206615 0,501 0,361 3,88188E-08 0,461949096 JAK1 3,70284E-ll 1,134080738 0,49 0,335 5,81272E-07 0,471686871 MAGI3 3,46256E-11 1,131747075 0,452 0,281 5,43553E-07 0,351076285 VEGFB 7,93637E-12 1,130459076 0,44 0,285 l,24585E-07 0,294171393 TNFAIP8 2,6594E-11 1,125571385 0,326 0,211 4,17473E-07 0,165910555 SLC7A2 6,75778E-10 1,123165078 0,318 0,195 l,06084E-05 0,201117239 ALDH2 8,92863E-21 1,122837967 0,83 0,578 l,40162E-16 1,127165396 CMTM6 4,75143E-24 1,120633149 0,644 0,533 7,4588E-20 0,367436496 MXRA8 2,23442E-11 1,120161909 0,375 0,173 3,5076E-07 0,159374007 LYPD6 8,72077E-08 1,119451614 0,271 0,137 0,001368987 0,163590793 MAST4 2,28028E-08 1,118682295 0,282 0,169 0,000357959 0,190914287 MXD4 3,52218E-16 1,116670458 0,68 0,471 5,52912E-12 0,833177504 BAIAP2L1 1,24594E-18 1,114997499 0,651 0,534 1,95588E-14 0,692167038 SPIN4 3,83637E-21 1,113650058 0,32 0,139 6,02234E-17 0,067006756 LDB2 l,30036E-14 1,113320384 0,534 0,382 2,0413E-10 0,419422202 KCP 3,43768E-09 1,112139554 0,205 0,078 5,39648E-05 0,078613203 MDK 1,2935E-142 1,111478983 1 1 2,0305E-138 9,615669833 TSPAN5 6,72814E-15 1,107695265 0,689 0,454 l,05618E-10 0,943538151 LIFR 2,11061E-09 1,106600477 0,726 0,304 3,31323E-05 1,009789341 SLC4A8 5,22912E-11 1,104460364 0,433 0,29 8,20867E-07 0,406793102 ITGB1 5,74348E-33 1,10304317 0,903 0,783 9,01611E-29 1,327144214 EPHB2 l,72096E-15 1,099060866 0,562 0,345 2,70156E-ll 0,305458778 TNP01 2,05419E-33 1,097053298 0,886 0,758 3,22467E-29 1,185210418 ZBTB8A 2,05298E-12 1,096326192 0,409 0,275 3,22277E-08 0,238307347 WWTR1 l,32425E-10 1,096054907 0,453 0,236 2,07882E-06 0,246617247 RPL18P13 2,87475E-12 1,094420385 0,177 0,066 4,51278E-08 0,047312928 HUNK 8,41495E-09 1,086172735 0,372 0,211 0,000132098 0,267903637 PHACTR2 l,48646E-26 1,081220576 0,849 0,741 2,33344E-22 1,654278224 PLEKHG3 2,06408E-09 1,080503626 0,418 0,264 3,24019E-05 0,303482349 S1PR3 l,09662E-07 1,080397235 0,353 0,175 0,001721466 0,249966146 SLIT3 6,36505E-10 1,07872292 0,267 0,099 9,99185E-06 0,099900146 PPP2R3A 7,73331E-13 1,075716518 0,566 0,384 l,21398E-08 0,56438922 CITED2 1,81727E-17 1,073577495 0,559 0,307 2,85275E-13 0,205383533 LAMCl l,08416E-22 1,068383423 0,861 0,678 l,70192E-18 1,524067657 MAP4 2,20008E-25 1,064053247 0,864 0,732 3,45369E-21 1,420178916 ARID3A 2,51263E-36 1,063048477 0,943 0,761 3,94432E-32 1,305688918 ABTB2 4,66959E-14 1,062625233 0,224 0,073 7,33033E-10 0,052098351 LHFPL2 2,96195E-37 1,062303957 0,96 0,835 4,64966E-33 2,102958361 SC5D 3,76269E-20 1,060710369 0,716 0,607 5,90667E-16 0,799979392 CAPN2 2,80636E-15 1,059252563 0,704 0,507 4,40543E-ll 0,985578899 FKBP14 l,25552E-09 1,053897497 0,394 0,283 l,97092E-05 0,303493256 IDS 3,48674E-13 1,051996437 0,421 0,313 5,47348E-09 0,208890603 CDC42EP3 2,07178E-13 1,051586139 0,491 0,427 3,25228E-09 0,464807617 SGPP1 3,06064E-10 1,045427468 0,33 0,164 4,80459E-06 0,125735127 MALT1 4,58062E-10 1,0441236 0,491 0,327 7,19066E-06 0,418859701 PKIA 7,90795E-12 1,04364575 0,424 0,334 l,24139E-07 0,296503451 NTM 2,4442E-09 1,042366851 0,321 0,238 3,8369E-05 0,235305413 B2M 6,44486E-27 1,041294477 0,883 0,753 l,01171E-22 1,547014877 TRIM8 4,34831E-14 1,041253919 0,431 0,29 6,82598E-10 0,18392329 SLC2A13 l,69671E-07 1,039892362 0,287 0,161 0,002663491 0,164483075

ITGA5 6,10708E-13 1,038730379 0,6 0,38 9,58689E-09 0,454753247

LEPROT 6,58127E-14 1,037396868 0,626 0,441 l,03313E-09 0,599405202

NIDI 5,42733E-13 1,036135906 0,584 0,423 8,51982E-09 0,43948757

ACBD3 6,79134E-16 1,035331106 0,623 0,478 l,0661E-ll 0,536892013

LGALS1 6,65316E-09 1,032583141 0,513 0,355 0,000104441 0,485326042

PRTG 3,2283E-22 1,031570463 1 0,697 5,06778E-18 14,36123362

DGKH l,24604E-07 1,030347374 0,362 0,231 0,001956032 0,315344392

AXL 4,57456E-11 1,029395061 0,452 0,309 7,18114E-07 0,32355782

SH3BP4 l,00008E-09 1,027946062 0,412 0,288 l,56993E-05 0,319861205

MMP15 2,23079E-09 1,027617602 0,422 0,283 3,50189E-05 0,287405654

TRPS1 l,53969E-06 1,019867033 0,224 0,106 0,024170094 0,108821643

TMEM98 l,24504E-28 1,017913543 0,916 0,779 l,95447E-24 2,17380568

PALLD 7,0347E-14 1,01591375 0,689 0,453 l,10431E-09 0,77796513

CACNA2D1 7,32995E-08 1,015174322 0,264 0,165 0,001150655 0,131118482

MIDI 2,71626E-16 1,013354786 0,718 0,537 4,26398E-12 0,918310337

RBP1 9,71377E-13 1,013036523 0,622 0,471 l,52487E-08 0,763575935

COL27A1 5,15098E-14 1,012508305 0,635 0,416 8,08601E-10 0,543005283

KLF5 l,33562E-06 1,012215234 0,26 0,105 0,02096649 0,134667819

SCMH1 4,48858E-08 1,011412555 0,276 0,161 0,000704617 0,153907673

ARHGEF12 2,7885E-11 1,010778484 0,581 0,381 4,37739E-07 0,481356194

MYH10 4,59703E-55 1,010208837 0,985 0,962 7,21641E-51 3,466510881

MAP4K5 2,53989E-17 1,010057562 0,74 0,56 3,98712E-13 0,794719966

FNDC3A 2,17575E-11 1,008077571 0,603 0,445 3,4155E-07 0,659357443

GPC6 2,26595E-09 1,00693171 0,496 0,265 3,55709E-05 0,355078917

FREM2 9,8514E-11 1,006094463 0,452 0,366 l,54647E-06 0,498089528

SUCO l,14742E-20 1,004222235 0,836 0,668 l,80122E-16 1,327970134 pct.l Fraction of mesoderm cells expressing marker genes pct.2 Fraction of other cells expressing marker genes

Gene Name P value Iog2-fold pct.l pct.2 Adjusted P Average change value expression

PAX6 5,7543E-132 4,607547238 0,677 0,043 9,0331E-128 0,530598949

MAP2 8,35646E-84 3,865231406 0,818 0,127 l,3118E-79 0,60335747

PAX3 8,96809E-64 3,696168507 0,67 0,062 l,40781E-59 0,415988489

CRABP1 9,7555E-163 3,678356298 0,946 0,411 1,5314E-158 0,82769064

LHX5-AS1 7,72113E-72 3,675930468 0,508 0,025 l,21206E-67 0,241920089

ZFHX4 5,76188E-59 3,596966521 0,781 0,184 9,045E-55 0,875481717

DLK1 4,28071E-57 3,578868085 0,707 0,154 6,71987E-53 0,667215211

CDH6 2,04471E-60 3,571263152 0,885 0,206 3,20978E-56 1,112776619

ILDR2 6,59423E-54 3,551316154 0,449 0,034 l,03516E-49 0,245852427

NR2F1 2,8939E-79 3,528945627 0,649 0,079 4,54284E-75 0,302755605

SIX3 3,78877E-53 3,469693603 0,39 0,017 5,94761E-49 0,174496295

EDNRA l,70819E-44 3,398188533 0,495 0,105 2,68152E-40 0,348280993

EFNA5 l,33654E-74 3,37577454 0,79 0,249 2,0981E-70 0,663327506

FST l,86929E-82 3,348722778 0,991 0,519 2,93441E-78 4,389127097

TPBG 7,59807E-72 3,217748886 0,779 0,329 l,19274E-67 0,875662219

GFRA1 6,75438E-54 3,194101325 0,484 0,075 l,0603E-49 0,229963727

ATP1A2 8,43674E-54 3,16530538 0,672 0,16 l,3244E-49 0,428469889

PCDH8 l,03073E-45 3,100206336 0,521 0,057 l,61805E-41 0,21892764

OTX2 9,38714E-50 3,06719557 0,798 0,281 l,47359E-45 1,04941845

LGI1 8,28696E-30 3,034941656 0,377 0,041 l,30089E-25 0,204046594

PTN 2,80726E-83 2,956666477 0,948 0,532 4,40684E-79 1,837755718

LHX5 5,92433E-37 2,918731212 0,356 0,013 9,30002E-33 0,115320232

MIAT l,19278E-42 2,845034404 0,651 0,229 l,87243E-38 0,53852554

PLCHI l,97204E-31 2,823959018 0,516 0,14 3,0957E-27 0,370902967

NAV3 2,77688E-27 2,783369379 0,284 0,045 4,35915E-23 0,148734201

COL2A1 2,03852E-31 2,778490167 0,755 0,188 3,20007E-27 0,803103104

SP5 l,54122E-37 2,775261607 0,573 0,115 2,4194E-33 0,268886773

SKIDA1 9,5738E-35 2,764205108 0,555 0,107 l,50289E-30 0,261414256

SOX2 5,34274E-67 2,702462125 0,907 0,378 8,38704E-63 0,800349122

RFX4 3,47137E-24 2,692322151 0,297 0,026 5,44935E-20 0,128008027

DRAXIN l,43817E-34 2,683615565 0,599 0,167 2,25763E-30 0,348604492

EPHB1 l,63924E-27 2,665503882 0,38 0,078 2,57328E-23 0,18575004

ZIC2 2,78342E-70 2,641215348 0,855 0,467 4,36941E-66 0,958531672

PTPRZ1 9,60427E-68 2,640073329 0,876 0,466 l,50768E-63 1,037943371

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FILIP1 7,43756E-19 2,619952011 0,33 0,06 1,16755E-14 0,196105725

TFAP2A 3,4979E-29 2,611489501 0,603 0,133 5,491E-25 0,286912363

GREB1L 2,84194E-44 2,603167695 0,909 0,383 4,46127E-40 1,246766296

NCALD 4,00151E-22 2,591577784 0,334 0,056 6,28157E-18 0,163555677

PLP1 3,33544E-41 2,534517052 0,711 0,347 5,23597E-37 0,680485457

RNF165 2,51144E-31 2,530729456 0,434 0,11 3,94245E-27 0,180986045

SYT11 6,75778E-29 2,510837188 0,486 0,163 l,06084E-24 0,285706206

SOX9 4,61774E-26 2,504073655 0,373 0,15 7,24893E-22 0,231216249

MYLK 2,43593E-27 2,485734168 0,456 0,191 3,82393E-23 0,348884283

FZD3 7,6335E-74 2,48161221 0,963 0,598 l,19831E-69 1,592586778

SOX5 6,03217E-20 2,472321473 0,438 0,127 9,4693E-16 0,287460745

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