Verfahren zur quantitativen Charakterisierung amyloider und/oder aggregierender

Peptide und/oder Proteine in einer Probe

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Charakterisierung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe, u. a. zur quantitativen Bestimmung des Einflusses eines Wirkstoffes auf die Konzentration, Größe und Form von Aggregaten amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine.

Stand der Technik

Es existiert noch kein zugelassenes Medikament für eine ursächliche Behandlung der Alzheimerschen Demenz (AD). Typischerweise findet man in den Gehirnen von AD-Patienten post-mortem Ablagerungen des sogenannten beta-Amyloid-Peptides (Aß) in Plaques. Deshalb werden schon lange verschiedene Formen des Aß, z. B. Fibrillen, für die Entstehung und das Fortschreiten von AD verantwortlich gemacht.

Seit wenigen Jahren werden besonders die kleinen Aß-Aggregate (Aß-Oligomere) als hauptsächlicher Verursacher für die Entstehung und den Fortschritt der AD verantwortlich gemacht. Eine Reduktion oder vollständige Eliminierung von Aß-Oligomeren wäre somit das wichtigste Kriterium, um die AD zu heilen oder zu verlangsamen.

Aß-Monomere entstehen ständig in unserem Körper und sind vermutlich per se nicht toxisch. Es wird spekuliert, ob sich Aß-Monomere abhängig von ihrer Konzentration, die sich letztlich durch Bildungs- und Abbau-Raten im Körper ergibt, zufällig und damit mit zunehmendem Alter immer wahrscheinlicher spontan zu Aß-Oligomeren zusammen lagern. Einmal entstandene Aß-Oligomere könnten sich durch einen Prion-ähnlichen Mechanismus dann vermehren und letztlich zur Krankheit führen.

Aufgrund dieser Überlegungen sollte es das Ziel einer ursächlichen Behandlung sein, toxische Aß-Oligomere vollständig zu vernichten und/oder deren Prion-ähnliche Vermehrung zu verhindern. Ein wichtiger Punkt dabei ist, dass jeder Wirkstoff in einem

|Bestätigungskopie| Tiermodel und in klinischen Studien getestet werden muss. Diese sind sehr zeitintensiv und kostspielig. Von großem Vorteil wäre eine schnelle, zuverlässige und quantitative in vitro-Untersuchung, die die effektivsten Wirkstoffe gegen Aß-Oligomere vorselektiert. Vor einigen Jahren wurde ein D-enantiomeres Peptid mit dem Namen D3 durch eine Spiegelbild-Phagendisplay-Selektion gegen überwiegend monomeres Aß(1-42) identifiziert mit dem Plan, dieses durch die Bindung zu stabilisieren und seine Umwandlung in toxische Aß-Aggregate zu verhindern. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand zerstört D3 die besonders toxischen Aß-Oligomere und wandelt sie dabei in nicht- toxische, nicht-amyloidogene und ThT-negative amorphe Aggregate um. Im Tiermodell wird selbst durch eine orale Verabreichung von D3 mit dem Trinkwasser erreicht, dass behandelte transgene AD-Mäuse deutlich weniger Plaques enthalten und signifikant verbesserte kognitive Fähigkeiten besitzen.

Nach dem Stand der Technik werden Aß-Oligomere z. B. in einer Aß-haltigen, nicht aufgetrennten Probe mittels Oligomer-spezifischer Antikörper detektiert und quantifiziert. Diese Methode ist nur semi-quantitativ, weil man für jede zu bestimmende Probe einen Vergleichsstandard benötigt, der notwendigerweise gleichzeitig mit der zu messenden Probe im Assay mitgeführt werden muss. Außerdem ist diese Methode nicht zuverlässig, weil die Oligomer-spezifischen Antikörper möglicherweise nicht alle Oligomer-Arten erkennen oder diese nicht in gleichem Maße erkennen.

Des Weiteren kann man mit Hilfe unterschiedlicher Zentrifugationstechniken eine Aß-haltige Probe fraktionieren, so dass in unterschiedlichen Fraktionen unterschiedliche Aß-Spezies vorliegen. Diese kann man anschließend mittels ELISA, Western Blot oder SDS-PAGE analysieren, wie z. B. aus Funke et al. bekannt ist (S. A. Funke, T. van Groen, I. Kadish, D. Bartnik, L. Nagel-Steger, O. Brener, T. Sehl, R. Batra-

Safferling, C. Moriscot, G. Schoehn, A. H. C. Horn, A. Muller-Schiffmann, C. Korth, H. Sticht, D. Willbold. Oral Treatment with the D-Enantiomeric Peptide D3 Improves the Pathology and Behavior of Alzheimers Disease Transgenic Mice. ACS Chem. Neu- rosci. (2010), 1 , 639-648). Eine dritte Methode, die oft verwendet wird, ist der ThioflavinT (ThT)-Test, mit dem aber nachteilig nur eine Reduzierung des Fibrillen-Anteils gemessen werden kann. Dies reicht nach heutigem Wissen nicht aus, um einen erfolgversprechenden Wirk- stoffkandidaten für die Oligomer-Reduzierung zu identifizieren. Somit sind nachteilig alle auf Antikörperdetektion basierenden Techniken von der Zugänglichkeit des Epitopes abhängig. Aufgrund verschiedener Aß-Aggregatstrukturen sind die Epitope aber öfters verdeckt. SDS-Polyacrylamid-Gelelek- trophorese (SDS-PAGE-) Analysen sind zwar von den oben genannten Problemen unabhängig, haben aber nachteilig eine geringere Sensitivität und sind nicht quantita- tiv. SDS-PAGE ist zudem nachteilig, da verschiedene Banden aus Dimeren, Trime- ren und Tetrameren gebildet und nachgewiesen werden, da insbesondere die stark aggregierenden Proben hochmolekulare Aggregate bilden. Somit ist auch dieses Verfahren nachteilig nur semi-quantitativ, weil man für jede zu bestimmende Probe einen Vergleichsstandard benötigt, der notwendigerweise gleichzeitig mit der zu messenden Probe im Assay mitgeführt werden muss.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur quantitativen Charakterisierung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe bereit zu stellen.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wird gelöst nach dem Verfahren nach Patentanspruch 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich aus den hierauf rückbezogenen Patentansprü- chen.

Beschreibung der Erfindung

Das Verfahren zur quantitativen Charakterisierung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe, weist nachfolgende Schritte auf: - eine Probe wird bereit gestellt, wobei die Probe ein amyloides und/oder aggregierendes Peptid und/oder Protein in mindestens einer Aggregatgröße und -Form umfasst,

- ein zu untersuchender Wirkstoff wird zu der Probenlösung zugegeben,

- die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine werden in Hinblick auf ihre Aggregatgröße und -Form voneinander getrennt. Hierdurch wird aus der Probe eine Mehrzahl an in Hinblick auf die Konzentration untersuchbaren Fraktionen erhalten, in denen die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine mit einer bestimmten Aggregatgröße und - Form vorliegen,

- die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine einer bestimmten Fraktion werden optional vollständig zu Monomerbausteinen denaturiert,

- die Konzentrationsänderung der Peptid- und/oder Protein- Bausteine wird

durch einen Vergleich mit Kontrollwerten ohne den Wirkstoff bestimmt.

Die Aufgabe wird ebenfalls durch nachfolgendes Verfahren gelöst.

Das Verfahren zur quantitativen Charakterisierung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe, weist hierzu nachfolgende Schritte auf:

- eine Probe wird bereit gestellt, wobei die Probe ein amyloides und/oder aggregierendes Peptid und/oder Protein in mindestens einer Aggregatgröße und -Form umfasst,

- ein zu untersuchender Wirkstoff wird zu der Probenlösung zugegeben,

- die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine werden im Hinblick auf ihre Aggregatgröße und -Form voneinander zu mehreren, mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 oder 15 untersuchbaren Fraktionen getrennt. Hierdurch wird aus der Probe eine Mehrzahl an in Hinblick auf die Konzentration untersuchbaren Fraktionen erhalten, in denen die amyloiden und/oder ag- gregierenden Peptide und/oder Proteine mit einer bestimmten Aggregatgröße und -Form vorliegen,

- die amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine einer bestimmten Fraktion werden optional vollständig zu Monomerbausteinen denaturiert,

- die Konzentrationsänderung der Peptid- und/oder Proteinbausteine in mindestens einer Fraktion, vorzugsweise in mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 oder aber 15 in Hinblick auf die Konzentration untersuchbaren Fraktionen wird durch einen Vergleich mit Kontrollwerten ohne den Wirkstoff bestimmt.

Es kann vorteilhaft durch eines der oben genannten Verfahren jede gewünschte Fraktion auf Konzentrationsänderungen nach Wirkstoffzugabe untersucht werden. Das Verfahren stellt somit einen Verfahrensschritt bereit, der es erlaubt mehr als eine Fraktion auf Konzentrationsänderungen hin zu untersuchen oder auch auf Änderungen der Aggregatgröße oder anderer Parameter. Somit werden durch das Verfahren Fraktionen gewonnen, die sowohl in quantitativer als in qualitativer Weise untersucht werden können und nicht nur in Hinblick auf Konzentrationsänderungen. Der Begriff „gewünschte Fraktion" im Sinne des Verfahrens umfasst insbesondere aber nicht ausschließlich solche Fraktionen, die vor der Auftrennung auch aggregierende bzw. aggregierte Peptide und/oder Proteinbausteine enthielten, insbesondere toxische Oligomere.

Zunächst wird eine Probenlösung vorbereitet, die amyloide und/oder aggregierende Peptide und/oder Proteine umfasst. Es kann auch eine Probe aus einem anderen Experiment, einer Zellkultur, einem Tier oder einem Menschen entnommen werden. Die Peptide und/oder Proteine weisen ein Aggregationsverhalten auf. Dies heißt, dass unter bestimmten Voraussetzungen die Peptide und/oder Proteine miteinander zu höher molekularen Formen aggregieren. Beispielhaft sei das bei der Alzheimer- schen Demenz auftretende Aß(1-42)-Peptid genannt, welches eine besonders starke Tendenz zur Aggregation aufweist. Neben Aß(1-42) treten auch noch andere Varianten von Aß auf, z. B. Aß(1-40), Aß(1-43), Aß(3-40), Aß(1-40), pyroGlu-Aß(3-40) und pyroGluAß(3-42) auf. Es wird z. B. ein cytotoxisches, oligomeres Assembly des (Aß-)Peptids und/oder Proteins angereichert oder bereit gestellt, wobei eine spezifische Größenverteilung durch eine Vorinkubation eingestellt wird. Dies bewirkt vorteilhaft, dass der zu untersuchende Wirkstoff hinsichtlich seines Einflusses auf die Partikelgrößenverteilung und gegebenenfalls Formverteilung exakt und eindeutig quantitativ untersucht werden kann. Selbst im Falle der aggregierenden Aß(1-42) umfassenden Proben kann auf diese Weise schnell der Einfluss des Wirkstoffes auf die toxischen

Aß-Oligomer-Spezies in der Probe bestimmt werden.

Es wird ein Wirkstoff zu der Probe zugegeben, welche die amyloiden und/oder ag- gregierenden Peptide und/oder Proteine mit unterschiedlicher Aggregatgröße und -Form umfasst. Der Wirkstoff ändert die Größenverteilung und damit die Konzentration bestimmter Aggregate in der Probe. Diese Konzentrationsänderung wird quantitativ festgestellt. Die Änderung ist ein Maß für die Reduktion oder sogar für die vollständige Eliminierung bestimmter toxischer Spezies mit nachweisbarer Aggregat- bzw. Partikelgröße. Das heißt, dass während des Verfahrens die Zunahme oder die Abnahme der Konzentration bestimmter amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine über die Änderung der Aggregatgrößenverteilung nachgewiesen wird.

Für ein vorzunehmendes Screening werden mehrere Wirkstoffe und deren Einfluss auf die Probe untersucht. Dann wird vorteilhaft ein Verfahren für eine schnelle Vorse- lektionierung geeigneter Wirkstoffe bereitgestellt.

Die Zusammensetzung an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit unterschiedlicher Aggregatgröße und -Form wird also während des Verfahrens unter Einfluss des Wirkstoffs verändert. Während einige amyloide und/oder aggregierende Peptide und/oder Proteine mit einer bestimmten Größe anfänglich in der Probe vorhanden waren, werden diese unter Einfluss des Wirkstoffs reduziert oder sogar vorteilhaft vollständig eliminiert. Andere Partikelgrößen nehmen unter dem Einfluss des Wirkstoffs zu oder bleiben konstant.

Die Partikel, die aus den amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen gebildet sind, werden voneinander getrennt. Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass aus der Probe eine Mehrzahl an Fraktionen erhalten wird. In den Fraktionen sind die Partikel an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit jeweils einer bestimmten Aggregatgröße und -Form enthalten. Diese Trennung der Partikel kann vorteilhaft mittels einer Dichtegradientenzentrifugation nach dem s-Wert vorgenommen werden. Andere physikalische Parameter der Aggregate können ebenfalls als Grundlage der vorzunehmenden Fraktionierung herangezogen werden, z. B. der hydrodynamische Radius der Partikel. Die Fraktionen werden räumlich voneinander getrennt, z. B. durch Abpipettieren. Man ist also nicht auf eine Dichtegradientenzentrifugation ein- geschränkt. Die Dichtegradientenzentrifugation hat aber den Vorteil alle ursprünglich in der Probe vorhandenen Aggregate der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine für eine weitere quantitative Analyse bereit zu stellen. Andere Trennmethoden sind geeignet wie z. B. die Größenausschlusschromatographie mit Trennung nach dem hydrodynamischen Radius. Abschließend wird die Konzentration an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen in der jeweiligen Fraktion bestimmt.

Dadurch wird vorteilhaft die Konzentrationsänderung an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit jeweils bestimmter Größe quantitativ unter dem Einfluss des Wirkstoffs ermittelt. Durch einen Vergleich mit Kontrollen ohne den Wirkstoff kann der Einfluss des Wirkstoffes auf die Verteilung der Aggregate der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine in der jeweiligen Fraktion quantitativ bestimmt werden. Hierdurch erhält man ein Maß unter anderem über die Wirksamkeit des Wirkstoffes hinsichtlich seiner Fähigkeit bestimmte Spezies aus der Probe zu eliminieren, z. B. toxische Oligomere. Es ist möglich, eine einzige Fraktion auf diese Weise zu untersuchen. Man erhält dann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Maß über die Fähigkeit des Wirkstoffs die bestimmten Konformere aus der Fraktion quantitativ zu verändern, z. B. toxische Oligomere aus der Probe zu eliminieren.

Vorteilhaft wird so ein Verfahren bereitgestellt, bei dem die Änderung des Anteils an Monomeren und/oder Oligomeren und / oder Fibrillen und / oder besonders großen Aggregaten unter dem Einfluss des Wirkstoffes quantitativ bestimmt werden kann. In einer Ausgestaltung der Erfindung wird auch die Änderung der Formverteilung der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss des Wirkstoffes untersucht, z. B. durch Kraftfeldmikroskopie. Auf diese Weise wird vorteilhaft neben der Änderung der Partikelgrößenverteilung auch die Änderung der Formverteilung der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss des Wirkstoffs erfasst, überprüft und/oder bestätigt.

Vorzugsweise werden mehrere Wirkstoffe in einem Screeningverfahren hinsichtlich des Einflusses auf die Partikelgrößenverteilung der Probe in vitro getestet. Ganz besonders vorteilhaft ist das Verfahren geeignet für das Screening potentieller Wirk- stoffe gegen die Alzheimersche Demenz (AD) basierend auf der Modulation der toxischen Amyloid-ß (Aß)-Oligomere unter dem Einfluss des Wirkstoffes.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert zudem ein umfassendes, quantitatives Ergebnis in Hinblick auf die sich ändernde Partikel- bzw. Aggregatgrößenverteilung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine unter dem Einfluss des Wirkstoffes. Damit werden die erfolgversprechendsten Wirkstoffe, z. B. für eine Therapie der Alzheimerschen Demenz vorselektioniert, welche die Konzentration an löslichen toxischen Bestandteilen wie z. B. den Aß-Oligomeren verringern.

Das Verfahren ist hierauf nicht beschränkt. Ohne eine Einschränkung des Verfahrens erlaubt dieses darüber hinaus auch die Feststellung, ob der Wirkstoff zu einer Zu- nähme anderer potentiell toxischer oder erwünschter Spezies in der Probe führt. Hierzu zählen im Falle der Alzheimerschen Demenz z. B. die Aß(1-42)-Monomere und/oder -Fibrillen. Vorzugsweise wird das Verfahren angewendet bei der Ermittlung von Wirkstoffen die nach heutigem Erkenntnisstand nicht zu einer Zunahme anderer toxischer Bestandteile führen. Hierzu werden besonders vorteilhaft mehrere der erhaltenen Fraktionen auf Konzentrationsänderung der Bausteine erfindungsgemäß untersucht.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine Probe vorbereitet, welche wenig oder gar keine Fibrillen und/oder größere Aggregate umfasst. Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass deren Bildung unter Einfluss des Wirk- Stoffes besonders einfach nachgewiesen werden kann. Besonders vorteilhaft erfolgt die Fraktionierung der in der Probenlösung befindlichen amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine mittels einer Dichte- gradientenzentrifugation unter Verwendung von z. B. Optiprep, Percoll, Saccharose oder analogem Dichtegadientenmaterial. Die Aggregate werden dabei nach der Grö- ße und gegebenenfalls der Form (Sedimentationskoeffizient) voneinander getrennt. Dieses Verfahren ist besonders bei aggregierenden Aß(1-42) Aggregaten und Tau- Aggregaten vorteilhaft.

Der Begriff„exakt bestimmt" umfasst besonders vorteilhaft einen Kalibrierungsschritt bei der Fraktionierung durch Moleküle bekannter Art und Verhaltens. Nach der Frak- tionierung liegt in jeder Fraktion nur eine bestimmte (das heißt bekannte) Art an Konformer vor, z. B. Oligomere oder Fibrillen und so weiter.

Bei der Dichtegradientenzentrifugation als Fraktionierungsschritt werden die Konformere nach ihrem s-Wert oder Sedimentationskoeffizienten aufgetrennt. Moleküle unterschiedlicher Größe können einen identischen hydrodynamischen Radius besit- zen, haben aber dennoch unterschiedliche s-Werte und werden danach auch aufgetrennt. Durch eine Kalibration mit Molekülen von bekanntem s-Wert sind die mittels Dichtegradientenzentrifugation erhaltenen Aggregate exakt nach ihrem s-Wert bestimmt.

Alternativ kann eine mehrstufige differentielle Zentrifugation vorgenommen werden, bei der stufenweise anhand der gewählten Zentrifugalkraft Aggregate entsprechend ihrem Sedimentationskoeffizienten absedimentiert werden. Auch dieses Verfahren ist besonders bei aggregierenden Aß(1-42) Aggregaten und Tau-Aggregaten vorteilhaft.

Alternativ kann auch eine Größenausschlusschromatographie angewendet werden, bei der nach dem hydrodynamischen Radius getrennt wird. Alternativ erfolgt die Fraktionierung durch Asymmetrische-Fluss-Feldflussfraktionierung, oder mittels Kapillarelektrophorese.

Auch diese Verfahren sind zur Kalibration geeignet.

Die Konzentrationsänderung an amyloiden und/oder aggregierenden Peptiden und/oder Proteinen mit einer bestimmten Größe in einer jeweiligen Fraktion wird in einer ganz besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung nach der Zugabe des Wirkstoffs durch eine vollständige Denaturierung der amyloiden Peptide und/oder Proteinbausteine während einer im Anschluss an die Fraktionierung durchgeführten Umkehrphasen-(RP-) HPLC bestimmt. Eine vollständige Denaturierung kann allgemein gesprochen über eine physikochemische Reaktion mit einem denaturierenden Agenz oder über die Temperatur erfolgen. Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass ausschließlich die Monomer Bausteine der quantitativen Analyse zugeführt werden.

In einer ganz besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt der Schritt der Denaturierung quasi per se durch die Säulenchemie und Temperatur. Hierdurch werden Schritte bei der Aufarbeitung der Probe eingespart, so dass das erfindungsgemäße Verfahren sehr schnell durchgeführt werden kann.

Grundsätzlich lässt sich die Konzentration der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine in der jeweiligen Fraktion aber auch durch Isotopenmar- kierung des verwendeten Peptids und/oder Proteins und anschließend an die Fraktionierung erfolgender Szintillationszählung der Fraktionen bestimmen.

Um festzustellen, welchen Einfluss die Wirkstoffzugabe auf vorhandene Oligomere hatte, wird die Lösung daher zunächst inkubiert und vor oder nach der Wirkstoffzugabe dann vorzugsweise auf einen vorgeformten Dichtegradienten aufgeschichtet und die darin enthaltenen Aggregat-Partikel entsprechend durch Ultrazentrifugation getrennt. Dabei spielt die Partikelgröße eine wichtige Rolle. Im Laufe dieser Zentrifu- gation sind auf diese Weise z. B. unterschiedliche Aß-Aggregate, wie Monomere, Oligomere und Fibrillen oder amorphe Aggregate nach ihrem unter anderem von der Partikelgröße abhängigen Sedimentationskoeffizienten voneinander getrennt. Diese werden fraktioniert geerntet.

Bei der Dichtegradientenzentrifugation werden die unterschiedlichen Aggregate nach ihrem s-Wert voneinander getrennt. Je größer der Partikel ist, desto weiter wandert er in den Gradienten ein. In den geernteten Fraktionen wird die Konzentration des (Aß-) amyloiden und/oder aggregierenden Peptids und/oder Proteins mittels RP- HPLC bestimmt. Dazu wird die Fraktion des Gradienten, welche unter den verwendeten Zentrifugati- onsbedingungen Partikel mit entsprechender Größe enthält, vorzugsweise komplett denaturiert und durch RP-HPLC analysiert.

Die Denaturierung der Aggregate zu Monomeren kann z. B. auf einem RP-HPLC- Säulenmaterial wie z. B. einer C8-Säule mit etwa 30 % (v/v) Acetonitril und 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure als mobiler HPLC-Phase bei einer Säulentemperatur von etwa 80 °C vollständig erfolgen. Die entstehenden Monomere des amyloiden und/oder aggregierenden Peptids und/oder Proteins werden dann vorzugsweise durch RP-HPLC nach Hydrophobizität aufgetrennt. Dadurch werden vorteilhaft auch Aß-Spezies vom Dichtegradientenmaterial lodixanol, welches aufgrund seiner spektroskopischen Eigenschaften die Absorptionsmessung von Proteinen unmöglich macht, getrennt. Eluierendes Peptid, wie z. B. Aß, wird mittels der UV-Absorption bei 215 nm detektiert. Die Peakflächenintegration kann mittels Agilent Chemstation Software erfolgen. Die Verrechnung daraus entstandener Werte mit der zuvor durch- geführten Kalibrierung erlaubt die Berechnung der Konzentration des in der jeweiligen Fraktion vorhandenen Peptids bzw. Proteins. Je Fraktion sollte der Mittelwert aus mehreren z. B. sechs voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten mit der sich ergebenen Standardabweichung berechnet werden.

Der Vorteil der HPLC-Analyse liegt darin, dass man dann z. B. Aß unabhängig vom vorherigen Aggregationszustand sehr sensitiv detektieren (z. B. ca. 20 nM oder 1 ,8 ng Aß(1-42) und zuverlässig quantifizieren kann.

Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens kann daher in einer Kopplung von Dichtegradientenzentrifugation und RP-HPLC bestehen, welche eine zuverlässige Quantifizierung insbesondere auch von Aß-Oligomeren ermöglicht. Hierzu wird in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung die Fraktion, umfassend toxische Oligomere mit und ohne Wirkstoffzugabe und ihre Veränderung der Konzentration untersucht.

Überraschend wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass die während der RP- HPLC verwendete mobile Phase in Kombination mit der erhöhten Säulentemperatur eine vollständige Denaturierung der in allen möglichen Aggregationszuständen vorliegenden Aß-Spezies gewährleistet. Ein Fachmann kann die Chemie und Temperatur der Bedingungen dieses Verfahrensschrittes anpassen, so dass die gewünschte Denaturierung der Probe erfolgt. Diese Erkenntnis ist insofern überraschend, da einige der bei der Alzheimerschen Demenz auftretenden Aß-Spezies besonders hohe Tendenzen zur Aggregation zeigen. Auch in diesem Fall ist aber die Denaturierung der amyloiden und/oder aggregierenden Peptide und/oder Proteine zu Monomer gewährleistet.

Besonders überraschend ist zudem, dass mit einer RP-HPLC auch das durch Dena- turierung als Monomer vorliegende amyloide und/oder aggregierende Peptid und/oder Protein von der den Dichtegradienten ausbildenden Substanz sauber getrennt wird und der quantitativen Analyse reproduzierbar zugänglich gemacht wird.

Durch die besonders vorteilhafte Kombination einer Dichtegradientenzentrifugatio basierenden Fraktionierung und der Konzentrationsbestimmung mit RP-HPLC wurde somit ein Verfahren entwickelt, welches besonders schnell den Einfluss potentieller Wirkstoffe auf den Anteil an toxischen Oligomer-Spezies eines Aß(1-42)-Peptids oder anderer Peptide und/oder Proteine quantifiziert, da es dabei auf die Monomerform abstellt.

Ein Vergleich der Kontrolle mit der einen Wirkstoff oder einen natürlichen Liganden beinhaltenden Probe erlaubt eine reproduzierbare und schnelle Bestimmung der Wirkstoffeffektivität bezüglich der Eliminierung und Reduktion bestimmter Spezies wie z. B. Oligomere und somit eine Abschätzung seiner Wirkung in einem Tiermodel und später in den klinischen Testphasen. Im Gegensatz hierzu ist gemäß des Stands der Technik nur die Möglichkeit beschrieben, den Einfluss einer Substanz auf den Aß-Oligomer Gehalt zu quantifizieren.

Ganz besonders vorteilhaft erhält man gleichzeitig aber auch durch entsprechende HPLC-Analyse und -Quantifizierung auch Daten zum Einfluss, den der Wirkstoff auf die Zunahme des amyloiden und/oder aggregierenden Peptids und/oder Proteins in anderen Fraktionen hat, z. B. auf Aß-Monomere und/oder Fibrillen enthaltende Fraktionen.

Es ist denkbar, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl an potentiellen Wirkstoffen hinsichtlich ihres Einflusses auf die Partikelgrößen-Verteilung amyloider und/oder aggregierender Peptide und/oder Proteine in einer Probe schnell und reproduzierbar quantifiziert werden. Die Probe kann dabei synthetischer Art sein. Es können aber auch natürliche Wirkstoffe oder entnommene Proben auf diese Weise untersucht werden.

Ausführungsbeispiele Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde angewendet, um den Effekt von D3 (D- Enantiomer) gemäß SEQ ID NO: 1 auf Aß-Oligomere zu quantifizieren. Zu Überprü- fung in einem Screening wurde ein Dimer von D3 synthetisiert und im oben beschriebenen Assay eingesetzt, um zu überprüfen, ob D3D3 (D-Enantiomer) tatsächlich noch effizienter als D3 ist.

Für die nachfolgenden Ausführungsbeispiele wurden lediglich eine Ultrazentrifuge und eine HPLC-Anlage mit passender Trennsäule und einem UV-Detektor benötigt. Zur Ermittlung der Reduzierung des Aß-Oligomer-Anteils in einer Aggregatmischung wurde vorbehandeltes und getrocknetes Aß(1-42)-Peptid in Puffer gelöst und so lange inkubiert, dass ein möglichst großer Aß-Oligomer-Anteil entstand. Zu dieser mit Oligomeren angereicherten Probe wurde entsprechend der zu analysierende Wirkstoff zugegeben. Es zeigen:

Figur 1 : Säulenchromatogramme einer RP-HPLC für unterschiedliche

Aggregationszustände des Aß(1-42)-Peptids.

Figur 2: Chromatogramme der RP-HPLC für die Fraktionen 1 bis 15 eines Dichtegradienten mit den daraus berechneten Konzentrationen je Fraktion.

Figur 3: Gemittelte Größenverteilung für sechs Aß(1-42)-Kontrollen ohne Wirkstoffzusatz nach Dichtegradientenzentrifugation und RP-HPLC.

Figur 4: Anwendung des vorgestellten Verfahrens auf die Analyse potentieller Wirkstoffe für die Therapie der Alzheimerschen Demenz am Beispiel eines D-Peptids (D3) und seines Tandem-Dimers (D3D3).

Figur 5: Versuchsansatz zur quantitativen Charakterisierung von amyloidem und/oder aggregierendem Aß ohne und mit Wirkstoff, sowie Festeilung der Änderung der Konzentration von Monomeren in verschie-denen Fraktionen nach Denaturierung während und mit der RP-HPLC und Wirkstoffzugabe.

Material und Methoden

1 mg lyophilisiertes Aß(1 -42) (Bachem, Heidelberg) wurde nach der Entnahme aus dem Gefrierschrank für 10 bis 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert, um die Temperatur des Peptidpellets und der Umgebung an einander anzugleichen und somit die Einkondensation von Luftfeuchtigkeit zu vermeiden. Danach wurde das Aß-Peptid in HFIP (1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in einer Konzentration von 1 mg/700 μΙ gelöst und zur vollständigen Lösung über Nacht unter Schütteln bei RT inkubiert, um sicher zu stellen, dass zu diesem Zeitpunkt das Aß(1-42) vollständig in Monomere aufgespalten vorliegt. Anschließend wurde das Aß(1-42) je 36 g pro Eppendorfgefäß aliquotiert. Um das HFIP zu entfernen, wurden die Aliquots unter dem Abzug für ca. 30 min offen stehen gelassen. Der Rotations- Vakuumkonzentrator (Rotations-Vakuumkonzentrator RVC 2-18, Christ, Mainz-Mombach) wurde ca. 30 min vorgekühlt. Danach wurden die Aß(1-42)-Aliquots 30 min lang im Rotations-Vakuumkonzentrator nachgetrocknet, damit auch die letzten HFIP-Reste abdampfen konnten. Das aliquotierte, getrocknete Aß( 1-42) wurde bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

Vor dem Experiment wurde ein Aß(1-42)-Aliquot in 100 μΙ 10 mM

NaH ₂ P0 ₄ /Na ₂ HP0 ₄ -Puffer (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), pH 7,4 zu 80 μΜ gelöst und unter Schütteln bei RT für 6 h inkubiert. Die Inkubationszeit von 6 h wurde für dieses spezielle Aß dieser speziellen Firma optimiert, um sicher zu stellen, dass ein möglichst großer Anteil des Aß als Oligomer vorliegt, um dessen Verringerung möglichst eindeutig messen zu können. Für andere Aß-Peptide anderer Herstellerfirmen kann die Inkubationszeit variieren und soll/kann entsprechend angepasst werden.

Danach wurde der zu analysierende Wirkstoffkandidat zu 10 oder 20 μΜ zugegeben. Die Koinkubation der Aß-Wirkstoff-Lösung war hier stets unter Schütteln bei RT 40 min. Falls kein Wirkstoff zugegeben wurde (Kontrolle), wurde die Aß-Lösung auf die gleiche Weise behandelt. Anschließend wurden die Proben auf einen vorgeformten Dichtegradienten (siehe Tabelle 1) aufgeschichtet. Das verwendete Gradientenmaterial bestand aus einer 60 %igen (w/v) lodixanollösung mit dem Namen Optiprep™ (Axis-Shield, Oslo, Norwegen). Es ist eine dimere Verbindung des lohexols mit dem systematischen Namen 5,5-[(2-hydroxy-1 ,3-propandiyl)-bis(acetylimino)]bis-[N,N'-bis(2,3hydroxyprop yl)- 2,4,6-triiodo-benzendicarboxamid]. Die Herstellung des diskontinuierlichen Gradienten erfolgte, indem auf den Boden eines Polyallomer-Zentrifugen-Röhrchens (Beck- man-Coulter, Palo Alto, USA) mit den Abmessungen 11 x 34 mm die dichteste Op- tiprep-Verdünnung pipettiert und stufenweise mit den weniger dichten Verdünnungen überschichtet wurde. Der auf 10 mM NaH ₂ PO ₄ /Na ₂ HPO ₄ -Puffer, pH 7,4 eingestellte Gradient wurde gemäß der Tabelle 1 aus sechs Stufen aufgebaut. Volumen (μΙ) lodixanol (%, Dichte (g/ml)

w/v)

100 5 1 ,030

260 10 1 ,056

780 20 1 ,109

260 30 1 , 162

260 40 1 ,215

260 50 1 ,267

Tab. 1 : Volumina, Konzentration und Dichte der Gradientenstufen.

Der nicht lineare Dichtegradient wurde bei 4 °C und 259.000 x g in einem TLS-55- Ausschwingrotor (Beckman-Coulter, Palo Alto, USA) für 3 h in einer TL 100- Ultrazentrifuge (Beckman-Coulter, Palo Alto, USA) zentrifugiert. Durch refraktometri- sche Bestimmung der lodixanolkonzentration in den einzelnen Fraktionen wird der Dichtegradient vermessen. Eine Abschätzung der Größe von sedimentierten Proteinpartikeln anhand der Position im Gradienten am Ende der Zentrifugation erfolgt anhand einer Kalibrierung mit Markerproteinen bekannter Größe und Form, welche unter identischen Zentrifugationsbedingungen auf dem Gradienten analysiert wurden.

Das Ernten der Fraktionen erfolgte von oben nach unten durch vorsichtiges Abpipettieren. Man erhielt 14 Fraktionen von je 140 μΙ. Somit war die 1. Fraktion die mit der geringsten und die 14. Fraktion die mit der höchsten Dichte. Möglicherweise pelletiertes Protein wurde in die Analyse miteinbezogen. In das abgeerntete Zentrifugenröhr- chen wurden 60 μΙ 6 M Guanidiniumchlorid (GdnCI) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gegeben und 10 min bei 98 °C gekocht. Das auf diese Weise aufbereitete Pellet stellte die 15. Fraktion dar.

Nach dem Fraktionieren des Zentrifugenröhrchen-Inhaltes wurde jede Fraktion mit- tels RP-HPLC (HPLC-System Agilent 1260 Infinity; quarternäre HPLC Pumpe mit Solvens-Entgaser G1311 B, Säulentemperiereinheit G1316A, Multiwellenlängende- tektor G1365C, manueller Injektor G1328C; Agilent, Waldbronn) analysiert. Als stationäre Phase wurde eine Zorbax SB-300 C8-Säule (5 μ, 4,8 x 250 mm, Agilent, Waldbronn) verwendet. Die Trennung der Substanzen erfolgte isokratisch mit 30 % (v/v) Acetonitril, 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure in H ₂ 0 als mobiler Phase mit einer Flussrate von 1 ml/min bei einer Säulentemperatur von 80 °C. Das Probenvolumen betrug 20 μΙ. Eluierende Substanzen wurden mittels UV-Absorption bei 215 nm de- tektiert. Datenaufzeichnung und Peakflächenintegration erfolgte mittels Agilent Chemstation Software (Agilent, Waldbronn). Durch die Verwendung der RP-HPLC wird das in den Fraktionen vorhandene Dichtegradientenmaterial lodixanol von dem Aß(1 -42)-Peptid getrennt. Erst durch diese Trennung ist es möglich Aß spektroskopisch zu detektieren, da ohne Abtrennung die starke Absorption des lodixanols im UV-Bereich die Absorption des Aß-Peptids überdeckt.

Die Bestimmung der molaren Aß-Konzentrationen erfolgte mittels einer Kalibrierung der Säule mit Aß-Lösungen mit bekannten Konzentrationen (Aß-Verdünnungsreihe). Die für den linearen Zusammenhang zwischen Fläche und Peptid-Konzentration angepasste Regressionsgerade hat ein Bestimmtheitsmass R ² von 0.998. Aufgrund dieser Quantifizierung ist es möglich für jeden Lauf die Rückgewinnungsrate des aufgetragenen Aß42 Peptids zu berechnen. Zu diesem Zweck werden die pro Fraktion bestimmten molaren Konzentrationen durch Multiplikation mit dem Fraktionsvolumen 140x10 ^"6 l (Fraktionen 1 bis 14) und 120x10 ^"6 l (Fraktion 15) in mol/Fraktion umgerechnet aufsummiert. Der Quotient aus dieser Summe und der Anzahl der in der aufgetragenen Probe enthaltenen Mole Aß-Peptid ergibt in Prozent dargestellt die Rückgewinnungsrate R.

Mit c _p Molare Konzentration Aß im Pellet, c _n Molare Konzentration Aß in den

Fraktionen 1 bis14, c ₀ Molare Konzentration Aß vor DGZ, V _F Fraktionsvolumen (140x10 ^"6 l), V _P Volumen der Pelletfraktion (120x10 ^"6 l) und V ₀ Probenvolumen vor DGZ (100x10 ^"6 l).

Die Rückgewinnungsrate betrug zwischen 0,8 und 1 ,0, bzw. zwischen 80 und 100 %. Durch die hohe Rückgewinnungsrate ist garantiert, dass die gewonnenen Daten den Zustand der gesamten Probe wieder spiegeln und nicht nur einen Anteil der Probe beschreiben.

Der Vorteil der RP-HPLC Methode gegenüber anderen Methoden besteht darin, dass die Quantifizierung des Abeta-Peptids unabhängig von seinem vorherigen

Aggregationszustand, d. h. Monomer, Oligomer oder Fibrille, ist. Dies ist z. B. nicht bei immunochemischen Nachweismethoden garantiert, da durch die Aggregation die Antikörper-bindenden Epitope möglicherweise schlechter oder gar nicht mehr zugängig sind.

Es wurde gezeigt, dass die Denaturierung der irgendwie in der Probe vorliegenden Aß 1 -42 Partikel immer zu Monomeren führt. Diese sind unabhängig von der ursprünglichen Struktur besonders vorteilhaft quantifizierbar. Hierdurch werden zuverlässig die verschiedenen Spezies wie Oligomere, Fibrillen und amorphe Aggregate immer als Monomer reproduzierbar quantifiziert.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt Säulenchromatogramme einer RP-HPLC für unterschiedliche

Aggregationszustände des Aß(1-42)-Peptids. Je Probe wurden 20 μΙ Lösung mit 1.8 ng Aß(1-42) auf eine C8-Säule (5 μ, 4,8 x 250 mm) injiziert und mit 30 % (v/v) Acetonitril, 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure in H ₂ 0 als Eluent mit einer Flussrate von 1 ml/min bei einer Säulentemperatur von 80 °C eluiert. Aufgetragen ist die relative Absorption bei 215 nm des Eluats gegenüber der Retentionszeit für frisch gelöstes (0 h), 2,5 h, 19 h und 60 h vorinkubiertes Aß(1-42), welches auf 40 % (w/v) lodixanol eingestellt wurde, um die Bedingungen des Dichtegradienten zu simulieren, lodixanol eluiert deutlich vor Aß(1-42) mit einer Retentionszeit zwischen 2 und 5 min. Das Chromatogramm dokumentiert deutlich die perfekte Abtrennung des die Detektion des Aß im UV behindernden lodixanols und die reproduzierbare Quantifizierung des Aß-Peptids unabhängig davon, ob es in einer Probe als Monomer, Oligomer oder als Fibrille vorlag.

Figur 2 zeigt Chromatogramme der RP-HPLC für die Fraktionen 1 bis 15 eines Diehtegradienten mit den daraus berechneten Konzentrationen je Fraktion. Nach der Präparation einer mit Oligomeren angereicherten Aß(1-42)-Probe wird diese auf einen lodixanol-Dichtegradienten aufgeschichtet und mit 259.000 g bei 4 °C 3 h lang zentrifugiert. Dabei werden unterschiedliche Aß-Aggregate nach ihrem s-Wert voneinander getrennt. Je größer der Partikel ist, desto weiter wandert er in den Gradienten ein. In den 14 von oben nach unten geernteten 140 μΙ großen Fraktionen und dem mit 60 μΙ 6 M GdnCI aufgekochten Pellet (Fraktion 15) wird die Konzentration des Aß(1-42)-Peptids mittels RP-HPLC bestimmt. Hierzu werden 20 μΙ jeder Fraktion auf einer C8-Säule mit 30 % (v/v) Acetonitril und 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure bei einer Säulentemperatur von 80 °C vollständig denaturiert und nach Hydrophobizität aufge- trennt. Dabei wird das Aß(1-42) vom Dichtegradientenmaterial lodixanol, welches aufgrund seiner spektroskopischen Eigenschaften die Absorptionsmessung von Proteinen unmöglich macht, getrennt. Eluierendes Aß(1-42) wird mittels UV- Absorption bei 215 nm detektiert. Peakflächenintegration erfolgt mittels Agilent Chemstation Software. Die Verrechnung daraus entstandener Werte mit der zuvor durchgeführten Kalibrierung erlaubt die Berechnung der Konzentration des in der jeweiligen Fraktion vorhandenen Aß-Peptids. Wie zuvor in Figur 1 gezeigt sind hier nun die Elutionsverläufe für alle geernteten Fraktionen eines Dichtegradienten in einer Figur zusammengefasst (A). Wesentlich ist die Konstanz der Retentionszeit für das Aß(1-42) unabhängig von der Position im Gradienten und damit von dem Aggre- gationszustand des Peptids. Im Diagramm (B) sind die anhand der für die Säule bestimmten Kalibrationsgeraden aus den Peakflächen errechneten Aß-Konzentrationen in mol/Liter dargestellt. Figur 3 zeigt die gemittelte Größenverteilung für sechs Aß(1-42)-Kontrollen ohne Wirkstoffzusatz nach Dichtegradientenzentrifugation und RP-HPLC. Pro Fraktion ist jeweils der Mittelwert aus sechs voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten mit der sich ergebenen Standardabweichung dargestellt. In den ersten Fraktio- nen findet sich das Aß(1-42)-Peptid wieder, welches zum Zeitpunkt der Fraktionierung als Monomer vorlag. Deutlich sind in den Fraktionen 4 bis 6 Oligomere des Aß(1-42)-Peptids zu erkennen, welche während der Vorinkubation entstanden sind. Aufgrund ihrer Position im Gradienten und dem Vergleich mit Proteinen bekannter s- Werte haben diese einen s-Wert von ca. 5 S. Aufgrund des s-Wertes und unter der Annahme einer globulären Form sind diese Oligomere aus ca. 20 monomeren Einheiten aufgebaut. Kraftfeldmikroskopie-Analysen konnten die globuläre Form dieser Partikel bestätigen. Toxizitätstests mit den fraktionierten Oligomeren zeigten deren neurotoxische Eigenschaften. Durch die Kombination von Dichtegradienten- Fraktionierung und Konzentrationsbestimmung mit RP-HPLC wurde ein Verfahren entwickelt, welches erlaubt, den Einfluss potentieller Wirkstoffe auf den Anteil an einer toxischen Oligomerspezies des Aß(1-42) Peptids Anteile von Aß-Oligomeren in einer Probe sowie Einflüsse auf deren Quantität durch potentielle Wirkstoffe zu analysieren.

Figur 4 zeigt die Anwendung des vorgestellten Verfahrens auf die Analyse potentiel- ler Wirkstoffe für die Therapie der Alzheimerschen Demenz am Beispiel eines D- Peptids (D3) und seines Tandem-Dimers (D3D3). Das Diagramm zeigt die Wirkung von 20 μΜ D3 gemäß SEQ ID NO: 1 und 10 μΜ D3D3, gemäß der SEQ ID NO: 2 auf die Größenverteilung der Aß(1-42)-Aggregate in einem Dichtegradienten. Nach Vorbereitung einer oligomerreichen Aß-Probe wird der zu testende Wirkstoff zugegeben. Dieser Ansatz wird nach einer 40 minütigen Inkubation auf einen lodixanol-

Dichtegradienten aufgeschichtet und mit 259.000 g bei 4 °C 3 h lang zentrifugiert. Als Kontrolle wird eine identisch behandelte Aß(1-42)-Lösung ohne Wirkstoffzugabe eingesetzt. Durch die Zentrifugation werden unterschiedliche Aß-Aggregate nach ihrem Sedimentationskoeffizienten (s-Wert) aufgetrennt. Je größer der s-Wert der Partikel ist, desto weiter wandert er in den Gradienten ein. Anschließend wird der Gradient manuell von oben nach unten fraktioniert. Es resultieren 14 Fraktionen mit je140 μΙ und eine 60 μΙ Pelletfraktion, welche mit 60 μΙ 6 M GdnHCI aufgekocht wird. Aß-Oligomere, bestehend aus ca. 20 monomeren Einheiten (s-Wert beträgt ca. 5 S), finden sich in den Fraktionen 4 bis 6 wieder. Für jeden Gradienten wird von allen Fraktionen jeweils ein 20 μΙ Aliquot mittels RP-HPLC analysiert. Zur Bestimmung der Aß-Konzentration pro Fraktion wird Aß in dem Aliquot auf einer C8-Säule mit einer mobilen Phase bestehend aus 30 % (v/v) Acetonitril und 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäu- re bei einer Säulentemperatur von 80 °C vollständig denaturiert und von dem Dichtegradientenmaterial lodixanol und dem Wirkstoff abgetrennt, so dass es durch seine UV-Absorption bei 215 nm detektiert und quantifiziert werden kann. Die Datenaufzeichnung und Peakflächenintegration erfolgt unter der Verwendung der Agilent Chemstation Software (Agilent, Waldbronn). Die so gewonnenen Konzentrationsdaten sind in dem Diagramm gegen die Nummern der Fraktion aufgetragen. In den Fraktionen 4 bis 6, in denen sich oligomere Aß-Spezies befinden, hat die Zugabe von D3 und D3D3 zu einer Verringerung der Menge an Oligomeren geführt. D3D3, welches nur halb so konzentriert eingesetzt worden war im Vergleich zu D3, zeigt in diesem Testsystem einen deutlich stärkeren Effekt als D3 in Bezug auf die Eliminierung oligomerer Aß-Spezies. Der Anteil an großen Aggregaten in den Fraktionen 1 1 bis 14 ist unter dem Einfluss der Wirkstoffe, insbesondere bei D3D3 deutlich größer. Die Kombination vom Dichtegradienten und der RP-HPLC stellt somit ein neues Verfahren zum Screening von Wirkstoffen für eine Therapie der Alzheimerschen Demenz und zur quantitativen Charakterisierung amyloider und/oder aggregierender Peptide bzw. Proteine dar, welches als neues Selektionskriterium die Fähigkeit zur Eliminierung der Aß-Oligomere verwendet.

Figur 5 zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens in Kürze. Nach Vorinkubation von Aß, wird die Probe in einem Ansatz mit und ohne Wirkstoffzugabe weiter untersucht. Nach der Auftrennung in 15 Fraktionen mit Dich- tegradientenzentrifugation wird nach der Denaturierung während der RP-HPLC die Konzentration an Monomerbausteinen in vorzugsweise allen 15 Fraktionen bestimmt und insbesondere der Einfluss des Wirkstoffs auf die Oligomerkonzentration ermittelt.