Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines therapeutischen TNF-alpha Inhibitors

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der in vitro-Diagnostik und betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren.

Inhibitoren des Tumornekrosefaktor-alpha Proteins (TNF-alpha, TNF-a, Kachektin) werden als Medikamente zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, wie z.B. Morbus Crohn, Morbus Bechterew, Psoriasis und insbesondere rheumatoider Arthritis, eingesetzt. Bei den TNF-alpha-Inhibitoren handelt es sich um TNF-alpha-bindende Proteine, wie beispielsweise anti-TNF- alpha Antikörper oder Fragmente davon oder gentechnologisch hergestellte Fusionsproteine, die die extrazelluläre TNF- alpha-Bindungsdomäne des humanen TNF-Rezeptors umfassen. Alle therapeutisch wirksamen TNF-alpha Inhibitoren binden an TNF- alpha Protein und bewirken eine Inaktivierung des TNF-alpha Proteins, indem sie die Bindung von TNF-alpha Protein an die TNF-Rezeptoren verhindern.

Diverse TNF-alpha Inhibitoren sind für die Therapie von chronisch entzündlichen Erkrankungen zugelassen, wie z.B. Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab pegol oder Golimumab und diverse Biosimilars (biopharmazeutische

Nachahmerprodukte) .

Problematisch ist, dass nicht alle Patienten gleichermaßen auf die TNF-alpha Inhibitoren ansprechen. Es ist bekannt, dass die Serum- bzw. Plasmakonzentration von TNF-alpha

Inhibitoren deutlich mit den klinischen Symptomen der

behandelten Patienten korreliert. Die Wirksamkeit einer TNF- alpha Inhibitor-Therapie korreliert in der Regel mit der Menge von therapeutischem Antikörper, die kurz vor der nächsten Medikamentengabe im Serum oder Plasma des Patienten nachweisbar ist, dem sogenannten Talspiegel.

Individuelle Unterschiede in der Pharmakokinetik, das

Auftreten von Antikörpern gegen den therapeutischen TNF-alpha Inhibitor (sog. ADA' s, anti-drug antibodies) können den

Talspiegel und damit die Wirksamkeit einer TNF-alpha

Inhibitor-Therapie beeinflussen. Das Ausbleiben eines

Therapieerfolgs kann unterschiedliche Ursachen haben, wie beispielsweise eine Unterdosierung oder das Vorhandensein von anti-drug antibodies.

Um also eine TNF-alpha Inhibitor-Therapie optimal gestalten zu können, z.B. durch eine Änderung der Dosierung oder durch einen Wechsel zu einem anderen Präparat, ist es erforderlich, die Serum- bzw. Plasmakonzentration des therapeutischen TNF- alpha Inhibitors in einem behandelten Patienten

festzustellen .

Es sind unterschiedliche Verfahren zur quantitativen

Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren in

Patientenproben bekannt. Zum einen sind kommerzielle ELISA- Teste für die Bestimmung von spezifischen TNF-alpha

Inhibitoren bekannt, bei denen monoklonale Antikörper mit Spezifität für den jeweiligen TNF-alpha Inhibitor auf einer Mikrotiterplatte fixiert sind (IDKmonitor® Teste für

Adalimumab, Infliximab und Etanercept, Immundiagnostik AG, Bensheim, Deutschland) oder bei denen TNF-alpha Protein direkt oder indirekt auf einer Mikrotiterplatte fixiert ist (IDKmonitor® Test für Golimumab, Immundiagnostik AG,

Bensheim, Deutschland und Level Adalimumab und Level

Infliximab Teste von Sanquin, Amsterdam, Niederlande) .

Aus WO-Al-2016/110595 und WO-Al-2018/007327 sind

partikelverstärkte, turbidimetrische Verfahren zur

quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha

Inhibitoren in Patientenproben bekannt, bei denen Polystyrol- Partikel, die mit TNF-alpha Protein beschichtet sind, mit der Probe vermischt werden und die Agglutination in dem

Reaktionsgemisch gemessen wird. Vorteilhaft ist, dass es sich um einen universalen Testaufbau handelt, mit dem jeder therapeutische TNF-alpha Inhibitor nachweisbar ist. Für eine präzise Quantifizierung eines spezifischen TNF-alpha

Inhibitors ist lediglich eine mit demselben spezifischen TNF- alpha Inhibitor erstellte Kalibrationskurve erforderlich. Nachteilig ist jedoch, dass zusätzlich die Verwendung eines unspezifischen, TNF-alpha-Inhibitor-vernetzenden Liganden aus der Gruppe anti-Ig-Antikörper (z.B. Fc- oder Fab-spezifische Antikörper) , Protein G, Protein A, Protein H, Protein L und Protein A/G-Fusionsprotein erforderlich ist, um eine

hinreichende Sensitivität des Tests zu erreichen, damit alle therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren, insbesondere auch Etanercept (Markenname Enbrel, Pfizer) , nachweisbar sind.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand also darin, ein universales Verfahren zur

quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha

Inhibitoren in Patientenproben bereit zu stellen, das

hinreichend sensitiv ist, um alle therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren nachweisen zu können.

In Bezug auf die bekannten partikelverstärkten Verfahren bestand die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende

Aufgabe insbesondere darin, ein universales,

partikelverstärktes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren in Patientenproben bereit zu stellen, das hinreichend sensitiv ist, um alle therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren nachweisen zu können, ohne dass die Verwendung eines unspezifischen, TNF-alpha- Inhibitor-vernetzenden Liganden, erforderlich ist.

Es wurde gefunden, dass durch ein In-Kontakt-Bringen der Probe mit isoliertem, freiem TNF-alpha Protein und der nachfolgenden Zugabe eines TNF-alpha-Bindungspartners ein hinreichend sensitives Verfahren zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren erreicht wird, mit dem alle therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren nachweisbar sind. Der in der Probe enthaltene therapeutische TNF-alpha Inhibitor bindet an das zugegebene TNF-alpha Protein und verhindert damit die Bindung des nachfolgend zugegebenen TNF- alpha-Bindungspartners . Je mehr eines therapeutischen TNF- alpha Inhibitors in einer Probe enthalten ist, desto stärker inhibiert er die Entstehung eines Komplexes aus TNF-alpha Protein und dem zugegebenen TNF-alpha-Bindungspartner . Es handelt sich also im Wesentlichen um ein kompetitives

Testverfahren .

In Bezug auf partikelverstärkte Verfahren wurde insbesondere gefunden, dass durch ein In-Kontakt-Bringen der Probe mit isoliertem, freiem TNF-alpha Protein und der nachfolgenden Zugabe einer partikulären Festphase, die mit einem TNF-alpha- Bindungspartner beschichtet ist, ein hinreichend sensitives Verfahren zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren erreicht wird, mit dem alle

therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren nachweisbar sind, ohne dass die Verwendung eines unspezifischen, TNF-alpha- Inhibitor-vernetzenden Liganden, erforderlich ist. Der in der Probe enthaltene therapeutische TNF-alpha Inhibitor bindet an das zugegebene TNF-alpha Protein und verhindert damit die Bindung des nachfolgend zugegebenen Festphasen-gekoppelten TNF-alpha-Bindungspartners . Je mehr eines therapeutischen TNF-alpha Inhibitors in einer Probe enthalten ist, desto stärker inhibiert er die Agglutinationsreaktion.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines therapeutischen TNF-alpha Inhibitors in einer Probe. Das Verfahren umfasst folgende Schritte : a) Bereitstellen eines Reaktionsgemisches durch In- Kontakt-Bringen der Probe

i. mit isoliertem, freiem TNF-alpha Protein und

dann

ii. mit einem ersten TNF-alpha-Bindungspartner; b) Bestimmen der Menge eines in dem Reaktionsgemisch entstehenden Komplexes aus TNF-alpha Protein und dem ersten TNF-alpha-Bindungspartner; und dann

c) Bestimmen der Menge des therapeutischen TNF-alpha

Inhibitors in der Probe durch Vergleichen der so bestimmten Menge des Komplexes aus TNF-alpha Protein und dem ersten TNF-alpha-Bindungspartner in dem Reaktionsgemisch mit Mengen eines Komplexes aus TNF- alpha Protein und dem ersten TNF-alpha- Bindungspartner in Reaktionsgemischen enthaltend Proben mit bekannten Konzentrationen eines TNF-alpha- Bindungspartners .

Bei der Probe kann es sich um eine Körperflüssigkeitsprobe handeln, vorzugsweise um eine humane Körperflüssigkeitsprobe, wie z.B. Vollblut, Plasma, Serum oder Urin. Üblicherweise stammt die Körperflüssigkeitsprobe von einem Patienten, dem ein therapeutischer TNF-alpha Inhibitor verabreicht wurde.

Das Verfahren eignet sich zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren, die an TNF-alpha

Protein binden, wie beispielsweise anti-TNF-alpha Antikörper oder Fragmente davon oder gentechnologisch hergestellte

Fusionsproteine, die die extrazelluläre TNF-alpha- Bindungsdomäne des humanen TNF-Rezeptors umfassen. Alle therapeutisch wirksamen TNF-alpha Inhibitoren binden an TNF- alpha Protein und bewirken eine Inaktivierung des TNF-alpha Proteins, indem sie die Bindung von TNF-alpha Protein an die TNF-Rezeptoren verhindern. Das Verfahren eignet sich

insbesondere zur quantitativen Bestimmung von therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren aus der Gruppe Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab pegol und Golimumab sowie deren Biosimilars .

Das isolierte, freie TNF-alpha Protein kann rekombinant oder synthetisch hergestelltes TNF-alpha Protein oder ein natives TNF-alpha Protein sein, das heißt, es kann aus natürlichen Quellen stammen, z.B. aus humanem Blut gereinigtes TNF-alpha Protein. Zur Herstellung von rekombinantem TNF-alpha Protein eignen sich bekannte prokaryotische oder eukaryotische

Expressionssysteme, wie z.B. die Expression in Bakterien (z.B. E. coli), in Hefen (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) , in pflanzlichen, tierischen oder humanen Zellkulturen (z.B. HEK-Zellen) . Zur Herstellung von

synthetischem TNF-alpha Protein eignen sich bekannte

Techniken zur in vitro-Proteinsynthese, wie z.B.

Festphasensynthesen (z.B. Merrifield-Synthese) .

Das TNF-alpha Protein ist vorzugsweise humanes TNF-alpha Protein. Der Begriff „TNF-alpha Protein" umfasst nicht nur das vollständige, sondern auch Fragmente des vollständigen TNF-alpha Proteins, an die therapeutische TNF-alpha

Inhibitoren binden können. Der Begriff „TNF-alpha Protein" umfasst ferner nicht nur das wildtypische TNF-alpha Protein oder Fragmente davon, sondern auch TNF-alpha Proteine mit einer oder mehr Aminosäuresubstitutionen, an die

therapeutische TNF-alpha Inhibitoren binden können. Das TNF- alpha Protein bzw. ein TNF-alpha Proteinfragment kann am N- Terminus mit einer heterologen Signalsequenz fusioniert sein, d.h. mit einem Polypeptid, das üblicherweise nicht in dem humanen TNF-alpha Protein vorhanden ist, die aber in dem gewählten Expressionssystem die Expression und/oder Sekretion des rekombinant exprimierten TNF-alpha Proteins positiv beeinflusst. Weiterhin kann das TNF-alpha Protein bzw. ein TNF-alpha Proteinfragment am C-Terminus mit einem oder mehreren Affinitäts-Tags fusioniert sein, die die Bindung des z.B. rekombinant exprimierten Proteins an einen

Affinitätsträger ermöglichen, wodurch z.B. die Reinigung von rekombinant exprimiertem TNF-alpha Protein ermöglicht wird. Bevorzugt sind kleine Affinitäts-Tags mit einer Länge von nicht mehr als 12 Aminosäuren. Besonders bevorzugt sind

Affinitäts-Tags aus der Gruppe His-Tag, Flag-Tag, Arg-Tag, c- Myc-Tag und Strep-Tag. Geeignete Affinitätsträger, die mit hoher Affinität an ein Affinitäts-Tag binden, sind z.B.

spezifische Antikörper, immobilisierte Kationen (z. B. Ni ²⁺ mit Affinität für His-Tags) oder andere Typen von Bindungspartnern (z.B. Streptavidin mit Affinität für Strep- Tags) . Der Begriff „isoliertes, freies TNF-alpha Protein" bezeichnet ein ungebundenes, unkonj ugiertes TNF-alpha

Protein, das beispielsweise weder mit einem Bindungspartner noch mit einer Festphase, noch mit einem detektierbaren

Label, noch mit einer Komponente eines signalbildenden

Systems assoziiert ist.

Nachdem die Probe mit isoliertem, freiem TNF-alpha Protein vermischt bzw. in Kontakt gebracht worden ist, wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise zunächst für einen Zeitraum von 1 Sekunde bis 10 Minuten, besonders bevorzugt für einen

Zeitraum von 5 Sekunden bis 5 Minuten inkubiert, bevor dann erst der erste TNF-alpha-Bindungspartner zugegeben wird.

Bevorzugterweise wird das Reaktionsgemisch bei einer

Temperatur von etwa 37 °C inkubiert. Dies stellt sicher, dass alle Moleküle eines in der Probe enthaltenen therapeutischen TNF-alpha Inhibitors an das zugegebene freie TNF-alpha

Protein binden und erhöht damit die Präzision der

quantitativen Bestimmung.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der erste TNF-alpha-Bindungspartner mit einer partikulären Festphase assoziiert, und es wird die

Agglutination der partikulären Festphase im Reaktionsgemisch gemessen, um die Menge des in dem Reaktionsgemisch

entstehenden Komplexes aus TNF-alpha Protein und dem ersten TNF-alpha-Bindungspartner zu bestimmen.

Unter dem Begriff „partikuläre Festphase" sind im Sinne dieser Erfindung nicht-zelluläre Teilchen zu verstehen, die einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 mpi aufweisen, üblicherweise zwischen 200 nm und 350 nm, bevorzugt zwischen 250 und 320 nm, besonders

bevorzugt zwischen 270 und 290 nm, ganz besonders bevorzugt 280 nm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus anorganischem

Material oder aus einer Mischung oder einer Kombination von beiden bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen oder nicht schwellfähigen

Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte des Wassers nahe kommt wie etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die bevorzugten Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange

suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise

durchsichtig oder undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie beispielsweise die sogenannten „core-and-shell" Partikel mit einem Kern und einer oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff

Mikropartikel umfasst beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel , Glaspartikel und

Magnetpartikel. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbare und aus wasserunlöslichem

Polymermaterial bestehende Partikel, insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind Latexpartikel z.B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren, Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril- Butadien-Styrol , Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat . Von besonderem Interesse sind

Latexpartikel mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung eines anti-TNF-alpha-Bindungspartners an die Latexpartikel erlauben. Humane, tierische, pflanzliche oder pilzliche Zellen oder Bakterien sind im Sinne dieser Erfindung explizit nicht von dem Begriff „partikuläre

Festphase" umfasst.

Der Begriff „assoziiert" ist breit zu verstehen und umfasst beispielsweise eine kovalente und eine nicht-kovalente

Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die

Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluss in eine Vertiefung oder einen Hohlraum etc. Bei einer kovalenten Bindung sind die Antikörper über eine chemische Bindung an die Festphase oder an eine Komponente eines signalgebenden Systems gebunden. Beispiele für eine nicht-kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluss in Hohlräume oder die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern.

Neben einer direkten Bindung an die Festphase oder die

Komponente eines signalgebenden Systems können die Antikörper auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit anderen spezifischen Bindungspartnern an die Festphase oder das Label gebunden sein. Dies soll anhand von Beispielen näher

illustriert werden: Der biotinylierte Antikörper kann über labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden, oder es kann ein Fluorescein-Antikörperkonj ugat über

festphasengebundene Anti-Fluorescein-Antikörper an die

Festphase gebunden werden, oder der Antikörper kann über Immunglobulin-bindende Proteine an die Festphase oder das Label gebunden werden.

Bei dem TNF-alpha-Bindungspartner, mit dem die partikuläre Festphase beschichtet ist, kann es sich um einen anti-TNF- alpha-Antikörper, ein Peptid- oder Nukleinsäure-Aptamer oder ein Peptid-Affirner handeln.

Bei dem anti-TNF-alpha-Antikörper, mit dem die partikuläre Festphase beschichtet ist, handelt es sich um ein

Immunglobulin, zum Beispiel ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgGi, IgG _2a/ IgG _2b/ IgG3, IgG ₄ , IgM. Der Antikörper weist mindestens eine Bindungsstelle (häufig Paratop genannt) für ein Epitop (häufig auch antigene

Determinante genannt) in dem TNF-alpha Protein auf. Ein solches Epitop ist zum Beispiel durch seine räumliche

Struktur und/oder durch das Vorhandensein von polaren

und/oder apolaren Gruppen gekennzeichnet. Die Bindungsstelle des Antikörpers ist komplementär zum Epitop. Die Antigen- Antikörper-Reaktion funktioniert nach dem sogenannten

„Schlüssel-Schloss-Prinzip" und ist in der Regel in einem hohen Grad spezifisch, d.h. die Antikörper vermögen kleine Abweichungen in der Primärstruktur, in der Ladung, in der räumlichen Konfiguration und der sterischen Anordnung des TNF-alpha Proteins zu unterscheiden.

Unter dem Begriff „Antikörper" sind im Sinne dieser Erfindung aber nicht nur komplette Antikörper zu verstehen, sondern ausdrücklich auch Antikörperfragmente, wie z.B. Fab, Fv, F(ab') _2/ Fab"; sowie auch Chimäre, humanisierte, bi- oder oligospezifische, oder „single chain" Antikörper; des

weiteren auch Aggregate, Polymere und Konjugate von

Immunglobulinen und/oder deren Fragmente, sofern die

Bindungseigenschaften an das TNF-alpha Protein erhalten sind. Antikörperfragmente lassen sich beispielsweise durch

enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin oder Papain herstellen. Antikörperaggregate, -polymere und - konjugate können durch vielfältige Methoden generiert werden, z.B. durch Hitzebehandlung, Umsetzung mit Substanzen wie Glutaraldehyd, Reaktion mit Immunglobulin-bindenden

Molekülen, Biotinylierung von Antikörpern und anschließende Reaktion mit Streptavidin oder Avidin, etc.

Bei einem anti-TNF-alpha-Antikörper im Sinne dieser Erfindung kann es sich um einen monoklonalen oder um einen polyklonalen Antikörper handeln. Der Antikörper kann nach den üblichen Verfahren hergestellt worden sein, z.B. durch Immunisierung eines Tieres, wie z.B. Maus, Ratte, Meerschweinchen,

Kaninchen, Pferd, Esel, Schaf, Ziege, Huhn etc. mit TNF-alpha Protein und anschließender Gewinnung des Antiserums; oder durch die Etablierung von Hybridomazellen und der

anschließenden Reinigung der sekretierten Antikörper; oder durch Klonierung und Expression der Nukleotidsequenzen bzw. modifizierter Versionen davon, die die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die Bindung des natürlichen Antikörpers an das TNF-alpha Protein verantwortlich sind.

Ist in der Probe ein therapeutischer TNF-alpha Inhibitor enthalten, bindet dieser in dem Reaktionsgemisch an das zugegebene freie TNF-alpha Protein und verhindert damit die Bindung des nachfolgend zugegebenen Festphasen-gekoppelten TNF-alpha-Bindungspartners , also die Entstehung eines

Komplexes aus TNF-alpha Protein und Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner . Nur freies, ungebundenes TNF-alpha Protein wird jetzt noch von dem Festphasen-gekoppelten TNF- alpha-Bindungspartner gebunden und bewirkt eine Agglutination der partikulären Festphase im Reaktionsgemisch. Je mehr eines therapeutischen TNF-alpha Inhibitors in einer Probe enthalten ist, desto stärker inhibiert er die Entstehung eines

Komplexes aus TNF-alpha Protein und Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner, also die Agglutinationsreaktion.

Die Messung der Agglutination der partikulären Festphase im Reaktionsgemisch kann photometrisch erfolgen, beispielsweise turbidimetrisch oder nephelometrisch . Bindungsteste beruhend auf dem Prinzip der partikelverstärkten Lichtstreuung sind seit etwa 1920 bekannt (zur Übersicht siehe Newman, D.J. et al . , Particle enhanced light Scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 1992; 29: 22-42). Bevorzugterweise werden in diesem Zusammenhang Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 0,1 bis 0,5 ym, besonders bevorzugt mit einem Durchmesser von 0,15 bis 0,35 ym verwendet. Bevorzugt werden

Polystyrolpartikel mit Amin-, Carboxyl- oder

Aldehydfunktionen verwendet. Weiterhin bevorzugt werden

Schale/Kern-Partikel verwendet. Die Synthese der Partikel und die kovalente Kopplung von Liganden ist z.B. in Peula, J.M. et al . , Covalent coupling of antibodies to aldehyde groups on polymer carriers. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 1995; 6: 779-785 beschrieben.

Alternativ kann die Messung der Agglutination der

partikulären Festphase im Reaktionsgemisch durch die Messung eines Signals erfolgen, das von einem signalbildenden System erzeugt wird, wenn eine erste und eine zweite Komponente des signalbildenden Systems in räumliche Nähe zueinander gebracht werden. In diesem Zusammenhang ist eine erste Fraktion der partikulären Festphase mit einer ersten Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert, und eine zweite Fraktion der partikulären Festphase ist mit einer zweiten Komponente des signalbildenden Systems assoziiert, wobei die erste und zweite Komponente des signalbildenden Systems so

Zusammenwirken, dass ein detektierbares Signal entsteht, wenn die erste und die zweite Komponente des signalbildenden

Systems in räumliche Nähe zueinander gebracht werden, und die Agglutination der partikulären Festphase im Reaktionsgemisch anhand des entstandenen Signals gemessen wird.

In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das signalbildende System mindestens eine erste und eine zweite Komponente, welche so _Z usammenwirken, dass ein detektierbares Signal entsteht, wenn sie in räumliche Nähe zueinander gebracht werden und dadurch miteinander in

Wechselwirkung treten können. Unter einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist insbesondere ein Energietransfer - also die direkte Übertragung von Energie zwischen den

Komponenten, z.B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung sowie über reaktive chemische Moleküle, wie z.B. kurzlebigen

Singulett-Sauerstoff - zu verstehen. Der Energietransfer kann von einer auf eine andere Komponente erfolgen, möglich ist aber auch eine Kaskade verschiedener Substanzen über die der Energietransfer läuft. Zum Beispiel kann es sich bei den Komponenten um ein Paar aus einem Energiespender und einem Energieempfänger handeln, wie beispielsweise Photosensitizer und chemilumineszierendes Agens (EP-A2-0515194 , LOCI®

Technologie) oder Photosensitizer und Fluorophor

(WO 95/06877) oder radioaktives Iod<125> und Fluorophor

(Udenfriend et al . (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 8672 -

8676) oder Fluorophor und Fluoreszenz-Quencher

(US 3,996,345). Besonders bevorzugt ist die erste Komponente des signalbildenden Systems ein chemilumineszierendes Agens und die zweite Komponente des signalbildenden Systems ein Photosensitizer oder umgekehrt, und es wird die

Chemilumineszenz im Reaktionsgemisch gemessen.

Nachdem die Agglutination in dem Reaktionsgemisch gemessen wurde (z.B. durch Bestimmung der maximalen

Absorptionsänderung des Reaktionsgemisches) , wird die so gemessene Agglutination mit der Agglutination in Reaktionsgemischen enthaltend Proben mit bekannten

Konzentrationen eines TNF-alpha-Bindungspartners verglichen. Dazu werden üblicherweise Proben mit verschiedenen, bekannten Konzentrationen eines therapeutischen TNF-alpha Inhibitors, eines anti-TNF-alpha-Antikörpers , eines TNF-alpha- spezifischen Peptid- oder Nukleinsäure-Aptamers oder eines TNF-alpha-spezifischen Peptid-Affimers (sogenannte

Kalibratoren) mit demselben Verfahren in Reaktionsgemischen vorab gemessen, und es wird eine Kalibrationskurve erstellt, an der dann die Konzentration der untersuchten Probe

abgelesen bzw. nach einem Umrechnungsschritt ermittelt werden kann .

Bei den oben beschriebenen Partikel-basierten

Agglutinationstesten handelt es sich um sogenannte homogene Verfahren, die sich dadurch auszeichnen, dass zum

quantitativen Nachweis des im Reaktionsgemisch entstandenen Komplexes aus TNF-alpha Protein und Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner keine Abtrennung von ungebundenem TNF-alpha Protein oder ungebundenem Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner erforderlich ist. Die Menge des in dem Reaktionsgemisch entstehenden Komplexes aus TNF-alpha Protein und Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner wird nach oder sogar während der Bindungsreaktion ohne einen weiteren Trenn- oder Waschschritt zur Abtrennung ungebundener Bindungspartner im Reaktionsgemisch gemessen.

Bei anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen

Verfahrens handelt es sich um sogenannte heterogene

Verfahren, die sich dadurch auszeichnen, dass zum

quantitativen Nachweis des im Reaktionsgemisch entstandenen Komplexes aus TNF-alpha Protein und Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner eine Abtrennung von ungebundenem TNF-alpha Protein und ungebundenem Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner erforderlich ist. Die Menge des in dem Reaktionsgemisch entstandenen Komplexes aus TNF-alpha Protein und Festphasen-gekoppeltem TNF-alpha-Bindungspartner wird erst nach Abtrennung des Komplexes von den übrigen

Bestandteilen des Reaktionsgemisches gemessen. Für die

Abtrennung des Komplexes werden mit der Festphase, an die der Komplex gebunden ist, ein oder mehrere Trenn- und/oder

Waschschritte durchgeführt. Anschließend wird die Festphase mit einem oder mehreren Reagenzien zum quantitativen Nachweis des Komplexes in Kontakt gebracht.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen

Verfahrens ist also der erste TNF-alpha-Bindungspartner mit einer Festphase assoziiert, und es wird zur Bestimmung der Menge des in dem Reaktionsgemisch entstehenden Komplexes aus TNF-alpha Protein und dem ersten TNF-alpha-Bindungspartner im Reaktionsgemisch in Schritt b) das Reaktionsgemisch von der Festphase abgetrennt. Anschließend wird die Festphase mit einem zweiten TNF-alpha-Bindungspartner in Kontakt gebracht, und es wird die Menge des zweiten TNF-alpha-Bindungspartners gemessen, der an den im Reaktionsgemisch entstandenen und mit der Festphase assoziierten Komplex aus TNF-alpha Protein und dem ersten TNF-alpha-Bindungspartner gebunden ist.

Bei der Festphase, mit der der erste TNF-alpha- Bindungspartner assoziiert ist, kann es sich um eine

partikuläre Festphase wie bereits weiter oben beschrieben handeln. Die Festphase kann jedoch auch aus den wie bereits weiter oben für die partikuläre Festphase beschriebenen

Materialien bestehen, aber andere Formen aufweisen, wie z.B. die Form eines Gefäßes, Röhrchens, einer

Mikrotitrationsplatte, einer Kugel, eines Stäbchens,

Streifens, Filter- oder Chromatographiepapiers etc.

Der zweite TNF-alpha-Bindungspartner, der nach der Abtrennung der Festphase für die quantitative Bestimmung der Menge des an die Festphase gebundenen Komplexes aus TNF-alpha Protein und erstem TNF-alpha-Bindungspartner mit der Festphase in Kontakt gebracht wird, ist vorzugsweise mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert. Bei der Komponente eines signalbildenden Systems kann es sich um ein Label handeln, dass selbst ein nachweisbares Signal erzeugt, so dass keine weiteren Komponenten notwendig sind. Viele organische Moleküle absorbieren ultraviolettes und sichtbares Licht, wobei diese Moleküle durch die

Lichtabsorption übertragene Energie in einen angeregten Energiezustand kommen können und die absorbierte Energie in Form von Licht einer anderen Wellenlänge als der des

eingestrahlten Lichts abgeben. Wieder andere Label können direkt ein nachweisbares Signal erzeugen wie z. B.

radioaktive Isotope oder Farbstoffe.

Bei der Komponente eines signalbildenden Systems kann es sich jedoch auch um ein Label handeln, dass zur Signalerzeugung weitere Komponenten benötigt, wie z.B. Substrate, Coenzyme, Quencher, Beschleuniger, zusätzliche Enzyme, Substanzen die mit Enzymprodukten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Ionen etc. Geeignete Label sind beispielsweise Enzyme einschließlich Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Glucoseoxidase, ß-Galactosidase,

Luciferase, Urease und Acetylcholinesterase ; Farbstoffe;

fluoreszierende Substanzen einschließlich

Fluoresceinisothiocyanat , Rhodamin, Phycoerythrin,

Phycocyanin, Ethidiumbromid, 5-Dimethylaminonaphthalen-l- sulfonylchlorid und fluoreszierende Chelate von seltenen Erden; chemilumineszierende Substanzen einschließlich

Luminol, Isoluminol, Acridiniumverbindungen, Olefin,

Enolether, Enamin, Arylvinylether, Dioxen, Arylimidazol, Lucigenin, Luciferin und Aequorin; Sensitizer einschließlich Eosin, 9, 10-Dibromoanthracen, Methylen Blau, Porphyrin, Phthalocyanin, Chlorophyll, Rose Bengal; Coenzyme;

Enzymsubstrate; radioaktive Isotope einschließlich ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹⁴ C, ³ H, ³² P, ³⁵ S, ¹⁴ C, ⁵¹ Cr, ⁵⁹ Fe, ⁵⁷ Co und ⁷⁵ Se; Partikel einschließlich magnetische Partikel oder Partikel, bevorzugt Latexpartikel, die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensitizern, fluoreszierenden Substanzen,

chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labein markiert sein können; Solpartikel einschließlich Gold- oder Silbersolen etc.

Bei dem zweiten TNF-alpha-Bindungspartner kann es sich, wie bereits weiter oben für den ersten TNF-alpha-Bindungspartner beschrieben, um einen anti-TNF-alpha-Antikörper, ein Peptid oder Nukleinsäure-Aptamer oder ein Peptid-Affirner handeln.

Bei dem ersten und zweiten TNF-alpha-Bindungspartner kann es sich um denselben Bindungspartner handeln, beispielsweise denselben monoklonalen anti-TNF-alpha-Antikörper, oder es kann sich um unterschiedliche Bindungspartner handeln, beispielsweise einen monoklonalen anti-TNF-alpha-Antikörper und ein Peptid-Aptamer oder zwei monoklonale anti-TNF-alpha- Antikörper, die an unterschiedliche Epitope des TNF-alpha Proteins binden.

Es wurde gefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung eines einzigen Universalkalibrators zur Bestimmung eines beliebigen therapeutischen TNF-alpha Inhibitors

erlaubt. Der Universalkalibrator kann entweder einen einzigen therapeutischen TNF-alpha Inhibitor, vorzugsweise aus der Gruppe Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab pegol und Golimumab und deren Biosimilars, oder ein Gemisch aus mindestens zwei unterschiedlichen therapeutischen TNF-alpha Inhibitoren oder deren Biosimilars oder einen anti-TNF-alpha- Antikörper oder ein TNF-alpha-spezifisches Peptid- oder

Nukleinsäure-Aptamer oder ein TNF-alpha-spezifisches Peptid- Affimer enthalten. Dies hat den Vorteil, dass ein einziges Testkit und ein einziger Kalibrator für die Bestimmung eines beliebigen therapeutischen TNF-alpha Inhibitors verwendet werden können und auf die Verwendung von Inhibitor

spezifischen Testkits oder Kalibratoren verzichtet werden kann. Unter einem „Universalkalibrator" ist auch ein Set von Kalibratormaterialien zu verstehen, die sich lediglich hinsichtlich der Konzentration des/der darin enthaltenen therapeutischen TNF-alpha Inhibitors oder Inhibitoren oder des anti-TNF-alpha-Antikörpers oder des TNF-alpha- spezifischen Peptid- oder Nukleinsäure-Aptamers oder des TNF- alpha-spezifischen Peptid-Affimers unterscheiden. Zwar zeigt nicht jede Kombination von zu bestimmendem therapeutischen TNF-alpha Inhibitor und Kalibrator die gleiche Reaktivität, jedoch können durch die Verwendung von linearen

Umrechnungsfunktionen bzw. von polynomen

Umrechnungsfunktionen (2ten bzw. 3ten Grades) die

unterschiedlichen Reaktivitäten der TNF-alpha Inhibitoren ausgeglichen und so korrekte Konzentrationen berechnet werden .

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zur Verwendung in einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines therapeutischen TNF-alpha Inhibitors in einer Probe und insbesondere zur Durchführung eines

erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Testkit enthält mindestens folgende Komponenten:

a) ein erstes Gefäß enthaltend ein Reagenz, das Reagenz enthaltend 50 yg - 2 mg/L isoliertes, freies TNF- alpha Protein; und

b) ein zweites Gefäß enthaltend einen ersten TNF-alpha- Bindungspartner .

Das Reagenz in dem ersten Gefäß enthält ein isoliertes, freies TNF-alpha Protein der Art, wie es bereits weiter oben beschrieben wurde, besonders bevorzugt ein rekombinantes TNF- alpha Protein. Das Reagenz enthält das TNF-alpha Protein in einer Endkonzentration von 50 yg - 2 mg/L, bevorzugterweise von 50 yg - 1 mg/L, ganz besonders bevorzugt von 100 yg - 0,5 mg/L. Das Reagenz kann in flüssiger Form in dem Gefäß

vorgesehen sein. Alternativ kann das Reagenz zum Zwecke der Langzeitstabilisierung auch als Lyophilisat vorgesehen sein, das erst kurz vor der Verwendung mit einem geeigneten

Lösungsmittelvolumen resuspendiert wird, so dass die

gewünschte Endkonzentration erreicht wird.

Für den Fall, dass einige oder alle Reagenzien des Testkits als Lyophilisate vorliegen, kann das Testkit zusätzlich die zur Lösung der Lyophilisate erforderlichen Lösemittel enthalten, wie z.B. destilliertes Wasser oder geeignete

Puffer .

Das zweite Gefäß des Testkits, das einen ersten TNF-alpha- Bindungspartner enthält, kann den ersten TNF-alpha- Bindungspartner in unterschiedlichen Ausführungsformen enthalten .

In einer Ausführungsform kann das zweite Gefäß ein Reagenz enthalten, das wiederum eine partikuläre Festphase enthält, vorzugsweise Latexpartikel, an die der erste TNF-alpha- Bindungspartner assoziiert ist. Bei dem Reagenz kann es sich um eine flüssige Suspension handeln oder um ein

resuspendierbares Lyophilisat derselben. Ein solches Testkit eignet sich für die Messung der Agglutination mittels photometrischer Methoden.

Eine andere Ausführungsform des Testkits enthält neben dem ersten Gefäß und dem zweiten Gefäß ferner ein drittes Gefäß, das einen zweiten TNF-alpha-Bindungspartner enthält. Dieses dritte Gefäß des Testkits kann den zweiten TNF-alpha- Bindungspartner in unterschiedlichen Ausführungsformen enthalten. Vorzugsweise enthält das dritte Gefäß ebenfalls eine partikuläre Festphase, die mit dem zweiten TNF-alpha- Bindungspartner, vorzugsweise mit einem anti-TNF-alpha- Antikörper beschichtet ist. Die partikuläre Festphase des Reagenzes in dem zweiten Gefäß ist in diesem Zusammenhang mit einer ersten Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert, und die partikuläre Festphase des Reagenzes in dem dritten Gefäß ist mit einer zweiten Komponente des signalbildenden Systems assoziiert, wobei die erste und zweite Komponente des signalbildenden Systems so

Zusammenwirken, dass ein detektierbares Signal entsteht, wenn die erste und die zweite Komponente des signalbildenden

Systems in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.

Vorzugsweise ist die erste Komponente des signalbildenden Systems ein chemilumineszierendes Agens, und die zweite

Komponente des signalbildenden Systems ist ein Photosensitizer oder umgekehrt. Ein solches Testkit eignet sich für die Messung der Agglutination mittels

Chemilumineszenzmessung .

Ein erster oder zweiter anti-TNF-alpha-Antikörper, mit dem die Festphase in dem Reagenz in dem zweiten und/oder dem dritten Gefäß beschichtet ist, ist vorzugsweise ein

monoklonaler Antikörper.

In einer anderen Ausführungsform ist der erste TNF-alpha- Bindungspartner, der in dem zweiten Gefäß enthalten ist mit einer Oberfläche des zweiten Gefäßes assoziiert,

beispielsweise auf dem Boden einer Kavität einer

Mikotiterplatte oder auf der Innenseite eines

Reaktionsgefäßes. Der Begriff „assoziiert" ist, wie bereits weiter oben beschrieben, in diesem Zusammenhang breit zu verstehen. Ein solches Testkit eignet sich besonders für die Durchführung heterogener Testverfahren, wie z.B. ELISA-Teste. Ein solches Testkit enthält vorzugsweise ferner ein drittes Gefäß, das einen zweiten TNF-alpha-Bindungspartner enthält, vorzugsweise in Form eines flüssigen Reagenzes (oder eines Lyophilisats desselben) , das den zweiten TNF-alpha- Bindungspartner enthält. Besonders bevorzugt ist der zweite TNF-alpha-Bindungspartner mit einer Komponente eines

signalbildenden Systems assoziiert, wie sie weiter oben bereits beispielhaft beschrieben wurden.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen . BEISPIELE

Beispiel 1: Homogene Agglutinationsteste zur quantitativen

Bestimmung verschiedener therapeutischer TNF- alpha Inhibitoren

500 yg humanes, rekombinantes , lyophilisiertes TNF-alpha- Protein (Active Bioscience GmbH, Hamburg, Deutschland) wurden in 500 yL Wasser gelöst und bei 2-8 °C gelagert (TNF-alpha- Stammlösung 1 mg/mL) . Zur Herstellung des Reagenzes 1 wurde die TNF-alpha-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 250 yg/L TNF-alpha-Protein in einem Lipoprotein-freiem humanem Citratplasma verdünnt.

Reagenz 2: Zur Herstellung des Reagenzes 2 wurden etwa 1,5 mg des monoklonalen anti-TNF-alpha-Antikörpers MAK 1D4 mit 1 mL Polystyrol-Latex-Partikeln (40 mg/mL, Teilchendurchmesser 0,2-0, 3 ym) in einer Pufferlösung vermischt und inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen der Partikel wurden die Partikel anschließend in 60 mL einer Pufferlösung resuspendiert .

Der monoklonale anti-TNF-alpha-Antikörper MAK 1D4 war durch Immunisierung einer Maus mit humanem TNF-alpha Protein und anschließender Hybridomazelletablierung hergestellt wurden.

Zur Herstellung von Proben, die einen therapeutischen TNF- alpha Inhibitor enthalten, wurden humanen Serumproben von normalen Spendern unterschiedliche Mengen von

• Adalimumab (Humira®, Abbvie Inc. , USA),

• Infliximab (Remicade®, MSD SHARP & DOHME GmbH,

Deutschland) ,

• Etanercept (Enbrel®, Pfizer Inc., USA) ,

• Certolizumab pegol (Cimzia®, UCB Pharma GmbH,

Deutschland) oder • Golimumab (Simponi®, Janssen Biologics B.V.,

Niederlande) zugegeben (Endkonzentration in der Probe 0,8-25 mg/L) .

Zur Herstellung von Kalibratoren wurden einem Pool von humanem Normalserum

• 100 mg/L Adalimumab (Humira®) , oder

• 100 mg/L Infliximab (Remicade®) zugegeben. Durch Verdünnung mit Normalserum oder einer

Pufferlösung wurden Kalibratoren mit geringeren Inhibitor- Konzentrationen erzeugt.

Die Serumproben bzw. die Kalibratorproben wurden 1:5 bzw. 1:20 mit einer Pufferlösung verdünnt. 50 pL Serumprobe bzw. Kalibratorprobe wurden mit 10 pL REAGENZ 1 vermisch

t und für eine Minute bei 37 °C inkubiert. Dann wurden dem Gemisch 35 pL REAGENZ 2 zugegeben, und es wurde in einem Zeitraum von 6 Minuten bei einer Wellenlänge von 840 nm in einem nephelometrischen Analysegerät (BN II System, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Deutschland) das Licht gemessen, das an den Antigen-Antikörper-Komplexen gestreut wird. Als Messergebnis wird die Veränderung des Messsignals (in Bit) nach 6 Minuten ermittelt.

Beispiel la: Bestimmung von Adalimumab mit Hilfe einer

Adalimumab-Kalibrationskurve

Sechs Serum-Kalibratoren mit unterschiedlichen Adalimumab- Konzentrationen wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen, und es wurde eine Kalibrationskurve erstellt.

Ferner wurden 14 Serumproben mit unterschiedlichen

Adalimumab-Konzentrationen mit dem erfindungsgemäßen

Verfahren gemessen. An der zuvor erstellten Kalibrationskurve wurden die zu den Messergebnissen zugehörigen Adalimumab- Konzentrationen abgelesen.

Tabelle 1 zeigt für jede Probe die gemäß Zudosierung von Adalimumab zu erwartende Adalimumab-Konzentration

(theoretische Konzentration) und die mit dem

erfindungsgemäßen Verfahren in einer Zweifachmessung

ermittelte Konzentration (gemessene Konzentration) . Es zeigt sich, dass die theoretischen Adalimumab-Konzentrationen im Konzentrationsbereich von 0,8 - 3 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 0,44 mg/L und im Konzentrationsbereich von 3 - 25 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 27,5 %

wiedergefunden werden. Dies erlaubt eine präzise

Quantifizierung von Adalimumab zur Therapieüberwachung.

Tabelle 1

Beispiel lb: Bestimmung von Infliximab mit Hilfe einer

Infliximab-Kalibrationskurve

Sechs Serum-Kalibratoren mit unterschiedlichen Infliximab- Konzentrationen wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen, und es wurde eine Kalibrationskurve erstellt.

Ferner wurden 14 Serumproben mit unterschiedlichen

Infliximab-Konzentrationen mit dem erfindungsgemäßen

Verfahren gemessen. An der zuvor erstellten Kalibrationskurve wurden die zu den Messergebnissen zugehörigen Infliximab- Konzentrationen abgelesen.

Tabelle 2 zeigt für jede Probe die gemäß Zudosierung von Infliximab zu erwartende Infliximab-Konzentration

(theoretische Konzentration) und die mit dem

erfindungsgemäßen Verfahren in einer Zweifachmessung

ermittelte Konzentration (gemessene Konzentration) . Es zeigt sich, dass die theoretischen Infliximab-Konzentrationen im Konzentrationsbereich von 0,8 - 5 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 0,47 mg/L und im Konzentrationsbereich von 5 - 25 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 24,5 %

wiedergefunden werden. Dies erlaubt eine präzise

Quantifizierung von Infliximab zur Therapieüberwachung.

Tabelle 2

Beispiel lc: Bestimmung verschiedener therapeutischer TNF- alpha Inhibitoren mit Hilfe einer Adalimumab- Kalibrationskurve

Sechs Serum-Kalibratoren mit unterschiedlichen Adalimumab- Konzentrationen wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen, und es wurde eine Kalibrationskurve erstellt.

Ferner wurden jeweils 12 bis 14 Serumproben mit

unterschiedlichen Adalimumab-, Infliximab-, Etanercept, Certolizumab pegol bzw. Golimumab-Konzentrationen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen. An der zuvor erstellten Kalibrationskurve wurden die zu den Messergebnissen zugehörigen Adalimumab-, Infliximab-, Etanercept,

Certolizumab pegol bzw. Golimumab-Konzentrationen abgelesen.

Tabellen 3 bis 7 zeigen für jede Probe die gemäß Zudosierung des jeweiligen Inhibitors zu erwartende Konzentration

(theoretische Konzentration) und die mit dem

erfindungsgemäßen Verfahren in einer Zweifachmessung

ermittelte Konzentration (gemessene Konzentration) . Es zeigt sich, dass die theoretischen Konzentrationen von Adalumimab und Infliximab auch ohne korrigierende Berechnung im

Konzentrationsbereich von 0,8 - 3 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 0,44 mg/L und im Konzentrationsbereich von 3 - 25 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 42,3 %

(Infliximab) wiedergefunden werden.

Es wurde gefunden, dass man -wenn man die gemessene

Konzentration gegen die theoretische Konzentration aufträgt- Funktionen (linear bzw. polynom) berechnen kann, die es erlauben die gemessenen Werte insbesondere für Etanercept, Certolizumab pegol und Golimumab zu korrigieren.

Unter Verwendung einer linearen Funktion oder einer

Polynomfunktion (2ten bzw. 3ten Grades) werden die

theoretischen Konzentrationen von Adalimumab, Infliximab, Etanercept, Certolizumab pegol und Golimumab mit akzeptablen Abweichungen wiedergefunden. Es zeigt sich, dass die

theoretischen Konzentrationen im Konzentrationsbereich von 10 - 25 mg/L mit einer maximalen Abweichung von 11,2 %

(Golimumab) wiedergefunden werden. Im Konzentrationsbereich von 2 - 10 mg/L sind die absoluten Abweichungen maximal 0,61 mg/L (Etanercept und Infliximab) .

Für Etanercept ist eine Umrechnung mittels Polynom nur im Konzentrationsbereich von 2 - 25 mg/L möglich. Tabelle 3

Tabelle 4

Tabelle 5

Tabelle 6

*=1:20 Probenverdünnung

Tabelle 7

Das hier beschriebene Verfahren erlaubt die automatische Bestimmung der Konzentrationen von verschiedenen TNF-alpha Inhibitoren in einem einzigen homogenen Assay.

Unter Verwendung einer linearen Funktion oder einer

Polynomfunktion (2ten bzw. 3ten Grades) zur Umrechnung der erhaltenen Ergebnisse ist die Genauigkeit der Wiederfindung jedes einzelnen TNF-alpha Inhibitors ausreichend zur

Therapieüberwachung und Therapiekontrolle.