Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR THE RECONSTRUCTION OF A RAMAN SPECTRUM
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/208184
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for the reconstruction of a Raman spectrum (160) from at least two response spectra (120a-120d) of the light intensity (3) generated by a sample (1) in response to an optical excitation (2), wherein at least two of the response spectra (102a-120d) are responses of the sample (1) to excitations (2) with different excitation spectra (110a-110d), comprising the following steps: the response spectra (120a-120d) are mapped (50) with a transformation (4) from the source space (5) thereof onto the representation (130a-130d) thereof in a working space (6), wherein the transformation (4) is carried out in such a way that a combination of spectra (120a-120d) in the source space (5) are mapped onto the combination of corresponding representations (130a-130d) in the working space (6), and a variable shifting (125) in the source space (5) brings about a multiplication in the working space (6) by a shifting factor (135) depending on said variable shifting (125); at least one equation (140a-40c) is set (60) in the working space (6), which correlates the difference between at least two representations (130a-130d) of response spectra (120a-120d) with the product of the representation (150) of the searched-for Raman spectrum (160) in the working space using a linear combination of shifting factors (135); and, from the equation or the equations (140a-140c), the representation (150) of the searched-for Raman spectrum (160) is determined (70) in the working space (6) as a solution. The invention also relates to a computer program product.

Inventors:
CHERNAVSKAIA, Olga (Ziegesarstraße 7, Jena, 07747, DE)
BOCKLITZ, Thomas (Arvid-Harnack-Straße 9, Jena, 07743, DE)
POPP, Jürgen (Am Wiesenbach 30, Kunitz, Jena, 07751, DE)
Application Number:
IB2017/053228
Publication Date:
December 07, 2017
Filing Date:
June 01, 2017
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
LEIBNIZ-INSTITUT FÜR PHOTONISCHE TECHNOLOGIEN E.V. (Albert-Einstein-Straße 9, Jena, 07745, DE)
FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITÄT JENA (Fürstengraben 1, Jena, 07743, DE)
International Classes:
G01N21/65; G01J3/28; G01J3/44; G01N21/27
Foreign References:
US20060192969A12006-08-31
US8570507B12013-10-29
Other References:
OSTICIOLI I ET AL: "Fluorescence and Raman spectra on painting materials: reconstruction of spectra with mathematical methods", JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY, vol. 37, no. 10, 2006, GB, pages 974 - 980, XP055397175, ISSN: 0377-0486, DOI: 10.1002/jrs.1587
MATOUSEK P ET AL: "Simple reconstruction algorithm for shifted excitation Raman difference spectroscopy", APPLIED SPECTROSC, THE SOCIETY FOR APPLIED SPECTROSCOPY. BALTIMORE, US, vol. 59, no. 6, 2005, pages 848 - 851, XP007916535, ISSN: 0003-7028
OSTICIOLI I ET AL: "Shift-Excitation Raman Difference Spectroscopy-Difference Deconvolution Method for the Luminescence Background Rejection from Raman Spectra of Solid Samples", APPLIED SPECTROSCOPY., vol. 61, no. 8, 2007, US, pages 839 - 844, XP055397189, ISSN: 0003-7028, DOI: 10.1366/000370207781540169
RAMOS P M ET AL: "Noise and background removal in Raman spectra of ancient pigments using wavelet transform", JOURNAL OF RAMAN SPECTROSCOPY, vol. 36, no. 9, 2005, GB, pages 848 - 856, XP055397153, ISSN: 0377-0486, DOI: 10.1002/jrs.1370
Attorney, Agent or Firm:
MAIWALD PATENTANWALTS GMBH (Elisenhof, Elisenstr. 3, München, 80335, DE)
Download PDF:
Claims:
Ansprüche

1. Verfahren zur Rekonstruktion eines Raman-Spektrums (160) aus mindestens zwei Antwortspektren (120a-120d) der von einer Probe (1) als Antwort auf eine optische Anregung (2) generierten Lichtintensität (3), wobei mindestens zwei der Antwortspektren (120a-120d) Antworten der Probe (1) auf Anregungen (2) mit unterschiedlichen Anregungsspektren (HOa-l lOd) sind, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

die Antwortspektren (120a-120d) werden mit einer Transformation (4) aus ihrem Ursprungsraum (5) auf ihre Darstellungen (130a-130d) in einem Arbeitsraum (6) abgebildet (50), wobei die Transformation (4) so beschaffen ist, dass

eine Summe von Spektren (120a-120d) im Ursprungsraum (5) auf die

Summe der korrespondierenden Darstellungen (130a-130d) im Arbeitsraum

(6) abgebildet wird und

eine Variablenverschiebung (125) im Ursprungsraum (5) eine

Multiplikation mit einem von dieser Variablenverschiebung (125) abhängigen

Verschiebungsfaktor (135) im Arbeitsraum (6) bewirkt;

im Arbeitsraum (6) wird mindestens eine Gleichung (140a- 140c) aufgestellt (60), die die Differenz zwischen mindestens zwei Darstellungen (130a-130d) von Antwortspektren (120a-120d) in Beziehung setzt zum Produkt aus der Darstellung (150) des gesuchten Raman-Spektrums (160) im Arbeitsraum mit einer

Linearkombination von Verschiebungsfaktoren (135);

aus der Gleichung oder den Gleichungen (140a- 140c) wird die Darstellung (150) des gesuchten Raman-Spektrums (160) im Arbeitsraum (6) als Lösung ermittelt (70).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Darstellung (150) des gesuchten Raman-Spektrums (160) durch die Inverse (4a) der

Transformation (4) in das gesuchte Raman-Spektrum (160) überführt wird (80).

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine diskrete Form der Transformation (4) auf Antwortspektren (120a-120d), die in Form diskreter Daten (122a-122d) vorliegen, angewendet wird (50).

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die diskrete Fourier- Transformation, DFT, als Transformation (4) gewählt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass

Antwortspektren (120a-120d), die in Form diskreter Daten (122a-122d) vorliegen, zu kontinuierlichen Funktionsverläufen (124a-124d) interpoliert werden (40).

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine

kontinuierliche Form der Transformation (4) auf die kontinuierlichen

Funktionsverläufe (124a-124d) der Antwortspektren (120a-120d) angewendet wird (50).

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transformation (4) mit Basisfunktionen gewählt wird, die nur auf einem begrenzten Teilgebiet des Ursprungsraums (5) von Null verschieden sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wavelet- Transformation als Transformation (4) gewählt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Antwortspektren (120a-120d), und/oder ihre Darstellungen (130a-130d) im Arbeitsraum (6), vor der Lösung (70) der Gleichungen (140a- 140c) entrauscht werden (30).

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Lösung (70) der Gleichungen (140a- 140c) die Tikhonov-Regularisierung, insbesondere die Methode der kleinsten Fehlerquadrate, gewählt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Linienbreite mindestens eines Anregung s Spektrums (110a- HOd) aus dem korrespondierenden Antwortspektrum (120a-120d) herauskorrigiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Anregungsspektrum (HOa-l lOd) zeitlich periodisch moduliert wird.

13. Computerprogrammprodukt, enthaltend maschinenlesbare Anweisungen, die, wenn sie auf einem Computer und/oder auf einem eingebetteten System ausgeführt werden, den Computer bzw. das eingebettete System dazu veranlassen, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 auszuführen.

Description:
Verfahren zur Rekonstruktion eines Raman-Spektrums

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rekonstruktion eines Raman-Spektrums aus Spektren, die eine Probe auf eine optische Anregung mit verschiedenen

Anregung s spektren hin generiert.

Stand der Technik

Bei der Raman-Spektroskopie werden die Schwingungszustände einer Probe optisch abgefragt, was in sich in energetisch verschobenen spektralen Anteilen manifestiert. Dadurch wird das Antwortspektrum des von der Probe inelastisch gestreuten Lichts verändert. Da die die Schwingungszustände molekülspezifisch sind, kann auf diese Weise die genaue chemische Zusammensetzung der Probe analysiert werden.

Der Raman-Effekt ist quantitativ ein kleiner Effekt. Insbesondere bei der

Untersuchung an biologischen Proben ist das inelastisch gestreute Licht von wesentlich intensiverem Fluoreszenzlicht überlagert. Um aus dieser Überlagerung das Raman-Spektrum zu extrahieren, werden heute unter anderem die allgemein bekannten Methoden SERDS und MRS verwendet.

Bei der SERDS-Methode (shifted excitation Raman difference spectroscopy) wird die Probe nacheinander mit zwei Anregungsspektren angeregt, die zueinander wellenlängenverschoben sind. Da weder das Fluoreszenzlicht noch das sonstige Störlicht von den im Anregungsspektrum enthaltenen Wellenlängen abhängt, sind diese unerwünschten Anteile in den jeweils erhaltenen Antwortspektren gleich. Indem beide Antwortspektren voneinander subtrahiert werden, werden beide unerwünschten Anteile eliminiert, und es entsteht ein resultierendes Spektrum, das der Ableitung des gesuchten Raman-Spektrums entspricht. Die SERDS-Methode ist beispielsweise in (P. Matousek, M. Towrie, A. W. Parker,„Simple Reconstruction Algorithm for Shifted Excitation Raman Difference Spectroscopy", Applied

Spectroscopy 59 (6), 848-851 (2005)) umrissen. Nachteilig ist, dass diese Methode darauf angewiesen ist, dass die

Wellenlängenverschiebung infinitesimal klein ist, so dass die Differenz der beiden Antwortspektren mathematisch zur Ableitung des gesuchten Raman-Spektrums äquivalent ist. Insbesondere muss die Verschiebung kleiner sein als die spektrale Breite eines Raman-Peaks. Die zu verwendende Verschiebung wird dadurch probenabhängig .

Bei der MRS-Methode (modulated Raman spectroscopy) wird die

Anregung s Wellenlänge periodisch moduliert. Das Raman-Spektrum wird aus dem sich periodisch ändernden Antwortspektrum mittels Hauptkomponentenanalyse extrahiert unter der Annahme, dass die erste Hauptkomponente der größten Varianz und somit den sich ändernden Raman-Informationen entspricht. Einen Überblick über die MRS-Methode und Anwendungen geben (A. C. De Luca, K. Dholakia, M. Mazilu,„Modulated Raman Spectroscopy for Enhanced Cancer Diagnosis at the Cellular Level", Sensors 15, 13680-13704 (2015)), (S. Dochow, B. Bergner, C. Krafft, J. Clement, M. Mazilu, B. B. Praveen, P. C. Ashok, R. Marchington, K. Dholakia, J. Popp,„Classification of Raman spectra of single cells with

autofluorescence suppression by wavelength modulated excitation", Analytical Methods 5, 4608-4614 (2013)) sowie (A. C. De Luca, M. Mazilu, A. Riehes, C. S. Herrington, K. Dholakia, "Online Fluorescence Suppression in Modulated Raman Spectroscopy", Analytical Chemistry 82, 738-745 (2010)).

Nachteilig ist auch hier, dass die der MRS-Methode zu Grunde liegende Annahme lediglich einer linearisierenden Näherung entspricht.

Aufgabe und Lösung

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem ein Raman-Spektrum probenunabhängig und mit einer besseren Genauigkeit als nach dem bisherigen Stand der Technik aus Antwortspektren rekonstruiert werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren gemäß

Hauptanspruch sowie durch ein Computerprogrammprodukt. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Unteransprüchen.

Gegenstand der Erfindung

Im Rahmen der Erfindung wurde ein Verfahren zur Rekonstruktion eines Raman- Spektrums aus mindestens zwei Antwortspektren der von einer Probe als Antwort auf eine optische Anregung generierten Lichtintensität entwickelt. Dabei sind mindestens zwei der Antwortspektren Antworten der Probe auf Anregungen mit unterschiedlichen Anregungsspektren. Die Anregungsspektren können insbesondere gegeneinander wellenlängenverschoben sein. In den Antwortspektren kann insbesondere die Lichtintensität über einer Wellenlänge oder Wellenzahl aufgetragen sein.

Erfindungsgemäß werden nun die folgenden Schritte durchgeführt:

Die Antwortspektren werden mit einer Transformation aus ihrem Ursprungsraum auf ihre Darstellungen in einem Arbeitsraum abgebildet. Dabei wird die Abhängigkeit von im Ursprungsraum erklärten Variablen, beispielsweise einer Wellenlänge oder Wellenzahl, durch eine Abhängigkeit von im Arbeitsraum erklärten Variablen, die beispielsweise die Dimension einer Ortsfrequenz-Frequenz haben können, ersetzt. Dementsprechend wird auch die im Ursprungsraum erklärte Lichtintensität in eine im Arbeitsraum erklärte Größe, die beispielweise die Dimension einer Leistungsdichte haben kann, überführt. Die physikalische Dimension der Variablen und der Darstellungen der Anregungsspektren im Arbeitsraum sind jedoch zweitrangig. Entscheidend ist, dass die Transformation so beschaffen ist, dass

• eine Summe von Spektren im Ursprungsraum auf die Summe der

korrespondierenden Darstellungen im Arbeitsraum abgebildet wird, die Transformation also linear ist, und

• eine Variablenverschiebung im Ursprungsraum eine Multiplikation mit einem von dieser Variablenverschiebung abhängigen Verschiebungsfaktor im Arbeitsraum bewirkt.

Diese beiden Eigenschaften bewirken, dass das Raman-Spektrum auch ohne die Annahme, dass die beiden Anregung sspektren infinitesimal zueinander wellenlängenverschoben sind, aus den Antwortspektren extrahiert werden kann.

Sei beispielsweise ii j) ein erstes diskretes Antwortspektrum, das mit einem ersten Anregung s spektrum erhalten wurde, und i 2 j) ein zweites Antwortspektrum, das mit einem zweiten, zu dem ersten Anregungs spektrum wellenlängenverschobenen, Anregung s spektrum erhalten wurde, j ist jeweils der Index, unter dem die

Intensitätswerte in den Spektren ii j) und i 2 j) abgelegt sind. Dieser Index j kann beispielsweise ein Maß für eine Wellenzahl im Antwortspektrum sein.

Die Spektren ii j) und i 2 j) lassen sich nun jeweils als Summe aus einem auf die Raman-Streuung zurückgehenden Anteil n j) bzw. r 2 j) und einem Untergrundanteil f j) schreiben:

U) = fU) + r l (j) ,

Ü) = f(j) + r 2 (j)

Dabei wurde einzig und allein die Annahme gemacht, dass der Untergrundanteil f j) für beide Spektren ii j) und i 2 j) gleich ist. Der Untergrund f j) und das Raman-Signal n j) bzw. r 2 j) unterscheiden sich nun auf Grund ihres unterschiedlichen physikalischen Zustandekommens dahingehend, dass der Untergrund f j) von der Wellenlängenverschiebung im Anregung sspektrum nicht betroffen ist. Der Untergrund f j) ist im Wesentlichen dominiert durch Fluoreszenzlicht und Umgebungslicht.

Umgebungslicht ist nicht durch die Anregung der Probe entstanden und daher automatisch von der Anregung unabhängig.

Fluoreszenzlicht wird emittiert, wenn Elektronen im Probenmaterial von einem höheren elektronischen Anregungszustand auf einen tieferen Anregungszustand relaxieren; die freiwerdende Energie wird jeweils in ein abgestrahltes Photon umgemünzt. Die hohe Intensität des Fluoreszenzlichts ist als Zusammenspiel aus Wirkungsquerschnitt und Zustandsdichte ein Resultat der Quantenmechanik.

Wird das Anregung sspektrum also um einen Index m wellenlängenverschoben, bleibt das Untergrund f j) konstant und das komplette Raman-Spektrum verschiebt sich:

r 2 {j) = r {j - m) .

Werden N Antwortspektren ii j) bis IN(J) mit sukzessiven Verschiebungen 0, mi, ... , niN-i aufgenommen, so lassen sich diese Antwortspektren somit schreiben als:

i l Ü) = fÜ) + r(j) ,

U) = f(j) + r(j - m x ) , i N (J) = f(j) + r(j -™ N _ X ) .

Hierin ist r j) das gesuchte Raman-Spektrum.

Die Aufnahme der Spektren ii j) bis IN(J) kann mit jeder experimentellen

Ausführungsform der Raman-Spektroskopie erfolgen. Hier können beispielsweise oberflächenverstärkte Techniken, wie SERS (Shifted Excitation Raman

Spectroscopy) oder TERS (Tip-Enhanced Raman Spectroscopy), aber auch beispielsweise nichtlineare Techniken, wie SRS (Stimulated Raman Spectroscopy) oder CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy), zum Einsatz kommen.

Die Transformation in den Arbeitsraum mit den beanspruchten Eigenschaften macht hieraus:

I l ik) = Fik) + Rik) - l ,

I 2 (k) = F(k) + R(k) Pik, m l ) ,

I N (k) = F(k) + R(k) - P(k, m N _ 1 ) ,

worin I(k) die Darstellung von i(j) im Arbeitsraum, F(k) die Darstellung von f j) im Arbeitsraum, R(k) die Darstellung von r j) im Arbeitsraum und P der

Verschiebungsfaktor, mit dem sich die Wellenlängenverschiebung der

Anregung s spektren im Arbeitsraum niederschlägt.

Wird die Differenz zwischen den Darstellungen I a (k) und Ib(k) zweier

Antwortspektren i a (k) und ib(k), im Arbeitsraum gebildet, fällt die Darstellung F(k) der unerwünschten Anteile heraus. Es entstehen eine oder mehrere Gleichungen, etwa

AI, (k) = I, (k) - I N (k) = R(k) (1 - P{k, m N _ )) ,

AI 2 ik) = I 2 ik) - I N ik) = Rik) iPik, m x ) - Pik, m N _ x )),

AI N _, ik) = I N _ X ik) - I N ik) = Rik) iPik, m N _ 2 ) - Pik, m N _ x )) .

Jede dieser Gleichungen setzt die Differenz aus zwei Darstellungen I a (k) und Ib(k) in Beziehung zum Produkt aus der Darstellung R(k) des gesuchten Raman-Spektrums r(j) im Arbeitsraum mit einer Linearkombination (Differenz) von Verschiebungsfaktoren P(k,mi), . . . , P(k,niN-i). Der Vektor R = R(k) ist für alle k gleich und kann über die Lösung eines Gleichungssystems, das gegeben ist durch ΔΙ = Q R ,

berechnet werden.

Hierin durchläuft der Zeilenindex der Matrix ΔΙ alle Werte von k, während der Spaltenindex von ΔΙ die Werte von 1 bis N- 1 durchläuft. In der Matrix Q, deren Zeilenindex alle Werte von k durchläuft und deren Spaltenindex von 1 bis N-1 läuft, sind alle Linearkombinationen der Verschiebungsfaktoren zusammengefasst. Gemäß dem Verfahren wird R im Arbeitsraum als Lösung ermittelt.

Es wurde erkannt, dass auf diese Weise keine Ableitung des gesuchten Raman- Spektrums mehr ermittelt wird, sondern vielmehr eine Darstellung dieses Spektrums selbst im Arbeitsraum. Dementsprechend ist die Bestimmung dieser Darstellung nicht mehr darauf angewiesen, dass die Wellenlängenverschiebung der Anregungsspektren zueinander infinitesimal klein und somit die Differenz zweier

Antwortspektren zu einer Ableitung des Raman-Spektrums äquivalent ist. Indem diese Bedingung fortfällt, entfällt zugleich weitestgehend die Kopplung des

Anregung s Spektrums an die zu untersuchende Probe. Zur Messung von Raman- Spektren an unterschiedlichen Proben ist dann kein Laser mehr notwendig, der kontinuierlich durchstimmbar ist. Es müssen nur noch wenige diskrete Linien erzeugt werden, was mit einem deutlich unkomplizierteren und preiswerteren Aufbau möglich ist.

Weiterhin lässt sich auf organische Weise die in drei oder mehr Antwortspektren enthaltene Information aggregieren, um die Genauigkeit der Rekonstruktion von R weiter zu steigern. Hat das Gleichungssystem genau zwei Gleichungen, hat es eine eindeutige Lösung, die gegeben ist durch

\ - P{k, m x ) Hat das Gleichungssystem mehr Gleichungen, ist es überbestimmt. Da die

Messungen der Intensitätsspektren i j) immer mit Rauschen und anderen

Messunsicherheiten behaftet sein werden, lässt sich mit einem solchen

überbestimmten System ein Ausgleich schaffen, der die Auswirkung der

Messunsicherheiten auf das Endergebnis für R minimiert.

Das als Lösung des Gleichungssystems erhaltene Endergebnis für R kann bei geeigneter Wahl des Arbeitsraums unmittelbar im Arbeitsraum weiterverwendet werden. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird jedoch die Darstellung R des gesuchten Raman-Spektrums f durch die Inverse der Transformation in das gesuchte Raman- Spektrum r im Ursprungsraum überführt.

Die Antwortspektren können beispielsweise jeweils in Form diskreter Daten vorliegen. So ist beispielsweise der Bereich von Wellenzahlen, für die die Intensität des Antwortspektrums mit einem gegebenen optischen Aufbau messbar ist, in der Regel begrenzt, und die Intensität liegt auch innerhalb dieses Bereiches nur für bestimmte diskrete Wellenzahlen vor. Vorteilhaft wird daher eine diskrete Form der Transformation auf die Antwortspektren angewendet. Diskrete Transformationen sind genau auf den vorliegenden Fall optimiert, dass Daten nicht überall und nicht mit beliebig feiner Auflösung vorliegen.

Besonders vorteilhaft wird in diesem Zusammenhang die diskrete Fourier- Transformation, DFT, als Transformation gewählt. Der Verschiebungsfaktor P(k,m) für eine Wellenlängenverschiebung m zwischen den Anregungsspektren ist dann ein Phasenfaktor und gegeben durch

P(k, m) = exp(— 2π i k m .

Antwortspektren, die in Form diskreter Daten vorliegen, können jedoch in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung auch zu kontinuierlichen Funktionsverläufen interpoliert werden. Hierdurch kann beispielsweise bereits eine erste Glättung und Filterung der Daten erfolgen, um den Einfluss von Rauschen und anderen Messunsicherheiten zurückzudrängen. Weiterhin vereinfacht sich die Rechnung, wenn ein kontinuierlicher Funktionsverlauf vorliegt, da dann

insbesondere eine kontinuierliche Form der Transformation auf die kontinuierlichen Funktionsverläufe der Antwortspektren angewendet werden kann. Schließlich lassen sich die kontinuierlichen Funktionsverläufe in sehr stark komprimierter Form speichern, beispielsweise als Parameters ätze für einen parametrisierten

Funktionsansatz.

In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine Transformation mit Basisfunktionen gewählt, die nur auf einem begrenzten

Teilgebiet des Ursprungsraums von Null verschieden sind. Die Transformation ist dann besonders gut an die Situation bei realen Messungen angepasst, dass das Antwortspektrum nur in einem begrenzten Bereich von Wellenzahlen verfügbar ist. Dass die Daten des Antwortspektrums nur mit einer endlichen Auflösung vorliegen, lässt sich„heilen", indem die diskreten Daten zu kontinuierlichen

Funktionsverläufen interpoliert werden.

In diesem Zusammenhang wird besonders vorteilhaft die Wavelet-Transformation als Transformation gewählt. Wavelets sind speziell dazu konstruiert, Detailinformation in aperiodischen Funktionsverläufen abzubilden, und eignen sich darüber hinaus insbesondere auch, um die Antwortspektren zusätzlich zu entrauschen.

Beispielsweise wird bei der Wavelet-Transformation die wesentliche Information über den Funktionsverlauf in einigen wenigen Wavelet- Koeffizienten im

Arbeitsraum aufkonzentiert, während weißes Rauschen nach der Wavelet- Transformation im Arbeitsraum wiederum als weißes Rauschen vorliegt, welches auf alle verfügbaren Wavelet-Koeffizienten gleichzeitig verschmiert ist. Es können beispielsweise alle Wavelet-Koeffizienten unterhalb einer bestimmten Schwelle auf Null gesetzt werden (Thresholding), um den größten Anteil des Rauschens zu entfernen bei zugleich guter Erhaltung der aperiodischen Details im

Funktionsverlauf. Dabei wirkt jeder Eingriff in einen Wavelet- Koeffizienten im Arbeitsraum immer nur lokal für einen bestimmten Bereich an Wellenzahlen, während hingegen etwa jeder Eingriff in einen Fourier- Koeffizienten nach einer Fourier- Tranformation in einen Frequenzraum als Arbeitsraum den Beitrag einer Basisfunktion global für alle Wellenzahlen ändert.

Vorteilhaft werden somit die Antwortspektren, und/oder ihre Darstellungen im Arbeitsraum, vor der Lösung der Gleichungen entrauscht. Dadurch wird vermieden, dass das in den Antwortspektren enthaltene Rauschen beim Lösen der Gleichungen deutlich verstärkt wird und möglicherweise das eigentliche Ergebnis überdeckt. Die Wavelet-Transformation liefert ein Beispiel dafür, dass dieses Entrauschen im Arbeitsraum stattfinden kann. Das Entrauschen kann jedoch insbesondere auch vor der Abbildung in den Arbeitsraum, und/oder vor der Interpolation diskreter Daten zu kontinuierlichen Funktionsverläufen, durchgeführt werden, um eine Verstärkung des Rauschens in diesen Verarbeitungsstufen zu vermeiden.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zur Lösung der Gleichungen die Tikhonov-Regularisierung, insbesondere die Methode der kleinsten Fehlerquadrate, gewählt. Diese Lösungsverfahren liefern auch bei stark

überbestimmten Gleichungssytemen Lösungen, die einen optimalen Ausgleich zwischen den in den Gleichungen verkörperten widersprüchlichen Aussagen darstellen.

Prinzipiell lassen sich zur Lösung der Gleichungen alle Ausgleichungs- und

Approximationsverfahren, sowie auch alle iterativen und direkten Gleichungs- systemlösungsverfahren, einsetzen. Die Tikhonov-Regularisierung ist ein

Ausgleichungs- bzw. Approximationsverfahren. Sie besitzt im Wesentlichen zwei Parameter als Freiheitsgrade. Werden diese beiden Parameter zu Null gesetzt, ergibt sich als Spezialfall die Methode der kleinsten Fehlerquadrate. In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird mindestens eine Linienbreite mindestens eines Anregung s Spektrums aus dem korrespondierenden Antwortspektrum herauskorrigiert. Die Linienbreite ist mit deutlich höherer Auflösung bekannt als der Auflösung, in der das Antwortspektrum vorliegt. Ihre Berücksichtigung bereits an dieser Stelle minimiert ihre Auswirkungen auf das letztendlich rekonstruierte Raman-Spektrum.

In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird mindestens ein

Anregung s spektrum zeitlich periodisch moduliert. Über eine Analyse, welche Anteile des Antwortspektrums sich mit der gleichen Modulation ändern, kann dann die Unterscheidung zwischen dem Raman-Spektrum und unerwünschten Anteilen des Antwortspektrums noch weiter verfeinert werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann nicht nur im Zusammenhang mit neu aufgenommenen Antwortspektren angewendet werden. Vielmehr lässt sich das Verfahren ausdrücklich auch auf bereits vorhandene Antwortspektren anwenden, die beispielsweise zum Zwecke einer Auswertung mit der SERDS- oder MRS-Methode angefertigt wurden. Beispielsweise können so auch noch neue Erkenntnisse an Proben gewonnen werden, die für eine erneute Aufnahme von Antwortspektren nicht mehr zugänglich sind. So können etwa biologische Proben nach einiger Zeit unbrauchbar werden, und/oder kostbare Proben können lediglich leihweise für einen kurzen Zeitraum zur Verfügung stehen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung erhöht auch die Resistenz von Raman- Messungen gegen Umgebungslicht. Nach dem bisherigen Stand der Technik konnten Raman-Spektren nur in einem abgedunkelten Raum aufgenommen werden.

Insbesondere bei dem Einsatz der Raman- Spektroskopie im klinischen Bereich war es bislang sehr störend, für jede Aufnahme eines Spektrums die Beleuchtung abdunkeln zu müssen. Das Verfahren kann insbesondere unabhängig von dem zur Gewinnung der

Antwortspektren verwendeten Messaufbau in Software implementiert sein, und seine Anwendung kann zeitlich der Aufnahme der Spektren nachgelagert sein. Die Erfindung bezieht sich daher auch auf ein Computerprogrammprodukt mit maschinenlesbaren Anweisungen, die, wenn sie auf einem Computer und/oder auf einem eingebetteten System ausgeführt werden, den Computer bzw. das eingebettete System dazu veranlassen, ein Verfahren gemäß der Erfindung auszuführen.

Spezieller Beschreibungsteil

Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung an Hand von Figuren erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung hierdurch beschränkt wird. Es ist gezeigt:

Figur 1: Skizze des Verfahrens gemäß der Erfindung.

Figur 2: Beispiele für Messaufbauten, mit denen das Verfahren genutzt werden kann.

Figur 1 verdeutlicht skizzenhaft das Verfahren gemäß der Erfindung. Das Verfahren geht davon aus, dass die Probe 1 eine optische Anregung 2 in Form von vier unterschiedlichen Anregungsspektren 110a- 1 lOd erhalten hat. Dementsprechend hat die von der Probe 1 als Antwort generierte Lichtintensität 3 vier unterschiedliche Antwortspektren 120a-120d, von denen die Antwortspektren 120a und 120b in Figur 1 beispielhaft dargestellt sind.

Die Antwortspektren 120a- 120d enthalten jeweils einen Anteil r j), der auf Raman- Streuung in der Probe 1 zurückgeht und somit von der Anregung mit dem jeweils zugeordneten Anregungsspektrum HOa-l lOd herrührt. Dieser Anteil r j) ist jedoch von einem starken Untergrundsignal f j) auf Grund von Fluoreszenz überlagert. Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung wird der Raman- Anteil r j) rekonstruiert und der Einfluss des Untergrundsignals f j) unterdrückt. Zu diesem Zweck werden die Antwortspektren 120a- 120d, die in Form diskreter Daten vorliegen, mit einer Transformation 4, hier der diskreten Fourier- Transformation, DFT, vom Ursprungsraum 5 in den Arbeitsraum 6 überführt (Schritt 50). Optional können die diskreten Daten 122a- 122d der Antwortspektren 120a- 120d zu kontinuierlichen Funktionsverläufen 124a- 124d interpoliert werden. Es kann dann beispielsweise auch eine Transformation 4 genutzt werden, die mit kontinuierlichen Funktionsverläufen arbeitet.

Die Transformation 4 ist zum Einen linear, d.h., die Summe der Signalbeiträge f(j) und r j) im Ursprungsraum 5 wird in die Summe der hierzu korrespondierenden Darstellungen F(k) und R(k) im Arbeitsraum überführt. Zum Anderen bewirkt eine Variablenverschiebung 125 im Ursprungsraum bei der Abbildung 50 durch die Transformation 4 in den Arbeitsraum 6 eine Multiplikation mit einem von der Variablenverschiebung 125 abhängigen Verschiebungsfaktor 135 im Arbeitsraum 6. Im Falle der DFT als Transformation 4 ist dieser Verschiebungsfaktor 135 ein Phasenfaktor, d.h. eine komplexe Exponentialfunktion, in deren Argument ein Produkt der Variablenverschiebung 125 mit der zur Wellenzahl j im Ursprungsraum 5 korrespondierenden Variablen k im Arbeitsraum 6 steht, k ist im Falle der DFT eine Frequenzdarstellung der Wellenzahl j, die ihrerseits die Dimension einer Ortsfrequenz hat, hat also die Dimension einer Ortsfrequenz-Frequenz. Es ist jedoch für die weitere Auswertung nicht relevant, inwieweit diese Dimension physikalisch interpretierbar ist. Der entscheidende Punkt der Transformation 4 ist, dass sie auf die unerwünschten Signalbeiträge f j) in irgendeiner Form anders wirkt als auf den Raman-Anteil r j), so dass die hierzu korrespondierenden Darstellungen F(k) und R(k) im Arbeitsraum 6 klarer voneinander unterschieden werden können als die ursprünglichen Signalbeiträge f(j) und r(j) im Ursprungsraum 5.

Die Transformation 4 liefert Darstellungen 130a- 130d der Antwortspektren 120a- 120d im Arbeitsraum 6. In Figur 1 ist beispielhaft ein zusätzlicher optionaler Entrauschungsschritt 30 eingezeichnet, der im Zuge der Transformation 4

unmittelbar auf den Darstellungen 130a- 130d durchgeführt wird. Bei der FFT als Transformation 4 können die Darstellungen 130a- 130d beispielsweise mit einem Tiefpass gefiltert werden. Bei der Wavelet-Transformation als Transformation 4 können beispielsweise alle Wavelet- Koeffizienten in den Darstellungen 130a- 130d, die einen bestimmten Schwellwert nicht überschreiten, auf Null gesetzt werden.

Im Arbeitsraum 6 werden die Darstellungen 130a-130d im Schritt 60 voneinander subtrahiert; in dem in Figur 1 gezeigten Beispiel wird die letzte Darstellung 130d als Subtrahend verwendet. Es entstehen drei Gleichungen 140a- 140c, in denen auf einer Seite die Differenz zwischen den jeweiligen Intensitäten und auf der anderen Seite das Produkt aus der Darstellung 150 des gesuchten Raman-Spektrums 160 mit einer Linearkombination von Verschiebungsfaktoren 135 steht. Im Falle der DFT als Transformation 4 ist diese Linearkombination eine Differenz von Exponentialfunktionen.

Die Verschiebungsfaktoren 135 hängen sowohl von der Variablen k, die im

Arbeitsraum 6 zur Wellenzahl bzw. zum Wellenzahlindex j korrespondiert, als auch von der Wellenlängenverschiebung m zwischen den Anregungsspektren 110a- 1 lOd. Die Verschiebungsfaktoren 135 hängen jedoch nicht explizit von der Darstellung 150 des gesuchten Raman-Spektrums 160 ab. Das Gleichungs System 140a-140c ist also in dieser Darstellung 150 linear. Im Schritt 70 wird die Darstellung 150 als Lösung des Gleichungs Systems 140a- 140c ermittelt.

Durch die Inverse 4a der Transformation 4, hier die inverse DFT, wird im Schritt 80 schließlich die Darstellung 150 in den Ursprungsraum 5 zurücktransformiert.

Dadurch wird in dem Ursprungsraum 5 das gesuchte Raman-Spektrum 160 ermittelt. Das Ergebnis ist in Figur 1 beispielhaft eingezeichnet. Der Vergleich mit den ebenfalls zeichnerisch dargestellten Antwortspektren 120a und 120b verdeutlicht den Gewinn, der mit der Anwendung des Verfahrens erzielt wurde. Auffällig ist insbesondere, dass drei Raman-Peaks 160x, 160y, 160z, deren Entsprechungen 120x, 120y und 120z in den ursprünglichen Antwortspektren 120a und 120b deutlich weniger stark ausgeprägt und in ihrer Struktur stark verwaschen sind, in dem rekonstruierten Raman- Spektrum 160 sehr klar hervortreten. Weiterhin wird auch die Interpretation des Raman- Spektrums 160 nicht mehr durch einen langsam mit der Wellenzahl j veränderlichen Untergrund erschwert.

Figur 2 zeigt beispielhaft Messaufbauten zur Gewinnung von Antwortspektren 120a- 120d.

Figur 2a zeigt einen Aufbau gemäß Stand der Technik, wie er für SERDS- und MRS- Messungen verwendet wird. Zur optischen Anregung 2 dient ein durchstimmbarer Laser 21, der die Anregung sspektren HOa-l lOd auf die Probe 1 einstrahlt. Die von der Probe 1 generierte Lichtintensität 3 wird mit einem Spektrometer 22 analysiert und zu Antwortspektren 120a- 120d weiterverarbeitet. Das Spektrometer 22 koordiniert über die Synchronisationsleitung 23 die Abstimmung des Lasers 21 mit der Datenaufnahme.

Figur 2b zeigt einen konstruktiv vereinfachten Aufbau gemäß Stand der Technik, dessen Nutzung in Kombination mit dem Verfahren gemäß der Erfindung finanziell vorteilhaft ist. An Stelle eines einzelnen durchstimmbaren Lasers 21 sind nun verschiedene Laser 21a-21n mit festen Wellenlängen vorgesehen. Über einen optischen Schalter 25 wird eingestellt, welche Wellenlängen zu jeder Zeit als Anregung s spektrum HOa-l lOd auf die Probe 1 eingestrahlt werden. Der optische Schalter 25 wird über die Synchronisationsleitung 23 vom Spektrometer 22 angesteuert. Bei gleicher Laserleistung kann die Kombination der Laser 21a-21n mit dem

Schalter 25 deutlich preiswerter sein als ein einzelner durchstimmbarer Laser 21. Dafür liegen die Wellenlängen der Laser 21a-21n um einen bestimmten

Mindestbetrag auseinander. Dementsprechend gibt es auch einen Mindestbetrag für die zwischen zwei Anregungsspektren HOa-l lOd einstellbare Wellenlängenverschiebung. Die Auswertung der Antwortspektren 120a- 120d nach dem bisherigen Stand der Technik war darauf angewiesen, dass die Wellenlängenverschiebung in Relation zu den Raman-Banden der Probe 1 als infinitesimal anzusehen war. Der besagte Mindestbetrag für die Wellenlängenverschiebung erfüllt diese Bedingung entweder nicht oder nur für bestimmte Proben 1. Dementsprechend war der in Figur 2b gezeigte Aufbau in der Praxis nur eingeschränkt verwendbar. Die verbesserte Auswertung der Antwortspektren 120a- 120d gemäß der Erfindung setzt keine enge Grenze mehr für die Wellenlängenverschiebung, so dass ohne Verlust an

Genauigkeit auch mit dem in Figur 2b gezeigten Aufbau gearbeitet werden kann.

Die Arbeiten, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurden im Rahmen des Projekts„PhotoSkin" vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) unter dem Förderkennzeichen 13N13243, sowie auch durch das 7.

Forschungsrahmenprogramm der Europäischen Union, gefördert.

Bezugszeichenliste

Probe

optische Anregung der Probe 1

von Probe 1 auf Anregung 2 generrierte Lichtintensität Transformation von Ursprungsraum 5 in Arbeitsraum 6a Inverse der Transformation 4

Ursprungsraum

Arbeitsraum

1 durchstimmbarer Laser

1a-21n separate Laser mit festen Wellenlängen

2 Spektrometer

3 Synchronisierungsleitung

5 optischer Schalter

0 Entrauschen der Spektren 120a- 120d bzw. Darstellungen 130a- 130d0 Interpolation der kontinuierlichen Verläufe 124a- 124d

0 Abbildung vom Ursprungsraum 5 in den Arbeitsraum 6

0 Aufstellen der Gleichungen 140a- 140c

0 Lösen der Gleichungen 140a- 140c nach Darstellung 150

0 Abbildung der Darstellung 150 in den Ursprungsraum 5

10a- 11 Od Anregungs spektren

20a- 120d Antwortspektren

20x- 120z Peaks in Antwortspektren 120a- 120d

22a- 122d diskrete Daten der Antwortspektren 120a- 120d

24a- 124d interpolierte kontinuierliche Verläufe der Spektren 120a-120d25 Variablenverschiebung im Ursprungsraum 5

30a-130d Darstellung der Antwortspektren 120a-120d im Arbeitsraum 635 Verschiebungsfaktor im Arbeitsraum 6

40a- 140c Gleichungen in der Darstellung 150 des Raman-Spektrums 160 150 Darstellung des Raman-Spektrums 160 im Arbeitsraum 6

160 rekonstruiertes Raman- Spektrum

160x-160z Peaks in rekonstruiertem Raman- Spektrum 160

f j) Untergrundanteil in den Antwortspektren 120a- 120d

F(k) Darstellung des Untergrundanteils f j) im Arbeitsraum 6 i j), ii-N(j) Antwortspektren 120a- 120d im Ursprungsraum 5

I(k), Ii-N(k) Darstellung der Spektren 120a- 120d im Arbeitsraum 6

ΔΙ Differenz zwischen Spektren 120a-120d

j Wellenzahl bzw. Wellenzahlindex im Ursprungsraum 5 k zu j korrespondierende Variable im Arbeitsraum 6

m, mi ; ... ; N-i Wellenlängenverschiebung

N Anzahl der aufgenommenen Spektren 120a- 120d

P(k,m) Verschiebungsfaktor 135 im Arbeitsraum 6

Q Linearkombinationen von Verschiebungsfaktoren

r j), ri,2<j) Raman- Anteil in den Antwortspektren 120a- 120d

R(k) Darstellung 150 des gesuchten Raman-Signals 160 im Raum 6