Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR RECOVERING DEGRADED AREAS USING GENETICALLY MODIFIED PLANT SPECIES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2010/112622
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the search for and choice of forest plants adapted to severe edaphological conditions in soils contaminated by pollutants, which plants are capable of surviving in most parts of the world and cannot enter the trophic chain. The genetic transformation thereof considerably enhances the metal absorption rate and storage capacity thereof and also makes it easier for said absorption to cover the majority of pollutants or harmful substances.

Inventors:
Navarro Aviñó, Juan Pedro (Xátiva 3, Piso 11 Planta 36, Valencia, E-46002, ES)
Application Number:
ES2009/070080
Publication Date:
October 07, 2010
Filing Date:
March 30, 2009
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
ABBA GAIA, S.L. (Parque Tecnológico, Av. Benjamín Franklin 12, Paterna, E-46980, ES)
Navarro Aviñó, Juan Pedro (Xátiva 3, Piso 11 Planta 36, Valencia, E-46002, ES)
International Classes:
B09C1/10; A01H5/00
Attorney, Agent or Firm:
MOLINERO ZOFIO, Félix (PTW International Inc, Doctor Ulecia, local Pozueie de Alarcόn, 28224, ES)
Download PDF:
Claims:
Reivindicaciones

[1] 1 . Un método de recuperación de espacios degradados mediante uso de especies vegetales genéticamente modificadas caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) Selección de especies vegetales que tengan capacidad de adaptación climatológica, edafológica, raíces profundas, capacidad de absorción de los elementos nocivos o sus mezclas, elementos y/o sus mezclas, gran capacidad de multiplicarse, aspecto ornamental, extensión geográfica mundial y que no entren en la cadena trófica. b) Modificación genética de dichas especies para dotarlas de una gran capacidad de producción de biomasa.

Plantación de dichas especies en los terrenos a recuperar, con una densidad de 1 a 70 especies por metro cuadrado.

[2] 2 . Método de recuperación de espacios degradados mediante el uso de especies vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que las especies vegetales seleccionadas en el paso a) son Nicotiana glauca para terrenos secos y Populus trémula x tremuloides cv. Etropole, para terrenos húmedos.

[3] 3 . Método de recuperación de espacios degradados mediante el uso de especies vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el gen utilizado para la modificación genética, de acuerdo con la reivindicación 2a, de la especie vegetal Nicotiana glauca es el TaPCS 1

[4] 4. Método de recuperación de espacios degradados mediante el uso de especies vegetales genéticamente modificadas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que los genes utilizados para la modificación genética, de acuerdo con la reivindicación 2a, de la especie vegetal Populus trémula x tremuloides cv. Etropole son el TaPCSl y el AtPCSl.

[5] 5. Método de recuperación de espacios degradados mediante el uso de especies vegetales caracterizado por que el gen que se utiliza para un posterior aumento de biomasa es el la gen YCF.

Description:
Descripción

MÉTODO DE RECUPERACIÓN DE ESPACIOS DEGRADADOS MEDIANTE USO DE ESPECIES VEGETALES GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

[ 1 ] SECTOR DE LA TÉCNICA

[2] La presente invención se refiere a la búsqueda y selección de vegetales silvestres adaptados a condiciones edafológicas severas en suelos contaminados por elementos contaminantes, que tengan capacidad de sobrevivir en la mayor parte del mundo y que no puedan entrar en la cadena trófica. Su transformación genética aumenta considerablemente su capacidad de almacenamiento y velocidad de absorción de metales, así como favorece que dicha absorción abarque la mayoría de los elementos contaminantes o nocivos.

[3] El método de dichas transformaciones pertenece a la Biotecnología y se puede definir como el conjunto de técnicas que modifican organismos vivos, (o parte de los mismos), transforman sustancias de origen orgánico o utilizan procesos biológicos para producir un nuevo conocimiento, desarrollar productos y servicios.

[4] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[5] La revolución industrial ha conllevado unas consecuencias muy perjudiciales para el medio ambiente por la acumulación de elementos contaminantes en el suelo, agua y atmósfera.

[6] El suelo, al ser el más estable de estos medios, permite que los contaminantes permanezcan más tiempo en el medio y que no puedan ser degradados durante un periodo de tiempo muy largo, y por tanto, que sea una acumulación progresiva que ocasione en primer lugar la disminución de la biodiversidad y la ausencia inicial de vegetación, además de la transferencia de estos elementos a otros medios como el aire y agua, contaminando tanto las aguas superficiales como subterráneas y entrar de esta forma en la cadena alimentaria.

[7] No obstante, observamos que existen una gran diversidad de especies vegetales adaptadas a estas circunstancias mediante un proceso de transformación genética a lo largo del tiempo, llegando incluso a colonizar estos suelos contaminados.

[8] Estas especies vegetales son conocidas como metalofitas, son las que han sufrido transformaciones genéticas para poder vivir en estos suelos.

[9] Por su especialización para vivir en estos ambientes contaminados, con unos minerales concretos, en áreas y condiciones edáficas concretas, hace que estas especies tengan muy difícil su supervivencia en otros lugares, y si añadimos a sus condiciones de supervivencia el clima, aumenta la dificultad para poder desarrollarlas en otras latitudes.

[10] Pues bien, el uso de especies vegetales para eliminar o acumular contaminantes nocivos para el medio ambiente es lo que conocemos como fitorremediación, que se define como la utilización de especies vegetales para llevar a cabo acciones de eliminación o transformación de contaminantes.

[11] Las técnicas que se han empleado para la descontaminación de suelos consisten básicamente en el aislamiento del terreno o en su descontaminación.

[12] Las técnicas de aislamiento que evitan que la contaminación se propague se basan en almacenarlos en vertederos apropiados, sellarlos in situ o destruirlos.

[13] Las técnicas de descontaminación y por lo tanto de recuperación del suelo son:

[14] • La extracción de los elementos contaminantes mediante la acción de un fluido; bien por aire (arrastre), o bien por agua (lavado). D

[15] Una vez arrastrados los elementos contaminantes se depuran.

[16] Se trata de unos métodos muy caros y poco eficientes.

[17] • Tratamiento químico, es decir, depurar el suelo por degradación de los contaminantes mediante reacciones químicas, normalmente por oxidación o des- cloración. Empleado para la estabilización de productos del petróleo. D

[18] Técnicas caras, complicadas y muy selectivas y que acaban degradando más el suelo, inf fertilizándolas .

[19] • Tratamiento electroquímico, que consiste en el desplazamiento de los elementos contaminantes mediante la creación de campos eléctricos, este desplazamiento se favorece añadiendo agua. D

[20] Se debe a fenómenos de migración, en forma iónica de los contaminantes a través del campo eléctrico.

[21] i.Electroósmosis, mediante el movimiento del líquido en relación a las superficies sólidas del campo eléctrico.

[22] ii.Electroforesis, consiste en el desplazamiento de las partículas coloidales cargadas en suspensión.

[23] Se trata de procedimientos muy caros y poco efectivos.

[24] • Tratamiento térmico, degrada los contaminantes mediante el suministro de calor. D

[25] Es un tratamiento ex situ y sin eficacia para los metales.

[26] Estos tratamientos dejan el suelo totalmente transformado, sin materia orgánica, sin microorganismos, y sin ningún tipo de biodiversidad, lo que les hace totalmente desaconsejables, aparte de ser, todos ellos, muy costosos.

[27] • Tratamiento microbiológico, mediante el empleo de ciertos microorganismos que tienen capacidad de degradación (Biorremediación). D

[28] La descontaminación mediante este método, se emplea para contaminantes orgánicos que son degradados aeróbicamente, aunque existen otros contaminantes orgánicos, como los alifáticos clorados, que deben ser degradados anaeróbicamente.

[29] Este tratamiento además de ser sólo prácticamente para contaminantes orgánicos necesita una vigilancia continuada para que los microorganismos se multipliquen y no pierdan su fuerza, además es necesario una eliminación constante de los microorganismos viejos que han perdido su potencia de degradación, por lo que podrían convertirse en especies invasivas y/ o mutantes. Además de lo anterior, hay que vigilar las condiciones de temperatura, pH, fuerza de los microorganismos, etc.

[30] Todos estos procedimientos anteriores, son muy caros y de dudosa eficacia.

[31] • Fitorremediación que la hemos definido antes, es la técnica que emplea especies vegetales para la eliminación de contaminantes. D

[32] Las especies vegetales que se han empleado en fitorremediación tienen un carácter muy selectivo, es decir, solo acumulan uno o dos metales, su biomasa es muy baja, lo que les permite una baja capacidad de almacenamiento. Crecen en zonas muy determinadas y poseen unas raíces cortas, que es por donde absorben estos metales, por lo que su absorción es muy superficial.

[33] Patente US005364451 Phytoremediation of metáis.

[34] Trata de un proceso para eliminar iones metálicos y describe métodos para realizar este propósito.

[35] El método consiste en extraer una cantidad de metal de un suelo contaminado que contiene metales pesados, para lo que emplea miembros transformados con el vector adecuado, que contiene una secuencia cDNA codificante para la metalotioneína. Como sabemos, se trata de una proteína que muestra una gran afinidad por los metales bivalentes pesados, como son el plomo y el cromo, y que los reivindica en la reivindicación n° 8, es decir, esta patente es selectiva de dichos dos metales.

[36] Posteriormente se fueron descubriendo especies vegetales cuya capacidad de absorción era mayor como las conocidas por hiperacumuladoras.

[37] Patente WO 0028093 Recovering metáis from soil.

[38] Esta patente se refiere a la recuperación de metales, tales como el níquel y cobalto, mediante fitorremediación o fitoextracción de suelos ricos en metales, donde el metal deseado es acumulado selectivamente en las especies vegetales hiperacumuladoras mediante un ajuste del pH del suelo.

[39] Los metales son finalmente extraídos de los tejidos de las partes aéreas de las especies vegetales.

[40] Pero la fitorremediación sigue siendo lenta, pues estas especies desarrollan muy poca biomasa y por lo tanto, poca capacidad de almacenamiento. Además, poseen un ciclo de vida corto, circunstancias que llegan a poner en duda la fitorremediación de terrenos. [41] Las plantas que reivindica están dentro de la familia de las Alyssum.

[42] El mayor problema de estas especies vegetales hiperacumuladoras es que generan poca biomasa, por lo que aunque acumulen mucho, no tienen capacidad de almacenamiento, por tanto, la cantidad de metal extraído es pequeña. Además suelen tener un ciclo de vida muy corto y sólo crecen en zonas muy delimitadas.

[43] El problema no resuelto hasta la fecha es la eliminación de elementos contaminantes de una manera eficaz, es decir, llegar a límites inferiores de los marcados por la Comunidad Económica Europea con tiempos de uno a dos años y no con tiempos mayores de 150/200 años, que es lo que se consigue con las llamadas plantas hiperacumuladoras, es decir, una disminución en el tiempo de cien veces, supondría la mejor solución para eliminar elementos contaminantes del suelo.

[44] La presente invención resuelve este problema mediante la búsqueda y selección de especies vegetales silvestres adaptadas a condiciones edafológicas severas en suelos contaminados, es decir, que ya han sufrido una transformación genética natural y se han adaptado a esas condiciones, y dentro de estas especies, las que no tengan posibilidad de entrar en la cadena alimentaria. Otra condición exigida es su capacidad para adaptar su crecimiento a una gran variedad climatológica a fin de conseguir una especie vegetal que pueda crecer con diferentes condiciones climatológicas. Este método se ha extendido también a suelos muy húmedos, seleccionando en este caso una especie arbórea.

[45] Posteriormente se ha realizado una transformación genética para aumentar considerablemente la capacidad de almacenamiento de los elementos contaminantes y la velocidad de absorción de dichos elementos.

[46] Los elementos o mezcla de los mismos que se pueden eliminar los hemos clasificado en dos grandes grupos; nocivos y no nocivos. Dentro de los nocivos, con estas especies vegetales se pueden eliminar metales pesados como plomo, cadmio, mercurio, plata, boro, aluminio, hierro, manganeso, cobre, níquel y cromo. Elementos radiactivos como uranio, rodio, torio y plutonio, y elementos no nocivos como sodio, magnesio, litio, potasio, calcio...

[47] BREVE EXPLICACIÓN DE LAS FIGURAS

[48] Figura 1. En ella se representa las mediciones de las diferentes características del suelo, para suelos contaminados tipo M 4 , M 15 , M 3, y los límites para suelo agrícola exigidos por la Unión Europea.

[49] Las unidades de estas mediciones se indican en la columna de la izquierda. El significado de n.d. es: no determinado.

[50] Figura 2. Muestra un diagrama de barras que representa el crecimiento en altura de las plantas después de seis meses.

[51] En el eje de ordenadas se indica la longitud en metros al cabo de dicho tiempo de las plantas salvajes de Nicotiana glauca (wt) y de las modificadas genéticamente con el gen TaPCSl OMG.

[52] Se comprueba que las plantas silvestres crecen unos tres metros y medio y la modificada genéticamente alcanzan los cinco metros. Lo que supone que en seis meses han crecido más de un 40%, las plantas modificadas genéticamente.

[53] Figura 3. Efecto de los suelos contaminados M 4 y M 15 sobre la producción de biomasa en gramos en biomasa total (T), biomasa aérea (A), tallos y hojas y biomasa radicular (R) concentración en mg/kg en Populus trémula x tremuloides cv. Etropole. El total acumulado de estos dos elementos (μg), en microgramos. Concentración en tallos y hojas (BCF) y concentración en raíz (RCF). Para plantas silvestres (wt) y modificadas genéticamente.

[54] Figura 4. Aumento de la biomasa en Populus trémula x tremuloides cv. Etropole.

Esta figura representa dos líneas de TaPCSl, y dos de AtPCSl, junto a una planta Silvestre, la de la derecha de la figura, todas en medio M4, es decir en un suelo muy contaminado.

[55] Se observa que las plantas que contienen cualquiera de los dos genes sufren menos la presencia del metal en el suelo y por eso crecen más.

[56] Figura 5. Se representa en un diagrama de barras en número que desarrollan las plantas sin modificar wt, con este gen de Nicotiana glauca y las modificadas con el gen YCF, a los 26 días.

[57] Se puede observar que en todos los casos las plantas modificadas genéticamente, con el gen YCF, desarrollan más follaje que las silvestres.

[58] Figura 6. Se representa en un diagrama de barras las longitudes alcanzadas por las raíces en centímetros, al cabo de 21 días de las plantas salvajes de Nicotiana glauca (wt) frente a las modificadas genéticamente con el gen YCF.

[59] Se observa que en todos los casos la longitud de las raíces de las plantas modificadas es superior que en las plantas salvajes.

[60] DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[61] El método de recuperación de espacios degradados mediante uso de especies vegetales genéticamente modificadas consiste en una serie de pasos que lo caracterizan.

[62] Se trata, en primer lugar, de estudiar (para hacer una selección que cumpla una serie de requisitos), las especies vegetales que tengan capacidad de adaptación climatológica y edafológica.

[63] Para ello hemos definido y clasificado una serie de suelos contaminados.

[64] Entendemos por suelo contaminado a todo aquel cuyas características físicas, químicas o biológicas han sido alteradas negativamente por la presencia de componentes de carácter peligroso de origen humano, en concentraciones tales que comporten un riesgo para la salud humana o el medio ambiente.

[65] Se han sacado una serie de muestras de suelos contaminados en zonas mineras, industriales y fluviales.

[66] Posteriormente se han analizado sus características y estudiado también las especies que sobrevivían en dichos suelos, desde diferentes puntos de vista; morfológico, rechazo alimentario de los animales a dichas especies vegetales, adaptabilidad ambiental y edafológica.

[67] Con las características de estos datos se han definido tres tipos de suelos contaminados, designándolos por M 3 , M 4 , M 15 y un suelo MT (suelo seleccionado del cauce del Rio Turia - Valencia) que adjuntamos en tabla aparte designada como Figura 1. En dicha tabla se indican las cantidades de las características especificadas en la columna de la izquierda, en las unidades indicadas en dicha columna, para los tres tipos de suelo M 3 , M 4 , y M 15 . En la última columna aparecen los límites de concentración establecidos por la Unión Europea, para metales pesados para suelos agrícolas.

[68] De las especies que se han desarrollado en los suelos M 3 , M 4 , M 15 y MT, y por lo tanto están adaptadas a estos suelos, se han rechazado aquellas que eventualmente pudieran formar parte de la cadena trófica y aquellas que sufrían estrés climático al variar, por un periodo determinado, las condiciones climáticas.

[69] El método continuó con el estudio morfológico de las especies vegetales, analizando la profundidad de sus raíces, aspecto de gran importancia en el presente método, pues es el órgano por el cual se absorben los elementos contaminantes, ya que se pretende conseguir una fitorremediación en profundidad y no meramente superficial, aunque la disolución de elementos contaminantes en la tierra sea lenta.

[70] Posteriormente se analizó el lugar o lugares de la especie vegetal donde almacena los elementos contaminantes extraídos del suelo (raíces, tallo y hojas), ya que según sea dónde se acumulan tendrán mayor o menor capacidad de almacenamiento de dichos metales. En la figura 3, se puede apreciar la producción de biomasa, en suelos altamente contaminados tipo M 4 y M 15 , así como las concentraciones en mg/kg de plomo y zinc, sus totales (μg) en microgramos, concentraciones por bioconcentración (BCF) y las concentraciones radiculares (RCF), en especies vegetales silvestres de Populus trémula x tremuloides cv. Etropole (wt) y modificados genéticamente (PTa3 y PTa5).

[71] Otra característica determinante y seguida en este método es el estudio de la cantidad de biomasa producida por estas especies vegetales, ya que al aumentar ésta, aumenta la capacidad de almacenamiento y por tanto la fitorremediación.

[72] Por último, se tenía que seleccionar especies vegetales que tuvieran no sólo una muy fácil reproducción sino que también cumpliera con el requisito de que fuera una re- producción muy abundante, es decir, que se multiplicara fácilmente.

[73] Con estos criterios se han ido seleccionando especies vegetales por exclusión, resultando como mejor opción Nicotiana glauca para terrenos secos y Populus trémula x tremuloides cv. Etropole para terrenos húmedos.

[74] La nicotiana glauca salvaje (wt), seleccionada tiene una serie de características que la hacen idónea para emplearla como combustible ya que; germina en campo abierto y su poder de germinación es muy bueno. Se reproduce por esquejes.

[75] Cuando se corta una rama o parte de la planta, la planta vuelve a regenerar esa parte y sigue creciendo.

[76] Resiste temperaturas muy altas, y también bastante bajas.

[77] Resiste sequía y salinidad.

[78] Es herbácea en las primeras etapas de su desarrollo lo que le permite tener un marco de plantación muy grande.

[79] Se lignifica pronto lo que permite que sea buena para su combustión y por tanto producir energía calorífica y/o eléctrica.

[80] Es muy poco o nada atacable por parásitos o enfermedades lo que permite que su producción no decaiga en eficiencia.

[81] Necesita muy poco riego.

[82] A estas especies vegetales, (Nicotiana glauca y Populus trémula x tremuloides), se les han introducido los genes TaPCSl, y TaPCSl-AtPCSl, respectivamente.

[83] El método impuesto continuó estudiando el comportamiento de las especies vegetales en su plantación y crecimiento, por lo que se tomaron varias muestras estudiándose el desarrollo de las mismas en suelo control (M 0 ), no contaminado y en suelos contaminados (M 3 , M 41 M 15 y MT).

[84] Se observó que en las especies vegetales seleccionadas y en todo tipo de suelos la biomasa aumentaba, en ambos casos, en más de un 40%, al estar modificadas genéticamente con TaPCSl y AtPCSl.

[85] La figura 4 representa dos líneas de TaPCSl y dos de AtPCSl de Populus trémula x tremuloides cv. Etropole, junto a una planta silvestre, que es la de la derecha de la figura 4, en terreno contaminado M 4 .

[86] Estos ensayos se realizaron también en suelos no contaminados, comprobándose que en todos los ensayos ocurría lo mismo, un aumento de biomasa en las especies modificadas, lo que constituye una verdadera novedad, es decir, la introducción de dichos genes en una especie vegetal, aumenta la producción de biomasa tanto en suelos contaminados como no contaminados.

[87] Una de las características más importantes en la fitorremediación es la cantidad de biomasa que desarrollan las especies vegetales seleccionadas, aunque el aumento de la biomasa fue sorprendente al introducir los genes TaPCSl y AtPCSl, como hemos indicado antes, se ha investigado el aumento de esta característica con otros genes y se descubrió que mediante la introducción del gen YCF, la producción de biomasa aumentaba en más de un 30%, por lo que añadiendo esta transformación a las obtenidas anteriormente con la introducción de los genes TaPCSl y AtPCSl, se conseguiría un aumento total de la biomasa de las plantas muy importante, además de una ñtorremediación que acortara el tiempo considerablemente.

[88] Se realizó un estudio comparativo del crecimiento en plantas de Nicotiana glauca modificadas genéticamente (GMOs) y sin modificar. Para ello, se partió de las siguientes líneas de plantas:

[89] wt

[90] Ll, L7 y L3 transformadas con el gen YCFl

[91] Se realizó un estudio del crecimiento de cada una de las líneas, evaluando primero el número de hojas de cada planta y, en un segundo experimento, la longitud de las raíces.

[92] Se puede observar en la figura 5 el número de hojas que desarrollan las plantas sin modificar con este gen wt y las modificadas a los 26 días.

[93] En las plantas transformadas con el gen YCFl se observan unos valores de crecimiento homogéneos dentro de las líneas, y además, superiores a los valores de las plantas wt en prácticamente todos los casos, como puede observarse en la figura 6 la longitud de las raíces a los 21 días.

[94] Dentro de cada grupo de líneas se observa un crecimiento radicular homogéneo, ya que no hay grandes diferencias en la longitud de las raíces de las líneas del mismo grupo.

[95] Las plantas transformadas con el gen YCFl son las que presentan un mayor crecimiento radicular, siendo la longitud de sus raíces superior a de las plantas wt.

[96] Al estudiar los 3 casos conjuntamente se observa que los gráficos muestran un patrón de crecimiento común, es decir, en los 3 experimentos se ve que las líneas transformadas con el gen YCFl proporcionan los mayores valores de crecimiento.

[97] Se concluye que con las especies vegetales modificadas disminuyen de 100 a 200 veces el tiempo necesario para la descontaminación de suelos.

[98] La metodología utilizada para la introducción de los genes con los que se consigue incrementar la síntesis de fitoquelatinas es la siguiente:

[99] En primer lugar se incluyeron los genes en el plásmido adecuado para la especie vegetal.

[100] En el caso de la especie vegetal Nicotiana glauca se partió del plásmido de levadura pYESTaPCSl que contiene el gen de la fitoquelatina sintetasa de Triticum aestivum (TaPCSl). El cDNA del gen clonado previamente en levadura se designó como plásmido pYESTaPCSl. [101] El plásmido se digiere sólo en un corte lineal con Xho I y se convierte dicho corte en extremos romos con la ayuda de la DNA polimerasa I. Después, del cambio a extremos romos, el resto del plásmido pYESTaPCSl se dirige con BamHI para producir un fragmento de 2 Kb conteniendo el cDNA del gen TaPCSl y con extremo 5' BamHI y 3' romo.

[102] Paralelamente, el plásmido pBI121 intacto se digiere con BamHI y ECL136 II (que deja romo el extremo 3' para que complemente con el 3' del inserto). El inserto de 2 Kb se liga en los sitios BamH I-Ecll36 II del plásmido recién cortado, obteniéndose la nueva construcción pBITaPCSl.

[103] La nueva construcción (pBITaPCSl) se electropora en una cepa de Agrobacterium tumefaciens, CSδClRiP Rif (Van Larebeke et al. 1974). Los explantes de hoja de Nicotiana glaucase infectan conA. tumefaciens después de dos días de cultivo en medio organogénico NB2510 [sales MS (Murashige y Skoog, 1962) incluyendo vitaminas Gamborg B5, 3 % sacarosa, 2.5 SYMBOL 109 \f 'Symbol' \s 12g mL 1 Naftaleno acético (NAA), 1 SYMBOL 109 \f 'Symbol' \s 12g mL 1 6 bencil ami- nopurina (BA) 0.8 % agar en la oscuridad. Los explantes de hojas adultas y jóvenes se infectan por inmersión en cultivo de Agrobacteriumdumnte 10 minutos. Después un día de co-cultivación los explantes se transfieren a un medio selectivo NB2510 conteniendo 100 SYMBOL 109 \f 'Symbol' \s 12g mL 1 de kanamicina y carbenicilina (350 SYMBOL 109 \f 'Symbol' Vs 12g/mL). Dos meses después de la infección, las plantas son individualmente extraídas de los explantes y transferidas a botes conteniendo 30 mi de medio Bl (sales MS incluyendo vitaminas Gamborg B5, 0.3 SYMBOL 109 \f 'Symbol' \s 12g mL 1 ácido indol acético de 0.2 SYMBOL 109 \f 'Symbol' \s 12g mL 1 NAA, 1 % sacarosa, 100 SYMBOL 109 \f 'Symbol' \s 12g mL 1 , 0.7 % agar).

[104] Además del gen TaPCSl, también se introdujo en Nicotiana glauca el gen YCFl (Yeast Cadmium Factor) de Saccharomyces cerevisiae. Se trata de un transportador vacuolar que facilita la entrada y acumulación de metales en la vacuola. A la secuencia del cDNA del gen YCFl de levadura (Saccharomyces cerevisiae) clonado previamente, se le añadió, en el extremo 5', la secuencia de corte de Xbal junto con la del promotor 35s (CaMV- Virus del mosaico de la coliflor), para aumentar la expresión del gen, y en el extremo 3', la secuencia del terminador 'oes' junto con el sitio de corte para Sacl. Paralelamente el plásmido pGreen 0179 intacto se digiere con Sacl y Xbal. El inserto se liga en los sitios Sac I - Xbal del plásmido recién cortado obteniéndose una nueva construcción llamada pGYCFl. El método de transformación es el mismo, pero en este caso con 1 a nueva construcción pGYCFl.

[105] En e 1 caso de la especie vegetal Populus trémula x tremuloides cv. Etropole, los genes introducidos son el TaPCS 1 y el AtPCS 1 (fitoquelatina sintetasa de Arabidopsis thaliana). El gen AtPCSl de la fitoquelatina sintetasa de Arabidopsis thaliana fue clonado mediante PCR en un ORF incompleto (en su extremo 5') de 1458 nt, al cual le fueron añadidos 44nt para completar la secuencia codificante en el extremo 5', junto con la secuencia GCTggATccACC conteniendo el lugar de corte de la enzima BamHI y el fragmento 'kozac' (CACC) en dicho extremo, para sobreexpresar el gen AtPCSl. También le fue añadido al final de la secuencia codificante (extremo 3') una secuencia de restricción para EcoRV que permite su posterior inserción en el plásmido. Paralelamente, el plásmido pBI121 intacto se digiere con BamHI y Ecll36II (que deja romo el extremo 3' para que complemente con el 3' del inserto), extrayendo el gen uidA en su lugar. El inserto de 1.6 Kb ( AtPCSl) se liga en lo s sitios BamHI y EcIl 3611 del plásmido recién cortado, obteniéndose una nueva construcción llamada pBIAtPCSl. El método de transformación es el mismo, pero en este caso con las dos construcciones, pBIAtPCSl y pBITaPCSl.

[106] El problema que se resuelve con este método es el de encontrar la especie vegetal ideal para la descontaminación de suelos, solucionando los problemas planteados anteriormente como son:

[107] • Disminución del tiempo de la fitorremediación en 100 a 150 veces. D

• Aumento de la producción de biomasa. D

• Adaptación a diferentes condiciones climáticas y edafológicas. D

• Aumento del rango de extracción de metales pesados. D

[108] Así, estas especies vegetales tendrán capacidad de adaptación a diferentes condiciones climáticas y edafológicas, produciendo una gran cantidad de biomasa, y acumulando elementos o mezcla de los mismos anteriormente clasificados en dos grandes grupos; nocivos y no nocivos. Dentro de los nocivos, con estas especies vegetales se pueden eliminar metales pesados como plomo, cadmio, mercurio, plata, boro, aluminio, hierro, manganeso, cobre, níquel y cromo. Elementos radiactivos como uranio, rodio, torio y plutonio, y elementos no nocivos como sodio, magnesio, litio, potasio, calcio, etc...

[109] Además, la especie N. glauca modificada es una planta que se puede decir agradable a la vista.