Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten bei dem man als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin verwendet.

Industriewasser wird für bestimmte Bergbautechniken, beispielsweise im Diamanten-, Gold- oder Silberbergbau in großen Mengen benötigt, insbesondere zur Aufarbeitung und Trennung der Wertstoffe vom Abraum. Derartige Bergbaugebiete liegen häufig in heißen, ariden oder semiariden Gebieten, in denen Wasser knapp ist und häufig mit hohem Aufwand in die Bergbaugebiete transportiert werden muss. Industriewasser wird daher in der Regel mehrfach verwendet und zwischen einzelnen Anwendungen zwischengelagert. In der Regel erfolgt die Lagerung in offenen Flüssigkeitsreservoiren wie beispielsweise Speicherseen oder Ähnlichem.

Um die Verluste an Wasser durch Verdunstung zu verringern, ist es bekannt, auf die Wasseroberfläche Sperrschichten aus hochsiedenden Kohlenwasserstoffen, beispielsweise Dieselöl, aufzubringen, welche die Verdunstung von Wasser verringern soll. Diese Sperrschicht ist aber häufig nicht flächendeckend und homogen. Häufig bilden sich „Fettaugen" anstelle einer homogenen Schicht. Die Flüssigkeitsverluste durch Verdampfen sind daher trotz der Sperrschicht hoch.

Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteris- tisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind.

Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.

Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Unsere ältere Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene An- Wendungen vorgeschlagen worden.

WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-in- Wasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie

kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.

EP 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiffrümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 80 ⁰ C.

WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Keratin- Materialien in kosmetischen Anwendungen.

WO 03/10331 offenbart einen mit Hydrophobin beschichteten Sensor, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Sub- stanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.

Die Verwendung von Hydrophobinen zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten in offenen Flüssigkeitsreservoiren ist bislang noch nicht offenbart worden.

Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten, insbesondere Flüssigkeiten in offenen Flüssigkeitsreservoiren bereitzustellen.

Dementsprechend wurde ein Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten (F) gefunden, bei dem man die Oberfläche der Flüssigkeit (F) mit einer mit dieser nicht mischbaren Sperrflüssigkeit (S) bedeckt, welche einen höheren Siedepunkt sowie eine geringere Dichte aufweist als die Flüssigkeit, wobei man der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrflüssigkeit (S) als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin zusetzt. Bevorzugt handelt sich bei der Flüssigkeit (F) um Wasser. Bevorzugt handelt es sich um eine Flüssigkeit in einem offenen Flüssigkeitsreservoir.

In einem zweiten Aspekt der Erfindung wurden offene Flüssigkeitsreservoire gefunden, welche mindestens eine Flüssigkeit (F) sowie eine Sperrflüssigkeit (S), welche einen höheren Siedepunkt sowie eine geringere Dichte aufweist als die Flüssigkeit (F), mit dieser nicht mischbar ist und die Oberfläche der Flüssigkeit (F) bedeckt umfassen, wobei das Flüssigkeitsreservoir weiterhin mindestens ein Hydrophobin umfasst.

In einem dritten Aspekt der Erfindung wurde die Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel für Flüssigkeitssperrschichten gefunden.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich die Verdunstungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit (F) durch die Verwendung von Hydrophobinen drastisch vermindern lässt. In einem typischen Ausführungsbeispiel der Erfindung waren in einem offenen Flüssigkeitsreservoir ohne die Verwendung von Hydrophobinen nach 20 Tagen mehr als 60 % der ursprünglich vorhandenen Flüssigkeit verdampft. Bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz verdampften in der gleichen Zeit nur etwa 13 Gew. % der ursprünglich vorhandenen Flüssigkeit.

Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:

Bei der Flüssigkeit (F), die vor Verdunstung geschützt werden soll, kann es sich prinzipiell um beliebige wässrige oder organische Flüssigkeiten handeln. Selbstverständlich kann es sich auch um ein Gemisch verschiedener Stoffe handeln. Bevorzugt handelt es sich aber um Wasser, beispielsweise um Trinkwasser, Brauchwasser, Industriewas- ser oder Seewasser. In der Regel handelt es sich um Abwässer oder wieder zu verwendende Brauchwässer aus industriellen, technischen Prozessen. Der Begriff „Wasser" soll nicht auf chemisch reines Wasser beschränkt sein, sondern das Wasser kann auch noch weitere Bestandteile gelöst, dispergiert oder aufgeschlämmt enthalten. Beispielweise kann das Wasser gelöste Salze oder Schlämme, beispielsweise aus Ab- räum oder Komponenten von Abraum oder aber auch mit Wasser mischbare, organische Lösemittel enthalten.

Die Flüssigkeit kann hierbei beliebig angeordnet sein. Beispielsweise kann es sich um Wasser in Meeren oder Seen handeln oder auch in beliebigen Vorrichtungen abgefüllte Flüssigkeiten. Bevorzugt befindet sich die Flüssigkeit in einem offenen Flüssigkeitsreservoir.

Der Begriff „offenes Flüssigkeitsreservoir" in Sinne dieser Erfindung bedeutet ein Flüssigkeitsreservoir, welches nicht vollständig von der Umgebung abgeschlossen ist, son- dem noch im Kontakt mit der Umgebung steht, so dass die Flüssigkeit prinzipiell verdampfen und in Umgebung gelangen kann. Es kann sich hierbei beispielsweise um einen Tank handeln, der eine nicht verschlossene Öffnung aufweist. In der Regel handelt es sich aber um ein Reservoir, bei dem die gesamte Oberfläche der Flüssigkeit nicht bedeckt ist. Es kann sich um natürliche oder um künstlich angelegte Flüssigkeits- reservoire handeln. Beispiele derartiger offener Flüssigkeitsreservoire umfassen Speicherseen, Talsperren, Zisternen, offene Lagerbehälter oder sogenannte Lagunen.

Erfindungsgemäß wird die Oberfläche der Flüssigkeit (F) mit einer mit dieser nicht mischbaren Sperrflüssigkeit (S) bedeckt. Bei der Sperrflüssigkeit kann es sich selbst- verständlich auch um ein Gemisch verschiedener Stoffe handeln. Der Begriff „nicht mischbar" bedeutet, dass sich keine wesentlichen Mengen der Sperrflüssigkeit in der Flüssigkeit lösen sollen. Es schließt selbstverständlich nicht aus, dass Spuren oder

unwesentliche Mengen gelöst werden könnten. Die Sperrflüssigkeit weist naturgemäß eine geringere Dichte auf, als die Flüssigkeit, deren Verdunstung verzögert werden soll. Die Sperrflüssigkeit weist weiterhin einen höheren Siedepunkt bzw. Siedebereich auf, als die Flüssigkeit, deren Verdunstung verzögert werden soll.

Der Fachmann trifft unter den prinzipiell möglichen Sperrflüssigkeiten (S) eine geeignete Auswahl.

Für den bevorzugten Fall, dass es sich bei der Flüssigkeit (F) um Wasser oder ein wässriges Flüssigkeitsgemisch handelt, haben sich unpolare oder im Wesentlichen unpolare Flüssigkeiten als Sperrflüssigkeit bewährt. Beispiele umfassen insbesondere Kohlenwasserstoffe bzw. Gemische von Kohlenwasserstoffen. Der Siedepunkt eingesetzter Kohlenwasserstoffe wird vom Fachmann gewählt. Bewährt hat sich ein Siedepunkt von mindestens 150 ⁰ C. Bei Mischungen bezieht sich diese Angabe auf die Un- tergrenze des Siedebereiches, wobei mögliche Verunreinigungen mit leichtflüchtigen Verbindungen nicht berücksichtigt werden. Beispielsweise können Kohlenwasserstoffgemische mit einem Siedebereich von 150 bis 250 ⁰ C, bevorzugt 200 bis 300 ⁰ C und besonders bevorzugt 220 bis 350 ⁰ C eingesetzt werden.

Beispiele derartiger Gemische umfassen hochsiedende paraffinische, naphthenische und aromatische Mineralöle. Derartige Mineralöle werden durch Vakuumdestillation aus Erdölen gewonnen. Bevorzugt sind hochsiedende im Wesentlichen paraffinische und/oder naphthenische Mineralöle. Derartige Mineralöle werden auch als Weißöle bezeichnet, wobei der Fachmann zwischen technischen Weißölen, die noch einen ge- ringen Aromatengehalt aufweisen können, sowie medizinischen Weißölen, die im Wesentlichen aromatenfrei sind, unterscheidet. Weitere Beispiele umfassen Petroleumbenzin oder Dieselöl.

Es können aber auch biologisch gut abbaubare, natürliche, insbesondere pflanzliche Öle eingesetzt werden. Beispiele umfassen Sojaöl, Holzöl, Tallöl, Distelöl, Ricinenöl, Rapsöl oder Leinöl. Weiterhin können auch Derivate derartiger Öle eingesetzt werden. Beispiele umfassen Ester wie Rapsölmethylester oder Tallölfettsäureester.

Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeitsoberfläche mit der Sperrflüssigkeit (S) bedeckt. Die Menge der Sperrflüssigkeit wird vom Fach- mann so bemessen, dass einerseits eine möglichst vollständige Bedeckung der Flüssigkeitsoberfläche gewährleistet ist, dass aber andererseits eine zu große Menge an Sperrflüssigkeit vermieden wird. Im Regelfalle sollte die Dicke der Sperrschicht nicht mehr als 2, bevorzugt nicht mehr als 1 mm betragen, ohne dass höhere Dicken damit prinzipiell ausgeschlossen sein sollten. Bewährt haben sich insbesondere Schichtdi- cken von 0,1 bis 1 mm, bevorzugt 0,2 bis 0,9 mm und besonders bevorzugt 0,3 bis 0,8 mm.

Erfindungsgemäß wird der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrschicht als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin zugesetzt. Selbstverständlich können auch Gemische aus verschiedenen Hydrophobinen eingesetzt werden.

Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen im Folgenden Proteine der allgemeinen Strukturformel (I)

Xn-C^Xi-so-C^Xo-s-C^XLioo-C ^t -Xi-ioo-C ^S -Xi-so-Ce-Xo-s-C^Xvso-C^Xm (I)

verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der Aminosäuren C für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen von 0 bis 500, bevorzugt von 15 bis 300.

Die Polypetide gemäß Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergröße- rung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20° , bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Die mit C ¹ bis C ⁸ benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C ¹ bis C ⁸ aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäß verwendeten Proteinen entweder reduziert vorliegen oder mit- einander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.

Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)

Xn-C ¹ -X ₃ .25-C ² -Xθ-2-C ³ -X ₅ «rC ⁴ -X2-3S-C5-X _a .iβ-C ^β -Xo.2-C ⁷ -X3^s-C« ^J -X _m (II)

zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, jedoch stehen die Indizes n und m für Zahlen von 0 bis 300, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)

Xn-C ¹ -X _& .o-C^C ³ -Xi _M 9-C ⁴ -X2^3-C ⁵ -X5β-C ^β -C ⁷ -Xβ.iβ-C ^β -X _m (III)

eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen von 0 bis 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der Aminosäuren C um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Aminosäuren C um Cystein.

Bei den Resten X _n und X _m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste X _n und/oder X _m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid- sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X _n und/oder X _m um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartner bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.

Der Fusionspartner kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X _n ) und am Carboxyterminus (X _m ) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartnerteile mit einer Position (X _n oder X _m ) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartnerteile sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartnerteile sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16), ya- ae(SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70 bis 99%, besonders bevorzugt 80 bis 98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem Fusionspartner als eine Gruppe X _n oder X _m noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirkend können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-,

(Phe)k- oder (Cys)k-Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht.

Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidse- quenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschich- tung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 tf I. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.

Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und

in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und Il (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol, 32, 413-437).

Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1 % Na-Dodecylsulfat (SDS) bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse Il Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1 % SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden.

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C ³ und C ⁴ bei Klasse Il Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I. Klasse Il Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl , basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobinteile, bevor- zugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.

Erfindungsgemäß besonders geeignet sind weiterhin die Fusionsproteine yaad-Xa- dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl- his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deleti- on von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller

Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Besonders zur Ausführung der Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA- his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Reste. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürtzer yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann

ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merri- field herstellen.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.

Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart.

Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfah- ren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung von Expressionskonstrukten, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expressi- on der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer'-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.

Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Au- xotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promoto- ren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, Ipp-, lac-,lpp-lac-,laclq-T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulati- onssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1 ,MFalpha, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.

Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhaft- erweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons.lS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen.

Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,plN-lll"3-B1, tgt11 oder pBdCI, in StreptomycesplJ101 , plJ364,plJ702 oderplJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacteri- um pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Ge- nexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage"zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminatoroder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. etal., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. andWiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor inser- tiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer- den.

Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Proteine eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co- Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel etal., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfin-

dungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder euka- ryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacte- riaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomy- ces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und100 ⁰ C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 ⁰ C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kon- tinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Erfindungsgemäß verwendete Proteine oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon, können mittels eines rekombinanten Verfahrens hergestellt werden, bei dem man einen Proteine-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Proteine induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Proteine können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermen- tiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 ⁰ C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die erfindunsgemäß verwerdeten Proteine nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten

Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French- Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der erfindunsgemäß verwendeten Proteine kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativerGelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Proteine oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N. Y.) Press). Weitere geeignete Tags sind z.B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.

Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.

Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen geeignet, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacco etch virus Protease).

Die Auswahl der Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung ist nicht beschränkt. Der Fachmann trifft eine geeignte Auswahl. Besonders bewährt haben sich Fusionsproteine, wie beispielsweise yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) oder yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21).

Die Hydrophobine können zur Ausführung der Erfindung vorteilhaft als wässrige Formulierungen eingesetzt werden. Hierzu können bevorzugt die bei der Synthese und/oder Isolierung erhaltenen wässrigen Lösungen eingesetzt werden. Den wässrigen Formulierungen können aber selbstverständlich auch noch mit Wasser mischbare, organische Lösemittel zugesetzt werden. Beispiele derartiger Lösemittel umfassen mit Wasser mischbaere Alkohole, wie beispielsweise Ethanol, Propanol oder Ethylengly- kol.

Selbstverständlich können die Hydrophobine aber auch zunächst als Substanz isoliert werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen, und als solche oder aber gelöst in einem nichtwässrigen Lösemittel bzw. entsprechende Formulierungen auf Basis nicht- wässriger Lösemittel zum Einsatz kommen.

Erfindungsgemäß verwendete Hydrophobin-Formulierungen können selbstverständlich noch weitere Hilfsstoffe und Additive umfassen. Beispiele umfassen Tenside, Puffer, Lösemittel, Konservierungsmittel wie Proteaseinhibitoren, Stabilisatoren wie beispielsweise Proteine, Zucker oder Zuckerderivate, Alkohole oder wasserlösliche Polymere.

Die Konzentration der Hydrophobine in der Formulierung wird vom Fachmann gewählt. Bewährt haben sich Konzentrationen von 0,001 ppm bis 10 %.

Erfindungsgemäß können die Hydrophobine der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrschicht zugegeben werden. Dies kann durch einfaches Mischen des Hydrophobins oder bevorzugt einer geeigneten Hydrophobin-Formulierung mit der Flüssigkeit und/oder der Sperrflüssigkeit erfolgen. Das Versetzen mit Hydrophobin kann vor dem Bedecken der Flüssigkeitsoberfläche mit der Sperrflüssigkeit erfolgen, oder auch erst danach. Bevorzugt kann auch nur die Oberfläche der Flüssigkeit mit dem Hydrophobin behandelt werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, indem man die Oberflä- che, insbesondere eine Wasseroberfläche, vor dem Bedecken mit der Sperrflüssigkeit mit einer Hydrophobinlösung besprüht. Es kann auch eine bereits mit der Sperrflüssigkeit bedeckte Oberfläche mit einer Hydrophobin-Formulierung besprüht werden. Vorzugsweise wird das Hyrophobin in der Flüssigkeit gelöst oder suspendiert, bevor die Sperrflüssigkeit aufgetragen wird.

Es sind schon geringe Mengen an Hydrophobinen ausreichend, um erfindungsgemäß Verdunstungsverzögerung zu bewirken. Die Menge an Hydrophobinen wird vom

Fachmann bestimmt. Bewährt haben sich Mengen von ca. 1 bis 10 g/m ² Oberfläche, bevorzugt 3 bis 8 g/m ² .

Die Erfindung eignet sich insbesondere zum Schutz von Industriewasser vor Verduns- tung, beispielsweise in Speicherseen oder dergleichen gespeichertes Wasser für Bergbauanwendungen.

Als natürliche Stoffe können Hydrophobine bevorzugt in biologisch abbaubaren Systemen engesetzt werden, beispielsweise, indem man als Sperrflüssigkeit eine biologisch gut abbaubare Flüssigkeit, wie beispielsweise ein natürlich vorkommendes, pflanzliches, tierisches oder bakterielles Öl einsetzt. Beispiele umfassen Rapsöl oder sogenannten „Bio-Diesel".

Es ist vorgeschlagen worden, zur Verhinderung oder zumindest zur Abschwächung von Hurrikans im Entstehungsgebiet des Hurrikans Öl auf das Wasser zu gießen, um hierdurch die Verdunstung des Wassers zumindest zu verzögern. Auch derartige Ölfilme können erfindungsgemäß mit Hydrophobinen weiter stabilisiert werden, um die Verdunstungsrate zu verringern. Hierzu bietet es sich insbesondere an, biologisch abbaubare Sperrflüssigkeiten zu verwenden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Teil A: Herstellung und Test der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine

Beispiel 1

Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-HiS6/ yaaE-His6

Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine PoIy- merase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HISe bzw. YAAE::HIS ₆ verwendet werden.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

Beispiel 2 Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-HiS6

Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.

Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS ₆ verwendet werden.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC

Beispiel 3

Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-HiSß

Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

Beispiel 4

Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-HJS6

Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.

Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).

KaM417ICCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Beispiel 5

Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-HJS6

Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.

Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang).

KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

Beispiel 6

Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-HJS6

Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.

Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Beispiel 7 Fermentation des rekombinanten E. coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-HiS6

Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-Hisβ expri- mierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 10Oμg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.

13.51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (ODδooπm 1 :10 gegen H2O gemessen) animpfen. Bei einer ODβonm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.

Beispiel 8

Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins

(Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)

100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension

wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum ZeI- laufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA- Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (Abbildung 1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Ni- ckel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.

Abbildung 1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins:

Spur 1 : Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)

Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt

Spuren 3 - 5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen

Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.

Beispiel 9 Charakterisierung des Hydrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas

Substrat:

Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):

Es wurde das gemäß Beispiel 8 gereinigte Hydrophobin eingesetzt.

Konzentration des Hydrophobins in der Lösung: 100 μg/ml, die Lösung enthielt weiterhin 50 mM Na-Acetat-Puffer sowie 0,1% Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaureat (Tween ^® 20), pH-Wert der Lösung: 4

Eintauchen von Glasplättchen fn diese Lösung über Nacht (Temperatur 80 ⁰ C) Danach wird das mit Hydrophobin beschichtete Glasplättchen der Lösung entnommen und in destilliertem Wasser gewachen,

Danach Inkubation 10min / 80 ⁰ C / 1% SDS-Lösung in dest. Wasser Erneutes Waschen in dest. Wasser

Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontäktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser mit der beschichteten Glasoberfläche bei Raumtemperatur bestimmt.

Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.

Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°;

Das mit dem Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his ₆ ) beschichtete Glasplättchen ergab einen Kontaktwinkel von 75 ± 5°.

Zunahme des Kontaktwinkels: 45°

Teil B:

Verwendung der Hydrophobine zur Reduzierung der Verdunstungsgeschwindigkeit

Verwendete Lösung:

Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Fusionsproteines yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in Lösung: 6,1 mg/ml.

Nullversuch: Wasser ohne Sperrflüssigkeit

Durch Verdünnen mit Wasser wurde eine Lösung einer Konzentration von 1 mg/ml Hydrophobin erhalten. 100 g davon wurden in ein Becherglas von 10 cm Durchmesser eingefüllt. Zu Vergleichszwecken wurden 100 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz verwendet. Beide Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert.

Es wurde kein signifikanter Unterschied bei der Verdunstung des Wassers bzw. der Hydrophobin-Lösung beobachtet. Bei beiden Proben waren nach 3 Tagen ca. 70 % des Wassers verdunstet.

Beispiel 10:

In einem Becherglas mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 6,56 g der oben erwähnten Hydrophobin-Lösung mit Wasser auf insgesamt 200 g verdünnt (Hydropho- bin-Konzentration 0,2 mg/ml, Gesamtmenge 40 mg). Die Oberfläche der Flüssigkeit (Fläche: 78,5 cm ² ) wurde mit 3,5 g Dieselöl (Dichte 0,83 g/ml) als Sperrflüssigkeit bedeckt. Die Wasseroberfläche wurde hiervon vollständig bedeckt. Die Dicke der Sperrschicht betrug ca. 0,54 mm.

Vergleichsbeispiel:

Zu Vergleichzwecken wurden 200 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz in der beschriebenen Art und Weise mit der Sperrflüssigkeit überschichtet.

Lagerung der Proben:

Die Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Die Gewichtsabnahme wurde über insgesamt 20 Tage jeweils durch Auswiegen bestimmt. Es wurden jeweils zwei Versuche und zwei Vergleichsversuche durchgeführt, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusam- mengefasst.

Tabelle 1 : Gesamte Flüssigkeitsmenge im Becherglas in Abhängigkeit von der Lagerdauer

Die Beispiele und Vergleichsbeispiele demonstrieren, dass durch den Zusatz von Hydrophobinen die verdunstungshemmende Wirkung der Sperrschicht signifikant gesteigert wird.

Während ohne den Hydrophobin-Zusatz nach 20 Tagen trotz Sperrschicht mehr als 60 % des Wassers verdampfen, verdampfen bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz in der gleichen Zeit nur etwa 13 Gew. %. Die Qualität der Sperrschicht wird durch den Zusatz von Hydrophobin signifikant verbessert.

Beispiel 11 :

In einem Becherglas mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 6,56 g der oben erwähnten Hydrophobin-Lösung mit Wasser auf insgesamt 200 g verdünnt (Hydropho- bin-Konzentration 0,2 mg/ml, Gesamtmenge 40 mg). Die Oberfläche der Flüssigkeit (Fläche: 78,5 cm ² ) wurde mit 6,0 g RME-Biodiesel als Sperrflüssigkeit bedeckt. Die Wasseroberfläche wurde hiervon vollständig bedeckt. Die Dicke der Sperrschicht betrug ca. 1 ,0 mm.

Vergleichsbeispiel:

Zu Vergleichzwecken wurden 200 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz in der beschriebenen Art und Weise mit der Sperrflüssigkeit überschichtet.

Lagerung der Proben:

Die Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Die Gewichtsabnahme wurde über insgesamt 19 Tage jeweils durch Auswiegen bestimmt. Es wurden jeweils zwei Versuche und zwei Vergleichsversuche durchgeführt, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2: Gesamte Flüssigkeitsmenge im Becherglas in Abhängigkeit von der Lagerdauer

Die Beispiele und Vergleichsbeispiele demonstrieren, dass durch den Zusatz von Hydrophobinen die verdunstungshemmende Wirkung der Sperrschicht signifikant gesteigert wird.

Während ohne den Hydrophobin-Zusatz nach 19 Tagen trotz Sperrschicht mehr als 95 % des Wassers verdampfen, verdampfen bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz in der gleichen Zeit nur etwa 15 Gew. %.

Beispiel 12:

In einem Becherglas mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 6,56 g der oben erwähnten Hydrophobin-Lösung mit Wasser auf insgesamt 200 g verdünnt (Hydropho- bin-Konzentration 0,2 mg/ml, Gesamtmenge 40 mg). Die Oberfläche der Flüssigkeit (Fläche: 78,5 cm ² ) wurde mit 6,0 g Rapsöl als Sperrflüssigkeit bedeckt. Die Wasseroberfläche wurde hiervon vollständig bedeckt. Die Dicke der Sperrschicht betrug ca. 1,0 mm.

Vergleichsbeispiel:

Zu Vergleichzwecken wurden 200 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz in der beschriebenen Art und Weise mit der Sperrflüssigkeit überschichtet. Lagerung der Proben:

Die Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Die Gewichtsabnahme wurde über insgesamt 19 Tage jeweils durch Auswiegen bestimmt. Es wurden jeweils zwei Versuche und zwei Vergleichsversuche durch-

geführt, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusam- mengefasst.

Tabelle 3: Gesamte Flüssigkeitsmenge im Becherglas in Abhängigkeit von der Lagerdauer

Die Beispiele und Vergleichsbeispiele demonstrieren, dass durch den Zusatz von Hydrophobinen die verdunstungshemmende Wirkung der Sperrschicht signifikant gesteigert wird.

Während ohne den Hydrophobin-Zusatz nach 19 Tagen trotz Sperrschicht mehr als 90 % des Wassers verdampfen, verdampfen bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz in der gleichen Zeit nur etwa 35 Gew. %.

Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll