BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von pri¬ märe Aminogruppen enthaltenden Spezies aus Lösungen sowie ver¬ schiedene Anwendungen dieses Verfahrens.

Es ist bekannt, primäre Amine und Aminosäuren sowie Proteine mit o-Phtaldialdehyl und Mercaptoethanol zu einem Isoindol- Derivat umzusetzen. Nach der Literaturstelle Analytical Bio- chemistry 54, 102 bis 114 (1973) wird dieses Verfahren dazu verwendet, um Peptide und Proteine nach Trennung durch Gel¬ elektrophorese fluoreszenzanalytisch zu bestimmen. Durch die Verwendung von Mercaptoethanol wird eine Erhöhung der Fluo¬ reszenzintensität erhalten. Eine quantitative Abtrennung von primäre Aminogruppen enthaltenden Spezies wird durch dieses Verfahren nicht bezweckt und auch nicht erreicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches Ver¬ fahren zur Abtrennung von primäre Amino.gruppen enthaltenden Spezies aus Lösungen bereitzustellen, da diese Spezies häuf bei der Bestimmung anderer Spezies, z.B. von sekundären Amino¬ säuren, stören.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß man die primäre Aminogruppen enthaltende Spezies mit einem HS-Gruppen enthaltenden, wasserunlöslichen Träger und einem Diaidehyd der Formel

R

CHO

CHO

R

1 2 worin R und R , die gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffgruppe (Hydrocarbylgruppe) darstellen, oder zusammen einen gegebenfalls substituierten aliphatischen, aro¬ matischen oder heterocyclischen Ring oder ein Ringsystem bil¬ den, zu einem wasserunlöslichen Komplex der Formel

S-Tr

N Sp

! C

W ^ ^ CH

worin Tr den wasserunlöslichen Träger und Sp den Rest der pri¬ märe Aminogruppen enthaltenden Spezies darstellt, umsetzt, und den Komplex aus der Lösung entfernt.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, primäre Aminogrup¬ pen enthaltende Spezies in einem Arbeitsschritt aus der zu un¬ tersuchenden Lösung zu entfernen. Dies wird durch eine spezi¬ fische chemische Reaktion erreicht, in der die primäre Amino¬ gruppen enthaltende Spezies kovalent an den HS-Gruppen ent¬ haltenden, wasserunlöslichen Träger gebunden und somit als wasserunlöslicher Komplex aus der Lösung entfernt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können als primäre Amino¬ gruppen enthaltende Spezies primäre Amine, primäre Aminosäuren, primäre Aminogruppen enthaltende Peptide, Proteine oder Kohlen¬ hydrate oder Mikroorganismen (z.B. Zellen, Bakterien oder Vi¬ ren) mit primären Oberflächen-Aminogruppen aus der Lösung ent¬ fernt werden.

Als HS-Gruppen enthaltende, wasserunlösliche Träger können poly ere organische Vebindungen, z.B. poly ere Kohlenhydrate verwendet werden, die dadurch erhältlich sind, daß man ein mit einem Oxiran aktiviertes poly eres Kohlenhydrat, wie Agarose oder Sepharose, mit Schwefelwasserstoff oder einem sauren Sul¬ fid umsetzt. Derartige Träger wurden bereits als feste Phasen bei der Affinitätschromatgraphie zur Reinigung von Proteinen eingesetzt (vgl. Methods in Enzymology, Vol. 182, 357 bis 369 (1990)); die Proteine sind aber nicht kovalent an der festen Phase gebunden.

Weiterhin können erfindungsgemäße Träger auf der Basis einer wasserlöslichen anorganischen Substanz verwendet werden, die dadurch erhältlich sind, daß man eine freie OH-Gruppe enthal¬ tende anorganische Substanz entweder (a) durch Behandlung mit einem Oxiran oder Siloxan aktiviert und anschließend mit Schwe¬ felwasserstoff oder einem sauren Sulfid umsetzt oder (b) mit einem Thiosilan umsetzt. Bevorzugte anorganische wasserunlös¬ liche Substanzen sind Kieselgele oder Aluminiumhydroxidgele. Derartige Gele sind als Zwischenprodukte bei der Synthese von chiralen Trägermaterialien für Chromatographie bekannt.

Als Dialdehyde können solche verwendet werden, in welchen di

1 2

Reste R und/oder R durch auxochrome oder bathochrome Grupp substituiert sind. Auf diese Weise läßt sich das Adsorptions spektrum der erhaltenen Komplexe in den längerwelligen Berei verschieben, so daß die Komplexe spektroskopisch analysiert werden können.

Bevorzugt verwendete Dialdehyde sind solche mit aromatischen Ringen, insbesondere o-Phthaldialdehyd oder o-Naphthodialdeh

Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Trennstυfe bei der B stimmung von sekundären Aminosäuren, wie Hydroxyproline , ve wendet werden. Bei diesen Verfahren stören primäre Aminosäure weshalb ihre quantitative Abtrennung vor der Durchführung der Bestimmung wünschenswert ist.

Hydroxyproline sind Bestandteile von Collagen. Bei Knochen¬ krebs wird das Bindegewebe um die Knochen zerstört, und man findet die Hydroxyproline im Blut und im Urin. Das erfindungs gemäße Verfahren kann also zur Diagnose von Knochenkrebs ver¬ wendet werden. Entsprechendes gilt für die Diagnose von Osteo porose, wo ebenfalls ein Abbau des Bindegewebes stattfindet. Das Verfahren ist auch für die Analyse von Lebensmitteln an¬ wendbar. Z.B. kann der Collagengehalt von Wurstwaren bestimmt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin zur Enteiweißun (Deproteinierung) von Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüss keiten, wie Blut und Urin, oder aber auch von Getränken, wie Bier, Wein und Fruchtsäf en, verwendet werden. Eiweißstoffe stören besonders bei Anwendung von Elektroden zur Elektrolyt¬ bestimmung, da die Elektroden durch die Eiweißstoffe ver¬ schmiert werden.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Keimfreima¬ chung und zur Entfernung von Antigenen verwendet werden.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bestimmung von primäre Aminogruppen enthaltenden Spezies in einer Lösung. Bei diesem Verfahren geht man so vor, daß man die Lösung mit einem Überschuß eines bathochrome oder auxochro me Substituenten enthaltenden Dialdehyds und dem HS-Gruppen en haltenden, wasserunlöslichen Träger umsetzt, den erhaltenen wa serunlöslichen Komplex trennt und den nicht im Komplex gebunde nen, gelösten Anteil des Dialdehyds spektroskopisch bestimmt.

Die Erfindung ist durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellung eines HS-Gruppen enthaltenden Agarose-Trägers

30 g Agarose-Beads (6 % Vernetzungsgrad) werden mit Wasser ge¬ waschen und filtriert. Das Filtrat wird in 24 ml 1 M NaOH sus¬ pendiert. Bei Raumtemperatur werden unter Rühren 0,75 ml Epi- chlorhydrin zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren wird weitere 2 Stunden bei 60°C gerührt. Anschließend werden die Beads mit Wasser gewaschen, bis das Eluat einen neutralen pH-Wert hat. Danach wird dreimal mit 0,5 M Natriumphosphat (pH-Wert 6,2) gewaschen. Sofort im Anschluß daran werden die Beads abge- nutscht und in 30 ml 2 M Natriumthiosulfat gegeben. Nach sechsstündigem Rühren bei Raumtemperatur wird mit 4 ml Di- thiothreitol (8 mg/ml) in 1 mM EDTA versetzt. Nach 30 Minuten wird abgenutscht. Dann wird mit verschiedenen Lösungen gewa¬ schen; zuerst mit 300 ml 0,1 M NaHCO , 1 M NaCl , 1 mM EDTA,

3 danach mit 300 ml 1 M EDTA und abschließend 300 ml 10 mM

Natriumacetat pH 4, 1 mM EDTA.

Beispiel 2

Herstellung eines HS-Gruppen enthaltenden Kieselgel-Trägers

100 g unbehandeltes Kieselgel (Fällungskieselsäure) werden mi 500 ml Toluol versetzt und zum Erreichen einer homogenen Kons tenz gerührt. Dann werden 50 g Trimethoxy-mercaptopropylsilan zugegeben und 4 Stunden am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wi die überstehende Lösung dekantiert, der Niederschlag auf eine Nutsche mit Ethanol gewaschen und trocken gesaugt.

Beispiel 3

Trennung von Catecholaminen

200 μl einer wäßrigen Lösung von (1 ) Adrenalin, (2) Noradrena- lin, (3 ⁾ N-Methyldopamin und (4) Dopamin (jeweils 10 μg) werde auf eine HPLC-Säule (100 x 4,6 mm, 3 μm) aufgegeben und bei ei ner Temperatur von 40°C und einer Flußrate von 1,5 ml/min mit einer mobilen Phase, enthaltend 32 Vol-?. CH C , 0,1 Vol-5. Tri- fluoressigsäure und 68 Vol-5- H 0, eluiert und anschließend in einem UV-Spektrometer (254 n ) detektiert. Es sind, entspre¬ chend den vier Komponenten der Lösung, vier Signale sichtbar.

200 μl der gleichen Lösung werden mit 0,5 ml eines Boratpuf¬ fers ⁽ 0,5 M, pH-Wert = 8), 1 mg o-Phthaldialdehyd und 300 mg des HS-Gruppen enthaltenden Agarose-Trägers von Beispiel 1 versetzt. Das Gemisch wird 3 Minuten geschüttelt und absitzen gelassen. Vom Überstand werden 10 μl auf die HPLC-Säule aufge¬ bracht und, wie vorstehend angegeben, mit der mobilen Phase eluiert. Das Chromatogra m zeigt nur noch die Signale der Kom¬ ponenten (1) und (3), d.h. der sekundären Amine. Die Komponen¬ ten ⁽ 2 ⁾ und (4), d.h. die primären Amine, erscheinen nicht mehr im Chromatogramm.

Das gleiche Ergebnis erhält man, wenn man den o-Phthaldialde- hyd durch Naphthodialdehyd ersetzt.

Beispiel 4

Entfernung von primären Aminosäuren aus Urin als Vorstufe zur Hydroxyprolin-Bestimmung

200 μl Urin werden zur Hydrolyse der Proteine in einem Pyrex- Glas mit Teflon-Stopfen zusammen mit einem sauren Kationenaus¬ tauscher 1 Stunde auf 150°C erhitzt. Die Aminosäuren werden mi 250 μl Boratpuffer (0,5 M, pH-Wert = 8) in Lösung gebracht. Ma läßt den Kationenaustauscher absitzen und versetzt 200 μl des Überstandes mit 20 μl einer o-Phthaldialdehydlösung und 300 mg des HS-Gruppen enthaltenden Kieselgel-Trägers von Beispiel 2. Die erhaltene Suspension wird 3 Minuten gerüttelt und anschlie¬ ßend zur Derivatisierung mit 100 μl Fluorenylmethyloxicarbonyl- chlorid (FMOC)-Lösung (2 mg/ml CH CN) versetzt. Die Derivati-

3 sierung der Aminosäuren wird zum Zweck der spektroskopischen

Analyse ⁽ Verschiebung des Absorptionsmaximums nach längeren

Wellenlängen) durchgeführt.

Nach weiteren 2 Minuten im Rüttler wird die Suspension 2 Minu¬ ten bei 13 000 Upm in einer EppendorfZentrifuge zentrifugiert .

10 ^μ l des Überstandes werden dann wie nach Beispiel 3 auf eine HPLC-Säule aufgebracht und eluiert. Im Chromatogramm (Detektion mit UV, 254 nm ⁾ finden sich nur noch die sekundären Aminosäuren

Zur quantitativen Bestimmung des trans-4-Hydroxyprolins kann man als internen Standard eine bekannte Menge einer Aminosäure mit sekundären Aminogruppen, z.B. N-Methyltaurin mitlaufen lassen.

Beispiel 5

Bestimmung von Hydroxyprolin in collagenhaltiger Wurst

Etwa 4 g einer gut homogenisierten Leberwurstprobe werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Rund- oder Erlenmeyerkolben eingewo gen. Es werden 30 ml Salzsäure hinzugefügt, und die Lösung wir bis zum schwachen Sieden erhitzt und 6 h unter Rückfluß gekoch

Das Hydrolysat wird quantitativ mit Wasser in einen 500 ml- Meßkolben überführt, mit etwa 5 ml Petroleumbenzin versetzt und mit Wasser so bis zur Marke aufgefüllt, daß die Petroleum¬ benzinschicht mit dem darin gelösten Fett über der Marke liegt Nach gründlichem Mischen wird die fetthaltige Petroleumbenzin¬ schicht durch Absaugen entfernt und die wäßrige Phase in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben filtriert.

Aus dem Hydrolysat wird eine geeignete Verdünnung hergestellt, so daß die erwartete Hydroxyprolinkonzentration im Bereich von 0,6 bis 2,4 μg/ml liegt. Das geschieht durch Verdünnen von 10 ml des Hydrolysats mit Wasser in einem 250-ml-Meßkolben.

Unter Verwendung von 200 μl des Hydrolysats werden die Stufen der Entfernung der primären Aminosäuren, die Derivatisierung mit FMOC und die spektroskopische Bestimmung des Hydroxypro- lins nach Beispiel 4 durchgeführt.

Da Hydroxyprolin ein wesentlicher Bestandteil von Collagen ist, läßt sich auf diese Weise indirekt der Collagengehalt der Wurst bestimmen.

Beispiel 6

Bestimmung von Elektrolyten im Blut

200 μl Blut werden mit 500 μl Boratpuffer (0,5 M, pH-Wert = 8) 300 mg des HS-Gruppen enthaltenden Kieselgel-Trägers von Bei¬ spiel 2 und 1 mg o-Phthaldialdehyd versetzt. Die Suspension wird 3 Minuten gerüttelt und absitzen gelassen. Die im Blut enthaltenen Proteine sind über ihre primären NH -Gruppen kova-

2 lent an den Träger gebunden. Dies kann man bereits dadurch er¬ kennen, daß der Träger durch die Erythrocyten rot gefärbt ist.

Der farblose Überstand ist proteinfrei (Biuret-Test negativ).

+ + +, . In dem Überstand werden die Alkali-Kationen (Li , Na , K ) mit

Hilfe einer üblichen ionensensitiven Elektrode bestimmt.

Es können etwa zweimal soviele Bestimmungen durchgeführt wer¬ den wie mit unbehandeltem Blut, bevor die Elektrode unbrauchba wird .

Beispiel 7

Keimfreimachung von wäßrigen Lösungen

200 μl Regenwasser werden mit 1 mg o-Phthaldialdehyd und 300 m des HS-Gruppen enthaltenden Kieselgel-Trägers von Beispiel 2 vermischt und 3 Minuten geschüttelt. Eine Probe des Überstande wird auf einen Agar-Nährboden aufgebracht und bei 37°C im Brut schrank 2 Tage inkubiert. Es ist kein Bakterienwachstum fest¬ stellbar. Eine unbehandelte Probe des Regenwassers zeigt nach 2-tägiger Inkubation ein starkes Bakterienwachstum.

Beispiel 8

Bestimmung einer primären Aminosäure durch Differenzanalyse

Eine Lösung von 20 mg o-Naphtholdialdehyd in 1 ml einer 30 3_i Acetonitril-Lösung (Rest Wasser) wird mit 5 mg Alanin, gelöst in 1 ml Wasser sowie mit 200 mg des HS-Gruppen enthaltenden Kieselgel-Trägers von Beispiel 2 versetzt. Die Suspension wird 3 Minuten geschüttelt und 2 Minuten zentrifugiert. Die Extink¬ tion der überstehenden Lösung wird in einem Photometer gemes¬ sen. Durch Anwendung des Lambert-Beer ' sehen Gesetzes läßt sich aus der Konzentrationsabnahme des Dialdehyds der Gehalt der Testlösung an Alanin berechnen.