CHAMPIGNON TRICHODERMA REESEI

La présente invention concerne un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles du champignon Trichoderma reesei.

Trichoderma reesei (T. reesei) est une espèce de champignon filamenteux cellulolytique, du genre Trichoderma, qui a été découvert pendant la Seconde Guerre mondiale dans le Pacifique Sud. Ce champignon a la capacité de sécréter une grande quantité d'enzymes cellulosiques (cellulases et hémicellulases), et il est aujourd'hui principalement utilisé dans le cycle de production des biocarburants de deuxième génération. En effet, les enzymes produites par ce champignon sont particulièrement utiles pour la transformation des matières de la biomasse végétale en bioproduits utiles à l'industrie, tels que le bioéthanol.

Les biocarburants de deuxième génération (issus de ressources non alimentaires) sont particulièrement d'intérêt de nos jours, étant donné que les biocarburants de première génération (issus de ressources alimentaires) ne peuvent être produits qu'en quantité limitée, dans la mesure où ils rentrent en concurrence avec la production alimentaire.

Le procédé de production des biocarburants de deuxième génération comprend quatre étapes principales : le prétraitement de la biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique, la fermentation et la distillation.

Même si toutes les étapes de la production des biocarburants de deuxième génération peuvent et doivent être optimisées -afin d'augmenter la production-, un effort particulier est porté sur l'étape d'hydrolyse enzymatique. Cette étape d'hydrolyse met en jeu les enzymes de type cellulase produites par le champignon filamenteux T. reesei.

De manière plus générale, Trichoderma reesei peut être utilisé comme souche plateforme pour la production de protéines d'intérêt industrielles homologues ou hétérologues. Afin d'optimiser les performances de Trichoderma reesei, il est essentiel d'améliorer les souches de Trichoderma reesei produisant les protéines d'intérêt.

Parmi les méthodes d'améliorations envisagées pour une diminution du coût de l'hydrolyse, l'ingénierie génétique de T. reesei est ainsi une solution. Elle permet d'améliorer les performances de sécrétion du champignon filamenteux producteur de cellulases, les propriétés des enzymes et de maîtriser la stabilité des souches en conditions industrielles.

La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l'ADN afin de créer des gènes génétiquement modifiés. Ceci peut permettre de générer des souches aux caractéristiques intéressantes d'un point de vue industriel. Il existe deux méthodes de mutagénèse couramment utilisées pour introduire des mutations chez T. reesei : la mutagénèse aléatoire et la mutagénèse dirigée.

La mutagénèse aléatoire consiste à induire des mutations non ciblées, n'importe où dans l'ADN. Ces mutations sont provoquées par l'exposition de l'organisme cible à des agents chimiques mutagènes ou à des radiations. Etant donné que les mutations sont un phénomène naturel, la mutagénèse aléatoire est donc considérée comme un accélérateur de ce processus naturel et les organismes ainsi obtenus sont considérés comme naturels et non comme organismes génétiquement modifiés (OGM) ; ils ne sont donc pas soumis à l'obligation de traçabilité. Cependant, cette méthode engendre en plus de la mutation responsable du caractère d'intérêt, un grand nombre de mutations indésirables dites « collatérales » qui contribuent, en s 'accumulant, à l'instabilité, à la mauvaise santé, voire à la létalité de l'organisme muté.

La mutagénèse dirigée permet d'introduire des mutations identifiées dans un gène précis. Pour ce faire, l'ADN d'intérêt contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter où le mécanisme de réparation de l'ADN s'occupe de l'intégrer dans le génome. L'utilisation d'un marqueur de sélection permet d'identifier les cellules ayant intégré la mutation de celles qui ne l'ont pas intégrée. Cependant, les organismes ayant subi cette mutagénèse sont considérés comme des OGM (en raison de l'introduction d'ADN exogène), et sont donc soumis à une obligation de traçabilité.

Dans le cas de l'utilisation de T. reesei pour la production de biocarburants de deuxième génération, l'amélioration de l'étape d'hydrolyse, via l'introduction de mutations (aléatoires ou dirigées) chez T. reesei n'est donc pas satisfaisante, en raison de l'accumulation des mutations indésirables que cela entraine, ou bien en raison de l'introduction d'ADN exogène. Il existe donc un besoin pour une nouvelle méthode d'amélioration de l'étape d'hydrolyse.

Les inventeurs de la présente invention ont ainsi développé une nouvelle méthode d'amélioration des performances de T. reesei en utilisant la reproduction sexuée de T. reesei. A ce jour la reproduction sexuée de T. reesei n'a jamais été utilisée comme outil d'amélioration car T. reesei a toujours été considéré comme ne pouvant pas faire de reproduction sexuée. Néanmoins la découverte d'une sexualité chez T. reesei (Seidl et ah, 2009) a ouvert de nouvelles possibilités d'amélioration génétique des souches. La reproduction sexuée permet, entre autres, de créer de la diversité génétique, de conserver les mutations bénéfiques et de supprimer du génome les mutations « collatérales ». T. reesei est un champignon dit hétérothallique, c'est-à-dire que la reproduction sexuée n'est possible qu'entre individus de type-sexuel compatibles (MAT1-1 et MAT1-2). De plus, T. reesei est hermaphrodite, c'est-à-dire qu'une souche produit à la fois des organes sexuels femelle et mâle (Figure 1).

La reproduction sexuée entre deux isolais naturels, fertiles et compatibles, de T. reesei donne lieu à des stromata qui contiennent la descendance (Figure 2A).

Afin de tester la reproduction sexuée sur les souches industrielles, une souche QM6a MAT1-1 a été construite par ingénierie génétique (Seidl et al., 2009). La reproduction sexuée entre les souches QM6a compatibles ne permet pas d'obtenir de stromata car ces souches sont femelles stériles (Figure 2B) (Seidl et al. , 2009).

Toutes les souches industrielles existantes connues de T. reesei ont été générées à partir de la souche naturelle QM6a. Etant donné que la souche naturelle QM6a est de type sexuel MAT1-2, toutes les souches industrielles de T. reesei sont aujourd'hui de type sexuel MAI 1-2, et sont femelles stériles mais mâles fertiles.

La reproduction sexuée peut être un outil d'amélioration rapide et efficace, mais si elle ne peut pas avoir lieu entre les souches industrielles, son utilité reste limitée. Des études scientifiques ont tenté de comprendre pourquoi les souches industrielles de T. reesei sont femelles stériles et comment y remédier. Ces recherches ont permis d'identifier le gène idcl comme déterminant de la stérilité femelle et montrent que le remplacement du gène défectueux par un gène fonctionnel permet de rétablir la fertilité femelle de la souche QM6a et de réaliser une reproduction sexuée (Kubicek et al, 2014 (WO2014/ 102241) ; Linke et al, 2015).

Néanmoins, cette stratégie présente un inconvénient majeur. En effet, cela nécessite d'introduire le gène fonctionnel dans chacune des souches industrielles à reproduire pour pouvoir rétablir la fertilité femelle des souches industrielles. D'autre part, cette stratégie ne prend pas en compte le fait que les souches industrielles sont issues de mutagénèses successives et qu'il est possible que d'autres gènes importants pour la fertilité femelle aient été modifiés. Ainsi, l'apport du gène idcl fonctionnel ne sera pas suffisant pour rétablir la fertilité femelle et ainsi rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei. Ainsi, être capable de rétablir la fertilité femelle dans la souche QM6a, ne signifie pas qu'elle pourra être rétablie dans les souches industrielles générées à partir de ladite souche QM6a.

Il existe donc un besoin pour une méthode permettant de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, notamment la souche QM6a ou les souches industrielles femelles stériles dérivées de la souche QM6a ou toute autre souche femelle stérile de T. reesei.

Les inventeurs de la présente invention ont ainsi mis au point une stratégie de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei qui ne nécessite ni d'introduire dans les souches femelles stériles une version fonctionnelle du gène idcl, qui ne nécessite pas de vérifier si la présence d'une version fonctionnelle du gène idcl est ou non suffisante pour rétablir la reproduction sexuée, ni même d'avoir à identifier et remplacer les autres gènes qui pourraient être défectueux. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi développé une stratégie de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei qui est simple et efficace à mettre en place.

La présente invention repose en effet sur les résultats des inventeurs selon lesquels l'utilisation d'une souche assistante ΔΜΑΤ (c'est-à-dire une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel, soit MAT 1-1 ou MAI 1-2, a été invalidé) en combinaison avec un arrosage séquentiel des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel, puis des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel permettait de rétablir la reproduction sexuée entre ces deux souches femelles stériles. L'utilisation d'une souche assistante a déjà été utilisée mais pas chez l'espèce T. reesei

(Silar, P. (2014)). Plus précisément, Jamet-Vierny et al. ont décrit l'utilisation d'une souche assistante qui permet d'apporter les protéines IDC1 nécessaires au développement des stromata dans le cadre de la reproduction des souches de Podospora anserina. Cette méthode qui repose sur la fabrication de tricaryon permet de rétablir la fertilité des souches de Podospora anserina. Cependant, il est à noter que cette méthode ne peut pas être utilisée avec les souches de T. reesei : en effet la seule utilisation de la méthode des tricaryons ne permet pas de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei (cf exemple 2a).

Les inventeurs de la présente invention ont néanmoins montré, de façon surprenante, que la méthode des tricaryons permettait de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei lorsqu'elle était utilisée en combinaison avec la technique de l'arrosage séquentiel (c'est-à-dire un arrosage avec des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel, puis des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel). Cet arrosage séquentiel, utilisé en combinaison avec une souche assistante ΔΜΑΤ, permet de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, et permet d'obtenir de façon répétitive des stromata (cf exemple 2i). Dans un premier aspect, l'invention concerne ainsi un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei comprenant les étapes suivantes :

une incubation dans un milieu approprié d'une souche assistante ΔΜΑΤ, ladite souche étant une souche femelle fertile de Trichoderma reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé,

un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel,

un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel avec des conidies d'une deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel.

Le « rétablissement de la reproduction sexuée » selon l'invention s'entend de l'obtention de stromata à partir de conidies d'une première souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel et d'une deuxième souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel, à l'aide d'une souche ΔΜΑΤ.

Une « souche femelle stérile de T. reesei » selon l'invention s'entend de toutes les souches de T. reesei qui sont femelles stériles et mâles fertiles. Il s'agit des souches de T. reesei dont la fertilité femelle peut être rétablie et qui peuvent être utilisées dans un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention. De telles souches sont par exemples les souches QM6a, NG14, RUTC30, QM9414, CL847, QM9136, QM9978, QM9979, PC3-7, TU-6, ... En d'autres termes, il s'agit de toutes les souches produites à partir de la souche QM6a et qui sont femelles stériles mais cela peut aussi être des souches de T. reesei issues d'autres isolais géographiques et qui sont femelles stériles et maies fertiles.

Une « incubation dans un milieu approprié » selon l'invention s'entend d'une incubation dans un milieu de culture approprié pour la croissance des champignons. Un tel milieu est par exemple le milieu PDA (Potato Dextrose Agar), le milieu SDA (Sabouraud Dextrose Agar), le milieu SPDA (Sweet Potato Dextrose Agar), le milieu MEA (Malt Extract Agar), le milieu Oatmeal Agar, le milieu Cornmeal Agar, et est de préférence un milieu complet. Un milieu complet selon l'invention est un milieu qui contient en plus des composants du milieu minimum, les métabolites finaux qui sont nécessaires pour la croissance, comme les acides aminés, les vitamines,les bases,... contrairement au milieu minimum qui est un milieu comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance d'un organisme.

Une « souche assistante ΔΜΑΤ » selon l'invention s'entend d'une souche de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel (mating-type) MAT 1-1 ou MAT1-2 a été invalidé. Ladite souche assistante ΔΜΑΤ peut être obtenue par toutes techniques d'invalidation de gènes/locus bien connues de l'homme du métier, ou par exemple par la méthode décrite dans l'exemple 1. La souche à partir de laquelle la souche assistante ΔΜΑΤ est obtenue doit être femelle fertile. Bien qu'appartenant à l'espèce T. reesei, cette souche assistante n'entre pas dans la définition d'une « souche femelle stérile de T. reesei » selon l'invention, en raison de l'invalidation du locus du mating type MAT1-1 ou MAT1-2. Cette souche assistante n'entre pas en jeu dans le processus de caryogamie puisqu'elle a été invalidée du locus du type-sexuel qui régule ledit processus. Le mécanisme de la souche assistante est inconnu, mais les hypothèses quant à son fonctionnement sont les suivantes :

- Dans le cas de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles : il peut y avoir fusion des noyaux, mais comme le gène idcl /la protéine IDCl sont défectueux, il n'y a pas de recrutement des hyphes pour la construction et le développement des stromata dans laquelle va se faire la caryogamie et le développement de la descendance.

Dans le cas de la reproduction entre deux souches femelles stériles et en présence de la souche assistante (Figure 3) : il peut y avoir fusion des noyaux parentaux. Dans ce cas il y a expression du gène idcl par la souche assistante, et ainsi synthèse de la protéine IDCl. Etant donné qu'il y a fusion de noyaux et présence des protéines IDCl, il peut y avoir recrutement des hyphes pour la construction et le développement des stromata dans laquelle va pouvoir se faire la caryogamie et le développement de la descendance. Les tissus femelles sont fournis par la souche JMAT, tandis que les tissus zygotiques sont fournis par les souches femelles stériles.

Le terme « conidies » selon l'invention s'entend d'une spore issue de la multiplication végétative d'un champignon (tel que T. reesei). Les conidies d'une souche de T. reesei du type sexuel MAT1-1 ou du type sexuel MAT1-2 sont obtenues selon les mêmes conditions. Par exemple, les conidies selon l'invention d'un premier type ou d'un deuxième type sexuel peuvent être obtenus par des mises en culture et incubations dans un milieu approprié (tel que le PDA), respectivement d'une souche de T. reesei d'un premier type sexuel ou d'une souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, jusqu'à l'apparition de conidies. De préférence les souches sont incubées à la lumière, et à une température d'environ 24-30°C jusqu'à l'apparition de conidies. Les conidies peuvent ensuite être récupérées par rinçage de la boite de culture avec de l'eau distillée/stérile. Le terme « conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel » selon l'invention s'entend des conidies d'une des deux souches de T. reesei utilisées dans le procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention. Le terme « conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel » selon l'invention s'entend des conidies d'une souche de T. reesei, compatible avec la première souche.

Selon l'invention, le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT1-1 ou MAT1 -2, notamment MAT1 -1.

Selon l'invention, le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est MAT 1-1 ou

MAT 1-2, notamment MA Tl -2.

Les termes « MAT 1-1 ou MAT 1-2 » font référence aux signes sexuels des champignons. Ce sont les deux types sexuels compatibles. Etant donné que T. reesei est un champignon dit hétérothallique, si le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT1- 1, alors le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est nécessairement MAT1-2. Inversement, si le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT 1-2, alors le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est nécessairement MAT1-1. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT 1-1, et le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est MAT 1-2.

La première souche et la deuxième souche de T. reesei utilisées dans un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention peuvent être des souches identiques ou différentes, sous réserves que les types sexuels soient compatibles. Par exemple, lorsque les souches sont identiques la première souche peut être une souche QM6a MAT 1-1 et la deuxième souche peut être une souche QM6a MAT1-2. Au contraire, lorsque les souches sont différentes, la première souche peut être une souche NG14 MAT 1-1 et la deuxième souche peut être une souche RUTC30 MAT1-2.

Selon l'invention, la souche de T. reesei est toute souche femelle stérile, telle que la souche QM6a ou une souche dérivée de la souche QM6a. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT 1-1 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT 1-2 ou une souche dérivée. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT 1-2 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT 1-1 ou une souche dérivée. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT 1-1 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT 1-2 ou une souche dérivée. De préférence, la souche QM6a MAT 1-2 fait référence à la souche déposée sous la référence ATCC® 13613. Une souche MATl-1 femelle stérile (telle que QM6a MATl-1) peut être obtenue (i) en remplaçant le locus MAT 1-2 par le locus MATl-1, (par exemple selon la méthode décrite dans l'article Linke, R. et al. (2015)) ; (ii) par croisement (par exemple une souche QM6a MAT 1-2 est croisée avec un isolât naturel de type sexuel MATl-1. Parmi les descendants obtenus, les individus de type sexuel MATl-1 femelle fertile peuvent être recroisés avec par exemple, la souche QM6a MAT1-2. Ce procédé est répété au moins 7 fois. Le fait de recroiser systématiquement le descendant avec le parent QM6a MAT 1-2 sept fois de suite permet d'obtenir un descendant final qui a une identité génétique identique à celle de la souche QM6a MAT1-2 à l'exception du type sexuel qui sera MATl-1. Il s'agit d'un rétrocroisement. Le descendant final est de type sexuel MATl-1 et est femelle stérile. Un exemple de rétrocroisement est donné dans la demande internationale WO2014/102241). Toutefois à chaque étape de ces rétrocroisements des souches stériles MATl-1 ou MAT 1-2 peuvent être obtenues et utilisées dans le procédé. Le terme « souche dérivée de la souche QM6a » selon l'invention s'entend de toutes les souches obtenues à partir de l'isolât naturel QM6a. Il s'agit notamment de toutes les souches industrielles de T. reesei connues à ce jour ou encore de toutes les souches de T. reesei femelles stériles.

Le terme « arrosage » selon l'invention s'entend du versement d'une solution contenant les conidies d'un premier type sexuel (par exemple 10 7 à 108 de conidies MATl-1) ou le versement d'une solution contenant les conidies d'un deuxième type sexuel (par exemple 10 7 à 108 de conidies MAT1-2). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'arrosage est uniquement réalisé avec des conidies d'un premier et/ou d'un deuxième type sexuel (par exemple sans ajout d'extrait cellulaire). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'arrosage est réalisé à l'aide d'une solution appropriée contenant uniquement les conidies d'un premier et/ou d'un deuxième type sexuel. Une solution appropriée s'entend par exemple de l'eau telle que de l'eau distillée ou de l'eau stérile.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ est une incubation à l'obscurité. L'obscurité limite la production de conidies et favorise l'accès des organes sexuels femelles par les organes sexuels mâles.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ dure au moins 2 jours, de préférence entre 2 et 6 jours. Plus particulièrement, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ dure au moins 4 jours, de préférence entre 4 et 5 jours. L'incubation pendant 4 à 5 jours permet d'optimiser le procédé de rétablissement (exemple 2i).

Selon un mode de réalisation de l'invention, les conidies de la première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel sont présentes à une concentration d'au moins 10 ⁵ conidies/ml.

Plus particulièrement, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les conidies de la première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel sont présentes à une concentration d'au moins 10 ⁶ conidies/ml, notamment de 10 ⁶ à 10 ⁸ conidies/ml, et de préférence de 10 ⁷ à 10 ⁸ conidies/ml. Une concentration de 10 7 à 108 conidies/ml permet d'optimiser le procédé de rétablissement (cf exemple 2i).

Les conditions optimales de l'arrosage séquentiel sont une incubation (ou pré- incubation) de la souche assistante ΔΜΑΤ pendant 4 ou 5 jours, ainsi qu'une concentration de conidies de 10 7 à 108 conidies/ml (cf exemple 2i).

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre, entre le premier et le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel.

Selon un mode de réalisation, ledit premier arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante Δ MAT et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, dure au moins 2 jours, de préférence entre 2 et 7 jours, et notamment au moins 3 ou 4 jours. Préférentiellement, selon ce mode de réalisation, ledit premier arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est effectué à une alternance de lumière et d'obscurité, de préférence entre 3 à 12 heures de lumière (jour) et entre 12 à 21 heures d'obscurité (nuit).

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est une incubation en alternance jour/nuit. Préférentiellement, l'alternance jour/nuit est une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. Il s'agit de la condition la plus favorable à la reproduction sexuée (Seidl, V., et al. (2009)).

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, dure 5 à 7 jours, de préférence 7 jours.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre une étape d'obtention de stromata. Selon l'invention, le terme « stromata » s'entend des structures macroscopiques (de diamètre de 3-4mm à 2cm) qui résultent de la reproduction sexuée. Ces structures sont constituées de tissus d'origine maternelle (les tissus qui les constituent proviennent de la souche assistante jouant le rôle de femelle) et sont pigmentés (couleur marron) en surface.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre, après le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, notamment jusqu'à l'apparition des stromata, et plus particulièrement jusqu'à ce que les stromata pigmentés soient visibles à l'œil nu.

Selon un mode de réalisation ledit deuxième arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, dure au moins 5 jours, de préférence entre 5 et 15 jours. Préférentiellement, selon ce mode de réalisation, ledit deuxième arrosage, et optionnellement l'étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est effectuée à une alternance de lumière et d'obscurité, de préférence entre 3 à 12 heures de lumière (jour) et entre 12 à 21 heures d'obscurité (nuit). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est une incubation en alternance jour/nuit. Préférentiellement, l'alternance jour/nuit est une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C.

Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comprend en outre, après l'apparition de stromata, une étape d'amplification desdits stromata. Ladite étape d'amplification est réalisée en effectuant au moins un transfert des stromata obtenus dans un nouveau milieu approprié (par exemple le PDA). Le nouveau milieu approprié peut être le même que celui utilisé précédemment, ou un milieu approprié différent. Le transfert des stromata dans un nouveau milieu approprié (par exemple dans une nouvelle boite de Pétri comprenant un milieu approprié) permet de multiplier de façon très significative et inattendue le nombre final de stromata obtenu (exemple 4). Selon cet aspect de l'invention plusieurs repiquages successifs peuvent être effectués, ce qui signifie que plusieurs transferts des stromata obtenus précédemment peuvent être transférés plusieurs fois dans un nouveau milieu approprié (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 transferts des stromata peuvent être effectués). Selon un mode de réalisation, ladite étape d'amplification dure au moins 3 jours, par exemple de 3 à 21 jours de préférence de 5 à 15 jours, et est de préférence effectuée à une alternance lumière/obscurité, notamment entre 3 à 12 heures de lumière (jour) et entre 12 à 21 heures d'obscurité (nuit), plus particulièrement 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. L'étape d'amplification (Le. le transfert des stromata dans un nouveau milieu approprié) permet (1) d'augmenter quantitativement le nombre de stromata, d'au moins 20% et même d'au moins 50% par rapport à un procédé sans étape d'amplification, mais également (2) d'augmenter la maturité des stromata.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, ledit procédé est un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, comprenant les étapes suivantes :

une incubation, notamment à l'obscurité, dans un milieu approprié d'une souche assistante MAT, ladite souche étant une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé, un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche femelle stérile MAI 1-1,

une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante Δ MAT et des conidies de la première souche femelle stérile MAT 1-1,

un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies de la première souche femelle stérile MAT 1-1, avec des conidies d'une deuxième souche femelle stérile MAT 1-2,

une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante Δ MAT et des conidies de la première souche femelle stérile MAT 1-1, avec des conidies de la deuxième souche femelle stérile MAT1-2, notamment jusqu'à l'apparition des stromata,

optionnellement une étape d'amplification des stromata.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, ledit procédé est un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, comprenant les étapes suivantes :

une incubation, notamment à l'obscurité, dans un milieu approprié d'une souche assistante ΔΜΑΤ, ladite souche étant une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé,

un premier arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ avec des conidies d'une première souche QM6a MATl-1 ou d'une souche femelle stérile MAT 1-1,

une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante

ΔΜΑΤ et des conidies de la souche QM6a MATl-1 ou d'une souche femelle stérile

MATl-1,

un deuxième arrosage de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies de la souche QM6a MATl-1, ou d'une souche femelle stérile MATl-1, avec des conidies d'une deuxième souche QM6a MAT 1-2 ou d'une souche dérivée de la souche QM6a MAT1- 2 ou d'une souche femelle stérile MAT 1-2,

une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante ΔΜΑΤ et des conidies de la souche QM6a MATl-1, ou d'une souche femelle stérile MATl-1, avec des conidies de souche QM6a MAT 1-2 ou d'une souche dérivée de la souche QM6a MAT 1-2 ou d'une souche femelle stérile MAT1-2, notamment jusqu'à l'apparition des stromata,

optionnellement une étape d'amplification des stromata. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement, comprend en outre l'obtention d'une souche de T. reesei. L'obtention de cette nouvelle souche de T. reesei, issue de souches de T. reesei femelles stériles, signifie que le rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei a bien été rétabli selon le procédé de l'invention.

Dans un deuxième aspect, l'invention concerne ainsi l'utilisation d'une souche de T. reesei obtenue par le procédé mentionné ci-dessus pour la production de cellulases ou de biocarburant. L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.

FIGURES

La Figure 1 représente le principe de la reproduction sexuée chez le champignon filamenteux T. reesei.

La Figure 2 représente la reproduction sexuée chez T. reesei. La partie (A) représente la reproduction sexuée entre deux isolats naturels (A) et la partie (B) représente la reproduction sexuée entre deux souches QM6a.

La Figure 3 représente le principe de la méthode de la souche assistante.

La Figure 4 représente le protocole de la mise en œuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention.

La Figure 5 représente les stromata obtenus suite à la mise en œuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention.

La Figure 6 représente l'assemblage final de la cassette d'invalidation dans le plasmide pUC19 (plasmide utilisé pour obtenir la souche assistante ΔΜΑΤ selon la présente invention). Les traits correspondent aux amorces qui ne sont pas positionnées à l'échelle. Les numéros correspondent aux amorces : 1 = 5'matl-2-F ; 2 = 5'matl-2-R ; 3 = matl-2/Hph-F; 4 = matl-2/Hph-R ; 5 = 3'matl-2-F ; 6 = 3'matl-2-R ; 7 = K7 Del Matl-2-F et 8 = K7-Del- Matl-2-R.

La Figure 7 représente la position des amorces choisies pour l'amplification des différents fragments de la cassette d'invalidation. Le chiffre « (1) » représente le fragment « Flank5' + marqueur », et le chiffre « (2) » représente le fragment « marqueur + flank3' ». La Figure 8 représente l'amplification de stromata. Les stromata obtenus suite à la mise en œuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention (tels que ceux obtenus à la Figure 5) sont présentés dans les boites de Pétri Al et Bl. Les stromata sont transférés sur un milieu PDA (cela correspond aux boites de Pétri A2 et B2) et le nombre de stromata peut être ainsi multiplié. Cette étape d'amplification/multiplication peut ainsi être répétée plusieurs fois, en transférant les stromata obenus sur un nouveau milieu PDA (cela correspond aux boites de Pétri A3 et B3).

EXEMPLES

Exemple 1 : Matériel & Méthodes

La présente invention met en jeu trois souches différentes. Les trois souches qui ont été utilisées dans les exemples sont les suivantes :

Les deux souches stériles à croiser : la souche QM6a MAT 1-1 et la souche QM6a MAT1-2. Pour obtenir la souche QM6a MAT1-1, le locus MAT1-2 a été remplacé par le locus MAT 1-1 dans la souche QM6a MAT 1-2. La souche QM6a MAT 1-2 a été obtenue auprès de l'ATCC (référence ATCC® 13631). Il s'agit de l'isolât naturel à l'origine de toutes les souches industrielles.

La souche assistante AMAT qui est une souche dans laquelle le locus de type sexuel MAT a été invalidé. Cette souche peut être construite selon le protocole indiqué ci- dessous :

Construction de la souche assistante AMAT

Cette souche doit être construite à partir d'une souche femelle fertile qui peut se croiser avec les deux souches stériles à croiser avant la manipulation génétique.

Pour construire la cassette d'invalidation du locus MAT 1-2, le gène de résistance à l'hygromycine B et les séquences 5' et 3' du locus MAT1-2 ont été assemblés dans un plasmide pUC19 (Figure 6) grâce au Gibson Assembly Kit (New England Biolabs) en suivant les recommandations du fabricant. Le gène de résistance à l'hygromycine B a été utilisé comme marqueur de sélection dans la présente invention mais un autre marqueur de sélection peut tout à fait être utilisé.

Le plasmide receveur pUC19 a préalablement été digéré par les enzymes Xbal et EcoRI. Les séquences d'environ 1000 pb en amont et en aval du locus MAT1-2 ont été amplifiées en utilisant les amorces 5'matl-2-F et 5'matl-2-R pour la région amont et 3'matl- 2-F et 3'matl-2-R pour la région aval (Tableau 1). Ces amorces contiennent des régions d'homologies permettant la recombinaison avec pUC19 d'un côté et le gène de résistance à l'hygromycine de l'autre. Le gène de résistance à l'hygromycine B a été amplifié à partir du plasmide pUT1140 à l'aide des amorces matl-2/Hph-F et matl-2/Hph-R. Ces amorces contiennent des régions d'homologies permettant la recombinaison avec le locus MAT 1-2 d'un côté et pUC19 de l'autre.

Dans un second temps, la cassette d'invalidation a été amplifiée à partir de l'ADN bactérien à l'aide des amorces K7-Del-Matl-2-F et K7-Del-Matl-2-R. Les produits PCR obtenus ont été purifiés à l'aide du PCR Purification Kit (Qiagen) et transformés dans des protoplastes de la souche sauvage fertile B31 à l'aide de CaCl ₂ et polyethylène-glycol (PEG). Une souche autre que la souche B31 aurait pu être utilisée, à la condition qu'elle soit femelle fertile. La séquence du plasmide ayant servi à transformer les souches B31 est représentée par la SEQ ID NO : 17.

La souche B31 (de type sexuel MAT1-2) est un descendant de la souche de T. reesei

CBS999.97 (ATCC® 204423) (Sexually Compétent, Sucrose- and Nitrate-Assimilating Strains of Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) from South American Soils). C'est l'équivalent de la souche CBS999.97 MAT1-2 de l'article de Seidl et al. (2009).

Les transformants ont été stabilisés et régénérés sur un milieu PDA contenant 0,8 M de saccharose et 100 μg/ml d'hygromycine B. Les colonies ont ensuite été repiquées et ont été purifiées par isolement des conidies sur le milieu de sélection PDA-hygromycine. Elles ont ensuite été soumises à un criblage phénotypique qui consiste à croiser les transformants B31 avec l'isolât naturel A2 qui est de type sexuel MAT1-1 et qui est compatible avec la souche B31 : si le locus MAT a bien été invalidé, alors il n'y aura pas de reproduction sexuée et donc absence de stromata.

Une amplification PCR permet ensuite de vérifier que le gène natif a bien été remplacé par la cassette d'invalidation. Cette validation se fait en deux étapes. La première consiste à vérifier l'invalidation du gène en réalisant une PCR avec les amorces permettant d'amplifier le gène (Matl-2-F interne et Matl-2-R interne) (Figure 7). Si ce dernier est bien invalidé, aucune amplification ne doit être obtenue. Cependant, afin de vérifier que ce résultat est bien une conséquence de l'absence du gène et non d'un mauvais fonctionnement de la PCR, un couple d'amorces témoin (EF1 et EF2) permettant l'amplification d'un fragment interne de 880 pb du gène tefl (codant pour le facteur d'élongation de la traduction al) présent dans le génome de toutes les souches de T. reesei est également utilisé. Dans un second temps, l'amplification des fragments « flank 5' + marqueur » et « marqueur + flank 3' » est réalisée afin de vérifier la présence de la cassette d'invalidation au locus. La position des amorces choisies est présentée sur la Figure 7. Pour valider l'insertion de la cassette génétique au site, les amorces doivent être choisies en aval du fragment flank5' et en amont du fragment flank3' (amorces Dmatl-2verif5F associée à verifHygro5' et Dmatl-2verif3R associée à verifHygro3').

Les séquences des amorces utilisées dans la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous.

Nom des Séquence des amorces (5' -> 3')

amorces

5'matl-2-F TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCCTTCCTGACCCTGGACTG (SEQ ID NO : 1)

5'matl-2-R GGTACACTTGGACTGCGTTGACTGATGGTG (SEQ ID NO : 2) matl-2/Hph-F CAACGCAGTCCAAGTGTACCTGTGCATTCTG (SEQ ID NO : 3) matl-2/Hph-R CCTTTGCCAAGGCAGTGCTAGTGTGTGTAC (SEQ ID NO : 4)

3'matl-2-F TAGCACTGCCTTGGCAAAGGCTAGACACTAC (SEQ ID NO : 5)

3'matl-2-R TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATGTACAATTACCACATGCG (SEQ ID NO : 6)

K7-Del-Matl-2-F CCAGGGCTTTGAGAGCAGTA (SEQ ID NO : 7)

K7-Del-Matl-2-R CTGGTGGCTGACACTTGCTA (SEQ ID NO : 8)

Dmatl -2verif5F GTACTGGTTGTTGGGCTGTG (SEQ ID NO : 9)

Dmatl -2verif3R CGGAGCAACTCTCAGGAAAC (SEQ ID NO : 10)

verifHygro5' CTCCGTAACACCCAATACGC (SEQ ID NO : 11)

verifHygro3' CTCTGGGCAAAGCACCAATC (SEQ ID NO : 12)

Matl-2-F interne TTCAGTGTTGGCCATTTTGA (SEQ ID NO : 13)

Matl-2-R interne GCTTCTCAAGCAAGGCAAGT (SEQ ID NO : 14)

EF1 ATGGGTAAGGAGGACAAGAC (SEQ ID NO : 15)

EF2 GGAAGTACCAGTGATCATGTT (SEQ ID NO : 16)

Tableau 1 : Récapitulatifs des amorces utilisées pour l'invalidation et remplacement du locus MAT

Séquence du plasmide (SEQ ID NO

tgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggg gagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgat taagcattggtaactgt cagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaa ggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagtttt cgttccactgagcgtcagaccc gtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttg caaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaact ctttttccgaaggtaactg gcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccacc acttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtgg ctgctgccagtggcgat aagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcg ggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactg agatacctaca gcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggt aagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggta tctttata gtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggg ggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgct ggccttttgctcacatgt tctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctg ataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag agcgcccaatacg caaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcc cgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggc accccaggcttta cactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacaca ggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaccc ttcctgaccctggactg tccagtggccaccggggcgtggctccagggctttgagagcagtaattggtgggagtttgg tagttgacatggctgcgaaaattggtgtccttcagaagttggtcaaggttgattattgaa tcagtttgcttcgagtg gtgatgaagaaatccccagagtatgagggtatgggatcagtgggatgttgaaggtgagaa taacaggtctgcgaaggggccgccgagtccgtgtggggtcttcttcaggttgctaaggtt ctactctctgcaag tgaaataaaagtgaaggatcgaggtgaatggacgcttgtgcccatgagttcacctcactt ttaactcactctgctgcatctgagaccctgcagaagtaaggcgaaagcttgtcagtggga aaagacccacggca ccatttaaatgtttacgtatgtggatatccgctaaatacgcctgctgtttgtgttggctc ttgccaagatcaatttcagcttctgccagtatttcaagtcaaacgttgtcatgaactacc tccatgttgaaattcttcatgga tcgtacactgtccgtttggaatctcagatctgaatcgtatgaaataacagaatcgagctt tcgcaactagatgtcccagcaacattgcgcccctggaaagtgataaactgcaactgcatt tgtgtgaaaccattggc ataagtgattgcgctctctggcggaacggacgaagacatgttgcttgatcttatcctttc catggagatcgtatatattctgatttgatgcaaatggtatgtacataaatgtccttcacg aactttcaggttgttcccaaa gctaaacttcacgcgcatcttgggtgaagtactgcctcgaacgtcatgcacacctggaga gcattttgctggtgtgcgaaatgaggatatctccacggtgggcgtattgttacgaagatg cacaccctctggcga tgggcgggtgggactgctagattctagccccaacacttcctttagaaggtacctaggtac gcttgcaaggttccttaggaggtagcttgtcgttggcaagcagaaatacatattacctag tagtacctaggtttcta ccttaccttcttacatatcagtagtacctagtcatttttccccaaggagggagggtgaga aaagagagataggtggggagcgcgcactgacctggcgctaaataacggaggggctggggg ggcactattcag attcactcgctttgggttggcagctctcatcaataaaggccagtaagttgaatcaccacg gcacgttccggctcacttgtagctcaccctccacccacagccttttcaattcttcaaagc attacctaggcgaccga aaacttcctacctctcaagttcctcctatcttccaactcctgcatcaacgttcatatccc atcttctcgcgatatattaccagagcaagcccgcaccatcagtcaacgcagtccaagtgt acctgtgcattctgggtaa 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tcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggcca ttgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcgggg cagtcctcggccc aaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacag tttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgt attgaccgattcct tgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatcc atagcctccgcgaccggttgtagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaac gtgacaccctgt gcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctaaactccccaatgtcaagcacttcc ggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaacca tcggcgcagct atttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttc gccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctc gacagacgtcgcgg tgagttcaggctttttcatgatggccctcctaccggtgatctcagctgtaggaaagagaa gaaggttagtagtcgacatggtggccctcctatagtgagtcgtattatactatgccgata tactatgccgatgattaat tgtcaacactaggcgccggtcacaactagtagatatcacttacgtgttgagaggcggcat gcgataagaggtgtaattacctgagaacatcttgttgccctgctttccgtgcgaaatact accggtacttttgggaa 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Tableau 2 : Séquence du plasmide utilisé pour transformer les souches B31

Suite à ces vérifications phénotypiques et moléculaires, la souche assistante B31 ::Δ ΑΓ-1ιρ1ι a été obtenue. Il s'agit d'une souche assistante ΔΜΑΤ (une souche de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé) selon la présente invention.

Exemple 2 : Exemples comparatifs avec différents procédés visant à rétablir la reproduction sexuée entre deux souches industrielles QM6a de T. reesei

Tous les essais ont été effectués dans des boites de Pétri contenant du milieu PDA. C'est le milieu le plus optimal pour la reproduction sexuée de T. reesei. a/ Méthode 1 fabrication d'un tricaryon

Il s'agit de la même méthode que celle décrite chez P. anserina Jamet-Vierny, C, Debuchy, R., Prigent, M. & Silar, P. (2007). IDC1, a pezizomycotina- spécifie gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology : FG & B 44, 1219-1230).

Pour obtenir un tricaryon, les souches ont été incubées séparément pendant deux jours maximum à 30°C pour éviter la formation de conidies et obtenir seulement du mycélium. Après deux jours de croissance, un implant d'agar de 0,5 cm sur 0,5 cm de chacune des souches impliquées (trois pour un tricaryon) a été découpé et placé dans un tube Eppendorf de 2 ml contenant 500 μΐ _^ d'eau stérile. Les mycéliums ont été mixés à l'aide d'un FastPrep®-24 (MP Biomedicals) pendant 20 secondes à une vitesse de 4 m/s, et 10 μΐ _^ du broyât ont été déposé sur les boites de Pétri. Les boites ont été incubées dans une étuve à 24°C avec une alternance de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.

L'expérience a été réalisée une première fois en triplicata. Aucun stromata n'a été obtenu. Les boites ont été maintenues à étuve jusqu'à ce que le milieu sèche, soit environ 1 mois.

L'obtention d'un tricaryon étant un événement rare, l'expérience a été répétée et 10 boites de Pétri différentes ont été inoculées. Aucun stromata n'a été obtenu. b/ Méthode 2 .'fabrication d'un tricaryon

Cette méthode est identique à la méthode 1 mais diffère par son incubation. Ici les boites de Pétri ne sont pas placées dans une étuve où il fait 24°C et où il y a 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité, mais sont laissées sur la paillasse du laboratoire dans lequel la température n'est pas constante (variation journalière) et où il n'y a pas de contrôle de la luminosité (luminosité naturelle). Le mélange des trois souches a été inoculé sur 10 boites de Pétri différentes. Aucun stromata n'a été obtenu. cl Méthode 3 : confrontation des trois souches

Les trois souches ont été inoculées sur une boite de Pétri à distance égale les unes des autres et à distance maximale du centre de la boite de Pétri. La boite a été incubée à 24°C avec une alternance jour/nuit (12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité). Aucun stromata n'a été obtenu. d/ Méthode 4 : mélange des trois souches au centre d'une boite de Pétri

Les trois souches ont été inoculées isolément sur une feuille de cellophane placée sur une boite de Pétri. Après 2-3 jours de croissance à l'obscurité, les mycéliums ont été prélevées, broyés à l'aide de billes dans un Fastprep®, mélangés dans un ratio 1 : 1 : 1 puis déposés au centre d'une boite de Pétri avec différentes concentrations (1, 1/10, 1/100,1/1000). Aucun stromata n'a été obtenu. el Méthode 5 : inoculation isolée des trois souches

Les trois souches ont été inoculées isolément sur une feuille de cellophane placée sur une boite de Pétri. Après 2-3 jours de croissance à l'obscurité, les mycéliums ont été prélevés, broyés à l'aide de billes dans un Fastprep, puis mélangés dans un ratio 1 : 1 : 1. Ce mélange a été inoculé dans un milieu liquide PD (Potatoes Dextose Broth) additionné de 1% de KH ₂ P0 ₃ et incubé (avec ou sans agitation) pour un à deux jours pour être ensuite déposé au centre d'une boite de Pétri avec différentes concentrations (1, 1/10), avec ou sans addition de 5mM d'acide ascorbique. Aucun stromata n'a été obtenu. fl Méthode 6 : inoculation des trois souches

Les trois souches ont été inoculées ensemble à partir de conidies dans un milieu liquide PD (Potatoes Dextose Broth) additionné de 1% de KH ₂ P0 _3i et incubé (avec ou sans agitation) pour 1 à 2 jours pour être ensuite déposé au centre d'une boite de PDA avec différentes concentrations (1, 1/10), avec ou sans addition de 5mM d'acide ascorbique. Aucun stromata n'a été obtenu. g/ Méthode 7 : inoculation isolée des trois souches

Les trois souches ont été inoculées isolément sur une feuille de cellophane placée sur une boite de Pétri. Après 2-3 jours de croissance à l'obscurité, les mycéliums ont été prélevés, broyés à l'aide de billes dans un Fastprep, puis mélangés avec un ratio 1 : 1 : 1 (QM6a 1-1 : QM6a 1-2 : MAT), ou 1 : 1 :2 ou 1 : 1 :5. Le mélange a été (i) soit étalé sur l'intégralité de la boite, (ii) soit inoculé au centre de la boite avec différentes dilutions (1, 1/10 et 1/100) sur milieu PDA, avec ou sans addition de 5mM d'acide ascorbique. Les boites ont ensuite été incubées à 24°C, (i) soit en alternance jour/nuit, (ii) soit pour une incubation d'une nuit à l'obscurité puis une alternance jour/nuit, (iii) soit à l'obscurité pour trois jours suivi d'une alternance jour/nuit, (iv) soit à l'obscurité pour 15 jours suivi d'une alternance jour/nuit. Aucun stromata n'a été obtenu. hl Méthode 8 : arrosage séquentiel avec ajout d'extraits cellulaires

Des isolais sauvages fertiles de souches de T. reesei ont été mis en confrontation sur une feuille de cellophane déposée sur du PDA. Le matériel biologique de ces croisements a été récupéré de T=0 à T=96h après inoculation et est soumis à une extraction de protéines. Les extraits protéiques ont été stérilisés par filtration. Enfin, la méthode de l'arrosage a été appliquée et les différents extraits cellulaires obtenus ont été ajoutés aux conidies. Un premier arrosage avec les conidies MAI 1-1, puis un deuxième arrosage avec les conidies MAT 1-2 (ou vice- versa) a été effectué. Aucun stromata n'a été obtenu. il Méthode 9 : arrosage séquentiel selon l'invention

Obtention des conidies :

Quatre à six jours avant l'arrosage, des boîtes de Pétri sont ensemencées avec chacune des souches donneuses de conidies (MAT1-1 puis MATl-2) qui serviront pour l'arrosage de la souche assistante, et incubées à 30°C à la lumière pour qu'il y ait production de conidies.

Le jour de l'arrosage, on dépose 4 ml d'eau stérile sur la souche donneuse {MAT 1-1 ou

MATl-2) et on récolte les conidies. Les conidies sont comptées et leur concentration est ajustée entre 10 ⁶ et 10 ⁸ conidies/ml.

Arrosage :

Dans la technique de l'arrosage, la souche assistante AMAT a la fonction de souche femelle qui va fournir les tissus maternels nécessaires à la fabrication des stromata. La souche assistante va être successivement arrosée par les conidies MAT1-1 puis MATl-2.

La souche assistante AMAT est arrosée uniformément avec 1 ml de conidies du premier type sexuel, puis incubée 7 jours, arrosée avec 1 ml de conidies du deuxième type sexuel et incubée jusqu'à l'obtention de stromata.

La souche assistante AMAT est mise en culture sur un milieu PDA et incubée à 24°C pendant 4 jours et à l'obscurité. Après 4 jours d'incubation la souche assistante a été arrosée avec 1 mL de conidies de type-sexuel MAT 1-1 et mise à incuber à 24°C pendant 7 jours avec une alternance de 12h de lumière et 12h d'obscurité.

Enfin, la souche assistante a été arrosée avec 1 mL de conidies MAT 1-2 et mise à incuber à 24°C avec une alternance de 12h de lumière et 12h d'obscurité jusqu'à apparition des stromata. Cette méthode a permis l'obtention de stromata. Six expériences (exp 1 à exp 6) différentes ont été réalisées. Ces dernières diffèrent par le temps de pré-incubation (4, 5 ou 6 jours) et par le nombre de conidies qui a été arrosé. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-après.

Tableau 3 : Nombre total de stromata obtenus avec les 6 boites

* : Beaucoup de structures pigmentées qui ressemblent à des stromata, mais qui sont de très petite taille (environ 2mm) ont été obtenues. Ils sont tellement nombreux qu'ils sont collés les uns aux autres, ce qui rend leur comptage difficile.

La technique de l'arrosage séquentiel permet d'obtenir de façon répétitive des stromata. Les conditions optimales pour obtenir les stromata sont les suivantes :

Pré-incubation de la souche assistante : 4 ou 5 jours ;

Concentration de conidies : 10 7 et 108 conidies/ml.

Exemple 3 : Différentes conditions d'arrosage séquentiel selon l'invention

Dans cet exemple, et comme indiqué dans le Tableau 4, la souche assistante a été arrosée par :

Une souche de type sexuel MAT 1-1 puis la même souche du type sexuel MAI 1-2, ou - Une souche de type sexuel MAT 1-2 puis la même souche du type sexuel MAT1-1, ou

De l'eau à chacun des arrosages (contrôle négatif). Arrosage 1 Arrosage 2

Souche assistante AMAT MAT 1-1 MAT 1-2

Souche assistante AMAT MAT 1-2 MAT 1-1

Souche assistante AMAT H20 H20

Tableau 4 : Récapitulatif des c ifférentes conditions testées

Entre l'arrosage 1 et l'arrosage 2, il y a une incubation pendant 7 jours à 24°C avec une alternance de 12h de lumière et 12h d'obscurité. Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-après.

Tableau 5 : Nombre total de stromata obtenus avec les 2 boites

Un premier arrosage avec une souche de type sexuel MAT1-1 favorise ainsi l'obtention d'un grand nombre de stromata, en comparaison avec un premier arrosage avec une souche de type sexuel MAT1 -2.

Exemple 4 : Amplification des stromata

L'amplification a été réalisée sous une alternance de 12h de lumière et de 12 h d'obscurité pendant une durée de 7 à 21 jours : le temps écoulé entre la première série de photos (Al ou Bl) et la deuxième série de photos (A2 ou B2) est de 15 jours. Les stromata des boites de Pétri Al/Bl obtenus selon l'invention (par exemple tels que ceux obtenus dans l'exemple 2) ont été transférés dans un nouveau milieu approprié (ici le PDA). Les stromata obtenus à l'issue de ce transfert sont réprésentés dans les boites de Pétri A2/B2. Un deuxième transfert dans un nouveau milieu approprié a ensuite été effectué : les stroamtas des boites de Pétri A2/B2 ont été transférés dans un nouveau milieu approprié. Les stromata obtenus à l'issue de ce transfert sont réprésentés dans les boites de Pétri A3/B3.

Les résultats de ces transferts sont représentés à la Figure 8.

L'analyse du nombre de stromata obtenu a permet de conclure que : 1) l'étape d'amplification (Le. le transfert des stromata dans un nouveau milieu approprié) permet d'augmenter quantitativement le nombre de stromata, d'au moins 20% et même d'au moins 50% par rapport à un procédé sans étape d'amplification,

2) l'étape d'amplification permet aussi d'augmenter la maturité des stromata.

Références :

Jamet-Vierny, C, Debuchy, R., Prigent, M., and Silar, P. (2007). IDC1, a pezizomycotina- specific gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology : FG & B 44, 1219- 1230.

Kubicek, C, Linke, R., Seiboth, B., Haarmann, T. and Lorenz, P. (2014). Genes/Genetic Eléments Associated With Mating Impariment In Trichoderma reesei QM6a And Its Derivatives And Process For Their Identification (WO2014/102241).

Linke, R., Thallinger, G. G., Haarmann, T., Eidner, J., Schreiter, M., Lorenz, P., Seiboth, B., and Kubicek, C.P. (2015). Restoration of female fertility in Trichoderma reesei QM6a pro vides the basis for inbreeding in this industrial cellulase producing fungus. Biotechnology for biofuels 8, 155.

Seidl, V., Seibel, C, Kubicek, C.P., and Schmoll, M. (2009). Sexual development in the industrial workhorse Trichoderma reesei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 13909-13914.

Silar, P. (2014). Simple Genetic Tools to study fruiting body development in Fungi. The Open Mycology Journal, 8, 148-155); Jamet-Vierny, C, Debuchy, R., Prigent, M. & Silar, P. (2007). IDC1, a pezizomycotina-specific gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina. Fungal genetics and biology : FG & B 44, 1219-1230