技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种发酵丁二 酸分离过程水循环利用的方法， 具体涉及一 种回收利用工业蒸发水、 蒸汽凝液发酵生产丁二酸同时提高丁二酸产量 的方法。

背景技术

丁二酸， 又名琥珀酸， 是一种二元有机酸， 它是一种重要的 c ₄ 平台化合物， 可用于表面 活性剂、 清洁剂添加剂和起泡剂等领域， 作为离子螯合剂， 可用于电镀行业， 在食品行业， 可 作为酸化剂、 pH改良剂、 风味物质和食品改良剂； 也可用于包括医药、 抗生素、 氨基酸和维 生素的生产。

生产丁二酸的方法主要有两种： 化学合成法和微生物发酵法， 化学生产方法一般采用丁烷 经顺丁烯二酸酐通过电解生产， 污染大、 转化率低、 成本高， 严重抑制了琥珀酸的发展潜力。 利用微生物发酵法生产丁二酸， 由于原料来源广泛且价格低廉， 污染小， 环境友好， 且在发酵 过程中可吸收固定 C0 ₂ ， 能有效缓解温室效应， 开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径， 近年 来成为研究的热点。 大肠杆菌由于遗传背景清楚、 易操作、 易调控、 培养及要求简单和生长迅 速等优点， 几年来被广泛用于研究以或得产丁二酸优秀菌 株。

利用微生物发酵生产丁二酸的发酵液需经过预 过滤、 超滤、 纳滤、 浓縮、 结晶最终得到丁 二酸二钠或丁二酸。发酵液在浓縮阶段分别得 到大量的蒸发水和蒸汽凝液， 蒸发水中含有少量 乙酸和甲酸等少量有机酸，将其用于细胞的有 氧培养， 通过提高细胞内一些关键酶的酶活促进 了细胞的代谢能力，进而提高了菌体的产酸性 能。丁二酸发酵液分离过程中产生的蒸汽凝液 不 含有机酸或金属离子， 将其用于菌体发酵时， 不会增加发酵体系的渗透压， 可用于细胞的厌氧 发酵阶段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是一种利用发酵丁 二酸分离过程中的蒸发水、蒸汽凝液发酵生 产丁二酸的方法， 以解决回收利用工业蒸发水、蒸汽凝液的问题 ， 并进一步提高丁二酸的发酵 能力和产酸能力。

为了实现本发明的目的， 本发明所采用的技术方案如下：

一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法， 包括种子有氧培养、厌氧发酵产酸和丁二酸 分离步骤，其特征在于用丁二酸分离步骤中回 收的蒸发水或者蒸汽凝液配制种子有氧培养的 培 养基、菌体厌氧发酵的培养基； 用丁二酸分离步骤中回收的蒸气凝液配制厌氧 发酵产酸培养基 以实现水循环利用。

其中，所述的丁二酸分离步骤中回收的蒸发水 或蒸汽凝液是将厌氧发酵产酸步骤结束后得 到的丁二酸发酵液经预过滤、 酸性条件下超滤、 酸性条件下纳滤、 中性条件下再次纳滤后， 减 压蒸发浓縮过程中产生的。蒸发水中含有少量 的乙酸、甲酸等有机酸，蒸汽凝液中没有有机 酸， 其中成分和蒸馏水相同。

进一步地，本发明所述的种子有氧培养的方法 应理解为现有技术中任何利用产丁二酸大肠 杆菌的种子有氧培养方法；在本发明中，是将 大肠杆菌 AFP111菌体在三角瓶中进行有氧培养， 培养基为 LB种子培养基。 具体地， 取单菌落转接到 5 mL试管， 摇床 37°C， 200 r/min过夜活 化， 然后按 1%接种量接至装液量为 50 mL的 500 mL三角瓶中好氧培养， 添加 30 mg/L的卡 那霉素、 氯霉素， 37°C， 200 r/min摇床培养 8小时左右作为种子液。

进一步地，本发明所述的厌氧发酵产酸的方法 应理解为现有技术中任何利用产丁二酸大肠 杆菌的厌氧发酵产酸方法； 在本发明中， 可以是摇瓶培养， 例如： 将种子有氧培养得到的种子 液于 4°C， 8000 r/min, 离心 10 min， 得到菌泥， 洗匀转接入装液量为 30 mL的 100 mL血清瓶 中厌氧培养， 使得菌体初始浓度为 10 ( Ο κ)) 左右， 初始葡萄糖浓度为 20 g/L， 再通入过滤 除菌后的 C0 ₂ 气体 2 min， 保证血清瓶中为厌氧环境， 37°C、 200 r/min厌氧发酵。 也可以是发 酵罐培养，例如：将菌体厌氧发酵得到的种子 液按 5%接种量转接到装有 4 L发酵培养基的 7 L 发酵罐 （BioFlo 110 fermenter; New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J. ) 中， 添加过滤除菌的 VBi和生物素至终浓度为 20 mg/L和 2 mg/L， 氯霉素 30 mg/L， 卡那霉素 30 mg/L， 发酵温 度维持在 37°C， 用 NaOH调节 pH值为 7.0。 发酵初始以 0.5 L/min通气量通空气， 搅拌转速 300 r/min, 当菌体浓度为 5 ( ΟΖ) ₆₀₀ ) 以上时开始通富氧空气， 当菌体浓度达到 15 ( ΟΖ) ₆₀₀ )时， 开始通过限速补糖控制菌体的比生长速率约为 0.07 h- ¹ , 直到菌体浓度达到 30 ( OZ) _6QQ )， 开始 通 C0 ₂ ， 转为厌氧发酵。

进一步地，本发明所述的丁二酸分离的方法应 理解为现有技术中任何利用产丁二酸大肠杆 菌发酵丁二酸得到的发酵液的丁二酸分离方法 ； 在本发明中， 包括以下步骤：

( 1 ) 预过滤： 对丁二酸发酵液进行预过滤， 采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒。

(2)酸性超滤： 调节滤液的 pH为 4.0〜6.0， 进行超滤， 以除去蛋白质等生物大分子， 操 作温度 25〜40°C， 操作压力： 0.2〜4.0 MPa， 收集超滤透过液。

( 3 )酸性纳滤： 调节超滤透过液的 pH值至 3.0〜4.0， 进行纳滤， 以除去色素、 多价无机 离子及未消耗的底物， 操作温度 25〜40°C， 操作压力： 1.0〜2.5MPa， 收集纳滤透过液。 (4) 中性纳滤： 调节含有丁二酸的纳滤透过液的 pH值至 6.0〜7.0， 再次进行纳滤， 以除 去甲酸、 乙酸等副产物及单价离子， 操作温度 25〜40°C， 操作压力： 0.2〜4.0MPa， 收集纳滤 截留液， 实现预浓縮。

(5 )蒸发浓縮： 将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓縮， 操作温度 65〜75°C， 操作压力： -0.08〜0.1MPa， 得到浓縮液， 同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液， 得到的蒸发水体积约为丁二 酸发酵液体积的 5/6，浓縮液 50〜70°C保温，用碳酸钠将浓縮液调节至 pH为 6.8，再冷却结晶、 干燥， 得到丁二酸酸钠。

本发明的有益效果在于：

1、 本发明将丁二酸发酵液在分离过程中产生的蒸 发水和蒸汽凝液代替现有技术中配制培 养基所有的蒸馏水、纯净水或者自来水等用于 大肠杆菌的培养和发酵， 实现了工业废水的回收 利用， 对环境友好， 同时丁二酸分离过程的蒸发水中含有少量的乙 酸、 甲酸等有机酸， 将其用 于大肠杆菌有氧培养，蒸发水中的有机酸可作 为糖异生碳源，提高了细胞内一些关键酶的酶 活， 有利于菌体的厌氧发酵产酸。 而用蒸汽凝液配制培养基也不产生不利影响。

2、本发明的步骤（3 )中， 利用丁二酸分离过程中的蒸发水配制发酵培养 基， 发酵结束时， 丁二酸浓度可达 55 g/L， 收率达 91.6%， 和自来水配制的培养基发酵结果相比， 丁二酸浓度提 高 8.5%, 生产强度提高 8.46%

附图说明

图 1 大肠杆菌 AFP111在用自来水配制的 JSM发酵培养基中培养过程中葡萄糖、丁二酸、 乙酸、 菌体密度随时间的变化曲线。

图 2 大肠杆菌 AFP111在用丁二酸回收过程产生的蒸发水配制的 JSM发酵培养基中培养 过程中葡萄糖、 丁二酸、 乙酸、 菌体密度随时间的变化曲线。

具体实施方式

本发明中所述的培养基：

( 1 ) LB种子液培养基： 蛋白胨 10 g/L, 酵母膏 5 g/L， NaCl 10 g/L。

(2) JSM发酵培养基：柠檬酸 3.0 g/L, Na ₂ HP0 ₄ -7H ₂ 0 3.00 g/L, KH ₂ P0 ₄ 8.00 g/L, (NH ₄ ) ₂ HP0 ₄ 8.00g/L， NH ₄ C1 0.2 g/L, (NH4) ₂ S0 ₄ 0.75 g/L, MgS04-7H ₂ 0 1.00 g/L, CaCl ₂ -2H ₂ 0 10.0 mg/L, ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 0.5g/L, CuCl ₂ -2H ₂ 0 0.25mg/L， MnS0 ₄ H ₂ 0 2.5 mg/L, CoCl ₂ 6H ₂ 0 1.75 mg/L, H3BO3 0.12 mg/L, Al ₂ (S0 ₄ )-3xH ₂ 0 1.77 mg/L, Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.5 mg/L, 柠檬酸铁 16.1 mg/L， VBi 20 mg/L, 生物素 2 mg/L。 本发明所用的重组大肠杆菌 Escherichia co/ZAFPlll来源有两处：

(1) Biotechnol Bioeng, 2001,74:89〜95。 申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献 出 处， 并联系了发表人系美国芝加哥大学的 David P.Clark教授， 并邮件请求其赠与该生物材料， 并免费获得了该生物材料； 且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发 放该生物材料；

(2)该生物材料还在中国专利 （申请号 96198547 申请日 1996.10.31， 授权日 2003年 1月 1日， 授权公告号 CN1097632C) 的专利文献中公开并获得授权。

本发明所采用的有机酸的分析方法为：

高效液相色谱法（HPLC): HPLC系统高效相色谱仪， WatersHPLCC2010工作站； 色谱柱 Prevail organic acid column 250mmx4.6mm;紫夕卜检测波长 215nm _; 流速 1 mL/min, 进量 20 μL, 流动相 25mmol/LKH ₂ P0 ₄ ， pH2.5; 柱温： 室温。

下面的实施例对本发明作详细说明， 但对本发明没有限制。

实施例 1

种子有氧培养： 将冻存管中的菌种转接到试管， 摇床过夜活化， 然后按 1%接种量转接到 装有 50 mL种子培养基的容量为 500 mL的三角瓶中， 温度 37°C、 摇床转速 200 r/min, 培养 时间 8h。

厌氧发酵摇瓶培养产酸： 将培养好的种子液于 4°C， 8000 r/min, 离心 lOmin, 得到菌泥， 用无菌水洗匀转接入装液量为 30 mL 的 100 mL 血清瓶中厌氧培养， 使得初始菌体浓度为 10(OD ₆₀₀ ), 再通入过滤除菌后的 C0 ₂ 气体 2min， 温度 37°C、 摇床转速 200 r/min， 厌氧发酵。

其中， 蒸发水和蒸汽凝液的制备和丁二酸的分离同步 完成， 具体的方法是：

(1) 预过滤： 对丁二酸发酵液进行预过滤， 采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒。

(2) 酸性超滤： 调节滤液的 pH为 4.0， 进行超滤， 以除去蛋白质等生物大分子， 操作温 度 25°C， 操作压力： 0.2MPa， 收集超滤透过液。

(3) 酸性纳滤： 调节超滤透过液的 pH值至 3.0， 进行纳滤， 以除去色素、 多价无机离子 及未消耗的底物， 操作温度 25°C， 操作压力： l.OMPa, 收集纳滤透过液。

(4) 中性纳滤： 调节含有丁二酸的纳滤透过液的 pH值至 6.0， 再次进行纳滤， 以除去甲 酸、 乙酸等副产物及单价离子， 操作温度 25°C， 操作压力： 0.2MPa， 收集纳滤截留液， 实现 预浓縮。

(5) 蒸发浓縮： 将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓縮， 操作温度 65°C， 操作压力： -O.OSMPa, 得到浓縮液， 同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液， 得到的蒸发水体积约为丁二酸发酵 液体积的 5/6， 浓縮液 50°C保温， 用碳酸钠将浓縮液调节至 pH为 6.8， 再冷却结晶、 干燥， 得 到丁二酸酸钠。

蒸发水、 蒸汽凝液中的物质检测： 采用高效液相色谱法 （HPLC ) 检测， 检测结果为蒸 水中的甲酸含量为 1.3 g/L， 乙酸含量为 2.8g/L， 蒸汽凝液中不含有任何有机酸。

按实施例 1的方法， 种子培养基分别用自来水、 蒸发水、 蒸汽凝液配制进行有氧培养， 酵培养基用自来水配制， 发酵结果入表 1。

表 1 分离过程水用于种子培养阶段对发酵结果产生 的影响 种子培养基 发酵培养基 初糖 (g/L) 丁二酸 乙酸 丁二酸收率

(g/L) (g/L) %

自来水 自来水 20 15.06 1.53 85

蒸发水 自来水 20 16.72 1.34 92.8 蒸汽凝液 自来水 20 15.12 1.63 84

由表 1可以看出， 当有氧阶段用蒸发水培养时， 丁二酸的产量和收率达到最高值， 分别为 16.72 g/L禾口 92.8%

实施例 2

种子有氧培养： 将冻存管中的菌种转接到试管， 摇床过夜活化， 然后按 1%接种量转接到 装有 50 mL种子培养基的容量为 500 mL的三角瓶中， 温度 37°C、 摇床 转速 200 r/min, 培养 时间 8h。

菌体厌氧发酵摇瓶培养产酸： 将培养好的种子液于 4°C， 8000 r/min, 离心 10 min， 得到 菌泥， 用无菌水洗匀转接入装液量为 30 mL的 100 mL血清瓶中厌氧培养， 使得初始菌体浓度 为 10(O ¾(K))， 再通入过滤除菌后的 C0 ₂ 气体 2 min， 温度 37°C、 摇床转速 200 r/min， 厌氧发 酵。

其中， 蒸发水和蒸汽凝液的制备和丁二酸的分离同步 完成， 具体的方法是：

( 1 ) 预过滤： 对丁二酸发酵液进行预过滤， 采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒。

( 2 ) 酸性超滤： 调节滤液的 pH为 6.0， 进行超滤， 以除去蛋白质等生物大分子， 操作温 度 40°C， 操作压力： 4.0 MPa， 收集超滤透过液。

( 3 ) 酸性纳滤： 调节超滤透过液的 pH值至 4.0， 进行纳滤， 以除去色素、 多价无机离子 及未消耗的底物， 操作温度 40°C， 操作压力： 2.5MPa， 收集纳滤透过液。

( 4 ) 中性纳滤： 调节含有丁二酸的纳滤透过液的 pH值至 7.0， 再次进行纳滤， 以除去甲 酸、 乙酸等副产物及单价离子， 操作温度 40°C， 操作压力： 4.0MPa， 收集纳滤截留液， 实现 预浓縮。 ( 5 ) 蒸发浓縮： 将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓縮， 操作温度 75 °C， 操作压力： O.lMPa, 得到浓縮液， 同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液， 得到的蒸发水体积约为丁二酸发酵 液体积的 5/6， 浓縮液 70°C保温， 用碳酸钠将浓縮液调节至 pH为 6.8， 再冷却结晶、 干燥， 得 到丁二酸酸钠。

蒸发水、 蒸汽凝液中的物质检测： 采用高效液相色谱法 （HPLC) 检测， 检测结果为蒸发 水中的甲酸含量为 1.0 g/L， 乙酸含量为 2.5 g/L， 蒸汽凝液中不含有任何有机酸。

按实施例 2的方法，种子培养基用自来水液配制进行有� �培养，发酵培养基分别用自来水、 蒸发水、 蒸汽凝液配制进行厌氧发酵， 结果见表 2。

表 2 分离过程水用于厌氧发酵阶段对发酵结果产生 的影响 种子培养基 发酵培养基 初糖 (g/L) 丁二酸 (g/L) 乙酸 (g/L) 丁二酸收率％ 自来水 自来水 20 15.06 1.53 85

自来水 蒸发水 20 15.86 1.45 88

自来水 蒸汽凝液 20 15.24 1.51 84.6 由表 2可知，用分离过程中产生的蒸发水厌氧发酵� �结果是最好的， 而蒸汽凝液中不含有 机酸， 其成分和蒸馏水相同， 故对发酵结果没有明显的影响。

实施例 3

种子培有氧培养： 将冻存管中的菌种转接到试管， 摇床过夜活化， 然后按 1%接种量转接 到装有 50 mL种子培养基的容量为 500 mL的三角瓶中， 温度 37°C、 摇床转速 200r/min， 培养 时间 8 h。

厌氧发酵罐培养产酸： 将培养好的种子液按 5%接种量转接到装有 4 L发酵培养基的 7 L 发酵罐 （BioFlo 110 fermenter;New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J. ) 中， 发酵温度维持在 37 °C , 用 NaOH调节 pH值为 7.0。 发酵初始以 0.5 L/min通气量通空气， 搅拌转速 300 r/min， 当菌体生长的 OZ) ₆ 。。值为 5 以上时通富氧空气， 调节转速， 使 DO≥30%， 当菌体浓度达到 15(OD ₆₀₀ ) , 开始限制补糖， 控制菌体的比生长速率约为 0.07 h- ¹ , 菌体浓度达到 开始通 C0 ₂ ， 转为厌氧发酵， 转速为 200 r/min， 用 NaC0 ₃ 调节 pH为 6.6。

其中， 蒸发水和蒸汽凝液的制备和丁二酸的分离同步 完成， 具体的方法是：

( 1 ) 预过滤： 对丁二酸发酵液进行预过滤， 采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒。

(2) 酸性超滤： 调节滤液的 pH为 4.8， 进行超滤， 以除去蛋白质等生物大分子， 操作温 度 30°C， 操作压力： 3.0 MPa， 收集超滤透过液。

( 3 ) 酸性纳滤： 调节超滤透过液的 pH值至 3.6， 进行纳滤， 以除去色素、 多价无机离子 及未消耗的底物， 操作温度 35°C， 操作压力： 2.0MPa， 收集纳滤透过液。

(4) 中性纳滤： 调节含有丁二酸的纳滤透过液的 pH值至 6.5， 再次进行纳滤， 以除去甲 酸、 乙酸等副产物及单价离子， 操作温度 30°C， 操作压力： 3.0 MPa， 收集纳滤截留液， 实现 预浓縮。

( 5 ) 蒸发浓縮： 将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓縮， 操作温度 70°C， 操作压力： 0.05MPa, 得到浓縮液， 同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液， 得到的蒸发水体积约为丁二酸发酵 液体积的 5/6， 浓縮液 60°C保温， 用碳酸钠将浓縮液调节至 pH为 6.8， 再冷却结晶、 干燥， 得 到丁二酸酸钠。

蒸发水、 蒸汽凝液中的物质检测： 采用高效液相色谱法 （HPLC) 检测， 检测结果为蒸发 水中的甲酸含量为 1.7 g/L， 乙酸含量为 2.9 g/L， 蒸汽凝液中不含有任何有机酸。

按照实施例 3中， 附图 1和附图 2分别是在 7 L发酵罐中分别采用自来水和丁二酸分离过 程中的蒸发水配制发酵基的发酵过程曲线。

由图 1和 2可知， 用自来水配置培养基最终发酵的丁二酸产量为 50.7 g/L， 用蒸发水配置 的培养基最终丁二酸产量为 55 g/L，丁二酸产量相比提高了 8.5%，生产强度分别为 1.05 g/L-h" ¹ 和 1.13 g/L_h- 由发酵结果可知， 用丁二酸分离过程中产生的蒸发水配置培养基 进行丁二酸的 发酵， 最终得到的丁二酸产量和生产强度均有所提高 。