Trennung, Isolation und Desintegration bilden bei den meisten Separations-Verfahren in Biologie und Medizin eine Einheit. Biologisches Material wird desintegriert, um im Folgenden einzelne Stoffe oder Stoffgruppen beziehungsweise Kompartimente anzurei- chern, zu separieren oder zu isolieren.

Die Isolierung von Stoffen aus den unterschied- lichsten biologischen Materialien wird seit langer Zeit praktiziert. Zur eindeutigen Charakterisierung ebenso wie zur Anwendung in unterschiedlichen Be- reichen, wie beispielsweise der Pharmazie oder Me- dizin, ist in den meisten Fällen die chemisch ein- heitliche Verbindung, also der reine Stoff, Voraus- setzung. Im gesamten life science Bereich stellen Trennmethoden daher eine der wichtigsten Grundlagen zur Identifizierung von Stoffen und deren Anwendung dar. Die Isolierung beziehungsweise Trennung stellt dabei häufig, je nach konkreter Isolierungsaufgabe, beispielsweise hinsichtlich der Reinheit des zu i- solierenden Stoffes, ein Problem dar.

Die Isolierung, Trennung oder Desintegration von biologischem Material, zum Beispiel Organismen, Ge- webe, biologischen Zellen, Organellen, Micellen, Viren etc., stellt in der Regel den ersten Schritt bei der Analyse oder Gewinnung von Zellinhaltsstof- fen dar. Bei solchen Inhaltsstoffen kann es sich zum Beispiel um Nucleinsäuren, Proteine, Metaboli- te, Farbstoffe etc. handeln. Da die Qualität aller nachfolgenden Schritte von der Desintegration des biologischen Materials bestimmt wird, kommt der Desintegration eine Schlüsselstellung zu. Neue Des- integrationsmethoden sind daher für eine Vielzahl von Verfahren interessant und besitzen ein entspre- chend großes Potential, um als Produkt gewinnbrin- gend vermarktet zu werden. Desintegrationsverfahren sind, wie auch vorstehend für die Trennverfahren dargelegt, Voraussetzungen für die life science' Bereiche, beispielsweise genomics', proteomics' und viele andere. Verfahren zur Desintegration von biologischem Material sind nicht universell, son- dern sehr spezifisch auf die jeweiligen Anforderun- gen ausgerichtet. Die bekannten Verfahren-mecha- nischen beziehungsweise nichtmechanischen Desinteg- rationsverfahren-sind toxisch, teuer, zeitaufwen- dig und arbeitsintensiv sowie auf bestimmte Appli- kationen beschränkt. Außerdem besteht ein hohes Ri- siko einer Querkontamination, die einen sehr großen Einfluss auf die Qualität aller nachfolgenden Pro- zessschritte ausübt, vor allem bei empfindlichen Nachweisverfahren, wie beispielsweise den PCR- basierten Nucleinsäurenachweismethoden. Des weite- ren ist bei den bekannten mechanischen Verfahren eine Standardisierung und Automatisierung erschwert oder eine Kombination mit Trenn-und Isolationsver- fahren kaum möglich.

Zu den gängigen Trenn-und Isolationsverfahren ver- fahren zählen die Filtration, die Zentrifugation, die Kristallisation, die Destillation, die Extrak- tion, die Elektrophorese, die Chromatographie und auf Magnetismus beruhende Verfahren.

Schließlich wird zwischen analytischen und präpara- tiven Verfahren unterschieden. Analytische Methoden dienen dem Nachweis von bestimmten Stoffen in Gemi- schen, während präparative Verfahren zur Anreiche- rung oder Gewinnung größerer Mengen eines möglichst reinen Stoffes eingesetzt werden.

Der Einsatz gepulster, elektrischer Felder für Trennzwecke ist bisher nicht bekannt.

Bekannt ist vielmehr, im Rahmen der Elektroporation derartige Felder einzusetzen (Prausnitz, M. R. et al., in Biophysical Journal 66 (1994), 1522-1530, US-Patent 5,019,034, US-Patent 5,273,525, US-Patent 5,304,120, US-Patent 5,389,069, US-Patent 5,422,272). Bei der Elektroporation werden über den jeweiligen Behandlungszeitraum in der Regel ein bis maximal zehn elektrische Impulse (Impulszahl) ein- gesetzt. In Abhängigkeit der Pulsfrequenz liegt die Behandlungsdauer maximal im Sekundenbereich, wobei die Feldstärke der Impulse so gewählt ist, dass die kritische Spannung (Vc, gleich etwa 1 Volt) über der Membran der zur elektroporierenden Zelle über- schritten wird (bei kugelförmigen Objekten gilt : v = 3/2 Eor mit r gleich Zellradius). Die Elektropo- ration wird im allgemeinen unter schonenden Bedin- gungen, das heißt beispielsweise bei Raumtempera- tur, durchgeführt, wobei die maximal physiologisch akzeptable Temperatur des jeweiligen Zielorganismus oder der Zielzelle nicht überschritten oder unter- schritten werden darf (US-Patent 5,466,587, US- Patent 5,545,130, US-Patent 5,547,467, US-Patent 5,749,847).

Ähnliche Bedingungen werden bei der Zellfusion ein- gesetzt, wobei auch hier im Vordergrund steht, mög- lichst schonende Bedingungen zu wählen, um eine ho- he Erfolgsrate bei der angestrebten Fusion zu er- reichen ("Electroporation and Electrofusion"in : Cell Biology, Plenum Press, New York und London (1989), Herausgeber : Neumann, E., Sowers, A. E. und Jordan, C. A.).

Schließlich wird für den Komplettaufschluss von biologischen Zellen ebenfalls in manchen Fällen mit gepulsten elektrischen Feldern gearbeitet, wobei die Zellinhaltstoffe unkontrolliert freigesetzt werden. Dabei werden im allgemeinen Impulszahlen von über 20000 eingesetzt, wobei die Feldstärke e- benso wie bei der Elektroporation üblicherweise ü- ber der kritischen Spannung (Vc) von 1 Volt über der Membran der aufzuschließenden Zelle liegt. Die eingesetzten Temperaturen für den Aufschluss der biologischen Zellen sind im allgemeinen recht hoch, das heißt liegen weit über den physiologisch geeig- neten Temperaturen, da der Aspekt der Schonung der Zellen keine Rolle mehr spielt und, im Gegensatz dazu, der Aufschluss durch den Einsatz extremer Be- dingungen beschleunigt und vervollständigt werden soll (US-Patent 5,235,905, US-Patent 5,447,733, US- Patent 5,393,541).

Es ist bisher nicht bekannt, mittels der herkömmli- chen Verfahren biologisches Material zu separieren, zu trennen, zu desintegrieren und Stoffe freizuset- zen und unmittelbar anzureichern oder zu isolieren, beziehungsweise zu reinigen. Herkömmlichen Verfah- ren, insbesondere Trennverfahren, geht im allgemei- nen eine zeitaufwendige und teure Probenvorberei- tung nach dem Zellaufschluss oder der Aufbereitung, insbesondere der Separation und/oder Desintegrati- on, des biologischen Materials voraus. So wird das biologische Material häufig zunächst homogenisiert und aufgeschlossen, um dann weiteren Verarbeitungs- schritten und schließlich dem Trennverfahren zuge- führt zu werden. Nur in Ausnahmefällen kann das Ho- mogenat direkt einem Trennverfahren unterzogen wer- den. Üblicherweise wird das Homogenat jedoch an- schließend zentrifugiert und der Überstand als Roh- extrakt einem Trennverfahren unterzogen, wobei zu- vor der pH-Wert, die Ionenstärke und andere Parame- ter eingestellt werden müssen.

Der Erfindung liegt also das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Trennung und Desinteg- ration von Stoffen aus und/oder an biologischen Ma- terialien bereitzustellen, das eine zeitaufwendige und teuere Probenvorbereitung unnötig macht und in einem einzigen Arbeitsschritt zur selektiven Frei- setzung und/oder Abtrennung des oder der erwünsch- ten Stoffe vor Ort-das heißt in situ-führt ; weiterhin soll das Verfahren eine universelle, standardisierte und damit automatisierte Trennung beziehungsweise Desintegration von biologischem Ma- terial, zum Beispiel Organismen, Gewebe, Zellen, Organellen, Micellen, Viren etc., gekoppelt mit der Freisetzung der Inhaltstoffe, ermöglichen.

Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, in- dem ein Verfahren zur selektiven Auftrennung von einem oder mehreren Stoffen aus einem in einem flüssigen Medium vorhandenen Stoffgemisch in situ mittels einer stationären und einer mobilen Phase bereitgestellt wird, wobei die stationäre Phase Be- standteil eines in dem flüssigen Medium befindli- chen biologischen Materials und die mobile Phase das flüssige Medium ist und wobei das in dem flüs- sigen Medium befindliche biologische Material ge- pulsten elektrischen Feldern mit einer Feldstärke bis 200 V/cm ausgesetzt wird. Das aufzutrennende Stoffgemisch kann vor der erfindungsgemäßen Abtren- nung, Desintegration, Isolierung oder Anreicherung in dem oder außerhalb des biologischen Materials vorhanden sein, oder auch in beidem. Das heißt, das Stoffgemisch kann direkt in dem flüssigen Medium oder eingeschlossen in dem biologischen Material im flüssigen Medium vorhanden sein. In bevorzugter Weise werden dabei, das heißt während und/oder nach der Behandlung mit den gepulsten, elektrischen Fel- dern ein oder mehrere erwünschte Stoffe aus dem biologischen Material freigesetzt, im flüssigen Me- dium angereichert und können dann vom biologischen Material mittels herkömmlicher Verfahren wie bei- spielsweise Zentrifugation oder Filtration von an- deren, unerwünschten Stoffen und/oder dem biologi- schen Material abgetrennt werden. In einer weiteren bevorzugten, alternativen Ausführungsform der Er- findung werden ein oder mehrere Stoffe im biologi- schen Material angereichert, damit dem flüssigen Medium außerhalb des biologischen Materials entzo- gen und anschließend das flüssige Medium außerhalb des biologischen Materials von dem biologischen Ma- terial abgetrennt, beispielsweise durch Zentrifuga- tion oder Filtration.

Die Erfindung sieht in bevorzugter Ausführungsform also vor, dass direkt in situ mit dem biologischen Material eine Reinigung von einem oder mehreren Stoffen durchgeführt wird, wobei der oder die Stof- fe in einem einzigen Schritt in situ freigesetzt und von anderen unerwünschten Stoffen getrennt wer- den. Die vorliegende Verfahrensweise vereinigt in bevorzugter Ausführungsform also die Schritte des Zellaufschlusses und der Stoffisolierung. Dabei dient das biologische Material, insbesondere dessen feste Bestandteile wie Zellskelett und Membranen, als eine Art stationäre Phase, während das flüssige Medium sowohl innerhalb als auch außerhalb des bio- logischen Materials als die mobile Phase aufgefasst werden kann. Das Verfahren zeichnet sich durch eine außergewöhnliche Einfachheit und Schnelligkeit aus, wobei eine zeitaufwendige mit einem hohen Material- bedarf verbundene Probenvorbereitung vor dem ei- gentlichen Trennschritt ebenso wenig wie ein Zell- aufschluss nicht mehr notwendig sind. In Abhängig- keit des biologischen Materials können verschiedene Arten von Wechselwirkungen zur Trennung oder Anrei- cherung von Stoffen gleichzeitig ausgenutzt werden.

Das Verfahren ist ein Verfahren zur Separation, I- solation und/oder Desintegration von biologischem Material in einem elektrischen Feld mit einer Feld- stärke bis 200 V/cm. Das Verfahren kann insbesonde- re zum Zellaufschluss mit geringem Zeit-und Mate- rialaufwand genutzt werden.

Das Verfahren ist universell einsetzbar und kann beispielsweise zur Abtrennung pharmakologisch inte- ressanter Proteine oder zur Bestimmung multipler Gleichgewichte zwischen verschiedenen Stoffen in biologischen Systemen verwendet werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter dem Begriff biologisches Material von ein-oder zweischichtig aufgebauten Lipid-oder Li- poproteinschichten umhüllte räumliche Einheiten, also Kompartimente, wie Zellen, insbesondere menschliche, tierische, pflanzliche, Hefe-oder bakterielle Zellen, Zellaggregate, Reste oder Teile davon, Zellkompartimente wie Endoplasmatisches Re- ticulum, Plastiden, Mitochondrien oder Zellkerne, fusionierte oder in Teilung befindliche Zellen, künstliche Zellsysteme, Liposomen oder andere Mehr- komponentensysteme natürlichen oder synthetischen Ursprungs verstanden. Das biologische Material weist einen festen Bestandteil, zum Beispiel Zell- skelett und Membranen, auch als stationäre Phase bezeichnet, und einen flüssigen Bestandteil, zum Beispiel cytoplasmatische Flüssigkeit, auf.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Auftrennen eines oder mehrerer Stoffe das, vorzugsweise im wesentlichen Osmose-oder Dif- fusions-getriebene, gezielte Verändern von Konzent- rationen eines oder mehrerer Stoffe in und außer- halb des biologischen Materials, insbesondere das Separieren eines oder mehrerer Stoffe von anderen Stoffen, verstanden, wobei der eine oder die mehre- ren Stoffe aus einer Auswahl ebenfalls in dem flüs- sigen Medium vorhandener Stoffe, also einem Stoff- gemisch, selektiert wird/werden. Durch das anlie- gende elektrische Feld können auch elektrophoreti- sche Effekte als Antriebskraft für eine An-oder Abreicherung eines Stoffes dienen, beziehungsweise ausgenutzt werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter dem oder den aufzutrennenden Stoffen sämtliche, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auftrennbaren Stoffe verstanden, insbesondere Nuc- leinsäuren wie DNA oder RNA, in zirkulärer oder li- nearer Form, Proteine oder Peptide, auch in deriva- tisierter Form wie Glycoproteine, oder Kohlenhydra- te, auch in derivatisierter Form wie Proteoglycane.

Selbstverständlich können auch weitere Stoffe, sei- en sie natürlichen oder synthetischen Ursprungs aufgetrennt werden, wie Farbstoffe, Metaboliten, Naturstoffe, synthetische Makromoleküle und ähnli- ches. Der Begriff Stoff erfasst zum Beispiel nicht das Lösungsmittel, zum Beispiel Wasser.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter Anreichern eine Konzentrationserhöhung und Entreichern eine Konzentrationsverminderung ver- standen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter Desintegration ein Prozess verstanden, der den Ordnungszustand von biologischem Material modi- fiziert oder die Modifizierung initiiert oder be- gleitet. Eine Zelle, insbesondere eine ohne Defek- te, weist einen hohen Ordnungszustand auf, der bei- spielsweise durch Lysevorgänge an der Zellmembran verändert werden kann, indem Kompartimente der Zel- le in die sie umgebende Lösung diffundieren. Im Sinne der Erfindung kann ein Verfahren zur Tren- nung, insbesondere zur selektriven Trennung, und/oder Anreicherung auch ein desintegrierendes Verfahren sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter flüssigem Medium eine vorzugsweise wässrige Lösung, Suspension oder Emulsion verstanden. Das flüssige Medium kann innerhalb des biologischen Ma- terials in seiner Zusammensetzung von der Zusammen- setzung außerhalb des biologischen Materials abwei- chen, beispielsweise innerhalb einer Zelle als Plasma und außerhalb der Zelle als physiologische Kochsalzlösung ausgeführt sein.

Die vorliegende Erfindung basiert unter anderem auf der Verwendung gepulster elektrischer Felder zur Behandlung von biologischem Material, wobei abhän- gig vom biologischen Material selbst, von Impuls- zahl, Impulsform, Behandlungsdauer und Temperatur die erzeugte Potentialdifferenz über der Membran des biologischen Materials vorzugsweise unterhalb der kritischen Spannung Vc liegt, so dass permanen- te oder transiente Poren in der Membran mit ver- schiedenen Durchmessern gebildet werden. Erfin- dungsgemäß ist es selbstverständlich auch möglich, Potentialdifferenzen über der Membran des biologi- schen Materials vorzusehen, die oberhalb der kriti- schen Spannung Vc liegen. Durch die gebildeten Po- ren können extrazelluläre Stoffe in das biologische Material, insbesondere die Zelle, gelangen, wobei umgekehrt intrazelluläre Stoffe freigesetzt werden.

Die Freisetzung beziehungsweise Aufnahme der Stoffe hängt von der Stärke und Art der Wechselwirkungen zwischen diesen Stoffen und zwischen den Stoffen und dem biologischen Material ab, der Lebensdauer sowie dem Durchmesser der Poren. Das biologische Material inklusiv der gegebenenfalls vorhandenen intrazellulären Matrix der vorhandenen Membranen und Zellwände, zum Beispiel Tubuline, etc. als "Zellskelett"ist an der Trennung beteiligt.

Die Erfindung sieht in einer bevorzugten Ausfüh- rungsform ein Verfahren zu einer chromatographiear- tigen selektiven Auftrennung von Stoffen in situ mittels einer stationären und einer mobilen Phase vor, wobei die stationäre Phase Bestandteil des biologischen Materials und die mobile Phase ein flüssiges Medium ist und wobei das in dem flüssigen Medium befindliche biologische Material gepulsten elektrischen Feldern mit Feldstärken bis 200 V/cm ausgesetzt wird und der oder die interessierenden Stoffe aus dem biologischen Material freigesetzt, im flüssigen Medium außerhalb des biologischen Ma- terials angereichert und von dem biologischen Mate- rial abgetrennt werden. Die Erfindung sieht also in vorteilhafter Weise vor, dass in situ, das heißt vor Ort, also im und am die interessierenden Stoffe enthaltenen biologischen Material die Anreicherung oder Trennung erfolgt, ohne dass das biologische Material vor der Trennung oder Anreicherung aufge- schlossen werden muss. Zur Abtrennung können erfin- dungsgemäß Zentrifugationsverfahren eingesetzt wer- den, die den oder die Stoffe von dem biologischen Material abtrennen können. Alternativ kann erfin- dungsgemäß auch vorgesehen sein, die Abtrennung des biologischen Materials von dem außerhalb des biolo- gischen Materials vorhandenen flüssigen Mediums durch Filtration, Kristallisation, Extraktion, E- lektrophorese, Chromatographie oder mittels ähnli- cher Verfahren durchzuführen.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen in situ- Trennverfahrens setzt für jede durchzuführende Iso- lieraufgabe die Optimierung der verschiedenen, die Trennleistung beeinflussender Parameter, wie die Feldstärke, die Impulszahl, die Impulsform, die Be- handlungsdauer, die Temperatur, die Lösung, die Art des biologischen Materials etc. voraus.

Die Erfindung sieht in einer bevorzugten Ausfüh- rungsform vor, biologisches Material in einem Pro- benträgersystem zu desintegrieren, wobei das Pro- bentragersystem mindestens ein nicht-leitendes Ele- ment sowie mindestens zwei leitende Elemente um- fasst, wobei an die leitenden Elemente eine Span- nung angelegt wird und das biologische Material in einem elektrischen Feld mit einer Feldstärke bis 200 V/cm, insbesondere in einem Bereich von 5 bis 50 V/cm, ausgesetzt wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das auf das biologische Material ein- wirkende elektrische Feld homogen oder inhomogen.

Vorzugsweise findet die Desintegration oder Tren- nung der Organismen, Zellen oder Kompartimente in einem inhomogenen elektrischen Feld statt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die elektrische Feldliniendichte lokal erhöht.

Die Desintegration oder Trennung, insbesondere se- lektive Trennung von biologischem Material findet vorteilhafterweise in einem inhomogenen elektri- schen Feld statt, bei dem beispielsweise lokal die elektrische Feldliniendichte erhöht sein kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist es vorteilhaft, wenn die Anzahl der elektrischen Impulse über 10 liegt. Die Impulszahl kann durch das Produkt von Behandlungsdauer und Frequenz be- stimmt werden. In Abhängigkeit der zu behandelnden Probe kann die Behandlungsdauer zwischen wenigen Sekunden und einigen Stunden betragen. Die verwen- deten Frequenzen sollten hierbei zwischen einigen mHz und mehreren GHz liegen. Durch die gewählte Frequenz kann die maximale Impulsdauer entsprechend eingeschränkt werden. Die Impulsdauer kann einige Nanosekunden betragen, aber mit Vorteil auch im Mi- nutenbereich liegen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die verwendeten gepulsten elektri- schen Felder verschiedene Impulsformen aufweisen.

Beispielsweise können exponentielle oder sinusför- mige Impulsformen wie auch Rechtecksimpulse und/oder Dreiecksimpulse eingesetzt werden. Vor- teilhaft ist es weiterhin, dass die Spannung des einzelnen Impulses in sich, beispielsweise sinus- förmig, schwankt. Zweckmäßigerweise können bei der Verwendung von Gleichspannungsimpulsen die Impulse ständig oder in Zeitintervallen umgepolt werden, so dass Wechselspannungs-Impulse appliziert werden können. Mit Vorteil ist auch eine Überlagerung von Gleich-und Wechselspannung möglich, um eine opti- male Anreicherung, Trennung und/oder Desintegration zu erreichen. Es ist beispielsweise auch möglich, verschiedene Impulsformen und/oder Impulsintensitä- ten, das heißt Spannungsstärken und Impulsdauer va- riabel zu kombinieren ; die Impulsdauer wird bei ex- ponentiellen Impulsformen durch die Zeitkonstante <BR> <BR> <BR> <BR> (T) ausgedrückt : T = CR (C : Kondensatorkapazität, R : Widerstand).

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann mit der entsprechenden Vorrichtung beispielsweise auch Drehstrom, das heißt Dreipha- sendrehstrom, verwendet werden. Somit können bei- spielsweise sinusförmige Wechselspannungen mit ei- ner Phasendifferenz von 120°, beziehungsweise 240° erzeugt werden.

Die Erfindung sieht dabei in einer bevorzugten Aus- führungsform vor, Impulszahlen, das heißt Impulse pro Behandlungsdauer von mindestens 15, vorzugswei- se von 15 bis 19000, insbesondere von 5000 bis 12000, einzusetzen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Feldstärke der Impulse weit unterhalb der kritischen Spannung Vc, die über der Membran oder Zellwand des biologischen Materi- als, zum Beispiel der Zelle oder des Liposoms, liegt. Erfindungsgemäß kann jedoch auch eine Feld- stärke der Impulse vorgesehen sein, die oberhalb der kritischen Spannung Vc liegt, die über der Membran oder Zellwand des biologischen Materials anliegt. Bevorzugt liegt die Feldstärke der Impulse bei 0 bis 200 V/cm, 0,001 bis 200 V/cm, 0,01 bis 200 V/cm, 20 bis 60 V/cm und insbesondere bei 30 bis 50 V/cm.

Erfindungsgemäß ist es in bevorzugter Ausführungs- form möglich, auf einen Impuls hoher elektrischer Feldstärke einen zweiten Impuls geringerer Feld- stärke folgen zu lassen, um so elektrophoretische Effekte zu unterstützen. Vorteilhafterweise können die Impulse mittels Gleichspannung überlagert wer- den.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, die chromatographische Auf- trennung bei Temperaturen zwischen-30 und +90°C, insbesondere 50 bis 55°C, durchzuführen. Insbeson- dere werden Temperaturen bevorzugt, die bei den ge- gebenen Rahmenbedingungen unterhalb der zu einem Zellaufschluss führenden Temperaturen und oberhalb beziehungsweise unterhalb der physiologischen, das heißt natürlicherweise vorliegenden Temperaturen des biologischen Materials liegen.

Vorteilhafterweise sieht die Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, die Des- integration bei Temperaturen zwischen 0 und 100°C, insbesondere zwischen 20 bis 80°C, durchzuführen.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Behandlungsdauer, in- nerhalb derer die Auftrennung durch den Einsatz ge- pulster, elektrischer Felder durchgeführt wird, we- nige Sekunden, zum Beispiel 2 bis 6 Sekunden, bis Stunden, zum Beispiel 3 bis 5 Stunden, beträgt.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Frequenz der Impulse 0,01 Hz bis 40 GHz beträgt.

Schließlich sieht die Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Impuls- dauer 25 ps bis 50 min, insbesondere 15 us beträgt.

Bei der Elektroporation und Elektrofusion, gegebe- nenfalls in Kombination mit Dielektrophorese, wer- den üblicherweise hypoosmolare Medien verwendet, deren Leitfähigkeit möglichst niedrig ist. Dadurch werden elektrolytische Effekte, die Veränderung des pH-Wertes und die Freisetzung cytotoxischer Ionen aus den Elektroden minimiert. Da die Erhaltung der Vitalität der Zellen bei diesen Verfahren im Vor- dergrund steht ist die Zusammensetzung des Mediums kritisch. Ein weiterer Grund für die Verwendung derartiger Medien bei den aufgeführten Verfahren ist die Form der Zellen in hypoosmolaren Lösungen ; sie runden sich ab. Somit wird die Berechnung der einzusetzenden Feldstärke erleichtert, die in der Regel bei kugelförmigen Objekten niedriger ist, um die kritische Spannung Vc zu erreichen. Außerdem werden bei den Verfahren überwiegend Medien verwen- det, die optimale Kaliumkonzentrationen enthalten, damit die Vitalität der behandelten Zellen gewähr- leistet ist. Neben der Osmolarität der Medien und dem Vorhandensein bestimmter Ionen ist die Leitfä- higkeit entscheidend. Bei der Elektroporation, E- lektrofusion und Dielektrophorese ist diese in der Regel gering. Im allgemeinen können nur so die Feldstärken erreicht werden, die nötig sind, um die für diese Verfahren erforderliche kritische Span- nung Vc zu erzielen.

Da bei dem erfindungsgemäßen in situ-Trennverfahren nicht die Vitalität der Zellen im Vordergrund steht, werden hier vorzugsweise isoosmolare Medien mit gegenüber den bei der Elektroporation, Elektro- fusion und Dielektrophorese üblicherweise verwende- ten Leitfähigkeiten hohen Leitfähigkeiten einge- setzt. Es können natürlich auch hypo-oder hyperos- molare Medien mit vergleichsweise niedrigen oder hohen Leitfähigkeiten eingesetzt werden. Dadurch entfällt bei dem in situ-Trennverfahren das aufwen- dige"Umpuffern"der Proben. Das biologische Mate- rial kann direkt als"Rohmaterial"eingesetzt wer- den. Die Leitfähigkeit des Mediums bei der erfin- dungsgemäßen Verfahrensweise, also dem in situ- Trennverfahren kann vorzugsweise von 1 uS/cm bis 2 S/cm, insbesondere von 5 bis 20 mS/cm betragen.

Pharmakologisch relevante, niedermolekulare Protei- ne wie der in E. coli clonierte und exprimierte hu- mane Makrophagen Migration Inhibitory Factor (huMIF) mit einer relativen Molekülmasse von ca.

12,3 kDa können über das erfindungsgemäße in-situ- Trennverfahren aus entsprechenden Zellsuspensionen gereinigt werden. Das erfindungsgemäße in-situ- Trennverfahren kann auch im Bereich von Bioreakto- ren eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Be- stimmung von Bindungsgleichgewichten verwendet wer- den. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, in Liposomen oder anderem biologischen Ma- terial Poren mit einer für das jeweilige Gleichge- wicht optimal angepassten Lebensdauer und Größe zu induzieren. Dies bietet die Möglichkeit, die Prin- zipien verschiedener Verfahren zur Bestimmung von Bindungsgleichgewichten mittels eines einzigen Ver- fahrens, nämlich des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens, zu nutzen. Erfindungsgemäß können auch mit Liganden gefüllte Liposomen eingesetzt werden, wobei nach entsprechender Permeabilisierung dieser Liposomen die Liganden bis zur Einstellung eines Gleichgewichtes frei vom intrazellulären Medium ins extrazelluläre Medium diffundieren können. Erfin- dungsgemäß kann vorgesehen sein, dass sich im ext- razellulären Medium Makromoleküle, an das die Li- ganden binden können, befinden, so dass der Anteil der gebundenen Liganden dem Gleichgewicht entzogen wird und Liganden aus dem intrazellulären Medium weiter nachströmen, bis die freien Anteile der Li- ganden in beiden Kammern ausgeglichen sind. Nach der Einstellung des Gleichgewichtes entspricht dann die Konzentration der Liganden im extrazellulären Medium der Konzentration des freien Liganden im As- soziationsgleichgewicht des intrazellulären Medi- ums. Somit können nach der Bestimmung der Liganden- konzentration im intrazellulären und extrazellulä- ren Medium die Konzentrationen des freien und des gebundenen Liganden bestimmt werden. Unter Kon- stanthaltung der Makromolekülkonzentration bei ver- schiedenen Ligandenkonzentration ist dann die Be- stimmung von Bindungskonstanten möglich.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, das Makromole- kül im intrazellulären Medium und den Liganden im extrazellulären Medium vorzusehen. Selbstverständ- lich können statt Liposomen auch biologische Zellen verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es also möglich, die Bindungs- eigenschaften zelleigener oder exprimierter zell- fremder Makromoleküle bezüglich eines bestimmten Liganden in situ zu untersuchen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung gepuls- ter, elektrischer Felder zur selektiven Trennung von Stoffen in situ, wobei die Stoffe entweder in einem biologisches Material umgebenden flüssigen Medium oder innerhalb des biologischen Materiales angereichert werden, wobei bei der Erzeugung der gepulsten, elektrischen Felder vorzugsweise Impuls- zahlen von mindestens 15, vorzugsweise von 15 bis 19000, insbesondere 5000 bis 12000, eingesetzt wer- den.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgese- hen, die zu behandelnden Proben auf Matrices, bei- spielsweise Membranen oder Vliese, aufzubringen.

Die Matrices können entweder in direktem Kontakt zu den leitenden Elementen stehen oder beispielsweise über Flüssigkeitszonen von den leitenden Elementen getrennt sein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die zu behandelnden Proben, insbesondere dotierte Matrices oder Flüs- sigkeiten, die das biologische Material beinhalten, nicht in direktem Kontakt mit den leitenden Elemen- ten, beispielsweise des Probenträgersystems, ste- hen. Der Kontakt kann vorteilhafterweise durch Luft unterbrochen werden, beispielsweise dadurch, dass leitende Elemente nicht in die Flüssigkeit einge- taucht werden und/oder durch eine Ummantelung lei- tender Elemente mit nicht leitenden Elementen. Um in den so präparierten Proben insbesondere Feld- stärken von bis zu 200 V/cm zu erreichen, ist es vorteilhaft, an den leitenden Elementen gegebenen- falls höhere Spannungen, auch in Abhängigkeit des Abstandes der leitenden Elemente, einzusetzen. Da bei den elektrischen Trenn-, Desintegrations-be- ziehungsweise Anreicherungsverfahren vorzugsweise gepulste elektrische Felder mit sehr niedrigen Feldstärken eingesetzt werden können oder vorteil- hafterweise kein direkter Kontakt der leitenden E- lemente mit der Probe vorhanden sein muss, wird die Wahl des Lösungsmittels nicht eingeschränkt. Es ist beispielsweise möglich, biologisches Material auch in Lösungen mit hohen spezifischen Leitfähig- keiten aufzuschließen beziehungsweise anzureichern oder zu trennen, ohne dass es zu Funkenentladungen kommen kann. Dies eröffnet insbesondere die Mög- lichkeit, die elektrische Trennung, Anreicherung und/oder Desintegration mit chemischen Verfahren zu kombinieren.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass bestimmte Salze, beispielswei- se chaotrope Salze sowie Detergenzien, Enzyme und andere vor oder während der elektrischen Trennung und/oder Desintegration eingesetzt werden können.

Selbstverständlich ist es auch möglich, eine chemi- sche Nachbehandlung der erhaltenen getrennten oder desintegrierten Proben beziehungsweise Suspensionen durchzuführen. Vorteilhafterweise kann die Kombina- tion einer chemischen Trennung, Anreicherung und/oder Desintegration mit der durch elektrische Felder induzierten oder begleiteten Anreicherung, Trennung und/oder Desintegration nicht nur zu einer einfachen Addition der Effekte führen, sondern auch zu unerwarteten und neuen synergetischen Effekten.

Mit Vorteil können Chemikalien, die die spezifische Leitfähigkeit der extrazellulären Phase der Zell- membran und gegebenenfalls des Zellinneren verän- dern und/oder stabilisieren, eingesetzt werden.

Dies wirkt sich vorteilhafterweise auf die Potenti- aldifferenz über die Zellmembran aus. Dadurch ver- ändert sich beispielsweise die kritische Spannung über die Zellmembran, die notwendig ist, um Poren, diskrete Läsionen und/oder Rupturen in der Zell- membran zu generieren. Außerdem können entsprechen- de Chemikalien, die die Fluidität der Zellmembranen beeinflussen und/oder modifizieren, eingesetzt wer- den. Ahnlich wie bei einer Temperaturerhöhung die Fluidität der Zellmembran beeinflusst wird und sich auf den Wert der kritischen Zellmembranspannung auswirkt, so können Chemikalien vorteilhafterweise ebenfalls die Fluidität der Zellmembran, insbeson- dere die kritische Zellmembranspannung, beeinflus- sen. Somit können Chemikalien und Temperaturände- rungen die Fluidität der Zellmembran beeinflussen, was sich auf den Wert der kritischen Zellspannung auswirkt. Die Chemikalien können gegebenenfalls auch additive, lytische Eigenschaften aufweisen.

Des weiteren kann in vorteilhafter Weise durch den Zusatz von Chemikalien der Abbau von Zellinhalt- stoffen vermindert werden. So kann beispielsweise die chemische Inhibition von Nucleasen und/oder Proteasen bei der Gewinnung von Nucleinsäuren und/oder Proteinen durch einen elektrischen Zell- aufschluss vorteilhaft sein. Aber auch andere Zell- inhaltsstoffe, wie beispielsweise Metabolite, kön- nen so während und nach ihrer Freisetzung durch den elektrischen Zellaufschluss, insbesondere während der Trennung und/oder Desintegration, stabilisiert werden.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung, die ein nicht-leitendes Element sowie mindestens zwei leitende Elemente, insbesondere Elektroden, um- fasst. In einer besonderen Ausführungsform ist vor- gesehen, dass das nicht-leitende Element als Auf- nahmemittel ausgebildet ist und beispielsweise über eine Abdeckung leitende Elemente mit dem Aufnahme- mittel so verbunden werden können, dass die Probe in dem Aufnahmemittel desintegriert werden kann. Es kann jedoch vorteilhafterweise auch vorgesehen sein, dass das Aufnahmemittel ein leitendes Element umfasst. Das leitende Elemente, kann ein nichtlei- tendes Element aufweisen, so dass eine Spannung aufgebaut werden kann, es ist jedoch auch möglich, dass das Aufnahmemittel nur ein erstes leitendes Element umfasst und das zweite leitende Element, in einer Abdeckung für das Aufnahmemittel so ange- bracht ist, dass es wirkverbindbar zu dem als Auf- nahmemittel ausgebildeten ersten leitenden Element positioniert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, ins- besondere ein Probenträgersystem oder eine in situ- Trennvorrichtung, wobei dieses als ein vorzugsweise im wesentlichen kastenförmiges, insbesondere qua- derförmiges, Gehäuse mit einer Bodenplatte, einer Deckplatte, zwei Seitenwänden und zwei als Seiten- wände ausgeführten Elektroden ausgeführt ist. Die Deckplatte weist zumindest eine Öffnung auf, wobei in der Deckplatte und gegebenenfalls in der Boden- platte weitere Öffnungen vorgesehen sein können.

Diese Öffnungen können jeweils mit einem Filter verschlossen sein, der einer Abtrennung des aufge- trennten Stoffes oder Stoffgemisches dient. Die E- lektroden können aus Aluminium, Edelstahl, Kohle, Platin, Gold oder Silber bestehen oder diese allein oder in Kombination enthalten. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Probenträgersystem auch einen Spannungsgenerator, insbesondere eine HVA-Apparatur ("high voltage apparatus"), einen Frequenzgenerator und einen Impulsgeber.

Um bei der elektrischen selektiven Trennung, Sepa- ration und/oder Desintegration einen hohen Proben- durchsatz zu ermöglichen, ist es vorteilhaft, Trennvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, bei denen mehrere Proben auf einmal behandelt werden können. Dies kann beispielsweise durch verschiedene Formate, wie sie auch in bekannten Microtiterplat- tensystemen verwendet werden, vorteilhaft reali- siert werden. Um elektrische Felder zu erzeugen, sind beispielsweise auch neue Arraysysteme vorteil- haft, die beispielsweise aus einem Probenträger und einer Abdeckung bestehen. Leitende und nicht lei- tende Elemente können hierbei vorteilhafterweise durch unterschiedliche Anordnung von leitenden und nicht leitenden Elementen der Probenträger sowie der Abdeckungen aufeinander abgestimmt sein. Bei- spielsweise können bei den Abdeckungen zylindrische Metallstäbe, mit einer zusätzlichen leitenden Plat- te in der Abdeckung des Probenträgers oder am Ende des Metallstabes Verwendung finden. Die Metallstäbe können vorteilhafterweise an ihrem in die Probe ra- genden Ende als Kugel ausgebildet sein. Mit Vorteil kann eine teilweise oder vollständige Isolierung der Metallstäbe beziehungsweise leitenden Elemente der Abdeckplatte der Trennvorrichtung und/oder der gesamten Trennvorrichtung und/oder des Probenträ- gers sinnvoll sein. Trennvorrichtungen für die se- lektive Trennung und Probenträger für die Desinteg- ration können vorteilhafterweise für die Prozesse der Desintegration, Trennung und/oder Isolierung eingesetzt werden. Um elektrische Desintegrations- arrays mit anderen Verfahren kompatibel zu gestal- ten, ist es vorteilhaft, standardisierte Abmessun- gen zu verwenden. Es ist beispielsweise von Vor- teil, ein solches elektrisches Desintegrationsarray oder beispielsweise einen einzelnen Probenträger auf die Abmessungen von probenträgerhaltigen be- kannten PCR Geräten, Fluorimetern, Spektrofotome- tern und ähnlichen anzupassen. Hierbei ist es be- sonders vorteilhaft, transparente Bereiche, bei- spielsweise in den nicht leitenden Elementen, ins- besondere den Bodenplatten, bereitzustellen.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Er- findung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Bei- spiele sowie der dazugehörenden Figuren näher er- läutert.

Die Figuren zeigen : Figur 1 schematisch das der Erfindung zugrunde- liegende Prinzip, Figur 2 eine in situ-Trennvorrichtung mit einer Öffnung in der Deckplatte im Längs- schnitt, Figur 3 eine in situ-Trennvorrichtung mit zwei getrennten Öffnungen in der Deckplatte imLängsschnitt, Figur 4 eine in situ-Trennvorrichtung mit einer Öffnung in der Deckplatte und einer Öffnung in der Bodenplatte, in die ein Filter eingesetzt ist im Längsschnitt, Figur 5 eine in situ-Trennvorrichtung mit zwei Öffnungen in der Deckplatte und einer Öffnung in der Bodenplatte im Längs- schnitt, wobei eine Öffnung in der Deckplatte und die Öffnung in der Bo- denplatte mit einem Filter versehen sind, Figur 6 einen Querschnitt durch die in situ- Trennvorrichtung der Figuren 2 bis 5, Figur 7 einen Querschnitt durch ein Probenträ- gersystem, Figur 8 einen Querschnitt durch das Probenträ- gersystem mit einer Abdeckung, Figur 9 einen Querschnitt durch das Probenträ- gersystem mit einer hydraulischen Ab- dichtung, Figur 10 eine Draufsicht auf einen Chip für die Trennung und/oder Desintegration, Figur 11 einen Längsschnitt durch Probenträger- systeme, Figur 12 einen Querschnitt durch einzelne Pro- benträgersystem, Figur 13 einen Längsschnitt durch Probenträger- systeme, wobei ein Aufnahmemittel lei- tende Elemente umfasst, Figur 14 einen Längsschnitt durch Abdeckungen für Aufnahmemittel, wobei diese leiten- de Elemente umfassen, Figur 15 die Abhängigkeit der Anreicherung eines Stoffes von der Feldstärke, Figuren die Abhängigkeit der Anreicherung eines 16 und 17 Stoffes von der Impulszahl, Figur 18 die Abhängigkeit der Anreicherung eines Stoffes von der Behandlungsdauer und Figur 19 die Abhängigkeit der Anreicherung eines Stoffes von der Trenntemperatur.

Die Figur 1 stellt in einer Prinzipskizze den Ab- lauf des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Darge- stellt ist eine in situ-Trennvorrichtung 12 in zwei Zuständen, wobei sich die in der Figur 1 linke Kam- mer 12 im Ruhezustand befindet, während die in der Figur 1 rechte Trennvorrichtung 12 gepulsten elekt- rischen Feldern E ausgesetzt ist. In der in situ- Trennvorrichtung 12 befindet sich eine Zelle 7 in einem außerhalb der Zelle 7 befindlichen flüssigen Medium 5. Die Zelle 7 setzt sich zusammen aus der intrazellulären Matrix 9, dem innerhalb des biolo- gischen Materials 7 befindlichen flüssigen Medium 10 sowie der Zellwand beziehungsweise Zellmembran 8. Die stationäre Phase des erfindungsgemäßen chro- matographischen Systems wird also durch die Zell- membran 8 und die intrazelluläre Matrix 9 gebildet, während die mobile Phase aus dem innerhalb und au- ßerhalb des biologischen Materials 7 befindlichen flüssigen Medium gebildet wird, wobei sich die Zu- sammensetzung des innerhalb des biologischen Mate- rials befindlichen Medium von der des außerhalb be- findlichen Medium durchaus unterscheiden kann. In- nerhalb des biologischen Materials befinden sich im Ruhezustand vier verschiedene Stoffe S1, S2, S3 und S4, wobei Sl mit der Zellwand 8 fest verbunden ist, während S2, S3 und S4 innerhalb des biologischen Materials 7 frei vorliegen. Die dargestellte Größe der zu trennenden Stoffe S entspricht der Molekül- große der zu trennenden Stoffe. Dargestellt sind ferner auch die beiden Elektroden 11 der in situ- Trennvorrichtung 12.

Nachdem die Zellen 7 in einem geeigneten flüssigen Medium 5 in die in situ-Trennvorrichtung 12 über- führt wurden, werden durch den Einfluss gepulster, elektrischer Felder E Poren 6 in der Zellmembran oder Zellwand 8 der Zellen 7 generiert (rechte Kam- mer). Die Feldstärke E wird dabei aus dem Quotien- ten aus angelegter Spannung und dem Abstand der E- lektroden 11 in der in situ-Trennvorrichtung 12 be- stimmt. Die Lebensdauer, Anzahl und Größe der Poren 6 hängt unter anderem von den Eigenschaften der biologischen Zelle 7, deren Größe, Form, Struktur, der Orientierung der Zelle 7 im elektrischen Feld, den gepulsten elektrischen Feldern selbst, das heißt der Feldstärke, der Impulszahl, der Behand- lungsdauer der Impulsfrequenz, der Zeitkonstante, der Impulsdauer, der Impulsform, der Behandlungs- temperatur, der Zusammensetzung des flüssigen Medi- ums 5, insbesondere dem pH-Wert, der Ionenstärke, der Leitfähigkeit, der Ionenart, der Osmolarität, der Konzentration des biologischen Materials sowie gegebenenfalls zugesetzter additiver Detergenzien, Chaotrope, Komplexbildner oder organischer Lösungs- mittel ab. Die chromatographische Trennleistung des erfindungsgemäßen Verfahrens selbst ist abhängig von den Eigenschaften und den daraus resultierenden Wechselwirkungen der zu trennenden Stoffe S1, S2, S3, S4 sowie der stationären und der mobilen Phase.

Zudem ist die relative Bewegung von stationärer und mobiler Phase zueinander für die Trennleistung des erfindungsgemäßen Verfahrens verantwortlich.

Die Eigenschaften der zu trennenden Stoffe Sl, S2, S3, S4 und der stationären und mobilen Phase bezüg- lich ihrer Fähigkeit, elektrostatische, hydrophobe, aromatische Wechselwirkungen und H-Brückenbindungen einzugehen, hängt von der Zusammensetzung des flüs- sigen Mediums 5 ab. Ebenso wirken sich die Behand- lungstemperatur und die Eigenschaften des verwende- ten elektrischen Feldes E aus. Die Größe der zu trennenden Stoffe Sl bis S4 ist in der Regel von diesen Faktoren unabhängig. Das erfindungsgemäße Verfahren setzt daher sämtliche Wechselwirkungen der gängigen chromatographischen Verfahren wie Gel- permeations-, Ionentauscher-, Affinitäts-und hyd- rophobe Interaktionschromatographie für die Tren- nung ein.

Von Bedeutung für die relative Bewegung von statio- närer gegenüber mobiler Phase ist die Zusammenset- zung des innerhalb des biologischen Materials 7 und des außerhalb des biologischen Materials 7 befind- lichen flüssigen Mediums hinsichtlich osmotischer und Diffusions-kontrollierter Prozesse. Die Erfin- dung nutzt zudem zusätzlich elektrophoretische Ef- fekte aus, die durch das Anlegen des elektrischen Feldes auftreten.

Die vorstehend beschriebenen Parameter beeinflussen die Geschwindigkeitskonstante k+ des Obergangs der Stoffe Sl bis S4 vom biologischen Material 7 in den außerhalb des biologischen Materials 7 befindlichen Bereich des flüssigen Mediums 5. Das gleiche gilt für die Geschwindigkeitskonstante k des Ubergangs der Stoffe S1 bis S4 vom außerhalb des biologischen Materials 7 befindlichen flüssigen Medium 5 in den Bereich innerhalb des biologischen Materials 7. Ist die Lebensdauer der Poren 6 ausreichend, um einen Gleichgewichtszustand zuzulassen, ergibt sich aus dem Quotienten von k ; und k-eine Gleichgewichts- verteilung K. Liegt die Lebensdauer der Poren 6 un- terhalb der Dauer der Einstellung des Gleichge- wichtszustandes, liegt eine apparente Gleichge- wichtskonstante Kapp vor. Die erfindungsgemäße Ver- fahrensweise trifft auf beide Fallgestaltungen zu.

Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften der Stoffe S1 bis S4 ergeben sich verschiedene Vertei- lungskonstanten, so dass sich entsprechend dieser Verteilungskonstanten die Konzentrationsverhältnis- se der Stoffe Sl bis S4 im Bereich innerhalb des biologischen Materials 7 und außerhalb des biologi- schen Materials 7 ändern. Erfindungsgemäß wird dies zur Trennung der Stoffe Sl bis S4 voneinander und von den restlichen, nicht dargestellten Stoffen so- wie dem biologischen Material 7 ausgenutzt.

Der Figur 1 kann entnommen werden, dass bei den Stoffen S1, S3 und S4 im Vergleich zu Stoff S2 der Stoffaustausch über die induzierten Poren 6 in der Membran 8 nicht durch ihre Größe oder Form limi- tiert ist. Erfindungsgemäß werden der Porendurch- messer und deren Lebensdauer, welche durch die in- dividuell einzustellenden Versuchsbedingungen defi- niert sind, als Molekularsieb ausgenutzt. Abgesehen von der Größe und Form unterscheiden sich Stoffe jedoch auch in anderen Eigenschaften, so dass mit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise neben der Trennung nach Größe und Form andere Stoffeigen- schaften ausgenutzt werden. So ist S1 mit der in- trazellulären Matrix 9, beispielsweise am Zellske- lett oder einer Organelle etc., assoziiert. Dieser Stoff kann daher nicht in den Bereich außerhalb des biologischen Materials 7 gelangen. Daraus folgt, dass k+1, K1 und damit die Konzentration außerhalb des biologischen Materials 7 [Sl] e = 0 gesetzt wer- den muss. S3 und S4 sind nicht mit der intrazellu- lären Matrix 9 assoziiert, liegen also löslich vor.

Sie besitzen jedoch unterschiedliche Eigenschaften, beispielsweise bezüglich ihrer Polarisierbarkeit, Hydrophobizität, Aromatizität und Elektrostatik. Unter der Annahme folgender Verhältnisse der Ver- teilungskonstanten der Stoffe : K1 = 0 < K2 < K3 < K4 ergibt sich bei jeweils der gleichen intrazellulä- ren Ausgangskonzentration ([Sl] ia = [S2] ia = [S3] ia = [S4] ia) und einer extrazellulären Ausgangskonzent- ration von jeweils Null, folgende intrazelluläre Konzentrationsverteilung nach der Behandlung : [Sllib = [sl] ia > [S2] ib > [S3] ib > [S4] ib und damit folgende extrazelluläre Konzentrations- verteilung : [Sl] eb = ° < [S2] eb < [S3] eb < [S4] eb Diese Konzentrationsänderungen werden erfindungsge- mäß zur Abtrennung der Stoffe S2 bis S4 von S1, das heißt der selektiven Auftrennung, eingesetzt. Durch geeignete Wahl der Auftrennparameter können auch S2 bis S4 voneinander getrennt werden, ohne dass ein Zellaufschluss und eine nachfolgende Reinigung not- wendig sind.

Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens auch mög- lich, Stoffe aus dem flüssigen Medium außerhalb des biologischen Materials 7 voneinander zu trennen, indem selektiv eine Auswahl dieser Stoffe innerhalb des biologischen Materials 7 angereichert wird und somit eine Entreicherung dieses Stoffes oder der Stoffe und eine Anreicherung eines anderen Stoffes oder anderer Stoffe im außerhalb des biologischen Materials 7 befindlichen Medium 5 stattfindet.

Nach dem Einsatz des gepulsten elektrischen Feldes E wird das biologische Material 7, das heißt die stationäre Phase, zusammen mit dem in der stationä- ren Phase befindlichen flüssigen Medium von dem au- ßerhalb des biologischen Materials 7 befindlichen flüssigen Medium, beispielsweise mittels Zentrifu- gation oder Filtration, abgetrennt. Man erhält auf diese Weise ein von S1 abgetrenntes Gemisch aus S2, S3 und S4 außerhalb des biologischen Materials 7.

Die Figuren 2 bis 6 stellen Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen in situ- Trennverfahrens dar, also Probenträgersysteme be- ziehungsweise in situ-Trennvorrichtungen 12. Die Figuren zeigen jeweils die Anordnung der beiden E- lektroden 11 mit deren Anschlüssen 17 und den E- lektrodenabstand 18. Die eingesetzten Spannungs-, Frequenz-und Impulsgeneratoren beziehungsweise -geber sind nicht dargestellt.

Der Elektrodenabstand 18 in der Trennvorrichtung 12 betrug 4 mm, das Elektrodenmaterial bestand aus A- luminium, die Kondensatorkapazität C betrug ca.

1,65 nF, der Widerstand der Behandlungszelle mit einer E. coli-Suspension und der eingesetzten HVA- Apparatur circa 2040 Ohm, die Zeitkonstante circa 3,4 us und die Impulsform war als exponentielle Ab- nahme ausgeführt.

Die verwendete exponentiell abnehmende Impulsform wurde durch eine Kondensatorentladung erzeugt. Das elektrische Laden der Kondensatoren erfolgte hier- bei mit einem niedrigeren Strom über einen längeren Zeitraum und mit entgegengesetzter, aber immer gleicher Stromrichtung, im Gegensatz zur elektri- schen Entladung der Kondensatoren. Diese elektri- schen Entladungen erzeugten Gleichspannungs- Impulse, die für das Trennverfahren ausschlaggebend waren. Die Impulsdauer wird bei exponentiell abneh- menden Impulsformen durch die Zeitkonstante (T) <BR> <BR> <BR> ausgedrückt : T = C R (C : Kondensatorkapazität ; R : Widerstand).

Neben der exponentiell abnehmenden Impulsform kön- nen beispielsweise auch Rechteckimpulse, Dreieckim- pulse oder sinusförmige Impulse eingesetzt werden.

Es ist außerdem möglich, dass die Spannung eines Impulses in sich, beispielsweise sinusförmig, schwankt. Des weiteren ist eine ständige Umpolung der aufeinanderfolgenden Impulse denkbar, so dass Wechselspannungs-Impulse appliziert werden.

Die Figur 2 zeigt eine in situ-Trennvorrichtung 12 mit einer Öffnung 15 in der Deckplatte 13, die zur Probeneingabe und zur Probenentnahme dient. Die Trennvorrichtung 12 ist in der Form eines Quaders ausgebildet, wobei Bodenplatte 14 und Deckplatte 13 des Quaders als nicht-leitende Elemente und zwei Seitenwände als Elektroden 11 ausgeführt sind. Die zwei anderen Seitenwände 28 und 29 (Figur 6) sind aus nicht-leitendem Material. Die Probe wird demge- mäss in die in situ-Trennvorrichtung 12 überführt und mit gepulsten elektrischen Feldern E behandelt.

Bei dieser Vorgehensweise wird die Probe nach ihrer Behandlung zentrifugiert, um das außerhalb des bio- logischen Materials 7 befindliche Medium vom Medium in dem biologischen Material und dem biologischen Material selbst zu trennen. Erfindungsgemäß kann dies bei entsprechender Abmessung der in situ- Trennvorrichtung 12 direkt mit der in situ- Trennvorrichtung 12 selbst erfolgen. Der Überstand mit dem oder den gewünschten Stoffen wird dann ab- genommen. Die Zentrifugation der Probe kann, nach der Behandlung mit gepulsten elektrischen Feldern E, auch separat erfolgen.

Die Figur 3 stellt im wesentlichen die gleiche Trennvorrichtung 12 wie in Figur 2 dargestellt dar, wobei jedoch in der Deckplatte 13 zwei Öffnungen 20 und 21 vorgesehen sind. Eine Öffnung 20 dient für die Probeneingabe, während die andere Öffnung 21 für die Probenentnahme genutzt wird. Dadurch wird ein kontinuierlicher Trennprozess möglich. Zudem kann jeweils eine der Öffnungen 20 oder 21 für ei- nen gegebenenfalls erforderlichen Druckausgleich dienen.

Die Figur 4 stellt eine in situ-Trennvorrichtung 12 mit einer Öffnung 15 in der Deckplatte 13 und einer Öffnung 22 in der Bodenplatte 14 dar, wobei in der Öffnung 22 ein Filter 23 angeordnet ist. Die Probe wird durch die Öffnung 15 in der Deckplatte 13 in die Kammer 12 gegeben. Nach Einsatz des gepulsten elektrischen Feldes E wird das außerhalb des biolo- gischen Materials 7 befindliche flüssige Medium ü- ber den Filter 23 und die Öffnung 22 in der Boden- platte entfernt. Mit dem Filter 23 ist es möglich, die biologischen Zellen und somit das in diesen Zellen befindliche Medium zurückzuhalten, wobei ei- ne kontinuierliche Trennvorrichtung ohne Zentrifu- gation und damit ein besonders schnelles und effi- zientes Auftrennverfahren möglich wird.

Die Figur 5 stellt im wesentlichen die bereits in Figur 4 dargestellte in situ-Trennvorrichtung 12 dar, wobei in der Deckplatte 13 jedoch zwei Öffnun- gen 24,25 vorgesehen sind, wobei in der Öffnung 25 ein Filter 26 eingesetzt und die Öffnung 24 mit ei- nem Deckel 50 verschließbar ist. Die dargestellte Trennvorrichtung 12 ermöglicht die kontinuierliche Zuführung extrazellulären Mediums über die Öffnung 25 mit dem Filter 26, wobei kein Probenmaterial in die Kammer 12 eingeführt wird. Die Probe kann viel- mehr separat über die verschließbare Öffnung 24 zu- gegeben werden. Das flüssige Medium wird über einen Filter 23, der in der Öffnung 22 eingebracht ist, entfernt.

Die Figur 6 stellt einen Querschnitt durch die Kam- mern der Figuren 2 bis 5 dar, wobei der Abstand 27 zwischen den Seitenwänden 28 und 29 erkennbar ist.

Figur 7 zeig eine als Probenträgersystem 31 ausge- bildete in situ-Trennvorrichtung 12, die insbesond- re für die Desintegration genutzt werden kann. Das Probenträgersystem umfasst mindestens zwei leitende Elemente, beispielsweise Elektroden 11, die paral- lel zueinander angeordnete Flächen ausbilden, die als eine Grundfläche, beispielsweise eine Boden- platte 14, und eine Deckplatte 13 ausgeführt sind.

Auf der Bodenplatte 14 befinden sich mindestens vier senkrecht angeordnete Seitenwände 28 und 29, die zusammen mit der Boden-und Deckplatte 13,14 Kammern ausbilden, in denen das zu behandelnde Ma- terial gelagert werden kann. Der Elektrodenabstand 18 kann variiert werden, so dass die Deckplatte 13 die Probe verschließt oder zumindest mit der Probe in Kontakt kommt, wodurch eine elektrische Spannung zwischen der Deckplatte 13, die zusätzlich eine in das Probemedium ragende Ausbuchtung aufweisen kann, und der Bodenplatte 14 über die in flüssigem Medium vorliegende Probe erzeugt werden kann. Das Proben- trägersystem 31 kann an die Gegebenheiten des zu untersuchenden biologischen Materials und an seine Abmessungen angepasst werden. Dies schließt Größen- ordnungen des Bereichs der Microsystemtechnik und Chiptechnologie als auch die derzeit gängigen Trä- gersysteme, die in Labors verwendet werden, ein.

Das Probenträgersystem 31 ist-wie die in situ- Trennvorrichtung 12-aus leitenden Elementen, den Elektroden 11 und nicht leitenden Elementen, wie beispielsweise den Seitenwänden 28 und 29 aufge- baut. Die Geometrie des Probenträgersystems kann so gewählt werden, dass gegebenenfalls sowohl homoge- ne, als auch inhomogene elektrische Felder erzeugt werden können. Die Applikation der elektrischen Felder erfolgt über Spannungs-, Frequenz-und Im- pulsgeneratoren, die entsprechend mit den leitenden Elementen, wie den Elektroden 11, der Probenträger- systeme 31, verbunden sind. In Anlehnung an Mic- roplattensysteme, mit denen definierte Schichtdi- cken erzeugt werden können, ist es vorteilhaft, e- lektronische Desintegrationsarrays mit definierten Elektrodenabständen 18 so zu konzipieren, dass die Bildung von Blasen, welche das elektrische Feld be- einflussen können, verhindert werden kann. Hierbei ist es beispielsweise besonders vorteilhaft, konve- xe Ausbuchtungen 33 in die leitenden Bereiche, wie die Elektroden 11, der Abdeckung 35 zu integrieren.

Die Blasenbildung wird so weitestgehend vermieden, da beim Absenken der Abdeckung 35 das flüssige Me- dium 5 zur Seite verdrängt wird und seitlich run- terlaufen kann. Voraussetzung hierfür ist bei- spielsweise die Verwendung von Probenvolumina, die größer als das Volumen des Probenträgernäpfchens 37 sind. Aufgrund der Oberflächenspannung bildet sich ein konvexer Meniskus aus, der dann blasenfrei ver- drängt werden kann. Um bei diesem Vorgang eine Querkontamination zu verhindern, ist es beispiels- weise vorteilhaft, Querkontaminationsbarrieren 39 so anzubringen, dass das flüssige Medium 5 bei- spielsweise beim Absenken der Abdeckung 35 nicht die benachbarten Probenträgernäpfchen 37 kontami- nieren kann.

Die Figur 8 zeigt ein Probenträgersystem 31, bei dem es möglich ist, auch mit Probenvolumina, die geringer als die Volumina des Probenträgernäpfchens 37 sind, definierte Elektrodenabstände 18 zu erhal- ten. Die Blasenbildung kann verhindert werden, in- dem entsprechend geformte Ausbuchtungen 33 in die leitenden Bereiche der Abdeckung 35 integriert sind. Beispielsweise kann eine konvex geformte Spitze der Ausbuchtung 33 vorteilhaft sein, um die Bildung von Blasen zu vermindern, aber beispiels- weise auch um bestimmte Formen elektrischer Felder zu erzeugen. Ausbuchtungen 41 mit konkav geformter Spitze sind vorzugsweise mit einem Kanal 43 verse- hen, damit mögliche Blasen entweichen können. Das Absenken der Abdeckung 35 führt dazu, dass die Pro- be in dem flüssigen Medium 5 durch die Ausbuchtun- gen 33 im Probenträgernäpfchen 37 seitlich ver- drängt werden. Sollte es zum Überlaufen kommen, bieten die Querkontaminationsbarrieren 39 Schutz vor Querkontaminationen. Des weiteren kann es vor- teilhaft sein, Hohlräume 45 zur Thermostatisierung der Probenträgersysteme 31 zu integrieren. Die Hohlräume 45 können durch die Seitenwände 28 und 29 sowie durch die Elektroden 11 und eine Verschluss- platte 47 gebildet werden. Über entsprechende An- schlüsse können thermostatisierte Flüssigkeiten für definierte Behandlungstemperaturen sorgen. Es ist vorteilhafterweise ebenfalls möglich, nicht leiten- de oder vorzugsweise leitende Elemente direkt an eine Thermostatisierung zu koppeln.

Die Figur 9 zeigt ein Probenträgersystem 31 mit ei- nem hydraulischen System 49. Um einen bestimmten Druck aufbauen zu können, der einen vorteilhaften Einfluss auf die elektrische Desintegration ausüben kann oder einen Druck aufzubauen, um beispielsweise in wässrigen Lösungen über 100°C zu arbeiten, ist es beispielsweise vorteilhaft, mit hydraulischen Systemen 49 zu arbeiten, die die Abdeckung 35 auf die Probenträgernäpfchen 37 pressen. Es sind jedoch auch Schraubensysteme möglich, um das Probenträger- system 31 abzudecken. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn die Ausbuchtungen 33 der Abdeckung 35 exakt beziehungsweise nahezu exakt in die Probenträger- näpfchen 37 des Probenträgersystems 31 passen, so dass ein geschlossenes System entsteht. Hierbei sind beispielsweise Führungen 50 beispielsweise am oberen Rand des Probennäpfchenträgers 37 vorteil- haft. Statt einem externen hydraulischen oder schraubenartigen System, kann ein solches System auch direkt mit dem Probenträgersystem 31 oder mit der Abdeckung 35 kombiniert sein, wie das in Figur 9b dargestellt ist.

Figur 10 zeigt eine Chip 51 für die elektrische Desintegration oder Trennung von beispielsweise Zellen. Der Chip 51 kann so aufgebaut sein, dass in seine Grundfläche 53, die einige Quadratmillimeter aber auch Quadratzentimeter groß sein kann, eine Matrix von Aufschlusseinheiten 55 integriert sein kann.

Die Aufschlusseinheiten 55 können aus leitenden E- lementen 57 und nicht leitenden Elementen 59 aufge- baut sein, in deren Zentrum ein Innenraum 61 für die Probenapplikation vorgesehen ist. Neben der ei- gentlichen elektrischen Desintegration und/oder Trennung von Zellen können auf den Chips 51 bei- spielsweise auch andere Verfahren, wie die Hybridi- sierung durchgeführt werden. Die Innenräume 61 bil- denden leitenden Elemente 57 und nicht leitenden Elemente 59 müssen jedoch nicht als Matrix vorlie- gen, sie können auch als einzelne Probenträgersys- teme 31 konzipiert sein. Für die Desintegration ist es vorteilhaft, wenn die leitenden Elemente 57 durch nicht leitende Elemente 59 voneinander ge- trennt sind. Die leitenden Elemente 57 können je- doch auch an Positionen, wo sie in Kontakt mit dem flüssigen Medium 5 kommen, mit einer nicht leiten- den Schicht überzogen sein. Die Abmessungen bezüg- lich der Höhe, sowie innere und äußere Abmessungen, sind variabel. Ebenfalls variabel sind die Ausdeh- nungen der leitenden Elemente 57 und der nicht lei- tenden Elemente 59. Neben kreisförmigen oder quad- ratischen Ausgestaltungen des horizontalen Quer- schnitts des Innenraums 61 des Probenträgersystems 31 sind selbstverständlich auch andere, beispiels- weise ovale, rechteckige, dreieckige geometrische Querschnitte denkbar. Wobei kreisförmige bezie- hungsweise ovale oder ellipsoide Formen inhomogene elektrische Felder ausbilden, bei denen die elekt- rische Feldliniendichte lokal erhöht ist, daher sind diese Ausgestaltungen vorteilhaft einzusetzen.

Wird Drehstrom zur Desintegration verwendet, müssen leitende Elemente 57 für drei Phasen vorhanden sein. Dies kann beispielsweise durch einen hexago- nischen horizontalen Querschnitt mit leitenden und nicht leitenden Elementen erzielt werden. Bei den vorstehend genannten Ausführungsformen kann es vor- teilhaft sein, Verschlussdeckel, beispielsweise Schnappverschlussdeckel zu integrieren, um das Ri- siko einer Querkontamination zusätzlich zu vermin- dern. Drehverschlüsse, die gegebenenfalls mit 0- Ringen versehen sind, sind selbstverständlich eben- falls vorteilhaft einsetzbar.

Figur 11 zeigt einen Längsschnitt durch Probenträ- gersysteme 31. Die Probenträgersysteme sind als be- hälterartige Aufnahmemittel 60 ausgestaltet. Figur lla zeigt ein im Querschnitt rechteckig ausgebilde- tes Aufnahmemittel 60. Bei diesem Aufnahmemittel 60 sind die Seitenwände 28 und 29 nahezu parallel zu- einander ausgerichtet oder als sich zum Boden hin verjüngender Kegelstumpf. Die Seitenwände 28 und 29 sind als leitende Elemente 57 ausgebildet. Die Ver- schlussplatte 61, die das Aufnahmemittel 60 nach unten abdichtet, ist als nicht-leitendes Element ausgebildet. Figur llb zeigt ein Aufnahmemittel 60, welches eine Abdeckung 35 aufweist. Das Aufnahme- mittel 60 zeigt eine sich zum Boden hin verjüngende kegelstumpfartige Form. Die Seitenwände 28 und 29 sind als leitende Elemente 57 ausgebildet. Die Ver- schlussplatte 61 besitzt im Querschnitt eine nahezu halbrunde Form. Die Abschlussplatte 61 ist als nicht leitendes Element 59 ausgebildet. Die Abde- ckung 35 besitzt ein Scharnier 63, das Abdeckung 35 und Aufnahmemittel 60 verbindet. Die Abdeckung 35 weist weiterhin eine Abdichtung 65 auf, die als in- nerer umlaufender Wall auf der dem Aufnahmemittel zugewandten Seite ausgebildet ist. Der Durchmesser des umlaufenden Walls der Abdichtung 65 ist so ge- wählt, dass er die Innenflächen 67 des Aufnahmemit- tels 60 so verschließt, dass nur sehr wenig bezie- hungsweise kein Material entweichen kann. Da das Aufnahmemittel 60 kegelstumpfartig zum Boden hin verjüngend ausgebildet ist, muss die Abdichtung 65 -wie in Figur llb dargestellt-einen ähnlichen Winkel aufweisen, um einen optimalen Verschluss zu gewährleisten.

Figur 12 zeigt einen Querschnitt durch einzelne Probenträgersysteme 31. Die Probenträgersysteme 31 weisen im Querschnitt leitende Elemente 57 und nicht-leitende Elemente 59 jeweils abwechselnd auf.

Figur 12a zeigt ein Aufnahmemittel 60 mit einem runden Querschnitt. Die leitenden Elemente 57 und die nicht-leitenden Elemente 59 sind gegenüberlie- gend angeordnet. Figur 12b zeigt ein Probenträger- system 31 mit einem quadratischen Querschnitt. Die jeweils gegenüberliegenden Seiten bilden jeweils die nicht-leitenden Elemente 60 und jeweils die leitenden Elemente 57. Figur 12c zeigt ein Proben- trägersystem 31 mit einem hexagonalen horizontalen Querschnitt. Das dargestellte Probenträgersystem 31 eignet sich für die Verwendung von Drehstrom. Die leitenden Elemente 57 wechseln sich mit den nicht- leitenden Elementen 60 randumlaufend ab. Die Anord- nung der leitenden Elemente 57 erfolgt dabei so, dass die Phase 1 69 sich gegenüberliegt. Die Phasen 2 71 und die Phasen 3 73 sind ebenfalls so angeord- net, dass sie gegenüberliegend ausgebildet sind.

Die leitenden Elemente 57 können so ausgebildet sein, dass sie in die Wandung 75 eingelassen sind, oder die Wandung 75 bilden, wobei in der Wandung 75 nicht-leitende Elemente 69 alternierend angeordnet sind.

Figur 13 zeigt einen Längsschnitt durch Probenträ- gersysteme, wobei Aufnahmemittel leitende Elemente umfassen. Die Figuren 13a bis 13d zeigen Quer- schnitte von Probenträgersystemen 31, bei denen je- weils das gesamte Aufnahmemittel 60 als leitendes Element 57 ausgebildet ist beziehungsweise mindes- tens ein leitendes Element 57 pro Aufnahmemittel 60 aufweist. Die im Längsschnitt dargestellten Aufnah- memittel 60 können beispielsweise einen Ausschnitt aus einem modifizierten Mikroplattensystem darstel- len. Die einzelnen Vertiefungen des Mikroplatten- systems, beispielhaft in der Figur 13 als Aufnahme- mittel 60 dargestellt, haben jeweils die Seitenwän- de 28 und 29 beziehungsweise die Verschlussplatten 61 als leitende Elemente 57 beziehungsweise nicht- leitende Elemente 59 ausgebildet. Figur 13a zeigt ein Probenträgersystem 31 aus mehreren aneinander- geordneten Aufnahmemitteln 60 und einer Abdeckung 35. Die Aufnahmemittel 60 sind durchgängig als lei- tendes Element 57 ausgebildet. In die Abdeckung 35, die als nicht-leitendes Element 59 ausgeführt ist, sind leitende Elemente 57 in Form von Stäben 77 so angebracht, dass die Stäbe 77 die Abdeckung 35 senkrecht durchdringen und in die Aufnahmemittel 60 hineinragen. Figur 13b zeigt einen vertikalen Quer- schnitt durch ein Probenträgersystem 31, bei dem das Aufnahmemittel 60 nicht durchgängig als leiten- des Element 57 ausgebildet ist. Die Probenträger- näpfchen 37 sind durch nicht-leitende Stege 79 ver- bunden. Figur 13b zeigt weiterhin, dass die als leitende Elemente 57 ausgebildeten Probenträger- näpfchen 37 an der Innenseite mit einer Schicht 81 isoliert sein können. Diese Schicht 81 kann an den Innenwänden der Seitenwände 28 oder 29 beziehungs- weise an der Verschlussplatte 61 auf der Seite an- gebracht sein, die in das Probenträgernäpfchen 37 weist. Die Ausbildung des leitenden Elementes 57 kann auch in Form einer leitenden Membran 83 erfol- gen. Die leitende Membran 83 bildet den Abschluss des Aufnahmemittels 60 beispielsweise in Form der Verschlussplatte 61. Die Figur 13c zeigt Aufnahme- mittel 60, die mit Ausnahme der Verschlussplatte 61 als nicht-leitende Elemente 59 ausgeführt sind ; die Verschlussplatte 61 ist als leitendes Element 57 ausgebildet. Die Verschlussplatte 61 kann eben, konkav oder konvex angeordnet sein. Figur 13d zeigt ein Probenträgersystem 31, bei dem jeweils die Sei- tenwände 28,29 die leitenden Elemente 57 bilden.

Der Boden der jeweiligen Probennäpfchen 37 ist e- benso wie die Stege 79 als nicht-leitendes Element 59 ausgebildet ; die Verschlussplatte 61 kann auch als nicht-leitende Membran 85 ausgeführt sein.

Durch diese Form der Anordnung sind leitende Ele- mente 57 und nicht-leitende Elemente 59 jeweils ab- wechselnd in dem Probenträgersystem 31 positio- niert. Eine in den Probenträgernäpfchen 37 befind- liche biologische Probe könnte durch die als lei- tende Elemente 57 ausgebildeten Seitenwände 28,29 desintegriert werden. Der dargestellte vertikale Querschnitt kann ein Ausschnitt aus einem modifi- zierten Microplattensystem sein.

Figur 14 zeigt einen Längsschnitt durch Abdeckungen 35, die leitende Elemente 57 umfassen. Die leiten- den Elemente 57 sind jeweils senkrecht in die Abde- ckung 35 eingebracht. Die leitenden Elemente 57 sind hierbei als Stäbe 77 ausgebildet. Die Stäbe 77 durchdringen die Abdeckung 35 senkrecht. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die Abdeckun- gen 35 als Deckel für Microplatten zum Einsatz kom- men oder für modifizierte Microplatten, wie sie in Figur 13 ausschnittsweise dargestellt sind. Die Stäbe 77, die als leitenden Elemente 57 ausgeführt sind, werden jeweils in den Abdeckungen so ange- bracht, dass ihr längeres Ende in Richtung der mög- lichen Aufnahmemittel 60 weist. Das in die Lösung ragende Ende der Stäbe 77 kann kugelförmig oder beispielsweise als T-Form ausgebildet sein. T- förmig heißt hierbei, dass an das in die Probe rag- bare Ende des Stabes 77 beispielsweise im Winkel von 90° ein Querstab angebracht ist, der eine ge- ringere Länge als der Stab 77 hat. Figur 14a zeigt den Ausschnitt aus einer Abdeckung 35, in die Stäbe 77 eingebracht sind. Die als zylindrische Metall- stäbe ausgebildeten Stäbe 77 weisen in der Abde- ckung 35 zusätzlich leitende Platten 87 auf. Die Stäbe 77 können in dem in die Probe weisenden Teil von einer Isolierung 89 umschlossen sein. Die Iso- lierung 89 ist hierbei so angebracht, dass sie die leitende Platte 87 ebenfalls auf der zu dem Aufnah- memittel 60 weisenden Seite isoliert ist. Figur 14b zeigt leitende Elemente 57, die über nicht-leitende Elemente 59 miteinander verbunden sind und Teil ei- ner Abdeckung 35, beispielsweise für Aufnahmemittel 60, sein können. Die leitenden Elemente 57 sind als Stäbe 77, beispielsweise in Form von im Querschnitt runden Metallstäben, ausgebildet. Der horizontale Querschnitt dieser Metallstäbe kann jedoch auch rechteckig oder polygon sein. Die als Metallstäbe ausgebildeten Stäbe 77 weisen zu ihrem unteren, in Richtung der Aufnahmemittel 60 weisenden, Ende T- förmige Endigungen 91 auf. Figur 14c zeigt den in Abbildung 14b dargestellten Verbund aus leitenden Elementen 57 und nicht-leitenden Elementen 59, wo- bei die leitenden Elemente 57 zum Teil eine Isolie- rung 89 aufweisen. Die Isolierung 89 umschließt die Stäbe 77 so, dass auf der nach oben gerichteten Seite die Stäbe 77 aus der Isolierung 89 herausra- gen und in der nach unten gerichteten Seite die T- förmige Endigung 91 frei liegt, also nicht von ei- ner Isolierung 89 umschlossen ist. Weiterhin weist der in Abbildung 14c dargestellte Verbund, bei- spielsweise als Teil einer Abdeckung 35, keine lei- tende Platte 57 auf. Abbildung 14c zeigt eine Abde- ckung 35, in die Stäbe 77 und leitende Platten 87 eingelassen sind. Die beispielsweise als zylindri- sche Metallstäbe ausgebildeten Stäbe 77 weisen an ihrem unteren längeren Ende Kugeln 93 auf, das heißt, der in das Aufnahmemittel 60 ragende Teil der Stäbe 77 endet in einer kugelförmigen Ausbil- dung. Die Kugeln 93 können bei allen Stäben 77 den gleichen Durchmesser oder aber unterschiedliche Durchmesser aufweisen. Die in Figur 14 dargestell- ten Verbünde aus leitenden Elementen 57 und nicht- leitenden Elementen 59 können Teil einer Abdeckung 35 sein. Diese Abdeckung 35 kann beispielsweise im Stand der Technik bekannte Microplatten abdecken, wobei für die Desintegration pro Well mindestens zwei leitende Elemente 57 wirkverbunden sein müs- sen. Es ist jedoch auch möglich, dass mit den in Figur 14 dargestellten leitenden Elementen 57 und nicht-leitenden Elementen 59 sowie der leitenden Platte 87 Probenträgersystem 31, wie in Figur 13b, 13c oder 13d dargestellt, abgedeckt werden. Das Aufbringen der Abdeckung 35 auf ein Probenträger- system 31 kann dabei so erfolgen, dass jeder ein- zelne in der Abdeckung 35 ausgebildete Stab 77 in ein einziges Aufnahmemittel 60, beispielsweise ein Probenträgernäpfchen 37, hineinragt. Probenträger- näpfchen 37 und leitende Elemente 47 wären in die- sem Falle wirkverbindbar angeordnet. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, die Abdeckplatte 35 mit dem in ihr angeordneten Stäben 77 so einzusetzen, dass jeweils mehrere Stäbe 77 in ein und demselben Pro- benträgernäpfchen 37 wirkverbindbar angeordnet sind. Die Desintegration mittels elektrischer Span- nung könnte hierbei zwischen den einzelnen Stäben 77 stattfinden.

Beispiel : DNA-und Proteinauftrennung in E. coli In einer Trennvorrichtung 12 gemäß Figur 2 wurde eine E. coli-Zellsuspension mit einer Zellkonzent- ration zwischen ein-bis zehnmal 109 KBE/ml (kolonienbildende Einheiten) E. coli-Stamm DH5a (mit dem pETllb High Copy Plasmid und MIF-Insert, Macrophage Migration Inhibitory Factor) mit gepuls- ten elektrischen Feldern behandelt. Die E. coli- Zellen befanden sich in PBS/EDTA-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4.

Ein Aliquot der Zellsuspension von 300 ul wurde in die in situ-Trennvorrichtung 12 pipettiert. Als Ne- gativkontrolle wurde das gleiche Volumen der Zell- suspension in einem Reaktionsgefäß unter entspre- chenden Bedingungen inkubiert. Nach der Behandlung mit den gepulsten elektrischen Feldern (vergleiche nachstehende Parametervariationen) wurde die Tempe- ratur der Zellsuspension bestimmt. Anschließend wurde die behandelte Zellsuspension gemischt und aus der Probenkammer abpipettiert. Daran schloss sich eine Zentrifugation von einer Minute mit 13000 rpm (16060 g) bei 4°C an, wobei sowohl die mit ge- pulsten elektrischen Feldern als auch die Negativ- kontrolle zentrifugiert wurde. Anschließend wurde der Oberstand, das heißt der Rohextrakt, abgenommen und untersucht. Dieser Rohextrakt beinhaltet die aus den Zellen freigesetzten Inhaltsstoffe und spiegelt somit die extrazelluläre Konzentration dieser Substanzen wieder.

Die DNA-Konzentration der Rohextrakte wurde in Mic- rotiterplatten mit dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR- Green I (Molecular Probes) über eine Geldokumenta- tionsanlage bestimmt. Hierzu wurden 50 ul einer DNA-Eichreihe (0,3 bis 5 ug/ml) in wässriger Lösung beziehungsweise die jeweiligen Rohextrakte mit 200 ul 5000-fach in 10 mM Tris/HCl ; 1 mM EDTA-Lösung, pH 7,5 verdünntem SYBR-Green I vermengt. Nach fünf Minuten wurde die Fluoreszenz der Proben bei Anre- gungen von 254 und 365 nm über die Pixeldichte be- stimmt. Hierzu wurde das Programm Image Tool ver- wendet.

Die Proteinkonzentration der Rohextrakte wurde mit dem BioRad-Protein-Assay, der auf dem Proteinnach- weis nach Bradford basiert, durchgeführt. Als Rea- genzlösung wurde das BioRad-Proteinreagenz- Konzentrat, 5-fach mit Wasser verdünnt, eingesetzt.

Die Proteinlösungen wurden mit der Reagenzlösung im Verhältnis 1 : 4 versetzt. Dies entspricht einer Mic- ro-Assay-Testlösung. BSA wurde in Wasser gelöst und für die Probenlösung entsprechend verdünnt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur von mindestens 10 Minuten wurde die Absorption der Proben bei ei- ner Wellenlänge von 590 nm mit einem Microti- terplatten-Lesegerät bestimmt.

Die Trenneffizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde also durch Bestimmung der Protein-und DNA- Konzentration der Rohextrakte bestimmt. Der Wert des jeweils niedrigsten variablen Parameters (Protein-beziehungsweise DNA-Konzentration) wurde jeweils gleich Null gesetzt und anhand der Maximal- werte das Verhältnis der prozentualen Werte von extrazellulären Proteinen und extrazellulärer DNA berechnet. Hierbei wurde das Verhältnis der Null- werte gleich eins gesetzt. Dies entspricht der An- reicherung von Proteinen gegenüber DNA im flüssigen Medium außerhalb des biologischen Materials. Da be- stimmte Proteine hauptsächlich aufgrund ihrer Größe durch kleine Poren von intrazellulären ins extra- zelluläre Medium übertreten, DNA, im speziellen ge- nomische DNA, jedoch überwiegend nur bei komplett lysierten Zellen in das extrazelluläre Medium ge- langt, gibt die Anreicherung auch den Grad des Zellaufschlusses wieder. Ein Zellaufschluss ist bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise aufgrund man- gelnder Selektivität natürlich nicht erwünscht.

Gemäß des vorliegenden Beispieles wurde also eine Abtrennung des Proteins von der DNA angestrebt, das heißt, es ist eine Proteinanreicherung im außerhalb des biologischen Materials, das heißt der Zellen, befindlichen flüssigen Mediums erwünscht. Je höher der Anreicherungswert für extrazelluläres Protein, desto mehr Protein gelangte aus der Zelle in das umgebende Medium und desto mehr DNA verblieb in der Zelle, was gleichsam einen geringen Grad an Zell- aufschluss widerspiegelt.

In den folgenden Ausführungsbeispielen wurde die Feldstärke, die Impulszahl (Iz) und damit sowohl die Behandlungsdauer (Bd) als auch die Frequenz (Fr) variiert (Iz Bd d Fr). Außerdem wurde der Einfluß der Behandlungstemperatur dargelegt.

Die Figur 15 zeigt die Abhängigkeit der extrazellu- lären Protein-Anreicherung von der eingesetzten Feldstärke. Bei einer Impulszahl von 18000 bei ei- ner Behandlungsdauer von 60 Minuten, einer Frequenz von 5 Hz und einer Temperatur von 25°C wurden Feld- stärken von 10 ; 30 ; 40 ; 60 V/cm eingesetzt. Zum Er- reichen der kritischen Spannung Vc wäre eine Feld- stärke von ca. 7 kV/cm notwendig gewesen. Die ein- gesetzten Feldstärken lagen damit weit unterhalb der kritischen Spannung Vc. Insbesondere bei einer Feldstärke von 30 bis 50 V/cm wurde eine besonders gute Anreicherung von Protein im außerhalb des bio- logischen Materials befindlichen Medium erreicht.

Dieser optimale Feldstärkebereich hängt jedoch auch von den Parametern, Impulszahl, Behandlungsdauer, Frequenz, Temperatur, Lösung und dem biologischen Material selbst ab.

Die Figuren 16 und 17 betreffen die Abhängigkeit der extrazellulären Proteinanreicherung von der Im- pulszahl. Da die Impulszahl das Produkt aus Behand- lungsdauer und Frequenz darstellt, wurden zwei, in Figur 16 und 17 dargestellte Analysen durchgeführt.

In einem Ausführungsbeispiel (Figur 16) wurde bei konstanter Behandlungsdauer die Frequenz der Impul- se variiert, wobei Impulszahlen von 900/9000/18000 und 90000 ; Frequenzen von 0,5/5/25 und 50 Hz ; eine Behandlungsdauer von 30 Minuten ; eine Feldstärke von 10 V/cm und eine Temperatur von 25°C eingesetzt wurden. Der Figur 16 kann entnommen werden, dass bei diesen Bedingungen, insbesondere bei einer Im- pulszahl von 9000, eine besonders gute Anreicherung von Protein außerhalb des biologischen Materials im flüssigen Medium erreicht werden konnte.

In der Figur 17 wurde bei konstanter Frequenz die Behandlungsdauer variiert, wobei Impulszahlen von 1500/9000/18000 ; Behandlungsdauern von 5/30 und 60 Minuten ; eine Frequenz von 5 Hz ; eine Feldstärke von 40 V/cm und eine Temperatur von 25°C eingesetzt wurden.

Aus den Figuren 16 und 17 wird deutlich, dass die extrazelluläre Anreicherung von Protein gegenüber DNA und damit die Trenneigenschaften des erfin- dungsgemäßen in situ-Trennverfahrens einen Bereich optimaler Impulszahlen von 5000 bis 12000 besitzt.

Dieser Bereich ist jedoch auch von den Parametern Feldstärken, Behandlungsdauer, Frequenz, Tempera- tur, Lösung und dem biologischen Material selbst abhängig.

Die Figur 18 stellt die Abhängigkeit der extrazel- lulären Anreicherung von Protein gegenüber DNA bei konstanter Impulszahl in Abhängigkeit von der Be- handlungsdauer dar. Es wurden Behandlungsdauern von 0/3,3/6,7/33,3 und 66,7 Minuten ; Frequenzen von 0/ 2,5/5/25 und 50 Hz ; eine Impulszahl von 10000 ; eine Feldstärke von 40 V/cm sowie eine Temperatur von 25°C gewählt. Bei den gewählten Bedingungen waren insbesondere Behandlungsdauern bis zu 10 Minuten günstig, um eine Anreicherung von Proteinen gegen- über DNA zu erreichen. Direkte Effekte der Frequenz bezüglich der Induktion von Poren machen sich erst in Frequenzgrößenordnungen bemerkbar, die Einfluss auf die Impulsform haben. Eine erhöhte Frequenz in den vorliegenden Ausführungsbeispielen hatte bei der verwendeten Apparatur lediglich Auswirkungen auf die maximal erreichbare Feldstärke. Deshalb ist die in Figur 18 dargestellte Abhängigkeit der An- reicherung von Proteinen bei konstanter Impulszahl und damit variabler Frequenz sowie Behandlungsdauer auf die Behandlungsdauer zurückzuführen. Die Daten sind somit mit der Abhängigkeit der Anreicherung von der Impulszahl bei konstanter Frequenz zu kor- relieren (vergleiche Figur 17).

Die Figur 19 verdeutlicht die Trenneigenschaften des vorliegenden Verfahrens in Abhängigkeit von der Temperatur. In diesem Ausführungsbeispiel wurden die Parameter wie folgt gewählt : Temperatur 10/30/ 45/55/50/65°C, Feldstärke 24 V/cm ; Impulszahl 18000, Behandlungsdauer 6 Minuten und Frequenz 50 Hz.

Das Optimum der Temperatur für die beispielhaft un- tersuchte Trennung von Proteinen und DNA liegt mit ca. 50°C deutlich über den ambienten Temperaturen, die bei einer Elektroporation von E. coli verwendet werden wurden. Der Aufschluss der Zellen wäre in diesem System vorzugsweise bei Temperaturen über 70°C durchzuführen. Das Temperaturoptimum der er- findungsgemäßen in situ-Trennverfahren hängt auch von den Parametern Feldstärke, Impulszahl, Fre- quenz, Behandlungsdauer, Lösung und biologischem Material selbst ab.

Aus den vorliegenden Daten wird deutlich, dass Stoffe, insbesondere nach dem Prinzip eines Moleku- larsiebes, das heißt nach ihrer Größe, getrennt werden. Stoffe, deren Größe keinen Durchtritt durch die erfindungsgemäß induzierten Poren ermöglicht, werden zurückgehalten. Kleinere niedermolekulare Stoffe hingegen gelangen durch die Poren in das au- ßerhalb des biologischen Materials befindliche Me- dium.