Méthode de criblage de séquences de conditions de culture

La présente invention concerne une méthode de criblage de séquences de conditions de culture d’intérêt pour des bioprocédés.

Lors de la conception d’un procédé de production de molécules d’intérêts par des cellules vivantes telles que des micro-organismes (appelé ici bio-procédé), une grande importance est généralement accordée au choix du microorganisme, eu égard à son rendement, à la qualité de sa production, etc. Pour cela, diverses méthodes de criblage ont été élaborées (Moutel et al. (2016) Process Biochemistry 51 :1855-1865), dont des méthodes mettant en oeuvre des techniques de microfluidique (Kim et al. (2015) Sci. Rep. 621 155).

Néanmoins, nombre d’autres paramètres peuvent influencer le rendement : pH, composition du milieu, température, moment d’application d’une contrainte physiologique, intensité de ladite contrainte, cycle application/absence (ou relâchement) de contrainte. Ainsi, déterminer les conditions optimales de production d’un bio-procédé nécessite de cribler un nombre de conditions de culture très important et en particulier un nombre de séquences de conditions de culture encore plus important.

Cependant, à ce jour, il existe peu de techniques de criblage de séquences de conditions de culture. Kim et al. (2014) Lab Chip 14:1415 décrit une méthode de criblage dans laquelle des micro-algues sont piégées dans une puce microfluidique puis dans laquelle les conditions d’éclairage sont modifiées à loisir, ce qui permet d’étudier leur impact sur la physiologique des microalgues et la production de lipides. Cependant, aucune modification des conditions de culture autre que les conditions d’éclairage n’ont pu être testées.

Il y a donc aujourd’hui un besoin important de techniques de criblage d’un nombre élevé de séquences de conditions de culture, en particulier de techniques permettant des changements de milieux de culture, et qui peuvent être utilisées avec n’importe quel type de cellules, en particulier des cellules non-adhérentes.

La présente invention résulte de la découverte inattendue des inventeurs qu’il était possible d’appliquer le concept dit du « split-pool » à des capsules comprenant des cellules vivantes qui peuvent être mises en culture sous différentes conditions de culture susceptibles d’affecter les cellules contenues dans les capsules, et qui peuvent être marquées spécifiquement par différents types de marqueurs afin de les identifier.

La technologie Combicult ^® , commercialisée par Plasticell, met en oeuvre des billes ( i.e . particules pleines/matricielles) et non des capsules, ce qui limite le type de cellules pouvant être cultivées et ne permet pas de protéger les cellules du stress extérieur (contrairement aux capsules qui rendent possible la culture de cellules fragiles).

Le procédé mis au point par les inventeurs se déroule ainsi schématiquement en 4 étapes :

1 ) encapsulation de cellules et criblage combinatoire,

2) test pour identifier une caractéristique d’intérêt dans les capsules,

3) tri des capsules pertinentes, et

4) détermination des séquences de conditions de culture auxquelles ont été soumises les capsules pertinentes.

Les inventeurs ont en particulier montré qu’il était possible de « coder » spécifiquement et de manière unique les séquences de conditions de culture auxquelles sont soumises des capsules, en associant ces séquences à une combinaison de marqueurs unique.

De plus, l'utilisation de capsules permet d'isoler les cellules cultivées des marqueurs utilisés pour identifier les conditions de culture auxquelles elles ont été soumises, minimisant ainsi le risque d'interactions potentiellement délétères entre les marqueurs et les cellules et élargissant également le spectre des marqueurs utilisables.

La présente invention concerne ainsi une méthode de criblage d’une séquence de conditions de culture d’intérêt pour l’obtention d’une caractéristique d’intérêt, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :

(a) la fourniture d’une pluralité de capsules, chacune desdites capsules comprenant :

- un cœur comprenant une phase interne comprenant au moins une cellule vivante, ladite cellule vivante n’étant en particulier pas une cellule souche embryonnaire humaine obtenue par destruction d’un embryon et

- une enveloppe comprenant une phase externe encapsulant totalement le cœur à sa périphérie ;

(b) la séparation aléatoire de la pluralité de capsules fournie à l’étape (a) en une pluralité de sous-ensembles,

(c) la culture de la pluralité de sous-ensembles de capsules dans une pluralité de conditions de culture différentes,

lesdits sous-ensembles de capsules étant cultivés dans une pluralité de milieux de culture externes, chaque milieu de culture externe comprenant un marqueur unique différent des marqueurs présents dans les autres milieux de culture externes,

lesdites capsules étant cultivées pendant une période appropriée pour permettre auxdits marqueurs de s’adsorber sur lesdites capsules, (d) la récupération et le regroupement de la pluralité de sous-ensembles de capsules suivis de la séparation aléatoire de la pluralité de capsules ainsi regroupées en une pluralité de nouveaux sous-ensembles,

(e) la culture de la pluralité de nouveaux sous-ensembles de capsules dans une pluralité de conditions de culture différentes,

lesdits nouveaux sous-ensembles de capsules étant cultivés dans une pluralité de milieux de culture externes, chaque milieu de culture externe comprenant un marqueur unique différent des marqueurs présents dans les autres milieux de culture externes, lesdites capsules étant cultivées pendant une période appropriée pour permettre auxdits marqueurs de s’adsorber sur lesdites capsules,

(f) optionnellement la répétition des étapes (b) à (e) de manière itérative,

(g) l’identification et la sélection, au sein de la pluralité de capsules, de capsules d’intérêt présentant, suite à la mise en œuvre des étapes (b) à (f), au moins une caractéristique d’intérêt, et

(h) l’identification de la ou des séquence(s) de conditions de culture à(aux) laquelle(s) les capsules d’intérêt identifiées à l’étape (g) ont été exposées, au moyen des marqueurs adsorbés sur lesdites capsules, la(les)dite(s) séquence(s) de conditions de culture ainsi identifiées étant une (des) séquence(s) de conditions de culture d’intérêt pour l’obtention de ladite caractéristique d’intérêt.

Les figures 1 et 2 illustrent une telle méthode de criblage d’une séquence de conditions de culture d’intérêt pour l’obtention d’une caractéristique d’intérêt selon l’invention (i.e. concept du split-pool), l'objectif étant de voir les effets de 3 milieux de culture différents et de leur séquence, avec deux incubations successives, autrement dit l’effet de séquences d’incubations dans deux milieux de culture, les deux milieux de culture étant choisis parmi trois milieux de culture différents.

En figure 1 , une population de capsules est séparée en trois lots, chaque lot étant incubé dans un milieu de culture choisi parmi les milieux de culture B, R et G. Les milieux contiennent chacun un marqueur spécifique, qui s'adsorbe sur les capsules.

En figure 2, les capsules sont ensuite collectées, mélangées et la population est séparée aléatoirement en trois nouveaux lots. Chaque lot est ensuite incubé dans un nouveau milieu de culture choisi parmi les milieux de culture B, R et G. Les milieux contiennent un marqueur spécifique, différents de ceux utilisés à l'étape précédente.

Les capsules sont ensuite collectées. Neuf sous-populations sont distinguables, chacune ayant connue une « histoire » différente et est marquée de manière univoque, tout en ayant nécessité seulement deux étapes de marquage et 6 marqueurs différents. Description détaillée de l’invention

Cellules

Les cellules vivantes présentes dans les capsules de l’invention peuvent être de tout type.

On peut notamment citer les cellules procaryotes, les archées, les cellules eucaryotes, et leurs mélanges. Ainsi, selon un mode de réalisation, la ou les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules procaryotes, les archées ou les cellules eucaryotes, de préférence parmi les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes, et leurs mélanges.

De préférence, la cellule vivante n'est pas pas une cellule souche embryonnaire humaine obtenue par destruction d’un embryon.

Parmi les cellules procaryotes, on peut en particulier citer les bactéries, en particulier les bactéries probiotiques.

Parmi les cellules eucaryotes, on peut en particulier citer les cellules animales, les cellules végétales, les levures, les champignons et leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation, la ou les cellules vivantes sont des cellules animales, en particulier des cellules animales choisies parmi des cellules de mammifère ou des cellules d’insecte. La ou les cellules vivantes utilisées dans le cadre de l’invention peuvent en particulier être des cellules souches.

Selon un autre mode de réalisation, la ou les cellules vivantes sont des cellules végétales, en particulier des cellules végétales choisies parmi les algues et les microalgues.

La ou les cellules vivantes peuvent également être des cellules génétiquement modifiées.

Dans le cadre de l’invention, la cellule vivante est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué des cellules procaryotes, telles que des bactéries ; des archées ; des cellules eucaryotes telles que des cellules animales, en particulier les cellules de mammifère, les cellules souches ou les cellules d’insectes, des cellules végétales, des levures ou des champignons.

Les cellules vivantes présentes dans les capsules de l’invention peuvent être des cellules adhérentes ou non adhérentes.

Dans le cadre de l’invention, les cellules présentes dans les capsules sont sous une forme vivante. Elles ne sont donc pas des cellules sous un état lyophilisé, ou sous forme de lysat, mort ou inactivé. Dans un mode de réalisation, les cellules vivantes présentes dans les capsules de l’invention sont des cellules non-adhérentes en suspension dans la phase interne de la capsule.

Le procédé selon l’invention a en effet l’avantage de pouvoir travailler sur des cellules non-adhérentes ou sur des cellules ayant besoin d’un environnement à trois dimensions pour survivre, ce qui n’est pas le cas des technologies de l’état de la technique.

Dans un autre mode de réalisation, les cellules vivantes présentes dans les capsules de l’invention sont des cellules adhérentes.

Capsules

L’étape a) de la méthode de criblage selon l’invention comprend la fourniture d’une pluralité de caspules, chaque capsule comprenant au moins une cellule vivante telle que définie dans la section « Cellules » ci-dessus.

Les capsules utilisées dans le cadre de l’invention comprennent :

- un cœur comprenant une phase interne comprenant au moins une cellule vivante, et

- une enveloppe comprenant une phase externe encapsulant totalement le cœur à sa périphérie.

De préférence, l’enveloppe comprend une phase externe gélifiée, ladite phase externe comprenant au moins un polyélectrolyte à l’état gélifié.

Selon un mode de réalisation, le cœur des capsules est (i) monophasique ou (ii) comporte une goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe gélifiée, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire, les cellules vivantes étant présentes dans la phase interne et/ou la phase intermédiaire.

Selon un mode de réalisation, la capsule de l’invention est une capsule dite « simple », signifiant que le cœur est constitué d’une seule phase, la phase interne. Une capsule « simple » est par exemple une capsule telle que décrite dans WO2010/063937 ou WO2016062836.

Selon un mode de réalisation, lorsque le cœur des capsules est monophasique, la ou les cellules vivantes sont présentes dans la phase interne du cœur des capsules.

Selon un autre mode de réalisation, lorsque les capsules comprennent une phase intermédiaire, la ou les cellules vivantes sont présentes dans la phase interne et/ou dans la phase intermédiaire. Une telle capsule « complexe » est par exemple une capsule telle que décrite dans WO2013/1 13855.

Selon un mode de réalisation, la taille des capsules est inférieure à 5 mm, de préférence comprise entre 50 pm et 3 mm. Pour une diffusion optimale des nutriments présents dans le milieu de culture externe jusqu'au centre des capsules, la taille des capsules est avantageusement de quelques centaines de microns, par exemple comprise entre 50 pm et 1000 pm, et mieux entre 50 pm et 500 pm.

Phase interne

La phase interne est généralement constituée d’une composition aqueuse, liquide ou visqueuse, comprenant au moins une cellule vivante.

Par « liquide » au sens de la présente invention, on entend une phase, le cas échéant un gel, pouvant s'écouler sous son propre poids à température ambiante et pression atmosphérique.

Selon un mode de réalisation, une phase comprenant les cellules vivantes selon l’invention a une viscosité allant de 1 mPa.s à 500 000 mPa.s, de préférence de 10 mPa.s à 300 000 mPa.s, mieux de 400 mPa.s à 200 000 mPa.s, et plus particulièrement de 2 000 mPa.s à 150 000 mPa.s, telle que mesurée à 25°C.

La viscosité est mesurée à température ambiante, par exemple T=25°C ± 2°C, et à pression ambiante, par exemple 1013 hPa, par la méthode décrite dans WO2016/096995.

La phase interne peut comprendre plusieurs cellules vivantes, du même type ou de types différents.

Les cellules vivantes encapsulées constituent ce que l’on appelle aussi la biomasse encapsulée.

La phase interne est typiquement apte à la survie, voire la prolifération, de la ou des cellules vivantes comprises dans ladite phase interne.

De préférence, la phase interne comprend une solution tampon apte à la survie des cellules vivantes.

A titre de tampon utilisable, on peut utiliser tout tampon connu en soi pour être adapté à la survie de cellules vivantes.

Comme il est bien connu de l’homme du métier, un tel tampon dépendra du type de cellules vivantes présentes dans la phase interne (cellule procaryote, eucaryote, animale ou végétale, cellule souche, ...).

La phase interne a de préférence un pH compris de 5 à 10, plus préférentiellement compris de 6 à 9. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté à la culture de cellules vivantes, la phase interne comprend des nutriments aptes à la prolifération de la ou des cellules vivantes. En particulier, selon un mode de réalisation, la phase interne comprend un milieu de culture interne, identique ou différent du milieu de culture externe décrit ci- après, adapté à la prolifération de la ou des cellules vivantes.

Par « milieu de culture », on entend une solution comprenant des nutriments aptes à la prolifération de la ou des cellules vivantes et jouant le rôle de tampon pH.

L’osmolarité du milieu de culture interne est de préférence comprise entre 10 mOsm et 1 000 mOsm.

Comme il est bien connu de l’homme du métier, un tel milieu de culture dépendra du type de cellules vivantes présentes dans la phase interne (cellule procaryote, eucaryote, animale ou végétale, cellule souche, ...).

Des exemples de milieu de culture interne appropriés pour la phase interne de la capsule incluent le milieu de culture Parker, Ham, Dulbecco, Grâce, MEM, le milieu de culture d'Erdschreiber, le milieu F/2, le milieu TAP, de l’eau de mer reconstituée, le milieu DM (diatomée), le milieu Minimum, et l’un quelconque de leurs mélanges. De tels milieux de culture sont décrits plus en détails ci-après.

Lors de l’encapsulation des cellules vivantes (i.e. avant tout procédé de culture des cellules vivantes), la phase interne comprend typiquement de 10 ³ à 10 ⁹ , de préférence de 10 ⁴ à 10 ⁸ , plus préférentiellement de 10 ⁵ à 10 ⁸ , par exemple de 10 ⁶ à 5.10 ⁶ cellules vivantes, par millilitre de phase interne.

En fonction de la taille des capsules, la phase interne comprend typiquement de 1 à 10 ⁷ , préférentiellement de 5 à 10 ⁶ , de 30 à 5.10 ⁵ , de 50 à 10 ⁵ , de 75 à 5.10 ⁴ , de 100 à 10 ⁴ , de 150 à 10 ⁴ , voire de 200 à 10 ³ cellules vivantes, par capsule.

Le comptage des cellules vivantes de la phase interne est préférentiellement réalisé avant l’encapsulation, ou bien après l’ouverture des capsules.

Le comptage des cellules vivantes peut être fait par la méthode de comptage Malassez. La cellule de Malassez est une lame de verre qui permet de compter le nombre de cellules en suspension dans une solution. Sur cette lame de verre, un quadrillage de 25 rectangles a été gravé, contenant eux-mêmes 20 petits carrés. Pour dénombrer les cellules végétales, on dépose sur la cellule de Malassez entre 10 pL et 15 pL de phase interne comprenant des cellules végétales en suspension. Après sédimentation, on compte le nombre de cellules végétales dans 10 rectangles (quadrillés). Le volume d'un rectangle quadrillé étant de 0,01 pL, on multiplie ce nombre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules végétales par millilitre de phase interne. Alternativement, le comptage des cellules vivantes peut être fait par mesure d’absorbance. D’après la loi de Beer-Lambert, pour une longueur d’onde l donnée, l’absorbance d’une solution est proportionnelle à sa concentration et à la longueur du trajet optique (distance sur laquelle la lumière traverse la solution). On peut donc mesurer la concentration en cellules vivantes de la phase interne en se basant sur une méthode de mesure d'absorbance (encore appelée densité optique). Il suffit pour cela de mesurer les densités optiques de phases internes contenant une quantité connue de cellules vivantes, ce qui permet de construire une courbe-étalon en fonction de la concentration cellulaire.

Avantageusement, les cellules vivantes présentes dans la phase interne des capsules sont en suspension dans la phase interne.

Par « en suspension » dans la phase interne, on entend que les cellules vivantes n’adhèrent pas à la membrane gélifiée des capsules, et ne sont pas en contact prolongé avec ladite membrane. Les cellules vivantes sont ainsi totalement baignées dans le milieu constituant la phase interne et sont libres de se déplacer selon les trois dimensions.

L’homme du métier est capable de vérifier que les cellules vivantes sont effectivement en suspension dans les capsules, typiquement en observant les capsules par microscopie et en mettant en évidence un mouvement différencié entre la capsule et les cellules vivantes qu’elle contient. Par exemple, dans le cas particulier des micro algues flagellées, on peut observer leur nage, due à l'action de leurs flagelles.

Selon un mode de réalisation, la phase interne comprend en outre au moins un agent de viscosité, de préférence biocompatible, typiquement choisi parmi les éthers de cellulose.

La présence d’un agent de viscosité permet de faciliter la préparation des capsules en diminuant la différence de viscosité entre la phase interne et la phase externe, qui comprend avantageusement un polyélectrolyte en solution.

Par « agent de viscosité », on entend un produit soluble dans la phase interne apte à moduler sa viscosité. Il peut notamment s’agir d’un polymère naturel, comme les glycosaminoglycanes (acide hyaluronique, chitosan, héparane sulfate, etc), l’amidon, les protéines de plantes, la gomme welan, ou toute autre gomme naturelle ; d’un polymère semi-synthétique, comme les amidons décomposés et leurs dérivés, les éthers de cellulose, comme l'hydroxypropyl méthyl cellulose (HPMC), l'hydroxy ethyl cellulose (HEC), le carboxy méthyl cellulose (CMC) et le 2-ethylcellulose ; ou encore d’un polymère synthétique, comme les polyéthers (polyéthylène glycol), les polyacrylamides, les polyvinyles, et leurs mélanges. De préférence, la phase interne comprend un éther de cellulose, comme le 2- ethylcellulose ou le 2-hydroxyethylcellulose. La phase interne peut comprendre une concentration massique de 0,01% à 5% en agent(s) de viscosité, préférentiellement de 0,1% à 1%, par rapport à la masse totale de la phase interne.

Phase externe

Selon l’invention, l’enveloppe des capsules peut être de tout type connu de l’homme du métier, sous réserve que sa composition ne soit pas préjudiciable à la survie / croissance des cellules vivantes encapsulées et n’empêche pas l’adsorption des marqueurs.

Selon l’invention, la phase externe de l’enveloppe des capsules comprend typiquement au moins un polyélectrolyte à l’état gélifié, aussi appelé polyélectrolyte gélifié. Cette enveloppe externe peut être également nommée « enveloppe gélifiée ».

On entend par « enveloppe gélifiée » une phase externe entourant au moins partiellement une phase interne, et comprenant un composé à l’état gélifié ou sous forme de gel. De préférence, l’enveloppe gélifiée est une phase aqueuse, et typiquement un hydrogel d’un polyélectrolyte à l’état gélifié. L’enveloppe gélifiée peut également être désignée par les termes « membrane » ou « écorce ».

De préférence, l’enveloppe gélifiée a une épaisseur inférieure à 500 pm, avantageusement supérieure à 10 pm. L’enveloppe gélifiée est généralement formée par une monocouche d’un matériau homogène.

Polyélectrolyte

L’enveloppe gélifiée comprend de préférence un gel contenant de l’eau et un polyélectrolyte avantageusement choisi parmi les protéines, les polysaccharides naturels, les polyélectrolytes réactifs aux ions multivalents, et leurs mélanges.

Par « polyélectrolyte réactif aux ions polyvalents », on entend, au sens de la présente invention, un polyélectrolyte susceptible de passer d’un état liquide dans une solution aqueuse à un état gélifié sous l’effet d’un contact avec une solution gélifiante contenant des ions multivalents tels que des ions d’un métal alcalino-terreux choisis par exemple parmi les ions calcium, les ions baryum, les ions magnésium, aluminium ou fer.

Dans l’état liquide, les chaînes individuelles de polyélectrolyte sont sensiblement libres de s’écouler les unes par rapport aux autres. Une solution aqueuse de 2% en masse de polyélectrolyte présente alors un comportement purement visqueux aux gradients de cisaillement caractéristiques du procédé de mise en forme. La viscosité de cette solution à cisaillement nul est entre 50 mPa.s et 10 000 mPa.s avantageusement entre 3 000 mPa.s et 7 000 mPa.s. Cette viscosité aux gradients de cisaillements caractéristiques des écoulements mis en jeu lors de la fabrication des capsules est par exemple mesurée à l’aide d’un rhéomètre à contrainte, ou déformation, imposée à la température de fabrication, 25°C par exemple. Pour les mesures, on utilisera typiquement une géométrie cône-plan de diamètre compris de 10 à 50 mm, et un angle du cône de 2° maximum.

Les chaînes individuelles de polyélectrolyte dans l’état liquide présentent avantageusement une masse molaire supérieure à 65 000 g/mol.

La solution gélifiante est par exemple une solution aqueuse d’un sel de formule

- X est choisi parmi le groupe constitué des ions halogénures (chlorure, bromure, iodure et fluorure) et des ions tartrate, lactate et carbonate,

- M est choisi parmi le groupe constitué des cations Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Ba ²⁺ , Al ³⁺ et Fe ³⁺ , et

- n et m sont supérieurs ou égaux à 1.

La concentration en sel X _n M _m dans la solution gélifiante est avantageusement comprise de 1% à 20% en masse, préférentiellement de 5% à 20% en masse.

A l’état gélifié, les chaînes individuelles de polyélectrolyte forment, avec les ions multivalents, un réseau tridimensionnel cohérent qui retient la phase interne et empêche son écoulement. Les chaînes individuelles sont retenues les unes par rapport aux autres et ne peuvent s’écouler librement les unes par rapport aux autres.

Le polyélectrolyte est de préférence un polymère biocompatible, il est par exemple produit biologiquement.

Avantageusement, il est choisi parmi les polysaccharides, les polyélectrolytes de synthèse à base d’acrylates (polyacrylate de sodium, de lithium, de potassium ou d’ammonium, ou polyacrylamide), ou les polyélectrolytes de synthèse à base de sulfonates (polystyrène sulfonate) de sodium, par exemple).

Plus particulièrement, le polyélectrolyte est choisi parmi les alginates d’alcalin, tel qu’un alginate de sodium ou un alginate de potassium, les géllanes et les pectines.

Dans le cas où le polyélectrolyte est un alginate de sodium (NaAlg), et où le réactif est le chlorure de calcium, la réaction qui se produit lors de la gélification est la suivante :

2NaAlg + CaCI ₂ -> Ca(Alg) ₂ + 2NaCI

Les alginates sont produits à partir d’algues brunes appelées « laminaires », désignées par le terme anglais « sea weed ». De préférence, le polyélectrolyte est un alginate d’alcalin ayant avantageusement une teneur en bloc a-L-guluronate supérieure à 50%, notamment supérieure à 55%, voire supérieure à 60%.

Le polyélectrolyte est par exemple un alginate, en particulier un alginate de sodium.

Le polyélectrolyte à l’état gélifié est typiquement un alginate de calcium.

Selon un mode de réalisation préféré, le pourcentage massique total en polyélectrolyte(s) dans la phase externe gélifiée est compris de 0,5% à 5%, de préférence inférieur à 3%.

Le pourcentage massique total en polyélectrolyte(s) dans la phase externe gélifiée est par exemple compris entre 0,5% et 3%, de préférence entre 1% et 2%.

Tensioactif

L’enveloppe gélifiée peut contenir en outre au moins un agent tensioactif.

La présence d’un tensioactif dans la phase externe permet de faciliter la préparation des capsules de l’invention, en augmentant la résistance de la phase externe liquide lors de l’impact de la goutte double avec la solution gélifiante.

Le tensioactif est avantageusement un tensioactif anionique, un tensioactif non ionique, un tensioactif cationique ou un mélange quelconque de ceux-ci. La masse moléculaire de l’agent tensioactif est typiquement comprise entre 150 g/mol et 10 000 g/mol, avantageusement entre 250 g/mol et 1 500 g/mol.

De manière générale, la teneur massique en tensioactif(s) dans la phase externe est typiquement inférieure ou égale à 2%, de préférence inférieure à 1 %, par rapport à la masse totale de la capsule.

La teneur massique en agent tensioactif(s) dans l’enveloppe est de préférence supérieure à 0,001% et est avantageusement supérieure à 0,1%.

Phase intermédiaire

Selon un mode de réalisation, les capsules selon l’invention comprennent une phase intermédiaire entre la phase interne et la phase externe.

Cette phase intermédiaire forme une enveloppe intermédiaire aqueuse, généralement biocompatible, qui encapsule totalement la phase interne et est totalement encapsulée par la phase externe.

Ceci permet de créer des structures complexes, plus proche de la réalité biologique que les boites de culture cellulaire. Ainsi, et à titre illustratif, des capsules contenant une coculture de kératinocytes et de fibroblastes humains ont été créées, comme montré dans WO20131 13855 où la phase intermédiaire est constituée de collagène, et héberge les fibroblastes ; les kératinocytes poussent à la surface de la phase intermédiaire et donnent sur le cœur liquide.

Lorsqu’une capsule comprend une phase intermédiaire, les cellules vivantes sont présentes en phase interne et/ou en phase intermédiaire.

La phase intermédiaire peut comprendre au moins une cellule vivante, qui peut être identique ou différente des cellules vivantes présentes dans la phase interne.

La phase intermédiaire, lorsqu’elle est présente et qu’elle comprend des cellules vivantes, est de préférence apte à la survie desdites cellules vivantes. Elle comprend avantageusement un milieu de culture apte à la culture desdites cellules, typiquement un un milieu de culture tel que défini ci-dessus pour la phase interne. Le milieu de culture présent dans la phase intermédiaire peut être identique ou différent du milieu de culture de la phase interne.

La phase intermédiaire, lorsqu’elle est présente et qu’elle comprend des cellules vivantes, comprend typiquement de 1 à 10 ⁷ , préférentiellement de 5 à 10 ⁶ , de 30 à 5.10 ⁵ , de 50 à 10 ⁵ , de 75 à 5.10 ⁴ , de 100 à 10 ⁴ , de 150 à 10 ⁴ , voire de 200 à 10 ³ cellules vivantes, par capsule.

Selon un mode de réalisation, une capsule selon l’invention est une capsule qui comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, notamment gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur liquide, ledit cœur étant monophasique.

Un tel type de particules correspond alors à une capsule simple comprenant deux phases distinctes, une phase interne liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une phase externe, notamment à l’état gélifié, entourant la phase interne. Avantageusement, le rapport du volume du cœur au volume de l’enveloppe externe, est compris entre 1 et 50, de préférence entre 1 et 10, et mieux entre 1 et 2.

Selon un autre mode de réalisation particulier, une capsule selon l’invention est une capsule qui comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, notamment gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur, ledit cœur comportant une goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire. Avantageusement, le rapport du volume du cœur au volume de l’enveloppe externe, est supérieur à 2, avantageusement est inférieur à 50, et de préférence est compris entre 5 et 10. La phase intermédiaire est par exemple réalisée à base d’une solution aqueuse.

Un tel type de capsule correspond alors à une capsule complexe signifiant que le cœur liquide, visqueux ou thixotrope, comporte une unique goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe gélifiée, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire.

Selon une variante, le cœur comprend une phase intermédiaire continue au sein de laquelle se trouve une pluralité de gouttes de phase(s) interne(s).

Selon un mode de réalisation, une capsule selon l’invention comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, notamment gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur, ledit cœur comportant une goutte intermédiaire d’une phase aqueuse, la phase aqueuse étant placée au contact de l’enveloppe externe, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase huileuse disposée dans la goutte intermédiaire. Pour des raisons évidentes, dans ce mode de réalisation ci-dessus, les cellules vivantes sont nécessairement situées dans le cœur au niveau de la phase aqueuse, donc de la goutte intermédiaire.

Avantageusement, la phase intermédiaire comprend en outre au moins un agent de viscosité (ou agent gélifiant), notamment tel que défini ci-dessous. L’agent de viscosité contribue notamment à améliorer la suspension de la/les goutte(s) interne(s) disposée(s) dans la goutte intermédiaire des capsules de l’invention selon ce mode de réalisation. En d’autres termes, l’agent de viscosité permet de prévenir/éviter les phénomènes de crémage ou de sédimentation de la/les goutte(s) interne(s) disposée(s) dans la goutte intermédiaire des capsules de l’invention selon ce mode de réalisation.

Lorsque l’agent de viscosité est en phase aqueuse comprenant les cellules vivantes, l’homme du métier saura ajuster la nature et/ou quantité en agent(s) gélifiant(s) de manière à assurer la suspensivité souhaitée sans porter préjudice à la survie ou croissance desdites cellules vivantes.

Lorsque l’enveloppe des capsules comprend au moins un polyélectrolyte gélifié, les capsules de l’invention sont typiquement préparées par un procédé comprenant les étapes suivantes :

(il ) la mise en contact d’une première solution, notamment liquide, comprenant au moins une cellule vivante et d’une deuxième solution liquide comprenant au moins un polyélectrolyte à l’état liquide, (ii1 ) la formation d’une goutte double comprenant une phase interne formée de la première solution et une phase externe liquide formée de la deuxième solution liquide,

(iii) l’immersion de la goutte double dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de la phase externe liquide (ou deuxième solution), ce par quoi on obtient la phase externe gélifiée, et

(iv) la récupération des capsules formées.

L’étape (il ) peut être caractérisée par le convoyage séparé dans une double enveloppe de la première solution, notamment liquide, et de la deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier, l’étape (ii1 ) se formant à la sortie de la double enveloppe.

Dans le cadre de la présente description, on entend par « goutte double » une goutte constituée d’une phase interne et d’une phase externe liquide, encapsulant totalement ladite phase interne à sa périphérie. La production de ce type de goutte est généralement effectuée par co-extrusion concentrique de deux solutions, selon un mode hydrodynamique de dripping ou de jetting, tel que décrit dans les demandes WO 2010/063937 et FR2964017.

Lorsque la goutte double entre en contact de la solution gélifiante, le réactif propre à gélifier le polyélectrolyte présent dans la solution gélifiante forme alors des liaisons entre les différentes chaînes de polyélectrolyte présentes dans la phase externe liquide. Le polyélectrolyte à l’état liquide passe alors à l’état gélifié, provoquant ainsi la gélification de la phase externe liquide.

Sans vouloir être lié à une théorie particulière, lors du passage à l’état gélifié du polyélectrolyte, les chaînes individuelles de polyélectrolyte présentes dans la phase externe liquide se raccordent les unes aux autres pour former un réseau réticulé, aussi appelé hydrogel, qui emprisonne de l’eau contenue dans la phase externe.

Une phase externe gélifiée, propre à retenir la phase interne de première solution est ainsi formée. Cette phase externe gélifiée présente une tenue mécanique propre, c’est-à-dire qu’elle est capable d’entourer totalement la phase interne et de retenir la ou les cellules vivantes présentes dans cette phase interne pour les retenir au cœur de la capsule gélifiée.

Les capsules selon l’invention séjournent dans la solution gélifiante le temps que la phase externe soit complètement gélifiée. Elles sont ensuite collectées et éventuellement plongées dans une solution aqueuse de rinçage, généralement essentiellement constituée d’eau et/ou de milieu de culture.

La taille des différentes phases formant initialement les gouttes doubles, et in fine les capsules, est généralement contrôlée par l’utilisation de deux pousse-seringues indépendants (à l’échelle du laboratoire) ou de deux pompes (à l’échelle industrielle), qui fournissent respectivement la première solution et la deuxième solution liquide mentionnées ci-dessus.

Le débit Qi du pousse-seringue associé à la première solution contrôle le diamètre de la phase interne de la capsule finale obtenue.

Le débit Q ₀ du pousse-seringue associé à la deuxième solution liquide contrôle l’épaisseur de la phase externe gélifiée, de la capsule finale obtenue.

Le réglage relatif et indépendant des débits Q, et Q ₀ permet de commander l’épaisseur de la phase externe gélifiée, indépendamment du diamètre extérieur de la capsule, et de moduler le rapport volumique entre la phase interne et la phase externe.

Dans un autre mode de réalisation, lorsque l’enveloppe des capsules comprend au moins un polyélectrolyte gélifié, les capsules de l’invention, en particulier comprenant une phase intermédiaire, sont typiquement préparées par un procédé comprenant les étapes suivantes :

(i2) la mise en contact d’une première solution et d’une deuxième solution, au moins une solution parmi les première et deuxième solutions comprenant au moins une cellule vivante, et d’une troisième solution liquide comprenant au moins un polyélectrolyte à l’état liquide,

(N2) la formation d’une goutte triple comprenant une phase interne formée de la première solution, d’une phase intermédiaire formée de la deuxième solution et d’une phase externe liquide formée de la troisième solution liquide,

(iii) l’immersion de la goutte triple dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de la phase externe liquide (ou troisième solution), ce par quoi on obtient la phase externe gélifiée, et

(iv) la récupération des capsules formées.

L’étape (i2) peut être caractérisée par le convoyage séparé dans une triple enveloppe de la première solution, notamment liquide, de la deuxième solution, notamment liquide, et de la troisième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier, l’étape (N2) se formant à la sortie de la triple enveloppe.

Ainsi, les capsules comprenant une phase intermédiaire sont généralement obtenues par co-extrusion concentrique de trois solutions, au moyen d’une triple enveloppe : un premier flux constitue la phase interne, un deuxième flux constitue la phase intermédiaire et un troisième flux constitue la phase externe. La production de telles capsules, dites « complexes », est notamment décrite dans la demande internationale WO 2012/089820. A la sortie de la triple enveloppe, les trois flux entrent en contact et se forme alors une goutte multi-composante, qui est ensuite gélifiée lorsqu’elle est plongée dans une solution gélifiante, de la même manière que dans le procédé de préparation de capsules « simples » décrit ci-dessus.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la méthode de criblage selon l’invention comprend une étape pré-(a) de préparation des capsules fournies à l’étape (a) comprenant les sous-étapes suivantes :

(M ) la mise en contact d’une première solution comprenant au moins une cellule vivante et d’une deuxième solution liquide comprenant au moins un polyélectrolyte à l’état liquide,

(111 ) la formation d’une goutte double comprenant une phase interne formée de la première solution et une phase externe liquide formée de la deuxième solution liquide,

ou

(i2) la mise en contact d’une première solution et d’une deuxième solution, au moins une solution parmi les première et deuxième solutions comprenant au moins une cellule vivante, et d’une troisième solution liquide comprenant au moins un polyélectrolyte à l’état liquide,

(112) la formation d’une goutte triple comprenant une phase interne formée de la première solution, d’une phase intermédiaire formée de la deuxième solution et une phase externe liquide formée de la troisième solution liquide,

(iii) l’immersion de la goutte double ou de la goutte triple dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de la phase externe liquide, ce par quoi on obtient la phase externe gélifiée, et

(iv) la récupération des capsules formées.

De préférence, toutes les capsules de la pluralité de capsules fournies à l’étape a) de la méthode de criblage selon l’invention comprennent le même type et/ou le même nombre de cellules vivantes.

De manière préférée, toutes les capsules de la pluralité de capsules fournies à l’étape a) de la méthode de criblage selon l’invention comprennent un cœur et une enveloppe de même type.

De manière encore préférée, toutes les capsules de la pluralité de capsules fournies à l’étape a) de la méthode de criblage selon l’invention sont identiques. Séparation des capsules

L’étape b) de la méthode de criblage selon l’invention comprenant la séparation aléatoire de la pluralité de capsules fournie à l’étape a) en une pluralité de sous- ensembles.

Chaque sous-ensemble formé à l’étape b) comprend au moins une capsule, de préférence au moins deux capsules, mieux au moins cinq capsules, voire au moins dix capsules.

De préférence, la pluralité de capsules fournie à l’étape a) est séparée en au moins deux sous-ensembles.

Dans un mode de réalisation particulier, la pluralité de capsules fournie à l’étape a) est séparée en n sous-ensembles, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2. De manière encore préférée, chaque sous-ensemble comprend au moins p capsules, p étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 5, et mieux supérieur ou égal à 10.

La pluralité de capsules fournie à l’étape a) peut être séparée en sous-ensembles par toute technique bien connue de l’homme du métier.

Typiquement, les capsules peuvent être récupérées en utilisant un tamis, et séparées en étant prélevées une par une, ou encore grâce à un contenant type cuillère ne pouvant contenir qu’un nombre fixé de capsules.

Il est connu que la culture de cellules vivantes au sein de capsules selon l’invention permet d’accéder à des concentrations de cellules plus élevées que dans les procédés en bulk, comme décrit dans WO2016062836. L'encapsulation de cellules vivantes et la culture en capsules de ces cellules vivantes, présente en outre les avantages suivants par rapport aux procédés classiques :

- les cellules vivantes encapsulées sont protégées des contraintes mécaniques, telles que le cisaillement, diminuant ainsi la mort cellulaire au cours du procédé de culture des cellules ;

- les cellules vivantes encapsulées sont partiellement protégées du milieu extérieur, car la membrane de la capsule présente une perméabilité sélective (en particulier, les bactéries ne peuvent pas pénétrer dans la capsule), ce qui permet avantageusement d’éviter d’éventuelles contaminations et donc de réduire la mort cellulaire ;

- la taille des capsules et leurs propriétés mécaniques les rendent plus faciles à manipuler que les cellules vivantes en tant que telles, notamment pour des changements de milieu de culture ou lors de la récolte ; et - un traitement postérieur à la croissance et éventuellement à rélicitation peut être mis en oeuvre afin d’imperméabiliser les capsules, isolant ainsi leur contenu pour en faciliter la conservation jusqu’à leur utilisation.

Les propriétés mécaniques de la membrane des capsules sont également avantageuses pour les raisons suivantes :

Le réseau d’hydrogel confère en effet des propriétés mécaniques semi-solides aux capsules de l’invention, bien supérieures à celles de cellules en tant que telles. En pratique, cela présente un intérêt significatif pour la culture de cellules vivantes, car cela permet de conférer une résistance mécanique importante à des cellules vivantes, classiquement fragiles. Alors que la résistance mécanique de ces cellules vivantes repose nativement sur les propriétés de la bicouche lipidique constituant leur membrane, lorsqu’elles sont encapsulées dans une capsule selon l’invention, celles-ci sont désormais protégées par un réseau macromoléculaire de plusieurs micromètres à plusieurs dizaines de micromètres d’épaisseur (i.e. la membrane d’hydrogel des capsules). Dans le cas de cellules vivantes ayant une résistance mécanique faible, un gain de résistance d’un facteur supérieur à 10, voire compris de 100 à 100 000, est obtenu, ce qui facilite les manipulations.

On obtient ainsi des objets « solides » plus facilement manipulables, à l’échelle de procédés industriels de type mélange, brassage, filtrage, lavage et décantage.

Il est également plus facile de manipuler ces objets, et donc la biomasse qu’ils encapsulent, pour faciliter la caractérisation différentielle des échantillons. Ceci permet la mise en œuvre facilitée et économique de larges études de criblage de conditions de culture et/ou d’élicitation de composés d’intérêt. Suite à une caractérisation de chacune des capsules par voie physicochimique (absorbance, fluorescence) et/ou biologique (ELISA), on réalise par exemple un traitement statistique, ou un tri des différentes populations en fonction de la réponse obtenue.

La membrane d’hydrogel des capsules de l’invention présente également une semi-perméabilité, reposant en particulier sur le caractère poreux de la structure du réseau de chaînes du polyélectrolyte. Ce réseau est caractérisé par une taille moyenne de pores comprise entre 5 nm et 25 nm, et présente donc une taille de coupure de l’ordre de 20 nm à 25 nm. Cette porosité permet le libre passage de gaz dissous, de minéraux, de nutriments nécessaires à la prolifération de cellules vivantes, tels que de petites biomolécules (acides aminés et peptides), et de petites macromolécules de poids moléculaire inférieur à 1 MDa. La membrane retient par contre tout élément de taille caractéristique supérieure à la taille de coupure, soit les macromolécules ou biomolécules de poids moléculaire supérieur à 1 MDa, ou encore les organismes cellulaires tels que les cellules vivantes, par exemple les algues, ou encore les bactéries et les champignons.

En pratique, cela présente un intérêt significatif pour la culture de cellules vivantes en permettant de contrôler les échanges entre l’extérieur et l’intérieur de la capsule.

Il est ainsi possible d’apporter des nutriments, de l’oxygène ou encore de la lumière à la biomasse encapsulée par transit à travers la phase externe. Il est parallèlement possible de permettre la sortie de molécules depuis l’intérieur de la capsule vers le milieu de culture extérieur, notamment pour l’élimination des déchets consécutifs du métabolisme/catabolisme de la biomasse encapsulée. Ces échanges peuvent de plus être facilités par un brassage du milieu de culture extérieur, sans que cela ne menace les cellules vivantes comme c’est le cas dans les procédés en bulk.

Il est également possible de limiter le passage d’organismes cellulaires à travers la membrane. Il est donc possible d’encapsuler les cellules vivantes avec l’ensemble de la flore bactérienne endogène apte à leur prolifération, tout en évitant toute contamination par des bactéries exogènes après l’encapsulation. Il est par exemple possible de laver les capsules contenant les cellules vivantes après une contamination bactérienne exogène, là où la même contamination engendrerait la destruction de l’ensemble des cellules dans un procédé en bulk.

Enfin, cette semi-perméabilité permet également de contrôler le relargage d’éléments encapsulés, tel que des composés d’intérêt produits par les cellules vivantes.

La production des cellules vivantes sous forme encapsulée conformément à l’invention permet aussi de limiter les effets de détection du quorum ( quorum sensing). Lors de leur croissance, les organismes libèrent généralement des molécules inhibitrices, qui limitent la prolifération des organismes alentours. Cet effet biologique permet aux populations de limiter leur densité, afin d’éviter les effets de privation de nourriture et de mort cellulaire associés à une surpopulation. L’encapsulation permet de drainer en continu ces molécules inhibitrices, sans entraîner de perte de biomasse.

Un lavage est aussi utile pour éliminer des déchets métaboliques ou cataboliques, et orienter ainsi l’activité de la biomasse. Cette approche se révèle ainsi être une méthode d’élicitation en soi.

Par ailleurs, un des facteurs limitant de la culture de cellules vivantes est l'apport de lumière. Dans un procédé en bulk, le flux de lumière est diminué par le « fouling », c'est-à-dire le collage de biomolécules et de micro-organismes sur les parois du bioréacteur. Cette couche absorbe la lumière, ce qui induit une baisse du flux lumineux capté par les cellules vivantes. L'accumulation de ce dépôt induit des pertes de charge croissantes et augmente les coûts de production.

Or, la culture de cellules vivantes en capsules selon l’invention permet de :

- limiter le dépôt des biomolécules, celles-ci étant en partie retenues à l'intérieur des capsules, de plus ces biomolécules peuvent être récupérées en fin de procédé, et

- empêcher le dépôt des cellules vivantes sur les parois des flacons dans lesquels les capsules sont cultivées ou stockées (propriété anti-fouling), lesdites cellules étant en effet encapsulées.

Enfin, ce lavage peut aussi être envisagé pour éliminer de possibles contaminants de la culture de biomasse, sans manipulation directe de celle-ci. Ces contaminants peuvent être d’origine chimique (molécules de type métaux lourds ou autres rejets chimiques), physique (de type particulaire), ou biologique (cellules mortes, bactéries exogènes...). Cette méthode peut donc permettre de limiter les pertes d’exploitation.

Une méthode de criblage selon l’invention offre donc des possibilités très larges en termes de types cellulaires utilisables et de conditions de culture. Elle permet notamment de travailler avec des cellules non adhérentes ou avec des cellules ayant besoin d'un environnement à 3 dimensions pour survire. Cette méthode, via le recours à l'encapsulation, apporte donc une plus-value de taille, que ce soit de manière générale ou pour les bioprocédés basés sur des cellules vivantes, en particulier des microalgues.

Culture des capsules

Les étapes c) et e) de la méthode de criblage selon l’invention comprennent chacune la culture de la pluralité de sous-ensembles de capsules dans une pluralité de conditions de culture différentes, lesdits sous-ensembles de capsules étant cultivés dans une pluralité de milieux de culture externes, chaque milieu de culture externe comprenant un marqueur unique différent des marqueurs présents dans les autres milieux de culture externes, lesdites capsules étant cultivées pendant une période appropriée pour permettre auxdits marqueurs de s’adsorber sur lesdites capsules.

Conditions de culture

Par « condition de culture », on entend ici l’environnement dans lequel les cellules sont placées ou auquel les cellules sont exposées. Ainsi, le terme « condition de culture » peut se référer à un milieu particulier, une température particulière, des conditions atmosphériques particulières, un substrat particulier, des conditions d’agitation particulières, des conditions d’éclairage particulières, à des agents particuliers incorporés dans le milieu de culture, un pH particulier, une salinité particulière, etc..., qui peuvent affecter la croissance des cellules et/ou la différentiation des cellules et/ou les propriétés des cellules et/ou la production de composés par les cellules.

Lors d’une étape de culture de la pluralité de sous-ensembles dans une pluralité de conditions de culture différentes, de préférence, chaque condition de culture de la pluralité de conditions de culture différentes est différente d’une autre condition de culture de ladite pluralité de conditions de culture différentes.

Une condition de culture de la pluralité de conditions de culture d’une étape de culture donnée (par exemple l’étape c)) peut être identique à une condition de culture de la pluralité de conditions de culture d’une autre étape de culture donnée (par exemple l’étape d)). Autrement dit, lors de la mise en œuvre de la méthode de criblage selon l’invention, une capsule donnée peut être cultivée dans les mêmes conditions de culture à deux étapes de culture différentes. De même, lors de la mise en œuvre de la méthode de criblage selon l’invention, une capsule donnée peut être cultivée dans une condition de culture à une étape de culture donnée, condition de culture dans laquelle est cultivée une autre capsule à une autre étape de culture.

Milieu de culture

Par « milieu de culture », on entend ici un support, en particulier liquide, permettant la culture de cellules. Un milieu de culture contient typiquement des sels minéraux, des sources d’énergie, des acides aminés, des vitamines, des facteurs de croissance.

Comme bien connu de l’homme du métier, le milieu de culture utilisé dépendra du type de cellules présentes dans les cellules cultivées.

Typiquement, le milieu de culture utilisé peut être sélectionné parmi le milieu Parker, Ham, Dulbecco, Grâce, MEM, le milieu de culture d'Erdschreiber, le milieu F/2, le milieu TAP, de l’eau de mer reconstituée, le milieu DM (diatomée), le milieu Minimum, et l’un quelconque de leurs mélanges.

Le milieu de culture d'Erdschreiber est une solution comprenant NaCI (1 1 ,4 g/L), Tris (5,90 g/L), NH ₄ CI (2,92 g/L), KOI (0,73 g/L), K ₂ HP0 ₄ .2H ₂ 0 (72 mg/L), FeS0 ₄ .2H ₂ 0 (1 ,9 mg/L), H ₂ S0 ₄ (0,04 mg/L), MgS0 ₄ (7,65 g/L), CaCI ₂ (1 ,43 g/L), NaN0 ₃ (2 mg/L), Na ₂ HPO ₄ (0,2 mg/L), un extrait de sol (24,36 ml_/L) et de l’eau (QSP 1 L). Un extrait de sol désigne le filtrat obtenu par filtration d’un mélange de terre et d’eau.

Le milieu F/2, commercialement disponible (notamment à l’Ecole des Sciences Biologiques de l’Université du Texas, ou chez Varicon Aqua), est une solution comprenant NaN0 ₃ (8,82.10 ⁴ mol/L), NaH ₂ P0 ₄ 0.H ₂ 0 (3,62.10 ⁵ mol/L), Na ₂ Si0 ₃ .9H ₂ 0 (1 ,06.10 ⁴ mol/L), FeCI ₃ .6H ₂ 0 (1 ,17.10 ⁵ mol/L), Na ₂ EDTA.2H ₂ 0 (1 ,17.10 ⁵ mol/L), CuS0 ₄ .5H ₂ 0 (3,93.10 ⁸ mol/L), Na ₂ Mo0 ₄ .2H ₂ 0 (2,60.10 ⁸ mol/L), ZnS0 ₄ .7H ₂ 0 (7,65.10 ⁸ mol/L), COCI ₂ .6H ₂ 0 (4,20.10 ⁸ mol/L), MnCI ₂ .4H ₂ 0 (9,10.10 ⁷ mol/L), thiamine HCI (2,96.10 ⁷ mol/L), biotine (2,05.10 ⁹ mol/L), cyanocobalamine (3,69.10 ¹ ° mol/L) et de l’eau (QSP 1 L).

Le milieu TAP, commercialement disponible, (notamment chez LifeTech), est un mélange de tampon Beijerincks (2x) (50 mL), de tampon phosphate 1 M pH 7 (1 mL), de Solution trace (1 mL), d’acide acétique (1 mL) et d’eau (QSP 1 L). Les compositions des tampons Beijerincks (2x) et phosphate 1 M pH 7 et de la Solution trace sont décrites dans les exemples ci-après. Le pH du milieu TAP est de 7,3. L’osmolarité du milieu TAP est de 60 mOsm.

L’eau de mer reconstituée est une solution comprenant NaCI (1 1 ,7 g/L), Tris (6,05 g/L), NH ₄ CI (3,00 g/L), KOI (0,75 g/L), K ₂ HP0 ₄ .2H ₂ 0 (74,4 mg/L), FeS0 ₄ .2H ₂ 0 (2 mg/L), H ₂ S0 ₄ (0,05 mg/L), MgS0 ₄ (7,85 g/L), CaCI ₂ (1 ,47 g/L) et de l’eau (QSP 1 L). Le pH de l’eau de mer reconstituée varie de 7,5 à 8,4. L’osmolarité de l’eau de mer reconstituée est de 676 mOsm.

Le milieu DM (diatomée) est une solution comprenant Ca(N0 ₃ ) ₂ (20 g/L), KH ₂ P0 ₄ (12,4 g/L), MgS0 ₄ .7H ₂ 0 (25 g/L), NaHC0 ₃ (15,9 g/L), FeNaEDTA (2,25 g/L), Na ₂ EDTA (2,25 g/L), H ₃ B0 ₃ (2,48 g/L), MnCI ₂ .4H ₂ 0 (1 ,39 g/L), (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ 0 ₂₄ .4H ₂ 0 (1 g/L), cyanocobalamine (0,04 g/L), thiamine HCl (0,04 g/L), biotine (0,04 g/L), NaSi0 ₃ .9H ₂ 0 (57 g/L) et de l’eau (QSP 1 L).

Le milieu Minimum est un mélange de tampon Beijerincks (2x) (50 mL), de tampon phosphate (2x) (50 mL), de Solution trace (1 mL) et d’eau (QSP 1 L). Les compositions des tampons Beijerincks (2x) et phosphate (2x) et de la Solution trace sont décrites dans les exemples ci-après. L’osmolarité du milieu Minimum est de 37 mOsm.

Le milieu de culture susceptible d’être présent dans le cœur des capsules est appelé « milieu de culture interne » et le milieu de culture dans lequel sont cultivées les capsules est appelé « milieu de culture externe ». Le milieu de culture interne peut être identique ou différent du milieu de culture externe.

Lorsque la condition de culture appliquée est une température particulière, des conditions atmosphériques particulières, des conditions d’agitation particulières, des conditions d’éclairage particulières, le milieu de culture externe utilisé sera de préférence un milieu de culture basique permettant la survie des cellules en culture.

Lorsque la condition de culture appliquée est un substrat particulier, des agents particuliers incorporés dans le milieu de culture externe, qui peuvent affecter la croissance des cellules et/ou la différentiation des cellules et/ou les propriétés des cellules et/ou la production de composés par les cellules, le milieu de culture externe utilisé sera de préférence un milieu de culture basique permettant la survie des cellules en culture comprenant en outre le substrat ou les agents particuliers testés.

Dans le cadre de l’invention, chaque milieu de culture externe comprend un marqueur unique différent des marqueurs présents dans les autres milieux de culture externes. En particulier, lors d’une étape de culture de la pluralité de sous-ensembles dans une pluralité de milieux de culture externes, chaque milieu de culture de la pluralité de milieux de culture externes comprend un marqueur différent de ceux contenus dans les autres milieux de culture externes de ladite pluralité de milieux de culture externes. De plus, le marqueur compris dans un milieu de culture externe de la pluralité de milieux de culture externes d’une étape de culture donnée (par exemple l’étape c)) est également différent des marqueurs contenus dans les milieux de culture externes de la pluralité de milieux de culture externes d’une autre/des autres étape(s) de culture donnée(s) (par exemple l’étape d)). Autrement dit, lors de la mise en œuvre de la méthode de criblage selon l’invention, une capsule donnée ne peut pas être mise en présence d’un même marqueur à deux étapes de culture différentes. De même, lors de la mise en œuvre de la méthode de criblage selon l’invention, deux capsules de deux sous-ensembles donnés ne peuvent pas être mises en présence d’un même marqueur à une étape de culture donnée.

Marqueurs

Par « marqueur », on entend ici un moyen d’identifier de manière unique une condition de culture à laquelle une cellule comprise dans une capsule a été exposée à un moment donné d’une séquence de conditions de culture. Les marqueurs pouvant être utilisés dans le cadre de l’invention sont ainsi par exemple des molécules à séquence, structure ou masse unique, des molécules ou objets (tels que des billes) fluorescentes.

N’importe quel marqueur peut être utilisé tant qu’il peut s’adsorber à la surface des capsules, de préférence s’adsorber facilement et de manière permanente à l’enveloppe desdites capsules, et qu’il peut être détecté à la surface de ces capsules, tel que des marqueurs peptidiques, des composés colorés ou fluorescents, des amines secondaires, des halocarbones, des mélanges d’isotopes stables, des oligonucléotides.

De préférence, un marqueur utilisé dans le cadre de l’invention est stable physiquement et non toxique pour les cellules vivantes encapsulées et/ou pas apte à pénétrer dans le cœur des capsules. L’homme du métier saura ajuster la nature et/ou la quantité de marqueurs présents dans les milieux de culture externes en fonction des prérequis susmentionnés, mais également de la nature du milieu de culture externe et/ou des conditions de culture considérées.

Dans un mode de réalisation particulier, le marqueur est sélectionné dans le groupe constitué d’un oligonucléotide, d’un fluorophore ou d’une protéine marquée. En particulier, les marqueurs utilisés dans le cadre de l’invention peuvent être des fluorophores encapsulés dans ou greffés sur des véhicules de polymères ou de silice ou conjugués à des protéines, des quantum dots, des colloïdes, en particulier des billes magnétiques, à la surface desquelles sont greffés des oligonucléotides tels que des sondes ADN ou des sondes ARN, ou des protéines marquées ou étiquetées avec un « tag » détectable.

Les quantum dots sont des nanocristaux semiconducteurs caractérisés par un large spectre d'excitation, un spectre d'émission fin, des pics d'émission ajustables, une longue durée de vie de photoluminescence et un photoblanchiment négligeable, et sont biocompatibles. Ces particules font typiquement une dizaine de nanomètres de diamètre.

Les quantum dots peuvent être choisis parmi les quantum dots dits « core », les quantum dots dits « core-shell », et leurs mélanges.

Les quantum dots dits « core » sont composés uniquement du cœur semi- conducteur et d'une couche de groupements carboxyles.

A titre de quantum dots « core », on peut citer les QD suivants chez Sigma : 777951 , dont le maximum d'émission est à 610 nm; 777978, dont le maximum d'émission est à 710 nm.

Les quantum dots dits « core-shell » ont un cœur protégé par une couche protectrice, typiquement en ZnS.

A titre de quantum dots « core-shell », on peut citer les QD suivants de chez OceanNanotech : QSH-490 et QSH-620, protégés par une couche de ZnS et présentant des groupements carboxyles.

Pour mesurer l'évolution de l'intensité de photoluminescence de quantum dots dans un milieu de culture, on peut notamment utiliser un lecteur de plaque TECAN M200 Pro.

Par « protéine marquée ou étiquetée avec un tag détectable », on entend ici une protéine dont au moins l’un des acides aminés est modifié (par exemple par un acide aminé comprenant un isotope particulier), ou est conjugué ou fusionné avec une molécule ou une autre protéine détectable par des techniques de détection usuelles, telle qu’un fluorophore, une étiquette de type GST, 6Histidine ou Flag. De telles protéines marquées ou étiquetées avec un tag détectable peuvent ainsi être typiquement détectées par immunoprécipitation ; immunofluorescence ; Western Blot avec détection colorimétrique, par chimioluminescence, par autoradiographie ou par fluorescence ; cytométrie en flux ; ou par microscopie à fluorescence.

Le greffage des sondes ADN ou ARN à la surface de colloïdes, en particulier de billes magnétiques, peut être mis en œuvre par toute technique bien connue de l’homme du métier. Il est en effet tout à fait possible d'établir des liaisons covalentes entre une sonde d'ADN ou d’ARN et une bille magnétique. Plusieurs méthodes sont bien connues de l’homme du métier, telles que l’utilisation de N-hydroxysuccinimide PEG ou N- oxysuccinimide, le l-Linker ou la voie enzymatique.

Dans un mode de réalisation particulier, les marqueurs utilisés dans le cadre de l’invention sont des particules colloïdales de polymère ou de silice encapsulant ou sur lesquelles sont greffées un fluorophore ou un oligonucléotide, ou des protéines marquées ou étiquetées avec un tag détectable. Dans un mode de réalisation particulier, les marqueurs utilisés dans le cadre de l’invention sont des particules colloïdales de polymère ou de silice encapsulant ou sur lesquelles sont greffées un fluorophore ou un oligonucléotide.

Dans le cadre de l’invention, les marqueurs utilisés marquent la capsule par adsorption sur ladite capsule, en particulier via des liaisons électrostatiques. Autrement dit, la présente invention a l’avantage de ne pas nécessiter d’encapsulation supplémentaire de la cellule au moment du marquage.

Afin que les marqueurs puissent s’adsorber de manière électrostatique aux capsules, il est nécessaire que les marqueurs et la surface des capsules aient une charge opposée.

Aussi, dans certains modes de réalisation, lorsque la charge des marqueurs utilisés est identique à la charge des capsules fournies à l’étape a), la charge des capsules est préalablement inversée avant la première étape de culture c).

Les techniques d’inversion de la charge d’une capsule sont bien connues de l’homme du métier. Ainsi lorsque la charge des capsules fournies à l’étape a) est négativement, par exemple lorsque le polyélectrolyte utilisé pour former l’enveloppe externe est un alginate, la charge des capsules peut être inversée par adsorption avec un polymère chargé positivement, tel que la polylysine.

En d’autres termes, dans un mode de réalisation particulier, le(s) marqueur(s) est/sont adsorbé(s) sur l’enveloppe des capsules au moyen de liaison faibles ou non covalentes, de préférences électrostatiques, optionnellement au moyen d’un intermédiaire, par exemple figuré par au moins un polymère chargé positivement, notamment la polylysine.

Récupération et regroupement des capsules et répétition

L’étape d) de la méthode de criblage selon l’invention comprend la récupération et le regroupement de la pluralité de sous-ensembles de capsules suivis de la séparation aléatoire de la pluralité de capsules ainsi regroupées en une pluralité de nouveaux sous- ensembles.

La récupération et le regroupement des sous-ensembles de capsules peuvent être mises en oeuvre par toute technique bien connue de l’homme du métier.

La récupération (ou récolte) des capsules se fait typiquement par élimination du milieu de culture externe par filtration des capsules, ou par toute autre technique de récupération des capsules. Pour filtrer les capsules, on utilise typiquement un tamis présentant une taille d’ouverture inférieure au diamètre moyen des capsules de l’invention, qui sont sensiblement sphériques. Lorsque les marqueurs adsorbés sur les capsules comprennent des billes magnétiques, les capsules peuvent également être récupérées avec un aimant.

Dans un mode de réalisation particulier, tous les sous-ensembles cultivés à l’étape de culture précédente sont regroupés. Dans un autre mode de réalisation particulier, une partie seulement des sous-ensembles cultivés à l’étape de culture précédente sont regroupés.

La séparation des capsules en nouveaux sous-ensembles peut être mise en oeuvre par toutes techniques bien connue de l’homme du métier telles que celles décrites dans la section « Séparation des capsules » ci-dessus.

Chaque nouveau sous-ensemble formé à l’étape d) comprend au moins une capsule, de préférence au moins deux capsules, mieux encore au moins cinq capsules, voire au moins dix capsules. Les capsules formant un nouveau sous-ensemble à l’étape d) pouvaient faire partie ou non d’un même sous-ensemble à l’étape de culture précédente.

De préférence, la pluralité de capsules regroupées à l’étape d) est séparée en au moins deux sous-ensembles.

Dans un mode de réalisation particulier, la pluralité de capsules regroupées à l’étape d) est séparée en m sous-ensembles, m étant un nombre entier supérieur ou égal à 2. De manière encore préférée, chaque sous-ensemble comprend au moins p capsules, p étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 5, et mieux encore supérieur ou égal à 10. Le nombre de sous-ensembles formés à l’étape d) peut être identique ou différent au nombre de sous-ensembles formé à l’étape de séparation précédente.

Les étapes b) à e) de la méthode de criblage selon l’invention peuvent être répétées de manière itérative.

Comme il apparaîtra clairement à l’homme du métier, le nombre de répétitions dépendra du nombre de conditions de culture constituant les séquences de conditions de culture à étudier.

Identification et sélection des capsules d’intérêt

L’étape g) de la méthode de criblage selon la présente invention comprend l'identification et la sélection, au sein de la pluralité de capsules, de capsules d’intérêt présentant, suite à la mise en oeuvre des étapes (b) à (f), au moins une caractéristique d’intérêt.

Par « identification d’une capsule d’intérêt », on entend ici le fait de mettre en évidence, par une technique de détection, qu’une capsule donnée, parmi une pluralité de capsules, présente une caractéristique recherchée.

Comme il apparaîtra clairement à l’homme du métier, la technique de détection utilisée dépendra de la caractéristique recherchée ou caractéristique d’intérêt.

De préférence, la technique de détection ne nécessite pas de détruire la capsule.

De nombreuses caractéristiques d’intérêt peuvent être recherchées.

Ainsi, la caractéristique d’intérêt peut être choisie parmi l’expression d’au moins une molécule d’intérêt par les cellules vivantes présentes dans la capsule, un niveau de biomasse d’intérêt présent dans la capsule, la présence dans la capsule d’une cellule ou d’un ensemble de cellules présentant une morphologie d’intérêt et la présence dans la capsule de cellules présentant une fonction d’intérêt.

Par « molécule d’intérêt », on entend ici tout composé, acide aminé, protéine, métabolite produit par une cellule vivante suite à la culture de ladite cellule dans des conditions de culture particulières. Ladite molécule d’intérêt peut être intracellulaire ou secrétée par la cellule dans la phase interne de la capsule la contenant.

Ainsi, dans ce mode de réalisation particulier, la/les séquence(s) de conditions de culture d’intérêt(s) correspond(ent) de préférence aux conditions d’élicitation optimale(s).

Dans le cadre de la présente description, on entend par « élicitation » la stimulation de la production de molécules d’intérêt par une cellule vivante, ladite stimulation étant provoquée par la mise en conditions particulières, qu'elles soient physico-chimiques, résultant d'une modulation de la température, de la pression ou de l'éclairement, ou encore qu’elles reposent sur la présence d’une molécule particulière, dite « molécule élicitante ». On provoque ainsi artificiellement la production de molécules d’intérêt par les cellules vivantes encapsulées.

Les capsules selon l’invention peuvent être mises en culture en conditions élicitantes bien connues de l’homme du métier, comme par l’ajout au milieu de culture externe d’acide salicylique, d'éthylène, de jasmonate ou de chitosan (cf. par exemple W02003/077881 ).

Les molécules d’intérêt produites peuvent typiquement être soumises à un ou plusieurs traitements, tels que purification, concentration, séchage, stérilisation et/ou extraction. Ces molécules peuvent ensuite être destinées à être incorporées dans une composition cosmétique, agro-alimentaire ou pharmaceutique.

A titre de molécule d’intérêt, les capsules de l’invention peuvent permettre notamment de produire des lipides présentant un intérêt en cosmétique, comme par exemple des acides gras, tels que l’acide linoléique, l’acide alpha linoléique, l'acide gamma linoléique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide eicosapentanoïque, l'acide docosahexanoïque, l'acide arachidonique ; des dérivés d’acide gras, tels que des céramides ; ou encore des stérols, tels que le brassicastérol, le campestériol, le stigmastérol et le sitostérol.

Selon la nature du ou des molécules d’intérêt et celle des cellules vivantes, l’homme du métier est apte à déterminer le ou les traitements nécessaires à la récupération et purification de ladite molécule d’intérêt.

Selon un mode de réalisation, la récupération de la molécule d’intérêt s’effectue par traitement du milieu de culture externe dans lequel les capsules sont en culture, par des méthodes de purification classiques, comme l’extraction liquide/liquide (séparation de phase organique/aqueuse), le lavage acido-basique, la concentration de solvant et/ou la purification par chromatographie, entre autres.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté aux cas où la molécule d’intérêt est excrétée par les cellules vivantes puis diffuse ensuite hors des capsules. Ce mode de réalisation présente l’avantage de conserver intactes les capsules et les cellules.

Selon un autre mode de réalisation, la récupération de la molécule d’intérêt s’effectue par ouverture des capsules, puis par ouverture de la membrane des cellules, puis par traitement du mélange obtenu, par des méthodes de purification classiques.

L’ouverture des capsules peut être de type chimique ou mécanique. Un mode d’ouverture chimique est par exemple la dépolymérisation de la membrane, typiquement par mise en contact avec une solution d’ions citrate. Un mode d’ouverture mécanique est typiquement le broyage des capsules.

L’ouverture de la membrane des cellules est typiquement réalisée par broyage des cellules.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté aux cas où la molécule d’intérêt reste confinée au sein des cellules vivantes.

Par « niveau de biomasse d’intérêt », on entend ici la quantité de cellules présentes dans la capsule, suite à la prolifération des cellules de la capsule du fait de la culture desdites cellules dans des conditions de culture particulières.

Par « ensemble de cellules présentant une morphologie d’intérêt », on entend ici au moins une cellule présente dans la capsule présentant des caractéristiques morphologiques, typiquement dues à une différentiation spécifique, qu’elle ne présentait pas au début de la méthode de criblage et qui sont dues à la culture de la cellule dans des conditions de culture particulières.

Par « cellules présentant une fonction d’intérêt », on entend ici des cellules présentant par exemple des activités enzymatiques particulières, des capacités de sécrétion de molécules spécifiques, etc..., qu’elles ne présentaient pas au début de la méthode de criblage et qui sont dues à la culture des cellules dans des conditions de culture particulières.

Par « sélection d’une capsule d’intérêt », on entend ici la séparation des capsules présentant une caractéristique d’intérêt, telle que définie ci-dessus, des capsules ne présentant pas cette caractéristique d’intérêt.

La sélection de la capsule d’intérêt peut être mise en œuvre par toute technique bien connue de l’homme du métier, telle que par exemple par cytométrie, par le COPAS Flow Pilot, ou encore l'outil de tri Millidrop Analyzer développé par MilliDrop, le pipetage automatique ou manuel.

Identification des séquences de conditions de culture d’intérêt

L’étape h) de la méthode de criblage selon l’invention comprend l’identification de la ou des séquence(s) de conditions de culture à(aux) laquelle(s) les capsules d’intérêt identifiées à l’étape (g) ont été exposées, au moyen des marqueurs adsorbés sur lesdites capsules, la(les)dite(s) séquence(s) de conditions de culture ainsi identifiées étant une (des) séquence(s) de conditions de culture d’intérêt pour l’obtention de ladite caractéristique d’intérêt. Le fait d’utiliser un marqueur unique associé à chaque condition de culture testée à chaque étape de culture, permet d’associer à chaque séquence de conditions de culture une combinaison spécifique et unique de marqueurs.

La présente invention repose sur cette association entre une combinaison spécifique et unique de marqueurs et une séquence spécifique de conditions de culture. Détecter la combinaison de marqueurs unique et spécifique s’étant adsorbée sur une capsule permet donc d’identifier la séquence spécifique de conditions de culture à laquelle cette capsule a été soumise.

La détection de la combinaison de marqueurs présents sur les capsules d’intérêt identifiées et sélectionnées à l’étape g) permet donc d’identifier la séquence de conditions de culture d’intérêt ayant permis d’obtenir la caractéristique d’intérêt recherchée.

Comme il sera clairement apparent pour l’homme du métier, la détection des marqueurs dépendra du type de marqueurs utilisés.

Ainsi, lorsque le marqueur est un fluorophore, la détection peut être réalisée par cytométrie ; lorsque le marqueur est oligonucléotide, la détection peut être réalisée par PCR ou par puce ADN ; lorsque le marqueur est un isotope spécifique, la détection peut notamment être réalisée par spectrométrie de masse.

Au vu de ce qui précède, et comme illustré par les exemples ci-dessous, il ressort que le concept du split-pool utilisé dans le cadre de la présente invention est particulièrement efficace pour cribler des séquences de conditions de culture avec des capsules comprenant des cellules vivantes.

Pour cela, il suffit de déplacer les capsules de bain en bain, exposant ainsi les cellules vivantes encapsulées à des conditions de culture différentes. Le marquage spécifique et univoque des capsules à chaque séjour dans un milieu de culture externe permet de révéler leur histoire respective a posteriori.

Les expressions « compris entre ... et ... », « compris de ... à ... » et « allant de ... à ... » doivent se comprendre bornes incluses, sauf si le contraire est spécifié.

Les exemples ci-après illustrent l’invention sans en limiter la portée. EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation de capsules utilisées dans le cadre de l’invention

1. Préparation des solutions pour la fabrication de capsules

L'intégralité du matériel (tubes, connecteurs, cristallisoir, etc.) utilisé est autoclavé. Pour les éléments du dispositif fluidique ne résistant pas aux hautes températures, on procède à un rinçage avec de l'éthanol à 70%. Le procédé d'encapsulation décrit ci-après est réalisé en conditions stériles, sous une hotte à flux laminaire. Tous les liquides sont également stérilisés. L'autoclavage est une méthode simple de stérilisation de liquides. Le bain de calcium est autoclavé. Pour les solutions de polymères (alginate et cellulose), si ces dernières sont portées à 120°C pendant 20 min, leurs propriétés rhéologiques sont altérées à un point qui rend l'encapsulation impossible. Leur stérilisation est donc effectuée par filtration à 0,2 pm ou par pasteurisation à 65°C pendant 60 minutes (plus long mais température moins élevée que l'autoclavage, ce qui altère moins les propriétés rhéologiques des polymères).

- Bain de calcium BF ( solution gélifiante) : CaCI ₂ (90 mM) et quelques gouttes d'une solution de Tween 20 10% m/v et de l’eau osmosée.

- Phase externe OF ( membrane ) : solution d’alginate (1 ,7%) et du SDS 0,5 mM dans HEPES (50 mM) et de l’eau osmosée.

- Phase interne IF (cœur) : mélange 50/50 d’une solution à 1 % de cellulose + HEPES 50 mM + eau et milieu de culture MCCM + micro-algue Chlamydomonas reinhardtii

- Milieu de culture externe (MCCM) : voir tableau 1

Tableau 1 : Composition du milieu MCCM

Toutes les phases subissent préalablement à leur utilisation une étape de filtration à 5 pm (sauf milieu de culture MCCM). Cette étape de filtration permet d’éviter la présence de particules ou d’agrégats solides conduisant au bouchage des buses utilisées pour la production, mais est aussi utilisée pour stériliser les phases.

2. Fabrication de capsules

Le procédé de fabrication de capsules est basé sur la co-extrusion concentrique de deux solutions, notamment décrite dans WO 2010/063937 et FR2964017, pour former des gouttes doubles.

Débit IF : 130 ml_/h.

Débit OF : 70 ml_/h.

Un dispositif piézo-électrique (Preloaded piezo actuator, 15 pm, de chez PI) est ensuite mis sous tension, et la fréquence d'excitation est ajustée (typiquement autour de 1 ,6 kHz). Une électrode est mise sous tension, typiquement à 1000 V afin de charger les gouttes. Les répulsions induites amènent les gouttes à s'éloigner, ce qui transforme le jet en cône et réduit la coalescence en vol. Cela permet d'obtenir une population de gouttes, et donc de capsules, très monodisperses. Les capsules terminent ensuite leur chute dans le bain de calcium.

Une fois la collecte terminée, les capsules sont laissées quelques minutes dans le bain de calcium, puis sont filtrées grâce à un tamis cellulaire (maille 100 pm). Les capsules sont ensuite lavées avec le milieu de culture MCCM.

Ce système permet d'encapsuler des microalgues sans effet délétère, et de les cultiver dans ce véhicule. Il est possible d'atteindre des concentrations très importantes (3460 millions de cellules par mL dans la capsule), sans impact majeur sur la viabilité de la culture.

Exemple 2 : test d’adsorption de marqueurs

Les marqueurs mis en œuvre dans cet exemple 2 sont des billes magnétiques, figurées par des particules composées d’un cœur paramagnétique encapsulé dans une coque en polymère (Ademtech, Carboxyl-Adembeads 0212) ou en silice (Ademtech, Silica-Adembeads 0252). Ces billes font 200 nm de diamètre. Les premières portent en surface des groupements carboxyles, les deuxièmes des silanols. Ainsi, ces billes portent une charge de surface négative. Leurs potentiels Zêta sont mesurés grâce à un Zetasizer Nano ZS, et valent respectivement -9,4 mV et -33,4 mV.

Ces particules restent individualisées en solution grâce aux répulsions électrostatiques (électrostatiques et stériques dans le cas des Carboxyl-Adembeads) qu’elles exercent l’une sur l’autre.

Les inventeurs ont vérifié si ces particules sont stables dans le milieu de culture MCCM décrit dans le tableau 1 ci-dessus.

Pour cela, les inventeurs ont dispersé lesdits marqueurs dans du MCCM, attendu une vingtaine de minutes et regardé au microscope l’état de la suspension.

Pour comparaison, les inventeurs ont réalisé la même expérience dans du chlorure de calcium 100 mM.

Les inventeurs ont montré que ces marqueurs ne s’agrègent pas dans le MCCM, et qu’ils sont donc utilisables dans le contexte de la présente invention.

Les inventeurs ont ensuite vérifié s’il était possible d’adsorber ces marqueurs sur les capsules.

Compte-tenu des charges négatives de l’enveloppe des capsules et des marqueurs, cette étape d’adsorption nécessite une étape préalable consistant à charger positivement l’enveloppe des capsules de l’exemple 1. Ainsi, les inventeurs ont incubé une centaine de capsules selon l’exemple 1 dans 200 pL de MCCM additionné de 0,001% d’un polymère chargé positivement, la polylysine PLL (DKSH), pendant une vingtaine de minutes. Les capsules sont ensuite lavées avec du MCCM. Puis, 5 pL d’une suspension de marqueurs sont ajoutées, et le tout est laissé à incuber 30 minutes.

Un contrôle est réalisé avec des capsules selon l’exemple 1 n’ayant pas été en présence de PLL.

Les capsules sont ensuite visualisées. Les inventeurs ont observé que l’utilisation d’un polymère chargé positivement permet d’inverser la charge de surface des capsules, ce qui permet l’adsorption des marqueurs chargées négativement à la surface desdites capsules.

Le même procédé est réalisé en laissant s’écouler plusieurs jours entre le traitement avec la PLL et l’ajout des marqueurs. Les inventeurs n’ont pas observé de différence avec l’incubation de 30 min, ce qui assure que la PLL, et donc les marqueurs, reste(nt) bien adsorbé(e)(s) à la surface des capsules. Exemple 3 : robustesse de l’adsorption de marqueurs sur les capsules

Il est important de savoir si les marqueurs se désorbent facilement de la surface des capsules, ou si au contraire ils restent adsorbés quand les capsules sont soumises à agitation ou sont manipulées. Les inventeurs ont donc étudié l’impact de manipulations et de rinçages sur ces capsules.

Etude 1

Les inventeurs ont contrôlé si les marqueurs se désorbaient des capsules selon l’exemple 2. Pour cela, ils ont placé ces capsules dans une boite de Pétri et ont visualisé les capsules une première fois, puis une deuxième fois après 12 heures. L'absorbance, ou densité optique (DO), des capsules est calculée à partir des images obtenues.

Les inventeurs ont ainsi observé que les marqueurs se désorbent peu de la capsule avec le temps, avec une très faible désorption inférieure à 9%.

Etude 2

Sur base des exemples 1 et 2 ci-dessus, les inventeurs ont recouvert des capsules en marqueurs selon l’exemple 2. Ces capsules sont séparées en deux lots. L’un est versé dans une boite de Pétri, laquelle est placée sur un agitateur orbital. L’autre est mis dans un tube Eppendorf lequel est disposé sur un agitateur à rouleaux (20 rotations/min). 12 heures plus tard, les capsules sont imagées, et la DO est calculée. Les inventeurs ont ainsi montré que plus de 50% des marqueurs restent adsorbés sur les capsules malgré ces agitations.

L’adsorption de marqueurs sur des capsules selon l’invention est donc efficace et robuste. En outre, cette approche est générique et peut être transposée à d’autres types de marqueurs, en particulier de colloïdes.

Exemple 4 : utilisation de marqueurs de type particules de silice fluorescentes

Des fluorophores sont greffés à la surface de sphères de silice après synthèse desdites sphères. Ils peuvent aussi être greffés dans tout le volume, ce qui augmente significativement le signal de fluorescence. Les inventeurs ont utilisé des particules (Sicastar-F 1 pm, Micromod).

1 ) Stabilité

Les inventeurs ont commencé par s’assurer de la stabilité de ces particules dans le milieu. Ils ont vérifié que ces particules ne s’agrègent pas dans le MCCM, en utilisant le même protocole que précédemment en exemple 2. Cette non-agrégation a ainsi été confirmée. Par ailleurs, le potentiel Zêta de ces particules est mesuré et vaut -37,6 mV.

Les inventeurs ont ensuite vérifié la stabilité de la fluorescence dans les milieux, et en présence de PLL.

Ils ont mesuré l’émission de fluorescence d’une suspension de Sicastar Green et Red dans du MCCM additionné de 10 ³ % de PLL. Ils ont ainsi observé que l’intensité de fluorescence des Sicastar Green et Red augmente respectivement de 20,2 et 8,3%, ce qui peut être attribué à la sédimentation des billes dans le puit. En tout état de cause, aucun impact majeur n’est à remarquer sur l’intensité de fluorescence.

2) Adsorption de particules de silice fluorescentes et codage couleur

Les inventeurs ont adsorbé ces particules fluorescentes de 1 pm (= marqueurs) sur les capsules préalablement recouvertes de PLL telles que décrites en exemple 2.

Pour cela, 2 tubes Eppendorf contenant 500 pL de HEPES-Ca et 290 capsules préalablement recouvertes de PLL ont été préparés. Puis, 2,4x10 ¹⁰ marqueurs sont ajoutés, chaque tube correspondant à une couleur. Les longueurs d’onde d’excitation/émission sont respectivement 485/510 nm et 569/585 nm pour les Sicastar-F Green et Red. Après 10 minutes d’incubation, les capsules sont lavées (avec HEPES-Ca) et visualisées au microscope à fluorescence.

Les inventeurs ont ainsi observé que les marqueurs s’adsorbent sur les capsules. De plus, la fluorescence des marqueurs dans le rouge ou le vert permet de marquer les capsules de manière univoque.

Les inventeurs ont vérifié que ces marqueurs ne se déplacent pas d’une capsule à une autre. Pour cela, deux populations de capsules sont marquées avec respectivement des Sicastar-F Green et des Sicastar-F Red. Les deux populations sont ensuite mélangées et l’ensemble est placé sur un microscope à fluorescence. Des clichés sont pris au temps initial et 12 heures après.

Les inventeurs ont montré que les billes fluorescentes restent adsorbées de manière permanente sur les capsules, sans passer d’une capsule à une autre.

Enfin, les inventeurs ont validé le fait qu’il est possible d’adsorber deux marqueurs différents sur une capsule. Pour cela, une population de capsules est d’abord marquée avec des Micromod Green, le tout est rincé puis les capsules sont exposées à des Micromod Red. Les capsules sont ensuite imagées. Les inventeurs ont ainsi montré que deux marqueurs différents pouvaient s’absorber consécutivement sur une capsule.

Ceci confirme la possibilité de recourir au marquage de capsules comprenant des cellules vivantes pour cribler rapidement et efficacement des séquences de conditions de culture d’intérêt pour l’obtention d’une caractéristique d’intérêt, et donc la pertinence et les avantages significatifs de la méthode selon l’invention.