"PROCESSO DE SELECÇÃO DE ORGANISMOS FOTOSSINTÉTICOS PARA A

PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS"

Domínio técnico

A presente invenção diz respeito a um processo para produção de biopolimeros por biossintese microbiana. Mais especificamente, diz respeito à biossintese de polihidroxialcanoatos (PHAs) . Devido às características plásticas e biodegradáveis dos PHAs, esta invenção é aplicável em várias áreas, como na indústria de plásticos, construção, distribuição, entre outras aplicações no campo da medicina e agroalimentar . Adicionalmente, e visto a cultura mista fotossintética obtida com a presente invenção, poder ser alimentada com meios complexos, como águas residuais ricas em ácidos gordos voláteis ou subprodutos agroindustriais ricos em açúcares, a aplicação desta invenção pode ainda ser alargada à área de valorização de subprodutos e tratamento de águas residuais.

Antecedentes

Os plásticos são materiais essenciais para a nossa sociedade. No entanto, a sua grande maioria é produzida a partir de compostos com base petroquímica. Como tal, a sua produção está dependente da disponibilidade de petróleo, composto este exaurível, de preços elevados e flutuantes. Além disso, estes plásticos, ditos convencionais, não são facilmente degradáveis, persistindo no ambiente por um tempo considerável, acumulando-se e contaminando solos e meios aquáticos. Como forma de ultrapassar este problema tem-se vindo a verificar um incentivo crescente à utilização de plásticos biodegradáveis. Estes bioplásticos podem ser produzidos a partir de vários biopolimeros , nomeadamente, a partir de polihidroxialcanoatos (PHAs) . Os PHAs são biopolimeros biodegradáveis sintetizados naturalmente por diversas bactérias que os acumulam intracelularmente na forma de grânulos. Estes biopolimeros podem ser produzidos com base em recursos renováveis e, visto serem completamente biodegradáveis, reúnem todas as características ecológicas necessárias para integrarem um processo de produção sustentável de bioplásticos. Além disso, os PHAs apresentam características físico-químicas semelhantes aos plásticos convencionais o que os torna numa alternativa viável aos plásticos de base petroquímica.

Estruturalmente os PHAs são poliésteres formados pela repetição de monómeros que apresentam a estrutura geral

- [O-CH (R) - (CH ₂ ) x-CO) -, em que R = -(CH ₂ ) _n -CH ₃ e n = 0-8 ou mais. Apesar de poderem ser sintetizadas variadas combinações e tamanhos de monómeros, as formas mais comuns de PHA produzidas por bactérias são o polímero de 3- hidroxibutirato (P3HB) em que R = CH3 e x = 1, e o co- polímero de 3-hidroxibutirato com 3-hidroxivalerato (P(3HB- 3HV) ) , em que no caso dos monómeros de 3-hidroxivalerato, R = CH2CH3 e x = 1.

A produção de PHAs por algumas bactérias pode ocorrer quando estas são sujeitas a condições de crescimento não balanceado, ou seja, quando conseguem transportar para o seu meio intracelular quantidades de carbono que excedem a sua capacidade de utilização para crescimento ou produção de energia. Esta incapacidade de utilização do carbono excedente pode dever-se à ausência de um ou mais nutrientes essenciais como azoto, fósforo, enxofre, magnésio, etc, ou dever-se a limitações metabólicas internas como ausência de enzimas metabólicas ou presença inibitória de cofatores em excesso (NADH, FADH) que afetam a homeostasia celular. Nestas condições, as bactérias acumulam o carbono excedente sob a forma de grânulos intracelulares de PHA que poderão ser consumidos futuramente no caso de indisponibilidade de carbono externo ou caso deixe de haver as referidas limitações de nutrientes essenciais e/ou limitações metabólicas internas.

Nos últimos anos, e em resposta à necessidade da sociedade de biopolimeros mais ecológicos, a produção de PHAs tem sido alvo de grande desenvolvimento.

Atualmente, os métodos de produção de PHA baseiam-se na utilização de sistemas de culturas puras, (tal como presente nos documentos com os seguintes números de publicação US 5871980, US 20060105439, US 8956835) , por vezes geneticamente modificadas (tal como nas patentes com os seguintes números de publicação US 8609378, US 8728778, US 20140349353) que requerem a esterilização de meios e equipamentos, o controlo rigoroso do sistema de operação e a alimentação de meios quimicamente definidos, por vezes, com suplementação de vitaminas e cofatores dispendiosos. Tudo isto conduz a custos operacionais elevados que inflacionam o preço do polímero e limitam a sua comercialização. Deste modo, para que os PHA possam ser comercialmente competitivos com os plásticos convencionais, é necessário desenvolver e implementar métodos de produção mais eficientes e menos onerosos. A utilização de culturas mistas microbianas (CMMs) para produção de PHAs foi proposta então como uma forma de diminuir os custos de produção deste polímero devido à possibilidade de se operar os sistemas em condições abertas

(sem necessidade de esterilidade) e de se poder utilizar meios complexos e baratos como substrato. Além do mais, a produção de PHA com CMMs apresenta o duplo benefício de permitir a produção de plásticos biodegradáveis enquanto se trata e valoriza produtos residuais, promovendo a sustentabilidade ambiental do processo. De facto, as CMMs podem utilizar resíduos agroindustriais complexos como substrato para produção de PHA. Ao contrário dos sistemas de culturas puras que tipicamente usam açucares como fonte de carbono, os ácidos gordos voláteis (AGVs) como o ácido acético, propiónico e butírico, são os melhores precursores para produção de PHAs em CMMs, e estes ácidos podem ser facilmente obtidos por fermentação de correntes residuais

[1] ·

No entanto, para que possa ocorrer a produção de PHAs em sistemas de CMMs, é primeiro necessário promover uma seleção microbiana da cultura por forma a enriquecê-la em bactérias acumuladoras de polímero. Tradicionalmente esta seleção tem sido efetuada submetendo a cultura a condições de alimentação transientes, numa estratégia designada como Fartura e Fome (FF) . Isto consiste em alternar períodos de excesso de carbono externo (Fartura), em que os organismos assimilam o carbono e acumulam-no como PHA, com períodos sem adição de substrato (Fome), onde apenas os organismos que acumularam PHA na fase de Fartura vão ter reservas de carbono que lhes permitirão crescer durante o período de Fome. A repetição de ciclos de FF favorece o crescimento celular a partir dos polímeros internos, criando deste modo uma pressão de seleção que beneficia organismos com elevadas capacidades de acumulação de PHA. No entanto, além da alternância entre estas duas fases, é também muito importante que as fases de fome impostas sejam longas e as fases de fartura sejam curtas [2 e 3] . Aparentemente, durante as longas fases de fome, há um decréscimo na síntese de enzimas utilizadas no crescimento celular, o que leva a limitações internas de crescimento. Como resultado, na fase de fartura seguinte, as células não conseguem crescer imediatamente após a alimentação do substrato, mas são capazes de acumular os AGVs como PHA, visto este metabolismo não ser afetado pela referida limitação interna. É esta característica que algumas bactérias apresentam e às quais se conseguem adaptar que permite a utilização da estratégia FF como método de seleção de bactérias acumuladoras de PHA. No entanto, é esta mesma necessidade de impor longos períodos de fome que torna os sistemas que usam CMMs selecionadas por FF, em processos com apenas cerca de 15 a 20% de tempo útil de produção e acumulação de polímero, sendo o restante tempo não produtivo e utilizado apenas para manter a pressão de seleção na cultura. Além do mais, e visto os AGVs serem os precursores ideais para produção de PHA em CMMs, é muito comum que os sistemas de produção com CMMs sejam precedidos por um passo em que águas residuais ou resíduos agroindustriais são fermentados a AGVs num reator anaeróbio. É deste reator anaeróbio que sai o efluente rico em AGVs que é alimentado ao bioreator onde é efetuada a seleção da CMM acumuladora de PHAs segundo a estratégia de FF. O efluente do reator anaeróbio poderá ainda ser eventualmente alimentado a um terceiro reator que contenha biomassa retirada do bioreator de seleção e onde se realiza apenas o processo de produção e acumulação de PHA numa longa fase de fartura (permite obter maior conteúdo interno de PHA do que o obtido durante a curta fase de fartura imposta no reator de seleção) . Deste modo, é possível que o sistema de produção de PHA com as CMMs tradicionalmente selecionadas por FF possa requerer até 3 bioreatores, com consequentes implicações ao nível do acréscimo dos custos de produção [ 4 ] .

Há no entanto ainda outro aspeto a considerar em relação aos sistemas de produção de PHA com CMMs selecionadas por FF. Este diz respeito ao tipo de organismos selecionados e à respetiva necessidade de arejamento do sistema. Quando a estratégia de seleção por FF é aplicada em condições aeróbias, o processo é designado por alimentação dinâmica aeróbia e são selecionadas bactérias aeróbias (por exemplo US 20120305478, US 20130040351, US 8030021) . Quando a fase de fartura ocorre em condições anaeróbias, o processo consiste em ciclos repetitivos de fartura anaeróbia/ fome aeróbia que leva à seleção de organismos capazes de acumular outros polímeros além do PHA, nomeadamente, polifosfato e/ou glicogénio (US 8187462) . De qualquer maneira, em ambos os processos referidos, as culturas requerem a presença de oxigénio como aceitador de eletrões, sendo este usualmente fornecido ao sistema através de arejamento intensivo. O arejamento dos sistemas aeróbios é reconhecido como o fator com maior consumo energético em bioreatores de culturas mistas, tal como verificado por Rosso et al.,2008 [5] em reatores de biomassa ativada (organismos aeróbios) de estações de tratamento de águas residuais . É verdade que com CMMs aeróbias conseguem-se atingir valores elevados de acumulação de PHA, na ordem dos 89% com alimentação de meios definidos com ácido acético [6] ou na ordem dos 75% com alimentação de resíduos agroindustriais fermentados, como por exemplo melaços de cana-de-açúcar [3] ou águas residuais da indústria do papel [7] . No entanto, a necessidade de arejamento intensivo aumenta substancialmente os custos de operação, o que adicionado aos fatores previamente referidos, como o período de produção de polímero efetuar-se apenas durante cerca de 20% do tempo de operação do sistema e de por vezes ser necessária a operação de mais que um bioreator, faz com que os preços atuais dos PHAs produzidos por CMMs aeróbias, não sejam ainda competitivos com os dos plásticos convencionais .

Recentemente, e na tentativa de baixar os custos de produção de PHA, foi proposto um novo sistema de produção de polímero que não requer arejamento do bioreator, permitindo, deste modo, a eliminação dos custos energéticos associados a este fator. Este novo sistema também usa CMMs selecionadas por FF, mas em que os organismos ao invés de serem aeróbios são fotossintéticos [8]. De facto, a diversidade de organismos acumuladores de PHA não se restringe ao mundo aeróbio, havendo inúmeras espécies de bactérias fotossintéticas que conseguem produzir e acumular PHAs. Estes organismos utilizam os seus sistemas fotossintéticos para produzirem energia (por exemplo, ATP) a partir da luz. Esta característica poderá ser vista como vantajosa em relação ao modo de produção de energia dos organismos aeróbios - que ocorre tipicamente através de reações de fosforilação oxidativa - pois torna-os independentes do fornecimento de oxigénio. No entanto, apesar desta independência das bactérias fotossintéticas em relação à presença de oxigénio, este sistema de CMMs fotossintéticas selecionadas por FF, pauta-se pelo enriquecimento da cultura num consórcio de bactérias acumuladores de PHA e algas produtoras de oxigénio. É esta produção de oxigénio por parte das algas que torna dispensável o arejamento do sistema e permite que a alternância entre fases de fartura e fome seja bem- sucedida. De facto, é essencial a presença de um aceitador de eletrões no sistema (neste caso o oxigénio) para que possa ocorrer o consumo (isto é, oxidação) de PHA durante a fase de fome.

Apesar de neste sistema de CMMs fotossintéticas o arejamento ser eliminado, o sistema requer, como contrapartida, a iluminação da cultura. Esta iluminação pode ser artificial, ou, natural. Neste último caso, a iluminação é gratuita, eliminando-se por completo os custos energéticos associados a esta operação.

Por comparação com os sistemas de CMMs aeróbias, este sistema de CMMs fotossintéticas permite então a redução dos custos de produção de PHA ao eliminar os custos com o arejamento, mas, no entanto, continua a ter as limitações inerentes à estratégia de FF usada na seleção da cultura (página 10, linhas 27-33) .

A presente invenção vem propor um novo sistema de produção de PHAs que utiliza CMMs fotossintéticas sem arejamento, mas que inova quanto à estratégia de seleção dos organismos fotossintéticos acumuladores de PHA. Neste sentido, a implementação da presente invenção permite ultrapassar as limitações dos processos até agora conhecidos e, como tal, dar resposta às necessidades atuais de sistemas de produção de bioplásticos ambientalmente sustentáveis.

Sumário

A presente invenção é referente a um processo de produção de polihidroxialcanoatos que compreende os seguintes passos : a) contactar uma cultura mista microbiana com a matéria-prima aquosa, que compreende substratos biodegradáveis ; b) enriquecer a cultura mista microbiana em organismos fotossintéticos acumuladores de PHA e produzir PHA por biossintese microbiana, submetendo a mistura do passo anterior a condições de operação não estéreis, anaeróbias, num bioreator iluminado e sempre na presença de, pelo menos, uma fonte de carbono;

c) recolher o efluente do bioreator e separar a fração sólida do efluente da fração liquida; d) direcionar a fração sólida para processamento posterior .

Numa forma de realização da presente invenção, a cultura mista microbiana compreende bactérias, algas ou fungos ou uma mistura entre estes. Numa outra forma de realização, os substratos biodegradáveis compreendem ácidos orgânicos, ácidos gordos voláteis, ácidos gordos, açúcares, álcoois, cetonas, aldeídos ou aminoácidos.

Ainda numa outra forma de realização, a cultura mista microbiana é operada em condições microaerofíliças .

Numa forma de realização, uma parte da fração sólida é recirculada ao bioreator ou direcionada na totalidade para processamento posterior.

Numa outra forma de realização, o processo compreende ainda a limitação da cultura em, pelo menos, um elemento essencial ao crescimento celular.

Ainda numa outra forma de realização, a limitação é selecionada entre azoto, enxofre, cálcio, fósforo, potássio, sódio, magnésio, ferro, zinco, manganês, cobalto, boro, cobre, cloro, níquel, selénio, ferro, molibdénio, bromo e/ou iodo.

Numa forma de realização, o processo compreende ainda fases escuras sem iluminação.

Numa outra forma de realização, o processamento posterior da fração sólida inclui a extração dos polímeros de PHA. Ainda numa outra forma de realização, a extração dos polímeros de PHA é realizada por processos físicos/mecânicos ou processos químicos para disrupção celular .

Numa forma de realização, o processamento posterior da fração sólida inclui a recuperação do fósforo concentrado na fração sólida.

Numa outra forma de realização, o processamento posterior da fração sólida inclui a extração de outros polímeros orgânicos, nomeadamente polissacáridos e/ou lipidos.

Ainda numa outra forma de realização, o processo compreende ainda um bioreator em paralelo, em que uma fração da biomassa do bioreator principal é recolhida e colocada no bioreator em paralelo, para aumento do conteúdo celular em PHA.

Numa forma de realização, o bioreator em paralelo é iluminado e operado em condições anaeróbias ou microaerofíliças .

Numa outra forma de realização, no bioreator em paralelo a biomassa é alimentada com substrato biodegradável selecionado entre ácidos orgânicos, ácidos gordos voláteis, ácidos gordos, açúcares, álcoois, cetonas, aldeídos ou aminoácidos .

Ainda numa outra forma de realização, o bioreator em paralelo compreende a limitação da cultura em, pelo menos, um elemento essencial ao crescimento celular, selecionado entre azoto, enxofre, cálcio, fósforo, potássio, sódio, magnésio, ferro, zinco, manganês, cobalto, boro, cobre, cloro, níquel, selénio, ferro, molibdénio, bromo e/ou iodo.

Ainda numa outra forma de realização, o bioreator em paralelo compreende fases escuras sem iluminação durante a sua operação.

Ainda numa outra forma de realização, a fração sólida do efluente do bioreactor em paralelo é separada da fração líquida, seguindo a fração sólida para processamento posterior .

Numa outra forma de realização, o processamento posterior da fração sólida recolhida do bioreator em paralelo inclui a extração dos polímeros de PHA.

Numa forma de realização, o processamento posterior da fração sólida recolhida do bioreator em paralelo inclui a recuperação do fósforo concentrado na fração sólida.

Ainda numa outra forma de realização, o processamento posterior da fração sólida recolhida do bioreator em paralelo inclui a recuperação de outros polímeros orgânicos contidos na fração sólida.

Por último, numa forma de realização, a operação do bioreator seleciona organismos acumuladores de PHA em detrimento de organismos não acumuladores de PHA. Descrição geral

A presente invenção diz respeito a um processo de produção de PHAs utilizando uma cultura mista microbiana (CMM) fotossintética selecionada num bioreator na presença de luz, sem necessidade de fornecimento de aceitadores de eletrões (por exemplo, oxigénio, nitratos, nitritos, entre outros) e sem necessidade de impor limitações de carbono. Esta estratégia de seleção de organismos fotossintéticos acumuladores de PHA, estratégia doravante designada por fartura permanente (FP), baseia-se nas capacidades únicas que algumas bactérias fotossintéticas anoxigénicas (bactérias não produtoras de oxigénio) apresentam. Este grupo inclui algumas das bactérias mais versáteis que existem, sendo elas capazes de crescer em condições que vão desde a fototrofia na presença de luz, à quimiotrofia no escuro, através de processos autotróficos (fixando CO2) ou heterotróficos , usando neste caso oxigénio ou moléculas inorgânicas e/ou orgânicas como aceitadores finais de eletrões durante os processos respiratórios [9] . Apesar das variadas possibilidades de combinações metabólicas, a estratégia de FP usada na presente invenção direciona-se especificamente à capacidade de crescimento em condições de fotoorganoheterotrofia, isto é, em que as bactérias usam a luz para produção de energia (por exemplo, ATP) e usam moléculas orgânicas tanto como fonte de equivalentes redutores, como de carbono. Deste modo, quando a estratégia de seleção por FP é aplicada ao sistema, as bactérias são cultivadas em condições preferencialmente anaeróbias na presença de luz, e, ao serem alimentadas com moléculas orgânicas de baixo potencial energético (por exemplo, ácidos acético, propiónico, butirico, málico, succinico e láctico) , usam o ATP produzido fotossinteticamente para transportar estas moléculas para o seu interior. Durante o metabolismo destas moléculas orgânicas, são produzidos equivalentes redutores (por exemplo, NADH, NADPH) que precisam de ser reoxidados, de forma a evitar a sua acumulação e manter a homeostasia celular. Como tal, é essencial que o poder redutor contido nestas moléculas seja dissipado, e, para isso, é necessário um aceitador de eletrões. Uma vez que a estratégia de seleção usada nesta invenção favorece a observância de condições anaeróbias no sistema, as bactérias não têm aceitadores de eletrões disponíveis, pelo que só conseguirão sobreviver aquelas que consigam ativar vias metabólicas que lhes permitam dissipar o poder redutor excedente. Uma das vias metabólicas que as bactérias têm para reoxidar os equivalentes redutores é precisamente através da produção de PHA, visto esta requerer a redução dos seus precursores durante a produção do polímero. De facto, quando são produzidos, por exemplo, monómeros de 3-hidroxibutirato (ver esquema ^Λ a) ' ) , é necessário reduzir uma molécula de acetoacetil-CoA a 3- hydroxibutiril-CoA, ocorrendo para isso a oxidação de equivalentes redutores.

o o Hidfoxiacsi-CoA

ses-sdrogenase OH O mm CH ₃ O

! i!

CH ₃ CCH ₂ C-SC0A CH _¾ eHCH C-SCoA CHCH _j CO

Acetaacetil-CoA NADPH+H* ADP 3-fcjdroxíbutíril-CaÀ CoASH P3H8

No caso de monómeros de 3-hidroxivalerato, também um equivalente redutor é oxidado quando se reduz um acetopropionil-Coa a 3-hidroxivaleril-Coa (ver esquema ^A b) ' ) .

FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)

Acetopropjani!-CaA N DP + NA DP 3-híd:roxiva)eri!-CoA P3HV

Neste caso, o PHA produzido não é apenas acumulado como reserva de carbono, mas, mais importante ainda, é usado como uma reserva/dissipador de poder redutor. Desta forma, ao aplicar a estratégia de FP, apenas as bactérias que consigam dissipar o poder redutor através da produção de PHA serão capazes de crescer. Assim, ao contrário da estratégia de FF onde os organismos são selecionados pela sua capacidade de crescerem do PHA acumulado, esta nova estratégia de FP seleciona organismos pela sua capacidade de internamente regularem o poder redutor celular através da produção de PHA.

0 facto da presente invenção implementar uma estratégia de seleção em que a cultura tem sempre uma fonte de carbono disponível, permite às bactérias fotossintéticas acumular PHAs continuamente fazendo com que todo o tempo do processo seja tempo útil de produção e acumulação de polímero. Não há deste modo períodos não produtivos, aumentando-se portanto a eficiência do processo. Mais ainda, a estratégia de seleção imposta leva a que a presença de organismos fotossintéticos não acumuladores de PHA (por exemplo, algas) seja residual, contribuindo para o aumento da produtividade do sistema. Adicionalmente, a presença residual das algas e o facto de o sistema não ser arejado, leva a que o sistema seja operado praticamente em condições permanentes de anaerobiose. Esta característica totalmente

FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) distinta de todos os processos até agora utilizados para produção de PHAs permite duas situações. Primeiro, que a maioria do carbono assimilado pelos organismos fotossintéticos não seja sujeito a oxidação, diminuindo como tal a fração de carbono dissipado como CO2 e aumentando a fração de carbono disponível para crescimento celular ou produção de polímero. Segundo, que quando a cultura é sujeita a condições de escuridão, ela possa ser alimentada com substratos ricos em açúcares e fermentá-los a AGVs . Quando a iluminação é reposta, a cultura pode utilizar os AGVs para crescimento e acumulação de PHA. Ou seja, esta invenção permite que os até 3 bioreatores utilizados nos processos com CMMs aeróbias possam ser reduzidos a apenas um. Isto é, num só reator e com a mesma CMM, é possível efetuar 1) a fermentação de uma corrente de resíduos em condições de escuridão; 2) após iluminação efetuar a seleção contínua dos organismos acumuladores de PHA e 3)efetuar-se a produção contínua do polímero. Esta invenção permite então ultrapassar as limitações de processos anteriores de produção de PHA ao baixar os custos de produção de polímero por 1) eliminação de custos com arejamento; 2) por permitir a produção contínua do polímero ao longo de todo o tempo útil de processo, aumentando a eficiência e produtividade do mesmo, 3) por permitir a condensação de diferentes processos num só reator diminuindo os custos capitais. Desta forma, esta invenção apresenta-se como um novo processo de produção de PHAs mais eficiente e menos dispendioso, permitindo que este bioplástico se torne comercialmente competitivo com os plásticos convencionais de origem petroquímica. Além de todas estas características, a presente invenção também inova pelo facto de o processo de operação da cultura levar à seleção de organismos com capacidades elevadas de remoção de nutrientes (particularmente fosfato) do meio de cultura, apresentando taxas de remoção próximas às observadas em sistemas otimizados de remoção biológica de fósforo. O fósforo assim removido pela cultura, fica concentrado na fração sólida do efluente, permitindo a sua recuperação e/ou reutilização, assegurando ao mesmo tempo que a fração liquida do efluente possa ser adequadamente eliminada por apresentar uma melhor qualidade em relação aos limites máximos de descarga de fosfato.

Tendo em conta as características da estratégia de seleção usada no processo apresentado, o modo ideal de produção de PHA por aplicação da presente invenção (que não exclui a ocorrência de alguns ajustamentos durante a sua aplicação) pode ser descrita do seguinte modo.

Num bioreator iluminado, ao qual não é fornecido qualquer aceitador de eletrões, uma CMM fotossintética é alimentada com AGVs . Os organismos conseguem ativamente transportar estes AGVs para o seu interior celular através da energia (ATP) produzida por fotossíntese. Durante o metabolismo dos AGVs, são produzidos equivalentes redutores (por exemplo, NADH, NADPH, FADH, entre outros) que necessitam de ser oxidados por forma a evitar que se acumulem e inibam as reações de metabolismo celular. Sendo o bioreator operado em condições de anaerobiose, os organismos encaminham os equivalentes redutores para a via de produção de PHA onde poderão ser reoxidados e libertados para utilização nas reações metabólicas. Os organismos podem então continuar a metabolizar os AGVs para crescimento e manutenção celular, sendo que os AGVs transportados são simultaneamente usados para crescimento e para produção de polímero. Ao garantir a iluminação e presença constante de AGVs, garante-se o contínuo transporte de carbono para a célula e sua acumulação como polímero. No caso de o carbono externo esgotar, as células não crescem nem consomem o polímero acumulado visto não terem aceitadores de eletrões disponíveis que lhes permitam oxidar o PHA. No caso de haver carbono presente mas algum elemento essencial esgotar

(por exemplo, azoto, fósforo, enxofre, entre outros), os organismos não conseguem crescer mas poderão continuar a acumular o polímero, sendo que neste caso o carbono transportado pelas células já não será dividido entre crescimento e produção de PHA, mas sim, praticamente todo acumulado como polímero. Na ausência de luz, e caso a fonte de carbono sejam moléculas com potencial energético baixo

(como os referidos AGVs), os organismos não têm meios de produção de ATP, não conseguindo transportar o carbono e entrando num estado de latência. No entanto, se a corrente de alimentação fornecida à cultura for rica em compostos energéticos, como açúcares, e visto o sistema ser operado em condições anaeróbias, os organismos fermentam os açúcares, produzindo, entre outros compostos, AGVs. Ao ser reposta a iluminação, os organismos poderão novamente transportar os AGVs e usá-los para crescimento e produção de polímero.

Tendo em conta a descrição efetuada, a aplicação desta invenção pode ser feita, preferencialmente, em dois cenários. Um primeiro, em que o sistema é operado com iluminação constante e a corrente de alimentação é constituída por AGVs que são usados para crescimento e produção continua de PHA. E um segundo, em que o sistema é operado em duas fases: uma fase escura em que a cultura é alimentada com uma corrente rica em açúcares, que são fermentados a AGVs; e uma fase de luz em que os AGVs produzidos na fase escura são usados para crescimento e produção contínua de PHA. A escolha entre os dois cenários relaciona-se com o tipo de corrente de alimentação que se pretende usar e/ou com o tipo de iluminação fornecida. Se o sistema for operado, por exemplo, com iluminação natural, a alternância entre a noite e o dia terá maior correspondência com o segundo cenário descrito. Também este segundo cenário permite a utilização de resíduos fermentáveis como alimentação. Já o primeiro cenário, e caso seja usado iluminação artificial, permite a produção ininterrupta de PHA.

Também o modo como é operada a alimentação do sistema está relacionado com os dois cenários descritos. Uma operação em contínuo ou semi-contínuo estará mais direcionada para o primeiro cenário em que os AGVs são continuamente fornecidos ao sistema para um produção ininterrupta de PHA. Já uma operação com alimentação sequencial por ciclos estará mais direcionada para o segundo cenário em que o influente rico em açúcares é fornecido ao sistema no início do ciclo (fase escura), sendo sujeito às diferentes fases do processo e depois removido como efluente no fim do ciclo (fim da fase de luz) .

Uma vez que a seleção dos organismos fotossintéticos acumuladores de PHA ocorre continuamente durante o período de iluminação, e visto os dois cenários descritos terem sempre um período de luz, a pressão de seleção está sempre presente no sistema garantindo que a CMM fotossintética esteja sempre enriquecida em organismos acumuladores de polímero .

Apesar destes serem os modos ideais de aplicação da invenção, isto não exclui que diferentes combinações de modos de operação possam ser aplicadas, tendo sempre como base, o princípio de que a seleção de organismos fotossintéticos acumuladores de PHA ocorre através da estratégia de FP previamente descrita.

Além desta invenção ser flexível à possibilidade de combinar diferentes modos de operação, também os modos de nutrição da CMM poderão ser pontualmente flexíveis. Apesar de a fotoorganoheterotrofia ser o modo de nutrição utilizada pela cultura durante a fase de luz e a quimioorganoheterotrofia ser a usada durante a fase escura em que podem ser alimentados açúcares, isto não exclui que a CMM possa por vezes recorrer a outros modos de nutrição como a litotrofia em que usa moléculas inorgânicas como dadores de eletrões (por exemplo, hidrogénio, sulfureto e enxofre) ou autotrofia, em que usa, por exemplo, dióxido de carbono ou bicarbonato, como fonte de carbono.

O resultado da aplicação desta invenção consiste num sistema de CMMs fotossintéticas enriquecidas em organismos acumuladores de PHA cujo efluente é contínua ou ciclicamente retirado do sistema, e cuja fração sólida, rica em PHAs está apta para seguir para o processamento posterior de extração e purificação do polímero. A aplicação da presente invenção permite então uma redução dos custos de produção de PHAs, visto:

1) poder-se utilizar fontes de carbono económicas (resíduos fermentáveis) ,

2) poder-se operar o sistema em condições não estéreis,

3) não ser necessário o arejamento do bioreator (eliminando os custos energéticos associados),

4) a produção de PHA ocorrer de forma contínua e ininterrupta durante o período de luz,

5) as condições preferenciais de operação em anaerobiose permitirem uma menor fração de carbono oxidado e, como tal, que seja maior a fração de carbono disponível para crescimento celular e produção de polímero,

6) ser necessária a operação de apenas um bioreator,

7) poder usar-se luz natural (eliminação de custos energéticos associados a iluminação artificial) como fonte de energia da cultura.

A possibilidade de a CMM ainda 8) remover nutrientes (particularmente fosfato) do meio de cultura e como tal, o efluente cumprir os limites de descarga em relação aos valores de concentração daquele composto, permite, conjuntamente com as características previamente referidas, que o sistema de produção de PHA descrito nesta invenção possa adicionalmente ser considerado como um processo de produção de bioplásticos ambientalmente sustentável. Breve descrição das figuras

Para uma mais fácil compreensão do presente pedido juntam- se em anexo figuras, as quais, representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar a técnica aqui divulgada.

A figura 1 representa o esquema do processo de seleçáo de organismos fotossintéticos para a produção de polihidroxialcanoatos como descrito na presente invenção.

1 - Matéria-pr ima aquosa.;

2 - Eioreator;

3 - Efluente do bioreator;

4 - Fração sólida do efluente;

5 - Fração liquida do efluente;

6 - Fração sólida recircuiada ao bioreator;

7 - Fração sólida direcionada para processamento posterior.

A figura 2 ilustra a variação da concentração da biomassa ativa X (8) e da concentração de acetato no inicio (9) e fim (10) do ciclo durante os 4 meses de operação do bioreator .

A figura 3 é uma imagem microscópica da CMM fotossintética enriquecida em organismos acumuladores de PHA. A - Campo claro; B - Imagens de fluorescência de coloração de Azul do Nilo indicando os grânulos de PHA.

A figura 4 ilustra as transformações ocorridas durante os 4 dias de operação da CMM fotossintética num bioreator em paralelo com maior disponibilidade de luz. A - Perfil de consumo de acetato (11) e produção de polímeros internos (PHB (12) e carbohidratos (13)) . A saída do efluente do reator reflete-se no decréscimo da concentração de PHA e carbohidratos. B - Valores cumulativos de acetato (11) consumido, PHB (12) produzido, carbohidratos (13) produzidos e biomassa ativa X (8) produzida. C - Variação da concentração da biomassa ativa X (8) e do conteúdo de PHB (12) em percentagem de peso seco celular (psc) .

A figura 5 ilustra a variação da concentração de fosfato durante os 4 dias de operação. Linhas a tracejado facilitam a visualização do perfil de consumo do fosfato.

A figura 6 ilustra a variação da concentração da biomassa ativa X (8) e do conteúdo de PHB (12) em percentagem de peso seco celular (psc) .

A figura 7 ilustra as transformações ocorridas durante um ciclo de 24h de operação da CMM fotossintética num bioreator com iluminação transiente de 12h escuro/12h luz. A - Perfil de fermentação da glucose (14) e produção de AGVs (acetato (11), propionato (15), butirato (17)) e etanol (16) na fase escura e consumo dos produtos de fermentação na fase de luz. B - Variação das concentrações no reator de AGVs + etanol (18), fosfato (19), PHB (12) e biomassa ativa X (8) durante o ciclo. C - Variação da concentração da biomassa ativa X (8) e do conteúdo de PHB (12) em percentagem de peso seco celular (psc) durante o ciclo . Descrição de formas de realização

Fazendo referência às figuras, vai ser agora descrita detalhadamente a invenção com recurso a uma forma de realização preferencial da invenção, a qual não pretende limitar o âmbito de proteção desta invenção.

A presente invenção diz respeito a qualquer processo ou método de produção de PHAs através da utilização de CMMs fotossintéticas selecionadas através de um regime sem imposição obrigatória de limitações de carbono. Mais precisamente, esta invenção descreve metodologias para seleção e enriquecimento de CMMs em organismos fotossintéticos com capacidade de produzirem e acumularem PHAs .

1 - Caracterização da cultura mista microbiana fotossintética

Neste processo é utilizada uma cultura mista microbiana para produção de PHAs. O termo ^> cultura mista' é aqui definido como uma comunidade de organismos composta por espécies distintas e variadas, podendo incluir bactérias, microalgas ou fungos. O termo ^> cultura mista' engloba também comunidades microbianas enriquecidas, preferencialmente, comunidades bacterianas, que são obtidas, nesta invenção, através da imposição de pressões de seleção favoráveis ao crescimento de organismos que afetam positivamente a produção de PHA e desfavoráveis ao crescimento de organismos que afetam negativamente a produção de PHA. A cultura microbiana pode provir de biomassa com origem em diferentes fontes. No caso das bactérias fotossintéticas, estas podem ser encontradas em ambientes que permitam a disponibilidade de luz. No entanto, devido à sua diversidade metabólica, poderão também ser encontradas em zonas escuras onde haja disponibilidade de oxigénio ou compostos fermentáveis. Como tal, a presença destas bactérias é frequente em sedimentos superficiais de lagos e charcos, solos húmidos e pântanos, podendo também ser encontradas em lamas ativadas, aterros, solos de minas e em ambientes salinos.

A fonte preferencial para obter estes organismos inclui ambientes sujeitos a stresses periódicos, como privação de carbono, nutrientes essenciais ou oxigénio. É expectável que a ocorrência destas limitações selecione bactérias que acumulem reservas de carbono como resposta a situações de stress. É também possível que organismos isolados de diferentes ambientes possam apresentar rendimentos e capacidades de produção de PHA diferentes.

A aplicação da estratégia de seleção FP, descrita nesta invenção, a biomassa recolhida de fontes como as referidas, permite a seleção de organismos acumuladores de PHA e, com o tempo, o enriquecimento de uma CMM fotossintética em organismos com capacidades elevadas de produção de PHA.

2 - Corrente de alimentação

A produção de PHAs pela CMM fotossintética ocorre em meio aquoso, usando-se matéria-prima que compreenda fontes de carbono, fontes de azoto e sais minerais. A composição da corrente de alimentação da CMM descrita em seguida, não exclui a possibilidade de a cultura poder utilizar outra variedade de compostos tanto para produção de polímero, crescimento e manutenção celular, não estando por isso restrita aos elementos indicados.

2 . 1 . Fonte de Carbono

A fonte de carbono preferível da CMM fotossintética para crescimento e produção de PHAs são AGVs, como o ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico e ácido valérico. A CMM pode no entanto utilizar outros compostos para crescimento, como ácidos orgânicos, ácidos gordos, açúcares, álcoois, cetonas, aldeídos e aminoácidos, não excluindo no entanto que estes mesmos compostos possam ser metabolizados, convertidos noutras moléculas e eventualmente utilizados pelos organismos para produção de PHAs .

Todos estes substratos podem ser compostos puros, ou provenientes de resíduos agroalimentares , resíduos florestais, águas residuais domésticas ou industriais, ou com origem noutros resíduos que sejam passivos de serem biodegradáveis e utilizáveis pela cultura como substrato.

Idealmente a CMM tem sempre uma fonte de carbono disponível no meio de cultura, para crescimento e/ou para produção contínua de PHA, não excluindo no entanto, que possam ocorrer momentos de privação de fonte de carbono e o sistema seja operado com limitação de carbono. 2.2. Fonte de azoto e sais minerais

A fonte de azoto preferencial da CMM é amónia, podendo esta ser fornecida em sais de amónia (por exemplo, (NH4)2HP04, NH4OH, (NH4)2S04, NH4CI), em compostos orgânicos azotados

(por exemplo, ureia, aminoácidos) ou em misturas de resíduos ou subprodutos que contenham compostos azotados

(por exemplo, extrato de levedura, caseína, farinha de so a) .

É também desejável que a corrente de alimentação inclua sais que contenham iões (por exemplo, sulfato, cálcio, fosfato, potássio, sódio) e metais (por exemplo, magnésio, ferro, zinco, manganês, cobalto, boro, cobre, níquel, molibdénio) .

Durante a operação do sistema, é preferível que a cultura não tenha o seu metabolismo limitado pela ausência de algum dos referidos elementos. No entanto, é possível que possam ocorrer baixas concentrações ou esgotamento de alguns destes elementos no meio de cultura, limitando o crescimento dos organismos, o que, con untamente com a disponibilidade de carbono, favorece a acumulação de polímero em detrimento do crescimento celular.

3 - Condições de operação do bioreator

A CMM é operada num bioreator que possa ser iluminado e que preferencialmente não seja arejado. Idealmente o sistema é operado em condições anaeróbias, podendo no entanto a sua operação também ocorrer em condições de microaerofília (>0%-10% O2 no meio de cultura) e, pontualmente, ocorrerem períodos de aerobiose. Não é no entanto desejável a entrada de oxigénio no bioreator, sendo esta evitada por forma a garantir que sejam mantidas as condições de anaerobiose ou microaerofilia no bioreator, previamente referidas. Estas condições são asseguradas mantendo o bioreator isolado do contacto com o ar atmosférico, através do controlo das entradas e saídas e do reator e/ou através do aumento da pressão interna do bioreator borbulhando um gás, como árgon, azoto ou outro que não contenha oxigénio.

Preferencialmente, a temperatura é controlada entre 5 e 60°C, mais precisamente entre 15 e 40°C, e idealmente, a 30°C. Também o pH é preferencialmente controlado entre 1,0 e 10,0, mais precisamente entre 4,0 e 8,0, e idealmente, a 6,5, usando adição automática de ácido (por exemplo HC1) e/ou base (por exemplo, NaOH, KOH) . Preferencialmente, o bioreator encontra-se continuamente agitado para uma melhor homogeneização da cultura.

O modo de operação do reator pode ser em contínuo, semi- contínuo ou como reator descontínuo sequencial. No primeiro caso, o reator é continuamente alimentado sendo simultaneamente removida uma quantidade proporcional de meio do reator (efluente) . O efluente pode ser removido por transbordo ou com bombeamento. No caso de operação em semi- contínuo, a alimentação do reator é alternada entre períodos de alimentação contínua e períodos sem alimentação, sendo o efluente removido por bombeamento. Na situação de operação sequencial do reator, isto é, operação por ciclos sequenciais, o ciclo começa com remoção do efluente, seguido da alimentação de igual quantidade de influente . Nos três casos referidos, o efluente removido do reator segue para separação da fração sólida (biomassa rica em PHAs) da fração liquida (meio exausto) . Parte da fração sólida poderá ser recirculada ao bioreator ou então, seguir na sua totalidade para processamentos posteriores, como extração e purificação do polímero e/ou recuperação de fósforo .

Os caudais de alimentação ao reator e remoção de efluente podem ser ajustados como forma de controlo direto ou indireto na concentração de nutrientes no reator, na concentração da biomassa, na concentração de polímero produzido, no tempo de retenção hidráulico (TRH) e no tempo de retenção de lamas (TRL) . O TRL no reator é controlado entre 1 a 12 dias, sendo idealmente observado um TRL entre 2 e 6 dias, e preferencialmente um TRL de 3 dias. Idealmente o reator é operado com um TRL igual ao TRH, isto é, o reator encontra-se em plena agitação quando o efluente é removido. Não se exclui, no entanto, que o reator possa ser operado com TRL superiores ao TRH, tanto por se efetuar recirculação de biomassa do efluente ao reator ou por impor períodos de sedimentação da biomassa no reator onde apenas o sobrenadante exausto é removido no efluente.

Os diferentes modos de operação do bioreator referidos, o tipo de fonte de carbono presente na alimentação e as condições de iluminação impostas ao reator podem ser combinados e ajustados entre si por forma a maximizar a produção de polímero, respeitando a necessidade de manter a pressão de seleção sobre a cultura. 4 - Iluminação do bioreator

Preferencialmente o bioreator encontra-se continuamente iluminado, podendo a fonte de luz ser artificial ou natural. Idealmente a fonte de luz é natural, podendo o bioreator ser operado no exterior.

Pontualmente ou periodicamente, o bioreator pode ser operado na ausência de luz, com fases de escuridão de 1 a 72h, preferencialmente entre 2 a 24h, e idealmente entre 6 a 18h.

Quando o reator é iluminado, é desejável que a quantidade de luz que é disponibilizada ao bioreator permita que os organismos, através dos seus sistemas fotossintéticos, sejam capazes de produzir energia (ATP) para utilizarem no transporte ativo de moléculas externas, crescimento, manutenção celular ou outras reações metabólicas. Isto não exclui que durante a operação do reator, nomeadamente em condições de iluminação natural, ocorram períodos de iluminação deficitária, levando a uma diminuição do metabolismo celular dos organismos.

5 - Tipo de bioreator

Preferencialmente, o tipo de bioreator utilizado durante a aplicação desta invenção permite que o sistema seja operado em condições fechadas, tal como descrito previamente, por forma a evitar a entrada de oxigénio no sistema. Idealmente, a configuração do bioreator permite ainda que, quando iluminado, a luz seja eficientemente distribuída dentro dele, disponibilizando uma iluminação adequada aos organismos nele contidos que lhes permita efetuar o seu metabolismo celular. Reatores compatíveis com esta configuração são por exemplo reatores em painel, reatores tubulares ou outros adequados para operação de organismos fotossintéticos.

6 - Produção de polímero num bioreator em paralelo

A produção de PHAs pela CMM fotossintética ocorre, preferencialmente, no bioreator onde é aplicada a estratégia de seleção descrita nesta invenção. No entanto, uma fração da biomassa desse reator pode ser recolhida e colocada num bioreator em paralelo (reator de acumulação) , sujeitando-a a condições que permitam aumentar ainda mais o conteúdo das células em polímero. Neste bioreator de acumulação são impostas condições que maximizem o transporte de carbono para o interior das células (por exemplo, aumento da luz disponível) e que favoreçam a acumulação de polímero em detrimento do crescimento celular (por exemplo, limitação de um nutriente essencial para o crescimento celular como o azoto, fósforo, enxofre, ou outros) .

7 - Polímero produzido

O PHA produzido pode ser constituído por repetição de monómeros idênticos, sendo neste caso um homopolímero, por exemplo só de monómeros de 3-hidroxibutirato (PHB) ou só de monómeros de 3-hidroxivalerato (PHV), ou, ser constituído por monómeros diversos, sendo neste caso um co-polímero, por exemplo de monómeros de 3-hidroxibutirato com 3- hidroxivalerato ( P ( 3HB-3HV) ) . Os homopolimeros ou co- polimeros produzidos pela cultura podem incluir na sua composição os monómeros mais frequentemente produzidos pelas bactérias como o 3-hidroxibutirato (3HB), 3- hidroxivalerato (3HV) , 3-hidroxi-2-metilbutirato (3H2MB), 3-hidroxi-2-metilvalerato (3H2MV), 3-hidroxihexanoato

(3HHx) ou outros descritos pela fórmula geral (página 11) .

O PHA produzido pode ser caracterizado em termos dos monómeros que o compõem, peso molecular, propriedades térmicas ou outros parâmetros importantes para a sua aplicação como bioplástico. O resultado destas caracterizações permite o ajustamento das condições operacionais do sistema (por exemplo, tipo de substrato, temperatura, pH) caso se pretenda alterar a composição do polímero e as suas características.

8 - Extração do polímero

O PHA é um polímero de síntese microbiana que é acumulado intracelularmente na forma de grânulos. Como tal, após a sua produção, é necessário sujeitar a biomassa a uma série de passos que permitam a disrupção da célula e libertação do polímero para o exterior. Esta disrupção celular pode ser efetuada por processos físicos/mecânicos (por exemplo, sonicação, choque térmico) ou químicos, com utilização ou de solventes orgânicos halogenados (por exemplo clorofórmio, diclorometano ) , detergentes, hipoclorito de sódio ou até, digestão enzimática. Após a libertação do PHA é necessário separá-lo dos materiais celulares residuais. Consoante o método utilizado na disrupção celular, o PHA pode ser recuperado por exemplo por evaporação do solvente ou com adição de um solvente onde o PHA seja pouco solúvel sujeitando-o a lavagens sucessivas para remoção resíduos celulares.

Dependendo da aplicação final do polímero, o processo de extração do polímero pode conter passos adicionais de purificação até se alcançar o grau de pureza desejável.

Exemplos de aplicação

Exemplo 1 : Seleção da CMM otossintética e produção de PHA na presença constante de luz

0 inoculo utilizado para seleção da CMM fotossintética acumuladora de PHA foi obtido de um consórcio fotossintético de bactérias e algas que fora previamente operado num reator descontínuo sequencial em regime de FF que, por sua vez, tinha sido originalmente selecionado a partir de sedimentos de um charco.

0 bioreator utilizado para seleção da CMM fotossintética tinha um volume útil de 2,4L e foi operado em modo descontínuo sequencial com ciclos de 24h, sob iluminação contínua de uma lâmpada de halogénio (60 W) que providenciava uma intensidade de luz de 127 W/m ² , correspondendo a uma intensidade de luz volumétrica de 1,8 W/L de cultura.

O bioreator era continuamente agitado e alimentado ciclicamente com 800 mL de meio fresco, constituído por 400 mL de meio de carbono e 400 mL de meio de fosfato (Tabela D · Tabela 1: Composição do meio de alimentação.

No fim de cada ciclo eram removidos 800 mL da cultura, resultando num TRL e TRH de 3 dias. A temperatura era controlada a 30°C, o pH controlado a 6,50 ± 0.05, com adição automática de HC1 0,5M e o bioreator era borbulhado com árgon à taxa de 10 mL/min para prevenir a entrada de ar externo. Os valores de concentração de oxigénio dissolvidos medidos na cultura eram de 0,0%. O bioreator foi operado nestas condições durante 4 meses tendo a população do inoculo evoluído ao longo do tempo e ficado enriquecida em organismos acumuladores de PHA, obtendo-se uma CMM fotossintética acumuladora de polímero.

Pela Figura 2 pode-se observar que durante este período de tempo a cultura nunca teve privação de carbono. Os valores de concentração de carbono no reator variaram ao longo do tempo em estreita relação com a variação da concentração celular, fruto da adaptação do inoculo às condições de operação e seleção dos organismos acumuladores de PHA. Durante este período de 4 meses, a cultura apresentou valores de conteúdo de PHA entre 5 e 70% em peso seco celular (psc) . Na Figura 3 pode-se observar uma imagem microscópica de biomassa corada com Azul do Nilo (corante que se liga ao PHA e permite a sua observação por fluorescência) recolhida na altura em que a cultura apresentava 70% psc em PHA.

Após se ter obtido a CMM fotossintética acumuladora de PHA e de esta estar a ser operada em estado estacionário no bioreator onde continuamente ocorria a seleção da cultura e produção de PHA, procedeu-se ainda a testes adicionais onde, numa fase em que a biomassa apresentava menor conteúdo em PHA (±5%), uma porção do efluente do bioreator foi colocada num reator em paralelo para incrementar o conteúdo em polímero. Este reator em paralelo foi operado durante 4 dias em condições análogas às do bioreator de seleção, com exceção de a intensidade de luz fornecida à cultura ser superior, mais especificamente, com valores de 6,1 W/L. Visto a maior disponibilidade de luz resultar num aumento do metabolismo celular, periodicamente foram dados pulsos de uma solução concentrada de acetato e fosfato (4,5 Cmol/L e 0,036 Pmol/L) de modo a impedir que houvesse limitação de carbono e para refornecer a cultura com fosfato (Figura 4) . Durante a operação do reator em paralelo, a CMM fotossintética atingiu conteúdos de PHA de 60% em psc, com rendimentos de produção de PHA por acetato consumido de 0, 67 Cmol PHB/Cmol Acetato e rendimentos de crescimento celular por acetato consumido de 0,11 Cmol X/Cmol Acetato.

Verificou-se ainda a remoção de fosfato (Figura 5) do meio de cultura, com valores de remoção na ordem de 2 a 4 mg P/g X.h, levando a que todo o fosfato alimentado à CMM fosse totalmente removido da fração liquida do meio e incorporado na fração sólida (biomassa) .

Exemplo 2 : Operação da CMM otossintética e produção de PHA em condições transientes de luz (ciclos de escuro/luz)

A CMM fotossintética utilizada na operação em condições transientes de luz foi obtida a partir da CMM fotossintética selecionada no Exemplo 1, encontrando-se já enriquecida em organismos acumuladores de PHA.

O bioreator utilizado para operação da CMM fotossintética tinha um volume útil de 4,4L e foi operado em modo descontinuo sequencial com ciclos de 24h, com iluminação transiente (12h escuro/12h luz) . Durante a fase de luz, a cultura era iluminada por uma lâmpada de halogénio (200 W) que providenciava uma intensidade de luz de 232 W/m ² , correspondendo a uma intensidade de luz volumétrica de 2,0 W/L de cultura. O bioreator era continuamente agitado e no inicio de cada ciclo era alimentado com volumes equivalentes de meio de carbono e de meio de fosfato (Tabela 2) por forma a manter um TRH e TRL de 4,5 dias.

Tabela 2 : Composição do meio de alimentação.

Solução Composição

0, 8 g/L MgS0 ₄ .7H ₂ 0

1, 6 g/L NaCl

2, 1 g/L NH ₄ C1

0,2 g/L CaCl ₂ .2H ₂ 0

Meio de carbono

8,2 g/L NaAcetato .3H ₂ 0

4,0 g/L C ₆ Hi ₂ 0 ₆ .H ₂ 0

20 mL solução citrato de ferro (l,0g/L)

4 mL solução mineral*

0,27 g/L KH ₂ P0 ₄

Meio de fosfato

0,33 g/L K ₂ HP0 ₄

70 mg/L ZnCl ₂

100 mg/L MnCl ₂ .4H ₂ 0

60 mg/L H3BO3

200 mg/L CoCl ₂ .6H ₂ 0

*Solução mineral

20 mg/L CuCl ₂ .2H ₂ 0

20 mg/L NiCl ₂ .6H ₂ 0

40 mg/L NaMo0 ₄ .2H ₂ 0

1 ml/L HC1 (25%) A temperatura era controlada a 30°C, o pH controlado a 6,50 ± 0,05, com adição automática de HC1 0,5M e o bioreator era borbulhado com árgon à taxa de 10 mL/min para prevenir a entrada de ar externo. Os valores de concentração de oxigénio dissolvidos medidos na cultura eram de 0,0%.

Na Figura 6 pode-se observar 15 dias de operação do bioreator onde a cultura apresentou valores de concentração de biomassa ativa na ordem dos 0,75 g/L e conteúdo em PHB entre os 30 e 50%.

Na Figura 7 pode-se observar as transformações ocorridas durante um ciclo de 24h do bioreator. Durante a fase escura, a glucose alimentada ao reator foi fermentada a acetato, propionato, butirato e etanol (Figura 7.A) . Quando a glucose esgotou, e durante as restantes horas da fase escura, a cultura não consumiu os produtos de fermentação. Durante as 12h da fase escura, não se verificou ainda nenhuma variação nem da concentração da biomassa ativa nem da concentração de PHA (Figura 7.B) . Quando o reator foi iluminado, a cultura começou a consumir os produtos de fermentação, iniciando também o seu crescimento celular e concomitante produção de polímero. A cultura nunca teve limitação de carbono nem de fosfato. Durante este ciclo de 24h, a CMM fotossintética apresentou conteúdos de PHA entre 25 e 35% psc (Figura 7.C) .

A presente descrição não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações apresentadas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral, tal como definido nas reivindicações. As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais .

Re erências

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