Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Abspaltung von Ölsäure aus Triglyceriden, dazu geeignete Lipasen oder Lipasemischungen und einen Mikroorganismus bzw. dessen Mutanten oder Varianten, der in der Lage ist diese Lipasemischung zu liefern.

Es ist bekannt, daß Pilze der Spezies Geotrichum und insbesondere der Art Geotrichum candidum Lipasen zu produzieren vermögen. Entsprechende Stämme und ihre Lipasen wurden von verschiedenen Autoren beschrieben, wobei sich die Lipasen von Stamm zu Stamm stark unterscheiden.

So beschreiben Sugihara et al in J. Bioche . 107, 426-430 (1990) die Art Trennung und Charakterisierung von zwei molekularen Formen einer Geotrichum candidum Lipase. Lipase 1 hat ein Molekulargewicht von 64 kDa und einen isoelektrischen Punkt von 4,3, wohingegen Lipase 2 ein Moleku¬ largewicht von 66 kDa und einen isoelektrischen Punkt von 4,3 hat. T. Jacobsen et al beschreiben in Enzyme Microb. Techno!. 1989, vol. 11, 90 Lipasen aus Geotrichum candidum mit einem Molekulargewicht von 53 kDa bzw. 37 kDa. Ein ähnl ches Molekulargewicht (53 kDa bis 55 kDa bei isoelektri¬ schen Punkten von 4,33) beschreiben Tsujisaka et al Agr. Biol. Chem. 37 (6) 1457, (1973). Schließlich beschreiben J. Shimada et al in J. Biochem. 106 (3) 383 (1989) und 107, 703 (1990) zwei Lipasen aus Geotrichum candidum, wobei das als Lipase 2 bezeichnete Enzym cloniert wurde und festgestellt wurde, daß es 544 Aminosäuren enthält.

Es hat auch immer wieder Hinweise in der wissenschaftlichen Literatur ge¬ geben, daß einzelne der Lipasen von Geotrichum candidum in der Lage seien, Fettsäure-Triglyceride selektiv zu spalten, d.h. aus solchen Fettsäure-

Triglyceriden, die aus Mischungen von Fettsäuren aufgebaut sind, bevorzugt die Ölsäure freizusetzen, so beschreiben E. Charton et al in einem Vortrag

zum CEC-GBF International Workshop 1990 am 13.09.1990, daß aus den Stämmen Geotrichum candidum ATCC 34614 und CMICC 335426 jeweils zwei extrazellu- läre Lipasen extrahiert wurden, und daß eine dieser Lipasen in der Lage ist cis-9-Fettsäuren aus den Glyceriden abzuspalten.

Verwiesen sei weiterhin auf die folgenden Arbeiten: T. A. Marks in Lipids, Vol. 3 (2) 143, (1967), auf M. Iwai et al in Agr. Bio!. Chem. , 37 (4), 929, (1973), auf J. Kroll, Pharmazie 28, (4), 263 (1973) und auf J. A. Alford in J. Lipid Research Vol. 5, 390 (1964). Diese Literaturstellen beschreiben teils die Isolierung spezieller G. candidum Lipasen und die Selektivität entsprechender Isolate.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß Pilze der Art Geotrichum candidum extrazelluläre Lipasen produzieren, und daß einzelne dieser Lipasen zur selektiven Fettspaltung befähigt sind.

Für die Praxis des Oleochemikers sind diese Erkenntnisse zwar von wissen¬ schaftlicher Bedeutung, jedoch nicht technich verwertbar. Wenn nämlich ein Mikroorganismenstamm eine Lipasemischung produziert, die nur eine selek¬ tive Lipase im Gemisch mit einer nicht oder wenig selektiven Lipase ent¬ hält, so kann dieser Stamm oder seine Enzymprodukte nur dann zur selek¬ tiven Spaltung von Fettsäuretriglyceriden eingesetzt werden, wenn diese selektive Lipase von anderen Lipasen gereinigt wird.

Die Abtrennung von Lipasen aus einem Lipasegemisch ist jedoch sehr schwierig und gelingt wegen der Ähnlichkeit der Enzyme bestenfalls im La¬ bormaßstab mit aufwendigen, meist Chromatographisehen Methoden.

Für die Herstellung hochreiner Ölsäure, für die technischer Bedarf be¬ steht, ist es jedoch von Interesse, ein durch gängige Fermentationsmetho¬ den und ohne aufwendige Trennverfahren herstellbares Lipasepräparat zur Verfügung zu haben, das zur selektiven Spaltung von Triglyceriden befähigt ist.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung einen Mikroorganismus bereitzustellen, der bei der Fermentation ein solches Lipasepräparat liefert und ein

Verfahren zur selektiven Spaltung von Triglyceriden mit Hilfe dieses Lipasepäparats aufzuzeigen.

Hauptgegenstand, der Erfindung ist daher ein durch Mutation und Selektion aus einem Wildstamm erzeugter Mikroorganismenstamm der Spezies Geotrichum mit der Hinterlegungsbezeichnung DSM 6590 und der Fähigkeit, eine Lipase¬ mischung zu erzeugen, die aus Triglyceriden von Fettsäuremischungen selek¬ tiv Ölsäure abspaltet, sowie Mutanten und Varianten dieses Stammes.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ist eine Lipasemischung aus Geotrichum sp. DSM 6590 herstellbar durch Anzüchten des Mikroorganismus unter üblichen Fermentationsbedingungen in Gegenwart von Estern der Öl¬ säure, Abtrennen der Zellen und fester Medienbestandteile und gewünschten- fal1s Entfernen niedermolekularer Bestandteile durch Ultrafiltration, Aus¬ konzentrieren durch Eindampfen und/oder Fällen und/oder Gefriertrocknung.

Ein dritter Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Lipasen nach den Ansprüchen 2 bis 4 zur selektiven Abspaltung von Ölsäure aus Fett¬ säuretriglyceriden.

Der erfindungsgemäß beanspruchte und eingesetzte Mikroorganismus Geotrichum sp. wurde durch Mutation und Selektion aus einem Wildstamm ent¬ wickelt, der in der Nähe der oleochemischen Anlagen der Anmelderin gefun¬ den wurde. Der Wildstamm dürfte der Spezies Geotrichum candidum zuzuordnen sein. Makroskopische und mikroskopische Untersuchungen zeigen, daß der Pilz ein gut entwickeltes Mycel bildet. Endteile der Hyphen zerfallen in kurze Arthrosporen, die sich als würfelartig oder kurz zylindrisch mit flachen Enden charakterisieren lassen. Cytologische Untersuchungen (Kern¬ färbung nach Giemsa) zeigten, daß die Hyphen septiert sind und die Hyphen- segmente 5 - 10 Kerne enthalten. Die Oidiosporen enthalten überwiegend 1 oder 2 Kerne im Verhältnis 1 : 1; nur wenige Oidiosporen besitzen 3 oder mehr Kerne.

Zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Stammes wurden Oidien eines Isolats des Wildstammes mit N-Methyl-N-Nitroso-N'-Nitroguanidin so mutagenisiert,

daß etwa 3,6 % der Oidien keimfähig blieben. Die mutierten Oidien wurden in verschiedenen Verdünnungsstufen nacheinander so ausplattiert, daß ein¬ zelne Kolonien gut voneinander getrennt wuchsen. Mittels der Lederberg'sehen Stempelmethode wurden Mutanten isoliert. Mutanten mit ge¬ steigerter Lipaseaktivität wurden erneut der Behandlung mit N-Methyl-N- Nitroso-N'-Nitroguanidin unterzogen. Nach vier Mutationszyklen wurde der erfindungsgemäße Stamm erhalten. Es handelt sich um eine Leaky-Mutante, also eine Mutante, die auf Grund ihrer äußeren Form als geschädigt er¬ kennbar ist. Die Lipaseaktivität ist gegenüber dem Wildstamm um den Faktor 50 gesteigert. Auf Grund der durch das Mutationsverfahren erzeugten Schä¬ digung kann angenommen werden, daß sich die erzeugte Mutante durch den - zufälligen Eingriff - des mutierenden Agens sehr stark von dem Wildstamm unterscheidet. Die erfindungsgemäße Mutante ist bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen als Geotrichum sp. DSM 6590 nach Budapester Vertrag hinterlegt.

Zur Erzeugung der Lipasemischung aus dem erfindungsgemäßen Stamm wird dieser unter üblichen Fermentationsbedingungen angezüchtet. Dabei sollte das Fermentationsmedium eine N-Quelle, wie z. B. Hefe-Extrakt, eine C-Quelle, einen Induktor und gewünschtenfalls Spurenelemente enthalten. Dabei hat sich herausgestellt, daß vorteilhafter Weise flüssige Fettsäure- triglyceride miteingesetzt werden, und daß diese gleichzeitig die Funktion eines Nährstoffes (C-Quelle) und die eines Induktors für die Lipasebildung übernehmen können. Eine vorteilhafte Menge an Fettsäuretriglyceriden bei¬ der Fermentation liegt zwischen 5 und 50 g/1 Fermentationsmedium. Es ist ^' dabei ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäß beanspruchten Stammes, daß die Verwendung des Induktors die gewünschte Selektivität der Lipase nicht nachteilig beeinflußt, gleichwohl aber die wirtschaftliche Ausbeute an Lipase ermöglicht. Dies ist überraschend und steht im Gegensatz zu Be¬ funden der Fachliteratur.

Zur Gewinnung einer Lipase-Mischung aus dem Fermentations-Medium werden Zellen und feste Medienbestandteile abgetrennt. Die Abtrennung kann in üblicher Weise etwa durch Zentrifugation oder durch Filtriereinrichtungen geschehen. Es ist dann zweckmäßig, das Fermentationsmedium, das die Lipase enthält, zu konzentrieren, was beispielsweise durch Ultraf ltration oder

Dünnschichtverdampfung geschehen kann. Es ist auch möglich, die Lipasen in geeigneter Weise durch Fällungsschritte zu isolieren.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Stammes gewonnene rohe Lipase-Mischung enthält im wesentlichen zwei Lipasen. Die Rohmischung kann für technische Prozesse mit Vorteil ohne Trennung dieser Lipasen eingesetzt werden, da beide Lipasen selektiv einfach-ungesättigte Fettsäuren mit Doppelbindung in cis-9-Stellung abspalten.

Falls dies gewünscht wird, kann die erfindungsgemäße Lipasemischung aus Geotrichum sp. DSM 6590 jedoch auch in zwei Einzel!ipasen getrennt werden, nämlich in eine Lipase mit einem Molekulargewicht von ca. 67 kDa und einem isoelektrischen Punkt pl 4,3 und in eine Lipase mit gleichem Molekularge¬ wicht und einem isoelektrischen Punkt pl 4,5. Die Trennung der beiden Li¬ pasen kann analytisch über Elektrophorese geschehen. Im präparativen Ma߬ stab ist sie durch säulenchro atographische Verfahren, insbesondere durch HPLC möglich.

Die erfindungsgemäßen Lipasen können allgemein zur Veresterung und zur Spaltung von Estern eingesetzt werden, insbesondere zur Spaltung von Tri¬ glyceriden. Aufgrund der Selektivität des Lipasegemisches und der Einzel- lipasen ist sie bevorzugt zur Abspaltung von einfach ungesättigten Säuren, insbesondere von Ölsäure aus ölsäurereichen Triglyceriden einzusetzen. So kann unter Zuhilfenahme der erfindungsgemäßen Lipasemischung aus ölsäure¬ reichen Triglyceriden, wie z. B. aus Sonnenblumenöl oder Sonnenblumenöl- Neuzüchtungen, aber auch aus Palmöl oder tierischen Ölen und Fetten Öl¬ säure mit sehr hohem Reinheitsgrad gewonnen werden.

Zur Triglyceridspaltung setzt man die Lipase als aufkonzentrierte Fermen¬ tationslösung, die durch Ultrafiltration gereinigt worden sein kann, als Präzipitat oder in gefriergetrockneter Form ein und gibt sie zu Öl-Was¬ ser-Gemischen. Dabei ist es vorteilhaft, das Verhältnis von Lipidphase (Ölphase) zu wäßriger Phase zwischen 10 : 90 und 90 : 10 einzustellen, vorzugsweise zwischen 60 : 40 und 90 : 10 einzustellen.

Bei vielen Einsatzarten der Lipase kann es vorteilhaft sein, die Phasen¬ grenzfläche zwischen Öl und Wasser zu erhöhen. Dies kann auf mechanischem Wege durch Rühren geschehen. Es können jedoch auch Emulgatoren zugesetzt werden. Besonders Partialglyceride haben sich dabei als Emulgatoren be¬ währt, so z. B. Glycerinmonooleat oder -stearat.

Bei der Spaltung von Estern durch das erf ndungsgemäße Lipase-Ge isch kann die wäßrige Phase mit Hilfe eines Puffers auf pH-Werte zwischen 4 und 8 eingestellt werden. Dies ist jedoch keine zwingende Voraussetzung, da die erfindungsgemäßen Lipasen-Mischungen und die Einzel-Lipasen wenig pH-ab¬ hängig sind. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird daher bei der Spaltung von Fettsäuretriglyceriden der pH-Wert nicht nachreguliert. Ge¬ eignete Temperaturen für die Spaltungsreaktion liegen zwischen 10 °C und 60 °C, insbesondere zwischen 30 °C und 40 °C. Die Einsatzmengen der Lipa¬ sen sollten zwischen 0,5 und 50 U/g Fett oder Öl liegen. Bevorzugt sind Einsatzmengen in einer Menge von 2 bis 15 U/g.

(U) entspricht der Freisetzung von 1 mol Fettsäure pro Minute.

Aus der flüssigen Phase können die erfindungsgemäßen Lipase-Mischungen oder auch die Einzel-Lipasen auch noch in üblicher Weise immobilisiert oder trägergebunden eingesetzt werden.

Wie in den Beispielen belegt, zeigt die Lipase-Mischung den Vorteil hoher Selektivität. So werden bei Einsatz eines ungereinigten und nicht aufge¬ trennten Enzympräparats, beispielsweise bei Palmöl, nur maximal 2 bis 3 % der gesättigten Fettsäuren enzymatisch freigesetzt, wohingegen Ölsäure zum überwiegenden Anteil abgespalten wird.

B e i s p i e l e

Beispiel 1: Isolierung des Wildstammes

Abstriche mit sterilen und feuchten Wattestäbchen von Substraten aus den Henkel Öl- und Fettbetrieben wurden auf Mais-Malz-Agarplatten ausgestri¬ chen.

Mais-Malz-Aqar:

- Maismehlextrakt 1000 ml

- Malzextrakt 30 g

- 10 % KOH 2 ml

Die Inkubation der Mais-Ma!z-Agarplatten mit den Abstrichen erfolgte bei 25 °C über 72 Stunden. Die Mikroorganismen wurden auf Mais-Malz-Agarplat¬ ten vereinzelt und die so erhaltenen Reinkulturen auf Fett-/Öl-Agarplatten (Olivenöl) transferiert.

Olivenöl-Aqarplatten:

- 1/15 M Sörensen-Phosphat-Puffer pH 7,0 und 1,5 % Agar autoklavieren

- bei ca. 80 °C mit 0,1 % Olivenöl, Triolein oder Trilinolein versetzen

- 3 - 5 Minuten mit Ultraschall (400 W) homogenisieren

- je 15 ml in Petrischalen gießen

Wenn ein Mikroorganismus eine Lipase ausscheidet (extracelluläre Lipase) bildet sich eine klare Zone um die Zellkolonie. Mit Hilfe der "Lysezonen" können die aktivsten Lipasebildner identifiziert werden. Durch die Auswahl der Triglyceride kann außerdem die Selektivität der gebildeten Lipasen grob abgeschätzt werden.

Ein auf diese Weise erhaltener Wildtyp-Lipasebildner zeigte eine besonders gute lipolytische Aktivität gegen Triolein und Trilinolein.

Der erhaltene Wildtyp wurde in Schüttelkolben-Kulturen fermentiert und die Ausscheidung von extracellulärer Lipase untersucht. Die zellfreien Kultur¬ brühen enthielten Lipaseaktivitäten von 0,7 - 1,0 U/ml Kulturfiltrat.

Medium:

Hefeextrakt (5 g/1)

Olivenöl (10 g/1)

Pepton (6 g/1)

NaCl (1,4 g/1) pH 6,3

Inkubationsbedinqunqen:

Das eingesetzte Olivenöl dient als Induktor der Lipaseproduktion.

150 ml Medium wurden in 500 ml-Erlenmeyer mit dem Schimmelpilz beimpft und bei 26 °C und 160 U/Min unter Schütteln inkubiert. Maximale Lipaseaktivi¬ tät wurde nach 72 - 96 Stunden gemessen.

Beispiel 2: Einspormycelien/Mutationsverfahren

Es wurden Einspormycelien, die durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungs¬ stufen einer Oidienabschwemmung des Wildtyps erhalten wurden, im folgenden Medium auf Lipaseaktivität untersucht.

Medium 1:

Hefeextrakt (10 g/1) Olivenöl (10 g/1) pH 6,3

Ein Isolat zeigte eine um 50 % gesteigerte Lipaseaktivität (2 U/ml).

Oidien dieses Isolats (Sporen, die der Pilz zur Vermehrung bildet), wurden mit N-Methyl-N-Nitroso-N'-Nitroguanidin so mutagenisiert, daß etwa 3,6 %

keimfähig blieben. Die mutierten Oidien wurden in verschiedenen Verdün¬ nungsstufen nacheinander so ausplattiert, daß einzelne Kolonien gut von¬ einander getrennt wuchsen (Bedingungen siehe unten). Mittels der Leder- berg-Stempel-Methode wurden harte ("normale") und Leaky-Mutanten (Mutan¬ ten, die aufgrund ihrer äußeren Form als geschädigt erkennbar sind) iso¬ liert. Mutanten mit gesteigerter Lipaseaktivität wurden erneut der N-Methyl-N-Nitroso-N'-Nitroguanidin-Behandlung unterzogen.

Nach 4 Mutationszyklen zeigte die isolierte Leaky-Mutante DSM 6590 eine gegenüber dem Wildtyp um den Faktor 50 gesteigerte Lipaseaktivität.

Beispiel 3: SchütteIkulturen/Fermentationen

Ein Fermentationsmedium wurde hergestellt, enthaltend:

Olivenöl 21 g/1 Maisquellwasser 10 g/1 Hefeextrakt KAT 20 g/1 (erhalten von der Fa. Ohly, Hamburg)

Es wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Der pH-Wert wurde 120 Stunden konstant gehalten. Es wurde unter Rühren bei 26 °C fermentiert. Dabei wurde pro Minute das Reaktorvolumen an Luft in den Fermenter eingeblasen.

Beispiel 4: Enzymaufbereitung

Die aus der Fermentation erhaltenen Kulturüberstände wurden über eine DurchlaufZentrifuge von Zellen und festen Medienbestandteilen getrennt.

Anschließend wurde über eine Ultrafiltrationseinheit und über eine Dünn¬ schichtverdampfung aufkonzentriert. Das so erhaltene Filtrat wurde ge¬ friergetrocknet. Erhalten wurde ein Rohpräparat. Es resultierten 24 Gramm Rohpräparat mit einer spezifischen Lipaseaktivität von 3000 U/g aus der Fermentation, entsprechend einer 63fachen Auftrocknung.

Beispiel 5: Enzymreinigung

Rohpräparat:

spez. Aktivität: 3000 U/g Proteingehalt: 5 %

Das Rohpräparat wurde in Wasser gelöst und über Nacht gegen Tris-Puffer (A-Puffer) dialysiert. Anschließend wurde die Lipase über einen Anionen- austauscher gebunden.

Bedingungen:

Anionenaustauscher: Q-Sepharose / Pharmacia

A-Puffer: Tris 30 mM pH 7,6

B-Puffer: Tris 30 mM pH 7,6 + 1 M NaCl

Die Lipase wurde in einem linearen Salzgradient (0 - 1 M NaCl), der mit den Puffern A und B aufgebaut wurde, eluiert.

In einem zweiten Schritt wurde die Lipaselösung auf eine Gelfiltrations¬ säule aufgegeben und mit Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer eluiert.

- Gelfiltration: Sephadex G 25 / Pharmacia (Säule: 100 cm Höhe, 11,3 cm Durchmesser)

- Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer - 50 M

- Menge aufgegebene Lipaselösung: 1200 ml

- spez. Aktivität: 50 U/ml

Die Lipase-haltige Fraktion wurde lyophil siert (gefriergetrocknet).

Lyophilisat:

spez. Aktivität: 60000 U/g ProteingehaU: 60 % Elektrophorese nativ: 2 Lipasebanden Elektrophorese SDS: 1 Bande, Molekulargewicht 67 kDa Isoelektrische Punkte: pl 4,3 und pl 4,5

Beispiel 6: Trennung der Lipasen

Die zwei elektrophoretisch nachgewiesenen Lipasen des gereinigten Lyophilisates wurden über HPLC getrennt.

Bedingungen:

TSK OEAE 3 SW Säule / Supelco

A-Puffer: Na-Phosphat 50 mM pH = 5,8

B-Puffer: Na-Phosphat 50 mM pH = 5,8 + 1 M NaCl

Gradient: in 1 Stunde von 0 auf 20 % B-Puffer

Flußrate: 1 ml/Min

Einspritzen: 100 μl einer 10 mg/ml Stammlösung in A-Puffer

Es wurden zwei Fraktionen mit je einer Lipase erhalten, die zu Selektivi¬ tätsuntersuchungen eingesetzt wurden.

Beispiel 7: Selektivitätsuntersuchungen

Es wurden sowohl die zwei getrennten Isoenzyme als auch das aufgereinigte Lyophilisat und das aus der Fermentation stammende Rohpräparat zu Selekti¬ vitätsuntersuchungen eingesetzt.

Bedingungen:

Reaktionsansatz:

Phosphatpuffer pH 7,0 - 0,05 M

Palmöl als Substrat

Verhältnis Puffer/Substrat 4/1 (v/v)

30 °C / schütteln

Gesamtvolumen Reaktionsansatz 1 ml

Lipasemenge Rohpräparat 2 mg/Ansatz

Lipasemenge Lyophilisat 0,1 mg/Ansatz bei Lipase-Nachdosierung: dieselben Mengen an Lipasen in 100 μl gelöst

Es wurden folgende Ansätze untersucht:

Nachdosieren von frischer Enzymlösung

Nachdosieren von Substrat

Reaktion im ungepufferten System

Reaktion bei verschiedenen Verhältnissen Puffer / Substrat

Variation des Substrates und somit der Fettsäurezusammensetzung:

Palmöl, Fancytalg, Sojaöl

Selektivität der Lipasen Werte nach 24 Stunden Reaktionszeit

gemäß Erfindung gemäß Erfindung Vergleichsbeispiel