Bei elektrophoretischen oder chromatographischen Trennverfahren macht man sich physikalische oder biochemische Eigenschaften der aufzutrennenden Verbindungen, wie etwa elektrische Ladung, Größe oder Molekulargewicht, zu nutze. Auf Probleme der Trennung trifft man hierbei bei Verbindungen, die ähnliche physikalische oder biochemische Eigenschaften aufweisen. Besondere Probleme bereitet hierbei beispielsweise die Auftrennung von hydrophoben Proteinen, insbesondere Membranproteinen, die mit den gängigen Trennverfahren, wie etwa der zweidimensionalen Gelelektrophorese, nicht auftrennbar sind.

Bei der zweidimensionalen Gelelektrophorese schließt sich in der Regel einem ersten Schritt in Form einer isoelektrischen Fokussierung, bei dem Auftrennung der Spezies der Probe nach ihrem pl-Wert erfolgt, ein hierzu senkrechter Trennschritt in Form einer SDS-Gelelektrophorese an, bei der Auftrennung der Spezies der Probe primär nach ihrem Molekulargewicht erfolgt.

Ein prinzipielles Problem hinsichtlich der isoelektrischen Fokussierung von Membranproteinen oder hydrophoben Proteinen im allgemeinen stellt hierbei die Tatsache dar, dass bei dieser Methode nur ungeladene, also neutrale oder zwitterionische, Detergentien verwendet werden können, nicht jedoch ionische Detergentien, wie beispielsweise SDS, die am besten für die Solubilisierung von Membranproteinen geeignet sind.

Die Ursachen für die Probleme hinsichtlich der Auftrennung von Membranproteinen durch isoelektrische Fokussierung sind daher vor allem die unzureichende Solubilisierung der Membranproteine einer Probe, die Adsorption der hydrophoben Proteine an die Polyacrylamid-Gelmatrix und Löslichkeitsprobleme der Membranproteine am isoelektrischen Punkt.

Somit ist also gerade für Membranproteine die zweidimensionale Gelektrophorese, die herkömmlich zur Charakterisierung eines Proteingemisches eingesetzt werden kann, völlig ungeeignet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Auftrennung von Makromolekülen zur Verfügung zu stellen, die aufgrund ihrer biochemischen oder physikalischen Eigenschaften mit den herkömmlichen Trennverfahren nicht oder nur schwer auftrennbar sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es insbesondere, ein mehrdimensionales Verfahren zur Auftrennung von hydrophoben Proteinen, vor allem Membranproteinen, zur Verfügung zu stellen, das besser geeignet zur Auftrennung der hydrophoben Proteine ist als die bislang beschriebenen und herkömmlich angewendeten Trennverfahren.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren, bei dem vor Durchführung des Trennverfahrens die Makromoleküle der Probe mit mindestens einer Gruppe inkubiert werden, die dazu in der Lage ist, an mindestens eines der Makromoleküle aus der Probe kovalent zu binden und die nach Bindung an das Makromolekül unter milden Bedingungen wieder vollständig oder teilweise entfernt werden kann, so dass nach der Inkubation mindestens ein Makromolekül der Probe mit mindestens einer Gruppe modifiziert worden ist und nach Durchführung des Trennverfahrens die modifizierende Gruppe wieder teilweise oder vollständig entfernt werden kann, so dass gegebenenfalls die unmodifizierten oder die lediglich mit einem Barcode versehenen Ausgangsverbindungen wiedererhalten werden können. Mit den auf diese Weise entmodifizierten Makromolekülen können nun gegebenenfalls weitere Trennschritte durchgeführt werden.

Im Stand der Technik (WO 99/19514) sind bislang lediglich Verfahren beschrieben, bei denen vor Durchführung eines Trennverfahrens entweder eine irreversible kovalente Modifizierung von Makromolekülen erfolgt, also eine solche, bei der Abspaltung der modifizierenden Gruppe unter milden Bedingungen nicht möglich ist, oder aber Verfahren, bei denen eine völlig unspezifische Markierung mit nicht kovalent bindenden, interkalierenden Farbstoffen erfolgt. Beide Verfahren sind nicht dazu geeignet, die erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Auftrennung einer Probe von Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Makromolekül aus der Probe vor Durchführung des Trennverfahrens mit mindestens einer Gruppe reversibel chemisch modifiziert wird, wobei mit reversibler chemischer Modifikation gemeint ist, dass die eingeführte Gruppe unter milden Bedingungen wieder teilweise oder vollständig vom Makromolekül abgespalten werden kann.

Durch selektive und spezifische Modifizierung von Makromolekülen der Probe werden so selektiv und spezifisch die physikalischen und/oder biochemischen Eigenschaften der Makromoleküle, wie beispielsweise das Molekulargewicht, die Polarität oder die elektrische Ladung, verändert, oder es wird eine Markierung eingeführt, wie beispielsweise eine magnetische oder radioaktive Markierung, so däss eine Trennung der Makromoleküle durch entsprechende Verfahren, die auf den genannten Eigenschaften beruhen, möglich wird.

Das Verfahren ist hierbei besonders geeignet, um Makromoleküle mit gleichen oder sehr ähnlichen Eigenschaften, insbesondere etwa gleichem oder ähnlichem Molekulargewicht, die sich jedoch in der Anzahl der funktionellen, chemisch modifizierbaren Gruppen unterscheiden, aufzutrennen. Durch Umsetzen mit modifizierenden Gruppen können so beispielsweise die molekularen Massen der einzelnen Makromoleküle in Abhängigkeit von den funktionellen Gruppen auf unterschiedliche Weise erhöht werden, so dass die Auftrennung dieser Makromoleküle möglich wird.

Bei den Makromolekülen handelt es sich hierbei erfindungsgemäß beispielsweise um Kohlenhydrate, Nukleinsäuren oder Proteine, insbesondere um hydrophobe Proteine, vor allem Membranproteine, oder um Verbindungen oder Komplexe, die mindestens eine der genannten Verbindungen umfassen. Bei der Verbindung kann es sich beispielsweise um ein Glykoprotein handeln, bei dem Komplex beispielsweise um ein mittels Detergentien solubilisiertes Membranprotein. Die Makromoleküle können erfindungsgemäß auch auf eine dem Fachmann bekannte Weise modifiziert sein.

Bei der Probe an Makromolekülen handelt es sich entsprechend um eine Probe, die mindestens zwei Makromoleküle ausgewählt aus mindestens einer der zuvor genannten Gruppen umfasst, wobei es sich vorzugsweise um eine Probe handelt, die mindestens zwei Makromoleküle umfasst, die aufgrund ihrer biochemischen oder physikalischen Eigenschaften oder aus technischen Gründen in einem Trennverfahren nicht oder nur schwer, insbesondere unzureichend, auftrennbar sind.

Die Probe an Makromolekülen umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform vollständig oder teilweise ein natürlicherweise vorkommendes Ensemble, wie etwa das Genom oder das Proteom einer Zelle und/oder eines Organells, vor allem das Proteom einer Zellmembran oder einer Organellmembran, wobei"teilweise" vorzugsweise bedeutet, dass die Probe mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 Makromoleküle, vor allem mindestens 20 Makromoleküle, eines solchen Ensembles umfasst.

Die Probe umfasst erfindungsgemäß mindestens ein Makromolekül, das durch eine modifizierende Gruppe modifiziert werden kann, vorzugsweise sind jedoch mehrere oder alle der Makromoleküle der Probe durch mindestens eine, vorzugsweise mehrere, modifizierende Gruppen modifizierbar.

Die Modifizierung des mindestens einen Makromoleküls durch die mindestens eine modifizierende Gruppe wird erfindungsgemäß dadurch möglich, dass Makromolekül und modifizierende Gruppe jeweils mindestens eine funktionelle Gruppe umfassen, die miteinander eine Verknüpfung, vorzugsweise eine kovalente Verknüpfung, ausbilden können. Beispielsweise umfasst das Makromolekül mindestens eine nukleophile Gruppe und die modifizierende Gruppe mindestens eine elektrophile Gruppe oder umgekehrt. Die mindestens eine funktionelle Gruppe des Makromoleküls wird im folgenden zur Unterscheidung von der mindestens einen funktionellen Gruppe der modifizierenden Gruppe auch"reaktive Gruppe"genannt.

Die modifizierende Gruppe kann entsprechend, in Abhängigkeit von der reaktiven Gruppe des Makromoleküls, beispielsweise mindestens eine der folgenden funktionellen Gruppen umfassen : Zur Reaktion mit einer Aldehydgruppe eine Hydrazid-oder Aminogruppe, zur Reaktion mit einer Thiolgruppe eine Thiolgruppe, ein Haloacetylderivat, z. B. RCOCH21, eine Maleimidgruppe oder eine Vinylsulfongruppe, zur Reaktion mit einer Aminogruppe einen Aktivester, z. B. NHS, eine Aldehydgruppe, ein Isthiocyanat, ein Isocyanat, ein Acylazidderivat, ein Sulfonylchlorid, ein aktiviertes Carbonatderivat, einen Imidoester oder ein Säureanhydrid.

Bei der mindestens einen reaktiven Gruppe, die das Makromolekül umfasst, handelt es sich vorzugsweise um eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe und/oder um eine Thiolgruppe. In einer besonderen Ausführungsform können diese Gruppen in Aminosäuren bzw : Aminosäureresten enthalten sein. Die reaktiven Gruppen können entweder natürlicherweise im Makromolekül enthalten sein oder in das Makromolekül in einer dem Fachmann bekannten Weise eingeführt worden sein.

Vorzugsweise sind mehrere reaktive Gruppen in einem zu modifizierenden Makromolekül vorhanden.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den reaktiven Gruppen um die Aminogruppen der Lysinreste sowie um die N-terminale Aminogruppe und/oder um die Thiolgruppen der Cysteinreste von natürlicherweise vorkommenden Proteinen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der reaktiven Gruppe um Keto-oder Aldehydgruppen, beispielsweise um Aldehydgruppen, die in der Zuckerkomponente von Glykoproteinen enthalten sind.

Die Makromoleküle können auch mehrere gleiche oder unterschiedliche reaktive Gruppen enthalten, die beispielsweise dazu in der Lage sein können, mit unterschiedlichen modifizierenden Gruppen auf selektive Weise zu reagieren.

Ebenso kann auch die modifizierende Gruppe mehrer gleiche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen enthalten. Modifikation von Makromolekülen mit mehreren reaktiven Gruppen durch mehrere modifizierende Gruppen kann gleichzeitig oder sukzessiv erfolgen.

Die modifizierende Gruppe zeichnet sich dadurch aus, dass sie entweder dazu in der Lage ist, eine Verbindung mit mindestens einem Makromolekül der Probe auszubilden, die unter milden Bedingungen wieder gespalten werden kann, oder aber die Gruppe ist dazu in der Lage eine stabile Bindung mit dem Makromolekül einzugehen, die unter milden Bedingungen nicht gespalten werden kann, wobei die modifizierende Gruppe dann jedoch eine Verknüpfung umfasst, die unter milden Bedingungen gespalten werden kann, so dass bei Spaltung dieser Verknüpfung die modifizierende Gruppe teilweise, vorzugsweise großteils, wieder entfernt werden kann. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass die modifizierende Gruppe je nach Verwendungszweck nach Durchführung des Trennverfahrens entweder vollständig oder teilweise wieder entfernbar und dadurch entweder das vollständig oder das weitgehend entmodifizierte Makromolekül wieder erhältlich ist.

Im ersten Fall, also für den Fall, dass die modifizierende Gruppe wieder vollständig entfernt werden kann, handelt es sich bei reaktiver Gruppe und funktioneller Gruppe vorzugsweise jeweils um eine Thiolgruppe. Die modifizierende Gruppe kann so unter milden oxidierenden Bedingungen eingeführt und unter milden reduzierenden Bedingungen wieder entfernt werden.

Im zweiten Fall handelt es sich bei reaktiver Gruppe und funktioneller Gruppe jeweils um eine der zuvor genannten Gruppen, die miteinander eine stabile kovalente Bindung ausbilden können, die unter milden chemischen Bedingungen nicht ohne weiteres gespalten werden kann, wie beispielsweise eine C-C-Bindung, eine Amid-, vor allem Peptid-, oder Ester-Bindung oder eine sonstige stabile Verknüpfung, vor allem kovalente Verknüpfung, die dem Fachmann bekannt ist. In diesem Fall umfasst die modifizierende Gruppe jedoch eine Verknüpfung, die unter milden Reaktionsbedingungen gespalten werden kann.

Mit einer unter milden Bedingungen spaltbaren Verknüpfung ist erfindungsgemäß beispielsweise gemeint eine unter leicht reduktiven oder leicht oxidativen Bedingungen, oder unter leichter Erhöhung oder Erniedrigung des pH-Wertes und/oder des Redoxpotentials spaltbare Verknüpfung oder etwa eine photolytisch spaltbare Verknüpfung. Allgemein sind hiermit desweiteren Bedingungen gemeint, bei denen eine Spaltung der normalerweise anzutreffenden kovalenten Verknüpfungen, wie sie in den vor Durchführung der Modifikation in der Probe vorliegenden Makromolekülen, wie beispielsweise Proteinen, anzutreffen sind, nicht stattfindet, das heißt, dass die Bindung unter Reaktionsbedingungen gespalten werden kann, bei welchen zumindest die Primärstruktur der Makromoleküle nicht verändert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Spaltung auch unter Erhalt der Sekundär-oder Tertiärstruktur der Makromoleküle erfolgen.

Insbesondere kann es sich hierbei bei der unter milden Bedingungen spaltbaren Gruppe beispielsweise handeln um eine Disulfidbrücke, die durch Einstellen eines reduktiven Milieus gespalten werden kann, oder etwa um eine vizinale cis- Diolgruppe, die mit Natriumperiodat (Na104) oder Bleitetraacetat (Pb (OAc) 4) gespalten werden kann, oder etwa um eine photolytisch spaltbare Gruppe, wie z. B. einen 1- (2-Nitrophenyl)-ethyl-ester, der durch UV-Strahlung von 300-360 nm gespalten werden kann oder um eine andere photolytisch spaltbare Gruppe, wie sie z. B. einer der folgenden Veröffentlichungen zu entnehmen sind : Proc. Natl. Acad.

Sci. (1995) 92 : 7590-4 : Photocleavable biotin derivatives : a versatile approach for the isolation of biomolecules ; J. Org. Chem. (1997) 62 : 2370-80 : Model studies for new o-Nitrobenzyl photolabile linkers : substituent effects on the rates of photochemical cleavage.

Die unter milden chemischen Bedingungen spaltbare Verknüpfung kann sich in jedem Bereich der modifizierenden Gruppe befinden. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sie sich jedoch in der Nähe der stabilen Verknüpfung, die zwischen Makromolekül und modifizierender Gruppe ausgebildet worden ist, so dass bei Spaltung dieser Verknüpfung die modifizierende Gruppe großteils wieder entfernt wird, wobei vorzugsweise nach so erfolgter Entfernung der modifizierenden Gruppe bzw. modifizierenden Gruppen der am Makromolekül verbleibende Rest dieser Gruppe (n) nicht mehr als 10 %, besonders bevorzugt nicht mehr als 5 %, vor allem nicht mehr als 2 %, des Molekulargewichts des entmodifizierten Makromoleküls ausmacht, so dass das ursprüngliche Molekulargewicht des Makromoleküls weitgehend wieder hergestellt wird.

In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich hierbei bei dem am Makromolekül verbleibenden Rest der modifizierenden Gruppe (n) um einen Barcode. Bei dem Barcode handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine Gruppe, die zur Detektion zwecks in-Gel-Hybridisierung mit z. B. einem radioaktiv markiertem Oligonukleotid dienen kann und/oder um eine Gruppe, die es erlaubt behandelte ("treated") von unbehandelten ("control") Makromolekülen zu unterscheiden sowie gegebenenfalls auf einem Gel zu trennen und separat zu detektieren.

Als Barcode ist in diesem Sinne also jede Gruppe geeignet, die eine Unterscheidung von unbehandeltem und behandeltem Molekül erlaubt. Bevorzugt umfasst der Barcode jedoch erfindungsgemäß mindestens ein Oligo-oder Polynukleotid, insbesondere eine RNA oder DNA, oder eine sogenannte peptide-nucleic acid (PNA), wobei diese Verbindungen sowohl einzel-als. auch doppelsträngig vorliegen können. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuren mit mindestens einer aromatischen Gruppe markiert, beispielsweise mit einer heterozyklischen Gruppe.

Vorzugsweise werden die Bedingungen bei der Modifizierung der Makromoleküle der Probe so gewählt, dass eine homogene Modifizierung der Spezies der Probe erfolgt. Homogen heißt in diesem Zusammenhang, dass die Makromoleküle der Probe in Abhängigkeit von der Anzahl der reaktiven Gruppen, die ein einzelnes Makromolekül umfasst, in unterschiedlichem Maße markiert werden.

Die Bedingungen können hierbei so gewählt werden, dass beispielsweise sämtliche reaktive Gruppen eines Makromoleküls mit der modifizierenden Gruppe umgesetzt werden oder aber nur ein bestimmter Prozentsatz der reaktiven Gruppen eines Makromoleküls mit der modifizierenden Gruppe umgesetzt werden, beispielsweise, indem eine relativ geringe Konzentration an. modifizierenden Gruppen eingesetzt wird.

Die Reaktionsbedingungen können, etwa bei Modifizierung von nativen Makromolekülen, auch so gewählt werden, dass nur besondere reaktive Gruppen mit der modifiziernden Gruppe umgesetzt werden, beispielsweise solche, die aufgrund ihrer Natur eine höhere Reaktivität zeigen als andere Gruppen, oder solche, die aufgrund der Tertiärstruktur des Makromoleküls leichter zugänglich sind als andere Gruppen, beispielsweise, weil sie nach außen hin exponiert sind.

Eine solche selektive Markierung kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass bei der Inkubation mit der mindestens einen modifzierenden Gruppe die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass zwischen der Reaktivität der verschiedenen reaktiven und/oder funktionellen Gruppen unterschieden werden kann, bzw., im letzteren Fall, dadurch, daß die Tertiärstruktur der Makromoleküle zumindest teilweise erhalten bleibt, wodurch nur die nach außen hin exponierten reaktiven Gruppen der Modifikation zugänglich sind, nicht jedoch die nach Innen gekehrten.

Das Trennverfahren umfaßt erfindungsgemäß mindestens einen elektrophoretischen oder chromtographischen Trennschritt. Die Probe wird hierbei vorzugsweise vor Auftrag auf das Gel in einer geeigneten Weise präpariert, wie sie dem Fachmann für die Durchführung entsprechender Trennverfahren, beispielsweise der Polyacrylamidgelelektrophorese, bekannt ist. Erfindungsgemäß kommen bei Durchführung der Polyacrylamidgelelektrophorese besonders bevorzugt Polyacrylamidgele mit einer hohen Trennschärfe zum Einsatz. Das Trennverfahren kann erfindungsgemäß sowohl zu analytischen als auch zu präparativen Zwecken eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Trennverfahren um ein mehrdimensionales, vor allem zweidimensionales, Trennverfahren, wobei in einer besonders bevorzugten Ausführungsform das Trennverfahren hierbei so durchgeführt wird, dass die Probe an Makromolekülen mit mindestens einer modifizierenden Gruppe inkubiert wird und anschließend mindestens ein Trennschritt mit der so behandelten, mindestens ein modifiziertes Makromolekül enthaltenden Probe, erfolgt, danach die modifizierenden Gruppen vollständig oder teilweise entfernt werden und anschließend mit den so entmodifizierten Makromolekülen ebenfalls mindestens ein Trennschritt durchgeführt wird.

Alternativ oder zusätzlich können natürlich auch bereits vor der Modifikation der Makromoleküle ein oder mehr Trennschritte mit den unbehandelten Makromolekülen durchgeführt werden.

Bei den Trennschritten kann es sich hierbei unabhängig voneinander um chromatographische oder elektrophoretische Verfahren handeln. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird für die Auftrennung der Makromoleküle die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) eingesetzt.

Insbesondere für die Auftrennung von hydrophoben Proteinen, vor allem Membranproteinen, ergibt sich hier der besondere Vorteil, daß anstelle der isoelektrischen Fokussierung, die bei zweidimensionalen gelelektrophoretischen Verfahren üblicherweise als erster Trennschritt angewendet wird, ein Trennschritt mit den Proteinen erfolgen kann, bei dem auch ionische Detergentien eingesetzt werden können, die zur Solubilisierung der Membranproteine besonders geeignet sind.

Der erste Trennschritt besteht daher insbesondere in diesem Fall erfindungsgemäß vorzugsweise in der elektrophoretischen Auftrennung der chemisch reversibel modifizierten Proteine durch SDS-PAGE. Als zweiter Schritt erfolgt dann, vorzugsweise etwa senkrecht zur ersten Trennrichtung, nach vollständiger oder teilweiser Entfernung der modifizierenden Gruppen, die elektrophoretische Auftrennung der entmodifizierten Proteine ebenfalls durch SDS-PAGE.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen 2D-Gel-Verfahrens gegenüber den bekannten 2D-Verfahren ist, dass ionische Detergentien bereits im ersten Trennschritt, insbesondere aber auch bereits in der Probenaufbereitung verwendet werden können. Hierdurch können insbesondere auch stark hydrophobe Proteine, vor allem Membranproteine, aufgetrennt werden, was mit den herkömmlichen Techniken der 2D-Gelelektrophorese nicht möglich ist.

Abbildungen In Fig. 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens schematisch dargestellt. Mit den modifizierten Makromolekülen erfolgt hierbei ein Trennschritt in der ersten Dimension und nach Entfernung der modifizierenden Gruppe erfolgt ein Trennschritt in der zweiten Dimension, vorzugsweise senkrecht zur ersten Trennrichtung.

In Fig. 2 ist schematisch ein modifiziertes Makromolekül dargestellt. Der mit P gekennzeichnete ovale Kreis kennzeichnet das Makromolekül, beispielsweise ein Protein. Der Rest stellt schematisch eine besondere Ausführungsform einer modifizierenden Gruppe dar. Die modifizierende Gruppe umfasst hierbei einen variablen Bereich (Traktor) und einen konstanten Bereich (Barcode), die durch eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe voneinander getrennt sind. In dieser Ausführungsform kann die modifizierende Gruppe unter Verbleib eines Barcodes unter milden Bedingungen entfernt werden. Der Barcode ermöglicht beispielsweise die Unterscheidung von modifizierten und nicht modifizierten Makromolekülen.

In Fig. 3 ist die Korrelation zwischen dem nativen Molekulargewicht und der Anzahl der Lysine für bekannte Membranproteine aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae dargestellt, in Fig. 4 eine entsprechende Korrelation zwischen nativem Molekulargewicht und Anzahl der Cysteine. Wie zu erkennen, besitzen Membranproteine mit ähnlichem Molekulargewicht eine unterschiedliche Anzahl von Cystein-und/oder Lysin-Resten, so dass durch Modifikation dieser reaktiven Gruppen das Molekulargewicht der Makromoleküle auf unterschiedliche Weise verändert wird.

In Fig. 5 ist schematisch die Durchführung der Reaktion gezeigt, wie sie im Ausführungsbeispiel 1 erläutert wird. R-NH2 repräsentiert hierbei ein Makromolekül mit einer reaktiven Gruppe. Dieses wird mit dem Reagens NHS-SS-Biotin umgesetzt, wobei die dargestellte Verbindung entsteht. Unter milden Reaktionsbedingungen kann nun Spaltung der Disulfidgruppe erfolgen unter Entfernung des Großteils der modifizierenden Gruppe.

Ausführungsbeispiele Modell-Proteine (lösliche als auch integrale Membranproteine) wurden mit 1 % SDS- Lösung denaturiert und mit NHS-SS-Biotin (selektiv für prim. Amine) an aminoterminalen NH2-und Lysin-Seitenketten modifiziert. Das Reagenz führt zu einem Massenanstieg von 391 Da/funktioneller Gruppe. Abspaltung der Biotin- Gruppe durch Reduktion mit DTT führte zu annähernd nativem Molekulargewicht (Verlust von 303 Da/funktioneller Gruppe). In Modellversuchen wurde ein Proteingemisch aus vier verschiedenen Proteinen mit NHS-SS-Biotin markiert, bzw. aufgereingter Cytochrom bc1-Komplex von Rhodovulum sulfidophilum.

Reaktionsbedingungen (Endkonzentrationen) : Protein je 0.1 mg/ml ; 125 mM HEPES pH 8.5 bis 9. 0 ; 1% (w/v) SDS NHS-SS-Biotin bis 2 mM Endkonzentration, DMSO bis 10% Endkonzentration.

Die Proteine wurden im HEPES/SDS-Puffer bei 37°C gelöst, und die Reaktion wurde durch Zusatz des Biotinylierungsreagenz (gelöst in DMSO) bis 1 mM Konzentration gestartet. Nach ca. 30 min wurde die zweite Hälfte Biotinylierungsreagenz zugesetzt bis zur Endkonzentration von 2 mM und erneut 30 min bei 37 °C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde per SDS-PAGE analysiert. Auf diese Weise konnte eine Erhöhung des Molekulargewichtes (im 10%-Bereich) erzielt werden, die durch Reduktion mit DTT reversibel war.

Nachfolgend eine Tabelle mit Rf Werten der Modell-Proteine vor und nach der Modifikation mit dem Biotin-Linker. Reduktion mit DTT führte zu annähernd nativen Rf Werten. Protein Molekulargewicht Anzahl Natives Modifiziertes Aminogruppen Protein, Protein, Rf Rf BSA 66 kDa 59 K + N-term 0. 272 0. 238 Trypsin 21 kDa 12 K + N-term 0. 776 0. 646 Inhibitor Lysozyme 14 kDa 6 K + N-term 0. 884 0. 871 FtsY (E. coli, 54 kDa (app. MW 33 K + N-term 0. 122 0. 136 P10121) 97 kDa) D48-FtsY 49 kDa (app MW 27 K + N-term 0. 231 0. 204 (E. coli) 60 kDa) Cytochrom By homology : bc1 50 kDa 11 K + N-term 0.737 0.635 cytochrom b 34 kDa (diffuse 14 K + N-term 0.599 0.511 cytochrom c1 Band) 8 K + N-term 0. 438 0.365 Rieske 25 kDa Rf Werte sind die Wanderungsdistanz des Proteins dividiert durch die Wanderungsdistanz des Bromphenolblaus. Proteine mit hohen Rf Werten laufen nahe an der Front. Der aufgereinigte Cytochrom bc1 Komplex ist freundlicherweise von Prof. Irmgard Sinning, BZH Heidelberg, zur Verfügung gestellt worden. Die Sequenz des verwendeten Komplexes ist nicht bekannt, daher wurde die Zusammensetzung des bc1 Komplexes vom nahe verwandten Rb. Capsulatus hier verwendet. Alle Untereinheiten des Komplexes sind integrale Membranproteine mit 1 Transmembranhelix (Cyt c1 und Rieske) bzw 8 (Cytochrom b). Alle anderen Modell- Proteine sind lösliche Proteine.