Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Separation eines polarisierbaren Biopartikels, ein mikrofluidisches System sowie dessen Verwendung.

Die Untersuchung isolierter Zellen ist ein erklärtes Ziel der Wissenschaft. Es gibt zahlreiche Mikrofluidikchips, mit denen versucht wurde, einzelne Zellen mit Oberflächeninteraktionen, in Gelen oder Kraftfeldern beispielsweise optischen Pinzetten, magnetischen, akustischen, positiven oder negativen dielektrophoretischen Wechselwirkungen im strömenden Medium festzuhalten, um sie einzeln kultivieren und analysieren zu können. Nachteilig bei der optischen Pinzette ist, dass die Zellen im Energiemaximum gehalten werden, was einen schnellen Temperaturanstieg in der Zelle zur Folge hat. Viele Methoden sind weiterhin zu schwach, um die Zellen im Mikrofluidikstrom kontaktlos zu fixieren.

Das Manipulieren von Partikeln mittels Dielektrophorese ist eine bekannte Technologie und das Separieren und Sortieren mehrerer größerer Zellen ist eine Hauptanwendung der Dielektrophorese. Bei der positiven Dielektrophorese (pDEP) werden die Zellen an die

Elektroden gezogen und haften durch die dielektrische Polarisierung an diese an. Durch das Ausschalten der Wechselfelder werden die Zellen wieder freigesetzt. Die positive

Dielektrophorese hat den Nachteil, dass die Zellen mit den Elektroden in Kontakt treten und im Bereich der höchsten Kraftfeldintensität gehalten werden. Eine Temperaturerhöhung an den Elektroden (eng. Jouleheating) bewirkt häufig ein Abtöten der Zellen. Bei der negativen Dielektrophorese (nDEP) werden die Zellen von den Elektroden abgestoßen. Dies kann bei bestimmter dreidimensionaler Anordnung der Elektroden genutzt werden, um Zellen im Feldminimum kontaktlos zu akkumulieren oder im strömenden Medium fest zu halten. Hierbei können beispielsweise Zellen in einem Feldkäfig hochfrequenter nDEP-Felder gefangen werden, die durch Ansteuerungen von beispielsweise Oktupolen erzeugt werden.

Bekannt sind mikrofluidische Vorrichtungen zur dielektrophoretischen Separation oder Akkumulation von Zellen. Nachteilig bei den beschriebenen System ist jedoch, dass beim

Einfangen einer Zelle nachfolgende Zellen durch nDEP- Abstoßung agglomerieren und in der anschließenden Einzelzellkultivierung zahlreich in der Nähe der kultivierten Zelle insbesondere im selben Fluidikstrom adhärierten oder sogar in den in die Analytik führenden Mikrofluidikstrom gezogen werden. Befinden sich mehrere Zellen in einem

Mikrofluidikkanal, können über die kurzen Diffusionswege schnell sezernierte Substanzen von Zelle zu Zelle ausgetauscht werden. Der unkontrollierte Austausch führt jedoch zu Undefinierten Umweltbedingungen während einer Einzelzellkultivierung. Eine Isolation und separierte kontaktlose Kultivierung ist für definierte Kultivierungsbedingungen jedoch unabdingbar.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, dass mindestens einen der vorgenannten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde ein Verfahren bereit zu stellen, das eine Isolation und eine kontrollierte Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellen in Strömungen erlaubt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Separation eines polarisierbaren

Biopartikels mit einem mikrofluidischen System, umfassend die folgenden Schritte: a) dielektrophoretische Vorseparation eines polarisierbaren Biopartikels aus einer Suspension von Biopartikeln;

b) fluidische Separation des ausgewählten Biopartikels durch Fixieren des Biopartikels in einem dielektrophoretischen Feldkäfig und Umströmen des Biopartikels mit Fluid; c) Überfuhrung des separierten Biopartikels aus dem dielektrophoretischen Feldkäfig in einen Kultivierungsraum;

d) dielektrophoretisches Fixieren des separierten Biopartikels in dem Kultivierungsraum und Untersuchung, Beobachtung, Manipulation und/oder Kultivierung des separierten Biopartikels.

Überraschend wurde gefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren die gezielt

kontrollierbare und kontaktlose Isolation auch von sehr kleinen einzelnen Mikroorganismen oder Einzelzellen aus Strömungen erlaubt. Insbesondere erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine aktive Isolation und Kultivierung unter kontrollierten Bedingungen von einzelnen Mikroorganismen oder Zellen kleiner als 5 μιη mittels negativer Dielektrophorese in MikroStrömungen. Somit erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die kontaktlose

Kultivierung von einzelnen Mikroorganismen oder Zellen kleiner als 5 μιη in

MikroStrömungen. Von besonderem Vorteil ist, dass hierdurch einzelne Mikroorganismen oder Einzelzellen unter definierten Umweltbedingungen in Strömungen kultiviert werden können. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung weiter, Proben von lebenden kontaktlos und unter definierten Bedingungen kultivierten Einzelzellen, insbesondere von Zellen, die kleiner als 5 μιη sind, zu nehmen. Die Erfindung erlaubt dem Experimentator die Umweltbedingungen der einzeln kultivierten Zelle gezielt zu beeinflussen, da die Zelle chemisch nicht mehr im Gleichgewicht mit ihrer Umgebung vorliegt, sondern ständig von frischen Medium umspült wird. Ein Chip, der zusätzlich die physikalischen Bedingungen, wie die Temperatur kontrollieren kann, wird auch als Envirostat bezeichnet. Hierdurch können zum Beispiel zusätzliche Informationen bei der Erstellung von Stoffwechselbilanzen über die Einzelzelle genutzt werden. Die Erfindung ermöglicht ferner die Elektroporation von isolierten einzelnen Mikroorganismen oder Einzelzellen unter definierten

Umweltbedingungen zum Einbringen von Fremd-DNA, zur Zellfusion oder zur Zelllyse.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ein stabiles kontaktloses Isolieren und

Kultivieren von einzelnen Zellen oder Mikroorganismen in MikroStrömungen. Die Zellen können aus Kulturen isoliert, in eine Kultivierungskammer überführt werden, und dort definiert auch über längere Zeit kontaktlos in Strömung kultiviert werden. Die Erfindung ermöglicht ferner Proben der lebenden Zelle zu nehmen und anschließend lebend aus dem Chip z.B. in ein Kultivierungsgefäß zur weiteren Kultivierung zu überführen.

Die Erfindung ermöglicht einen gezielten Zugang zu Daten aus Einzelzellbilanzen für die systematische Beschreibung biologischer Mechanismen. Einzelzell-Pertubationsexperimente können durchgeführt werden, um beispielsweise Zellantworten auf Stresssignale, wie sie in biotechnologischen Produktionen maßgeblich dessen Ausbeute beeinflussen, zu detektieren. Die Zellantworten können katalogisiert und biologischen Mechanismen zugeordnet werden. Im Kontext der Systembiologie ermöglicht die Erfindung somit die Identifikation und Standardisierung von Zellantworten, um intrazelluläre Mechanismen entkoppelt von

Variabilität und ohne unkontrollierte Einflüsse durch andere Zellen in einer Population analysieren zu können. Es können auch pathogene einzelne Bakterien kultiviert und gezielt mit Wirkstoffen pertubiert werden, um unter klar definierten Bedingungen die Wirkungsweise in zellulären Mechanismen einzugrenzen, um gezielt bessere Wirkstoffe entwickeln zu können.

Unter dem Begriff "mikrofluidisches System" ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein System zu verstehen, das derart kleine Abmessungen der Mikrokanäle aufweist, dass der Fluidstrom laminar ist, ohne dass sich Wirbel bilden. Unter dem Begriff "Biopartikel" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Partikel allgemein zu verstehen. Insbesondere umfasst der Begriff Biopartikel biologische Zellen, Zellgruppen, Zellbestandteile oder Zellorganellen oder biologisch relevante Makromoleküle. Der Begriff Biopartikel ist insbesondere nicht auf einzelne biologische Zellen beschränkt.

Unter dem Begriff " Analyt" oder "Analyte" werden im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen in einer Probe enthaltenen Stoffe, über die, bei einer insbesondere chemischen Analyse, eine Aussage getroffen werden soll, verstanden. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst eine dielektrophoretische Vorseparation eines polarisierbaren Biopartikels aus einer Suspension. Dielektrophoretische Verfahren sind insbesondere negativ dielektrophoretische Verfahren. Die negative Dielektrophorese (nDEP) erlaubt, Zellen im Energieminimum und hierdurch auch in regulierten Temperaturen kontaktlos in Strömungen zu halten. Die dielektrophoretische Vorseparation ermöglicht es, den ausgewählten Biopartikel von weiteren Biopartikeln abzutrennen, beispielsweise eine zu separierende Zelle von weiteren Zellen, beispielsweise von einer Zellsuspension. Hierdurch kann eine Zelle von weiteren Zellen einer Zellsuspension abgetrennt werden. Insbesondere können durch eine dielektrophoretische Vorseparation die Partikel von weiteren Partikeln abgetrennt werden, die an den Kanalwänden anhaften. Dies ist insbesondere bei der

Abtrennung von Bakterienzellen vorteilhaft.

Die Abtrennung toter Zellen und deren Überreste oder Debris ist durch dielektrophoretische Verfahren nicht möglich, da diese nicht länger ausreichend durch die angelegten

Wechselfelder polarisierbar sind, um sie mit Mikroelektroden- Anordnungen ablenken zu können. In einem weiteren Schritt b) erfolgt daher eine weitere fluidische Separation des ausgewählten Biopartikels durch Fixieren des Biopartikels in einem dielektrophoretischen Feldkäfig und Umströmen des Biopartikels mit Fluid. Unter dem Begriff "fluidische Separation" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden, dass der Biopartikel durch einen Fluidstrom separiert wird, wobei der

ausgewählte Biopartikel hierzu erfindungsgemäß in einem dielektrophoretischen Feldkäfig festgehalten und mit dem Fluid umströmt wird. Hierdurch kann der ausgewählte Biopartikel von weiteren vereinzelten im Fluid vorliegenden polarisierbaren Biopartikeln abgetrennt werden, sowie insbesondere von toten, nicht dielektrophoretisch abtrennbaren Zellen und deren Überresten.

In einem nächsten Schritt wird der separierte Biopartikel aus dem dielektrophoretischen Feldkäfig aus dem Separationsraum heraus in einen Kultivierungsraum überfuhrt. Es ist vorteilhaft, die Bereiche der Isolation und der Kultivierung der Biopartikel räumlich zu trennen, da hierdurch der Partikel zur Untersuchung in einen Mikrokanalbereich überfuhrt werden kann, der nicht von verklebten Zellen oder Zellresten kontaminiert ist. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn der Kultivierungsraum nicht in einer linearen Verlängerung des Mikrokanals, in dem die Separation stattfindet, liegt. Vorzugsweise liegt der

Kultivierungsraum in einem Mikrokanal, der in einem Winkel zu dem Mikrokanal liegt, in dem die Separation stattfindet. Hierdurch wird die Kontamination mit sezernierten

Substanzen fremder Zellen und Zellüberresten weiter vermindert.

In dem Kultivierungsraum kann der separierte Biopartikel dielektrophoretisch fixiert und untersucht, beobachtet, manipuliert und/oder kultiviert werden. Von besonderem Vorteil ist, dass die vorliegende Erfindung ermöglicht, Proben von lebenden, kontaktlos und unter definierten Bedingungen kultivierten Einzelzellen zu nehmen. Insbesondere ermöglicht die Erfindung auch das Isolieren von Zelllysat aus einzelnen Zellen einer Zellsuspension. In vorteilhafter Weise ermöglicht dies das chemische oder physikalische kontaktlose Pertubieren von einzelnen Mikroorganismen oder kleineren Einzelzellen unter durch den Experimentator definierten Bedingungen in Strömungen. Von besonderem Vorteil ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, dass Analyte eines einzelnen Biopartikels untersucht werden können. So kann das Fluid stromabwärts des Kultivierungsraums zur Probenahme abgeleitet, direkt analysiert werden oder in einen Analyseapparat außerhalb des mikrofluidischen Systems zur Analyse geleitet werden.

Insbesondere vorteilhaft enthält das Fluid lediglich die Sekrete des ausgewählten Biopartikels, ohne dass Verunreinigungen durch weitere Biopartikel die Messungen verfälschen.

Die Separationsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können verhindern, dass extrazelluläre Substanzen anderer Zellen in den Analytikbereich zur Analyse des Biopartikels gelangen können. Die Isolation sezernierter Substanzen einer Zelle ermöglicht somit auch die nicht optisch basierte Analyse einzelner Mikroorganismen, beispielsweise mittels

Massenspektroskopie.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens leitet man Analyte des separierten Biopartikels zur Analyse aus dem Kultivierungsraum ab. Die Analyte können beispielsweise in eine Messstation abgeleitet werden.

Das Verfahren ermöglicht beispielsweise die optisch basierte und die nicht-optisch basierte Analyse von Biopartikeln insbesondere einzelnen Mikroorganismen oder Einzelzellen in Strömungen. Beispiele für optische Verfahren sind mikroskopische, spektroskopische oder fluoreszenzoptische Messmethoden. Ein Beispiel für die nicht-optisch basierte Analyse ist die Analyse mittels Massenspektroskopie. Die Beobachtung der separierten Biopartikel kann mit optischen Verfahren durchgeführt werden.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Analyte des separierten Biopartikels mit optischen und/oder nicht-optischen Verfahren analysiert werden. Insbesondere kann die Untersuchung des oder der Analyte des separierten

Biopartikels mit nicht-optischen Verfahren durchgeführt werden. Dies erlaubt eine weitaus umfangreichere Untersuchung der Biopartikel, als dies durch die bislang üblichen lediglich optischen Verfahren zur Verfügung gestellt werden konnte. Beispiele für nicht-optische Verfahren sind massenspektroskopische Verfahren. Massenspektroskopische Verfahren ermöglichen zum Beispiel metabolische Flussanalysen mit einzelnen definiert kultivierten und definiert pertubierten Zellen durchzuführen. Weitere Beispiele für in mikrofluidischen Systemen anwendbare nicht-optische Verfahren sind chromatographische Methoden, beispielsweise HPLC(high-pressure liquid chromatography)-Verfahren, sowie

elektrochemische Methoden der Amperometrie oder der bioelektrischen Impedanzanalyse. Bevorzugt ist auch eine chromatographische Auftrennung beispielsweise mit Nano-HPLC Systemen und eine anschießende Detektion mit optischen z.B. fluoreszenzspektroskopischen oder/und mit nicht optischen massenspektroskopischen Analysemethoden. Insbesondere macht die Erfindung eine, nicht direkte, optische Analyse außerhalb des Chips für die Einzelzellanalyse zugänglich. Vorteilhaft ist vor allem, dass identische von allen Zellen produzierte Biomoleküle sich durch die Verwendung des erfindungsgemäßen

Verfahrens nicht mehr mischen und somit der einen kultivierten Zelle zugeordnet werden können.

Insbesondere wird durch nicht-optische Verfahren eine quantitative Analytik des Biopartikels ermöglicht. Unter einer Manipulation der separierten Biopartikel ist insbesondere zu verstehen, dass man den Biopartikel gezielt chemischen oder physikalischen Einflüssen aussetzen kann.

Beispielsweise kann der Biopartikel mittels des Fluides mit Substanzen bestimmter

Konzentration umgeben werden. Unter einer Manipulation ist insbesondere eine Perturbation zu verstehen. Der Begriff "Perturbation" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung im Sinne einer Störung eines biologischen Systems, beispielsweise einer Zelle, zu verstehen, insbesondere erzeugt durch ein Signal, das in einem System zu Kompensations- oder Regelungs-Prozessen führt und dessen Funktion beeinflusst. Es kann bevorzugt sein die Temperatur des Fluides während der Untersuchung, Beobachtung und/oder Manipulation des separierten Biopartikels zu kontrollieren.

Der separierte Biopartikel wird im Kultivierungsraum dielektrophoretisch fixiert. In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das

dielektrophoretische Fixieren des separierten Biopartikels in dem Kultivierungsraum in einem weiteren dielektrophoretischen Feldkäfig und/oder mittels einer, vorzugsweise pfeilförmigen, Elektrodenanordnung. Es ist bevorzugt, dass das dielektrophoretische Fixieren mittels eines weiteren dielektrophoretischen Feldkäfigs erfolgt. Eine Fixierung der Partikel in einem Feldkäfig ist beispielsweise vorteilhaft, da die Partikel im fixierten Zustand besser untersucht werden können. Insbesondere erlaubt ein dielektrophoretischer Feldkäfig ein stabiles und kontaktloses Manipulieren und Halten von Mikroorganismen mit geringen Spannungen in hochfrequenten Wechselfeldern.

Bevorzugt ist eine Verwendung eines Oktupols zur Erzeugung des Feldkäfigs. Der Aufbau und die Funktionsweise eines Feldkäfigs in der Mikrofluidik ist dem Fachmann bekannt, ebenso die Dimensionierung des Oktupols zur Erzeugung des Feldkäfigs angepasst an die Größenverteilung der Partikel, insbesondere Mikroorganismen. Der im Rahmen der

Erfindung verwendete Begriff eines Feldkäfigs ist jedoch nicht auf die konstruktive Gestaltung eines Oktupols beschränkt. Es können Elektroden in verschiedensten Formausführungen, beispielsweise zwei planar gegenüberliegenden Ringen, ringformende Spitzen von einer oder mehr Elektroden auf einer Ebene, Hexagone oder anders kantig oder rundgeformte Elektroden realisiert werden. Erforderlich sind in üblichen Konstruktionen jedoch mindestens zwei gegenüberliegende Elektroden.

In bevorzugten Ausführungsformen weist der Kultivierungsraum wie auch der

Separierungsraum einen Feldkäfig auf. Zumeist wird der erste Feldkäfig des

Separierungsraums nach der Freisetzung des Biopartikels in den Kultivierungsraum nicht länger benötigt. In weiteren Ausführungsformen kann der erste Feldkäfig des

Separierungsraums jedoch auch zur Kultivierung genutzt werden. Beispielsweise kann so eine parallele Kultivierung von Mutter- und Tochterzellen ermöglicht werden.

Alternativ kann der separierte Biopartikel in dem Kultivierungsraum mittels einer, vorzugsweise hakenförmigen, Elektrodenanordnung im Mikrofluidikstrom fixiert werden. Vorzugsweise zeigt die Spitze der Hakenform eine zusätzliche Kante auf, welche mit der Spitzenkante vertikal zur Strömungsrichtung des Fluids linear verbunden ist. Vorzugsweise weist die zusätzliche Kante eine Länge auf, die dreifach größer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Zelle. Eine hakenförmige Elektrodenanordnung erlaubt auch, dass ein Biopartikel insbesondere eine Zelle, mit Hilfe der Mikroströmung kontaktlos im Fluid, insbesondere in Medium kultiviert, pertubiert und analysiert werden kann. Das Fluid kann jedes geeignete Medium sein, insbesondere eine wässrige Lösung, beispielsweise ein

Zellkulturmedium, eine Puffer- oder Salzlösung, oder ähnliche Lösungen. Das Spannungsintervall zur Untersuchung, Beobachtung, Manipulation und/oder Kultivierung des separierten Biopartikels liegt vorzugsweise im Bereich von > 0,05 V bis < 8 V , bevorzugt im Bereich von > 0,1 V bis < 6 V, besonders bevorzugt im Bereich von > 1,5 V bis < 2 V. Der bevorzugte Spannungsbereich kann in vorteilhafter Weise insbesondere für die definierte Kultivierung mit einem eingebrachten Temperatursensor genutzt werden, um in dem

Mikrokultivierungsraum gezielt und sehr schnell die Temperatur regulieren zu können. Hierdurch werden zu dem Temperatur-Pertubierungen mit definiert kultivierten Einzelzellen ermöglicht.

Die auf die Biopartikel wirkende, so genannte Effektivspannung für eine Untersuchung, Beobachtung, Manipulation und/oder Kultivierung des separierten Biopartikels kann im Bereich von > 0,5 V bis < 3 V, bevorzugt im Bereich von > 0,75 V bis < 2 V, liegen. Die Effektivspannung kann in Abhängigkeit von Feldkäfig und der Größe des zu untersuchenden Biopartikels gewählt werden. Beispielsweise kann die Effektivspannung für eine

Untersuchung von Krebszellen bei einem Abstand zwischen den Elektroden des Feldkäfigs, beispielsweise einer Oktupol-Elektrodenkonfiguration, von etwa 20μιη im Bereich von > 0,5 V bis < 1,5 V liegen. Stärkere Kraftfelder können beispielsweise zur Vermessung der mechanischen Eigenschaften von Zellen verwendet werden, die sich beispielsweise bei roten Blutkörperchen im Falle einer HIV- oder Malaria-Infektionen verändern. Durch einen

Wechsel der Spannungen, beispielsweise einer möglichst geringen Spannung um eine Zelle zu fangen und zu halten, und einer höheren Spannung um die Zelle zusammenzudrücken, kann beobachtet werden, wie sich die Zelle nach der Entlastung verhält. Alternativ kann man die Zelle durch ein definiertes Kraftfeld, welches gleichzeitig zur Vermessung der Zellgröße verwendbar ist, hindurchführen, wobei sich die Zelle beim Durchtreten des Kraftfeldes verformt. Dieses kann beispielsweise durch Veränderungen im zeitlichen Verlauf einer Widerstandsmessung beobachtet werden.

Bevorzugte Biopartikel sind insbesondere biologische Zellen, Zellgruppen, Zellbestandteile oder Zellorganellen. Bevorzugte Zellen sind Bakterien, eukaryontische Zellen insbesondere Krebszellen, Blutzellen, Viren oder Hefezellen. Insbesondere sind auch Zellorganellen beispielsweise Mitochondrien oder Chloroplasten bevorzugte Biopartikel. Bevorzugt weisen die Biopartikel eine Größe oder mittleren Durchmesser von < 5 μιη, vorzugsweise < 4 μιη, auf. Unter der Größe eines Biopartikels wird insbesondere der mittlere Durchmesser des Biopartikels, beispielsweise einer Zelle, verstanden. In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Biopartikel eine Größe oder mittleren Durchmesser im Bereich von > 0,5 μιη bis < 5 μιη auf. Weiter bevorzugt weisen die Biopartikel eine Größe oder mittleren Durchmesser im Bereich von > 1 μιη bis < 5 μιη, vorzugsweise im Bereich von > 2 μιη bis < 5 μιη auf. Auch bevorzugt weisen die Biopartikel eine Größe oder mittleren Durchmesser im Bereich von > 0,5 μιη bis < 2 μιη, vorzugsweise im Bereich von > 1 μιη bis < 2 μιη auf. Es ist ein weiterer Vorteil der Erfindung, dass derart kleine Mikroorganismen oder Zellen in Strömung isoliert und kultiviert werden können. Es stellt einen besonderen Vorteil der Erfindung dar, dass eine kontaktlose Kultivierung von einzelnen Mikroorganismen oder Zellen kleiner als 5 μιη in MikroStrömungen zur Verfügung gestellt werden kann.

Insbesondere ist es bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren in einem mikrofluidischen System durchzuführen, wobei die Mikrokanalstrukturen eine Tiefe < 20 μιη, vorzugsweise im Bereich von > 2 μιη bis < 20 μιη, bevorzugt im Bereich von > 2 μιη bis < 10 μιη, besonders bevorzugt im Bereich von > 2 μιη bis < 5 μιη, aufweisen. In einem Bereich von > 2 μιη bis < 20 μιη ist ein insbesondere gutes Manipulieren insbesondere von Bakterien und anderen Mikroorganismen oder kleineren Zellen mit einer Größe von 0,5 μιη bis 5 μιη mittels negativer Dielektrophorese möglich.

Insbesondere ist es bevorzugt, dass die Abstände der auf dem Substrat angebrachten

Elektroden in einer Ebene vorzugsweise im Bereich von > 2 μιη bis < 20 μιη, bevorzugt im Bereich von > 2 μιη bis < 10 μιη, besonders bevorzugt im Bereich von > 2 μιη bis < 5 μιη, liegen.

In bevorzugten Ausführungsformen kann man den separierten Biopartikel nach der

Untersuchung, Beobachtung und/oder Manipulation für die Vermehrung zu einer Population lebend abführen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in vorteilhafter Weise das Ablegen analysierter einzelnen lebender Mikroorganismen oder Einzelzellen, um sie wieder zu einer Population für beispielsweise biotechnologische Prozesse heranziehen zu können. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein mikrofluidisches System, insbesondere eine Flusszelle, zur dielektrophoretischen Separation von polarisierbaren Biopartikeln wie Zellen und/oder Zellorganellen, umfassend eine Mikrokanalstruktur mit folgenden Strukturen: einen Vorseparationsraum, wobei der Vorseparationsraum eine erste Zuleitung zur Zuführung eines die polarisierbaren Biopartikel enthaltenden Fluids und eine erste Ableitung zum Abführen wenigstens eines Teils des die polarisierbaren Biopartikel enthaltenden Fluids aufweist;

einen Separationsraum, wobei eine aus dem Vorseparationsraum ausmündende Zuleitung den Separationsraum mit dem Vorseparationsraum verbindet;

eine zweite Ableitung zum optionalen Abführen eines, weitere polarisierbare und/oder nicht polarisierbare Biopartikel enthaltenden Fluids, die aus dem Separationsraum ausmündet;

einen Kultivierungsraum, wobei eine aus dem Separationsraum ausmündende

Zuleitung den Kultivierungsraum mit dem Separationsraum verbindet;

eine dritte aus dem Kultivierungsraum ausmündenden Ableitung zur Ableitung der Analyte;

eine zweite Zuleitung zur Zuführung eines Fluids, wobei die zweite Zuleitung in den Separationsraum oder den Kultivierungsraum einmündet.

Die Struktur der Mikrokanäle erlaubt es in vorteilhafter Weise, insbesondere kleinere

Einzelzellen, beispielsweise mit einer Größe oder eines durchschnittlichen Durchmessers von < 5 μιη, insbesondere im Bereich von > 0,5 μιη bis < 5 μιη, aus Kulturen zu isolieren, in eine Kultivierungskammer zu führen, dort definiert über längere Zeit kontaktlos in Strömungen zu kultivieren, sowie Proben von der lebenden Zelle zu nehmen und wieder lebend aus dem Chip beispielsweise in ein Kultivierungsgefäß pumpen zu können.

In bevorzugten Ausfuhrungsformen kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Separation eines polarisierbaren Biopartikels mit einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System ausgeführt werden.

Insbesondere vorteilhaft ist die aus dem Kultivierungsraum ausmündende Ableitung der Analyte. Diese Ableitung erlaubt, die Analyte aus dem Chip beispielsweise in Messstationen abzuleiten.

Vorzugsweise kann die Ableitung zum optionalen Abfuhren eines weitere polarisierbare Biopartikel enthaltenden Fluids, die aus dem Separationsraum ausmündet, wieder in den Vorseparationsraum oder dessen Abführung einmünden. Diese Ausführungsform kann einen Fluidanschluss für den Chip einsparen. Dies hat den Vorteil, dass das Split- Verhältnis des Fluidikstroms im Vorseparationsraum konstant bleibt und nicht beim Kontaktieren der peripheren Fluidik nachträglich bei jedem neuen Aufbau eingestellt werden muss.

Vorzugsweise mündet die zweite Zuleitung zur Zuführung eines Fluids in den

Separationsraum. Vorzugsweise kreuzt die zweite Zuleitung zur Zuführung eines Fluids in den Separationsraum die Zuleitung aus dem Vorseparationsraum und die zweite aus dem Separationsraum ausmünde Ableitung zum optionalen Abführen eines weitere polarisierbare Biopartikel enthaltenden Fluids, so dass der Separationsraum vorzugsweise in einer Kreuzung von Mikrokanälen liegt.

Die Verwendung eines Kreuzkanals erlaubt in vorteilhafter Weise, durch das Einbringen der Zellen durch den einen Kanal und Umspülung der im Kreuzbereich durch einen Oktupol gefangenen Einzelzelle mit Fluid, insbesondere Analytmedium, aus dem kreuzenden Kanal, die Einzelzelle isoliert analysieren zu können.

Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn der Kultivierungsraum nicht in einer linearen

Verlängerung des Mikrokanals, in dem die Separation stattfindet, liegt. Vorzugsweise liegt der Kultivierungsraum in einem Mikrokanal, der in einem Winkel, beispielsweise einem im Wesentlichen rechten Winkel, zu dem Mikrokanal, in dem die Separation stattfindet.

Hierdurch wird die Kontamination mit sezernierten Substanzen fremder Zellen und

Zellüberreste weiter vermindert.

Insbesondere durch eine Isolation und Kultivierung mit minimalem Abstand zum

Analytikausgang und einer totvolumenfreien Kanalfertigung, können in vorteilhafter Weise Proben von einzelnen lebenden und unter definierten Bedingungen kultivierten

Mikroorganismen mit dem Medium aufgefangen werden oder direkt analysiert werden.

Insbesondere ist es vorteilhaft eine zusätzliche Zuleitung zu der Kultivierungskammer vorzusehen. Dies ermöglicht, den Biopartikel mit einer Pumpe größeren Fördervolumens in außerhalb des Mikrofluidiksystems liegende Kultivierungsgefäße durch eine zusätzliche Ableitung aus der Kultivierungskammer zu befördern.

In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Mikrokanalstrukturen eine Tiefe < 20 μιη, vorzugsweise im Bereich von > 2 μιη bis < 20 μιη, bevorzugt im Bereich von > 2 um bis < 10 μιη, besonders bevorzugt im Bereich von > 2 μιη bis < 5 μιη, auf. In vorteilhafter Weise erlauben flache Elektrodenstrukturen in Mikrofluidikchips, insbesondere durch die nDEP-Technologie, ein sehr stabiles, kontaktloses Isolieren und Kultivieren von einzelnen Mikroorganismen in MikroStrömungen. Eine Verringerung der Kanalhöhe und damit der Verringerung des Elektrodenabstands, welcher einen quadratischen Einfluss auf die nDEP-Kraftwirkung hat, erlaubt eine Verbesserung der Haltekraft bezüglich der polarisierbaren Biopartikel. Das exakte Einstellen der Mikrokanalhöhe im

Dimensionsbereich der klassischen Größenverteilung von Mikroorganismen erlaubt bei Mehrkomponentensystemen mit Elektroden eine sehr genaue Einstellung der

Elektrodenabstände. Durch die genaue Einstellmöglichkeit der Abstände in der Fertigung kann die nDEP-Kraftwirkung auf Biopartikel wie Mikroorganismen optimiert werden. Dieses ermöglicht in vorteilhafter Weise das Manipulieren von Bakterien oder kleineren Zellen einer Größe oder eines mittleren Durchmessers von < 5 μιη, insbesondere im Bereich von > 0,5 μιη bis < 5 μιη.

Ein weiterer Vorteil einer geringen Kanalhöhe der Mikrokanalstrukturen liegt darin, dass ein geringeres Fluidvolumen einem Feld ausgesetzt ist, wodurch eine geringere oder

vernachlässigbare Erwärmung im elektrischen Wechselfeld auftritt. Dies erlaubt das

Anwenden einer wesentlich höheren elektrischen Wechselfeldintensität und somit wesentlich verbesserte Abstoßung durch die negativ dielektrophoretische Wechselwirkung bei vernachlässigbarer Erwärmung. Die verbesserte Kraftwirkung kann neue

Manipulationsmöglichkeiten, wie das Halten von sehr kleinen Zelltypen wie Bakterien in MikroStrömungen, zur Verfügung stellen. Die Breite der Mikrokanäle liegt vorzugsweise im Bereich von > 50 μιη bis < 1 mm, bevorzugt im Bereich von > 100 μιη bis < 800 μιη, besonders bevorzugt im Bereich von > 200 μιη bis < 700 μιη. Die wesentlich breiteren als hohen Kanäle ermöglichen eine wesentlich bessere nD EP-Manipulation durch eine bessere fluidische Kontrolle durch leichter zu fördernde laminare Fluidvo lumenströme. Hierdurch kann ein nur 0,5μιη großer im nDEP- Feldkäfig gefangenes polarisierbares Biomolekül oder Zelle druckschwankungsfreier und stabiler mit Medium kontaktlos umspült und versorgt werden. Weiterhin ist eine Breite der Mikrokanäle im Bereich von > 100 μιη bis < 300 μιη, insbesondere von etwa 200 μιη, bevorzugt. Diese Breite der Mikrokanäle ermöglicht eine gute fluidische Kontrolle. Der Kultivierungsraum ist im Vergleich zu den Mikrokanälen vorzugsweise in einem

Verhältnis von 1,5: 1 bis 10: 1 : verbreitert, bevorzugt 7-fach breiter, als die Breite der Mikrokanäle. Dies ermöglicht einen schnelleren Transport in verbindenden Kanälen und eine stabilere nDEP-Manipulation der polarisierbaren Biomoleküle im Kultivierungsraum. Durch die Verbreiterung der Mikrokanäle wird der Mediumstrom entschleunigt. Dies kann gezielt bei den Elektroden zur nDEP-Manipulation vorgenommen werden und ermöglich z.B. beim Halten der sehr kleinen Zellen im Feldkäfig geringere Spannungen zu verwenden. Hierdurch erreicht kann das Manipulieren von nur 0,5 μιη großen Zellen in einem für die Zelle nicht invasiven Spannungsbereich erzielt werden.

Ebenfalls ist der Separationsraum im Vergleich zu den Mikrokanälen vorzugsweise in einem Verhältnis von 1,5: 1 bis 10: 1 : verbreitert, bevorzugt 7-fach breiter als die Breite der

Mikrokanäle. Der Separationsraum hat vorzugsweise eine Breite von wenigstens 400 μιη. Es ist besonders bevorzugt, dass der Separationsraum in einer Erweiterung, oder einem verbreiterten Bereich, eines Kanals oder besser in einer Kreuzung von Mikrokanälen liegt. Insbesondere liegt der Separationsraum vorzugsweise nicht in einem üblichen linearen, engen Bereich der Mikrokanäle. Dies hat den Effekt, dass die Strömungskraft des Fluides im Bereich des Separationsraumes verringert ist.

Liegt der Separationsraum in einer Kreuzung von Mikrokanälen, ist vorzugsweise die Kanalkreuzung des Separationsraums möglichst klein ausgebildet. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn die Seitenlängen der Kreuzung ca. 200 μιη betragen. Bei Verwendung einer Oktupol-Elektrodenkonfiguration ist es bevorzugt, dass die Elektroden des Oktupols möglichst exakt auf dem Kreuzungspunkt der Kanäle, die den Separationsraum ausbilden, liegen. Weiter ist bevorzugt, dass die Elektroden auf die Kanten der Zu- und Ableitungen geführt sind. Weiter ist bevorzugt, dass die Elektroden lediglich an den Kanten isoliert sind, wobei die Freilegung der Isolation der Elektroden bereits an den Ecken der Kreuzung beginnt. Dies kann den Vorteil bewirken, dass ein gutes Kraftfeld ausgebildet werden kann.

Vorzugsweise ist der Kanal, in den der polarisierbare Biopartikel abgetrennt werden soll, bzw. die aus dem Separationsraum ausmündende Zuleitung in den Kultivierungsraum, die den Kultivierungsraum mit dem Separationsraum verbindet, mindestens 2-fach kleiner als der Zuftihrkanal und Ausgangskanal zum Austragen nicht zu separierender Partikel. Alternativ ist bevorzugt, dass die Breite des in den Separationsraum einmündenden Mikrokanals der Breite der aus dem Separationsraum ausmündenden Zuleitung in den Kultivierungsraum entspricht, und beispielsweise bei etwa 200 μιη liegt.

Die Abstände zwischen Vorseparationsraum und Separationsraum sind variabel. Bevorzugt ist ein Abstand zwischen dem Vorseparationsraum und dem Separationsraum oder eine Länge der aus dem Vorseparationsraum ausmündenden Zuleitung, die den Separationsraum mit dem Vorseparationsraum erbindet, von wenigstens ca. 50 μιη. Dies hat den Vorteil, dass sichergestellt werden kann, dass Elektroden mit unterschiedlichen Kraftfeldfunktionen einander nicht beeinflussen und die Funktionen der Kraftfelder nicht gestört werden.

Geeignete Elektroden- und/oder Pumpenanordnungen werden in Abhängigkeit von den gewünschten Fluidflüssen verwendet.

Bevorzugte Elektrodenanordnungen umfassen insbesondere geeignete

Elektrodenanordnungen zur Erzeugung eines dielektrophoretischen Feldkäfigs sowie

Elektrodenanordnungen zur Ablenkung der Biopartikel. Vorzugsweise ist in dem

Separationsraum und/oder in dem Kultivierungsraum ein dielektrophoretischer Feldkäfig angeordnet. In dem Vorseparationsraum kann eine Ablenkelektrode angeordnet sein. In bevorzugten Ausfuhrungsformen liegt der Winkel der Ablenkelektrode möglichst steil also klein zum Winkel der Strömungsrichtung. Dies vereinfacht das Ablenken der Biopartikel.

Die Abstände der Elektroden beispielsweise zum Einfangen ca. 2 μιη bis 5 μιη großer Biopartikel liegen bevorzugt höchstens bei 20 μιη, vorzugsweise im Bereich von > 10 μιη bis < 15 μιη. Die Abstände der Elektroden zum Einfangen ca. 0,5 μιη bis 2 μιη großer Biopartikel liegen bevorzugt höchstens bei 15 μιη, vorzugsweise im Bereich von > 5 μιη bis < 12 μιη.

Vorzugsweise ist in dem Separationsraum und/oder in dem Kultivierungsraum ein

dielektrophoretischer Feldkäfig angeordnet, um einen separierten Biopartikel zu fixieren.

Bevorzugt ist in Separationsraum und Kultivierungsraum ein dielektrophoretischer Feldkäfig angeordnet. Weiterhin kann auch in dem Vorseparationsraum ein dielektrophoretischer Feldkäfig angeordnet sein. Der Abstand zwischen den Elektroden des Feldkäfigs entspricht vorzugsweise der Kanalhöhe. Bevorzugt ist der Abstand der Elektroden des Feldkäfigs mindestens ca. dreifach größer als der Durchmesser des zu separierenden Biopartikels. Vorzugsweise liegt zur Separation von Biopartikeln einer Größe von 0,5 μιη bis 5 μιη der Abstand der Elektroden des Feldkäfigs im Bereich von 2 μιη bis mindestens 15 μιη, vorzugsweise maximal bei 50 μιη. Zur Separation von Blutplättchen (engl, platelets) kann der Abstand der Elektroden des Feldkäfigs beispielsweise im Bereich von > 16 μιη bis < 18 μιη liegen, zur Separation von ca. 15 μιη großen Krebszellen bei 40 μιη.

Vorzugsweise wird ein dielektrophoretischer Feldkäfig durch eine Oktupol-Elektrode ausgebildet, wobei durch eine partielle Freilegung der Passivierung der inneren Oktupol- Elektroden ein abschirmendes nDEP-Kraftfeld um die freigelegten Elektroden ausgebildet wird. In bevorzugten Ausführungsformen liegt der Abstand zwischen den Elektroden des

Feldkäfigs, insbesondere einer Oktupol-Elektrodenanordnung, im Bereich von > 10 μιη bis < 20 μιη. Bei einer Wechselspannung von 0,1 V bis 4 V für die negative Dielektrophorese können kleinere Elektrodenabstände nicht nur eine vielfach höhere Ablenkkraft sondern auch eine wesentlich reduzierte Widerstandserwärmung der Flüssigkeit zwischen den Elektroden bewirken. In sehr vorteilhafter Weise kann die Wärmeentwicklung durch die

Widerstandserwärmung hierdurch vernachlässigbar klein sein. Dies ermöglicht es, den Nachteil der Widerstandserwärmung (eng. Joule heating) der negativen Dielektrophorese zu überwinden. Weiterhin kann hierdurch eine sehr stabile Ablenkung und sehr stabiles Fangen von Biopartikeln selbst bei schnelleren Strömungen gewährleistet werden.

In vorteilhafter Weise können mit einem Abstand zwischen den Elektroden von 20 μιη einer Oktupol-Geometrie weiterhin Zellen mit einer Größe zwischen 0,5 μιη und 20 μιη gezielt gefangen und manipuliert werden, beispielsweise Krebs-, Nieren und Blutzellen sowie Mikroben, beispielsweise, industriell relevante, Hefen und Bakterien, sowie Zellorganellen wie Mitochondrien.

Darüber hinaus können Zellinteraktionen mit kleinen Zellen vermessen werden.

Beispielsweise wird es ermöglicht, gezielt zwei, drei oder mehrere Zellen zusammenzuführen und zu kontaktieren oder aufeinander zu drücken. Das kontaktlose Manipulieren durch das Kraftfeld verhindert hierbei den Einfluss von Substraten, so dass der isolierte Kontakt der Zellen analysiert werden kann. Anschließend können die Zellen gezielt wieder abgetrennt werden. Beispielsweise konnten humane Nierenzellen mit Bakterien oder einzelne rote Blutkörperchen mit einem einzelnen Thrombozyten zusammen geführt und wieder getrennt werden. Hierdurch können auch Tochterzellen einer wachsenden Zelle gezielt abgetrennt werden. Die Elektroden ermöglichen weiterhin einen Temperaturwechsel im Bereich von

Millisekunden, wodurch der Einfluss von schnellen Temperaturwechseln auf biologische Systeme untersucht werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren sowie mikrofluidische System ermöglichen somit eine Kontrolle über die Mikroumgebung von Biopartikeln, die zentral für die biologische Forschung ist, da sie die Untersuchung der Veränderung eines einzelnen Parameters auf ein biologisches System erlaubt und somit die Untersuchung der Ursachen einer Zellantwort deutlich verbessern kann.

Das erfindungsgemäße mikrofluidische System kann insbesondere durch

mikrotechnologische Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann ein insbesondere durch Prägen oder Ätzen strukturiertes Substrat, beispielsweise ein Glassubstrat, ein Siliziumsubstrat oder ein biokompatibles Polymersubstrat verwendet werden. Auf das Substrat können anschließend, beispielsweise mittels Dünnschichttechniken und/oder

Lithographie, Elektroden aufgebracht werden. Danach kann das resultierende System mit einer Abdeckung, beispielsweise einer Glasplatte oder einer Polymerplatte, abgedeckt werden. In vorteilhafter Weise sind Gläser biokompatibel. Bevorzugt sind Borosilikatgläser und Quarzgläser. Borosilikatgläser sind sehr gut geeignet, da sie gegenüber Temperatur, mechanisch und chemisch sehr beständig sind. Quarzgläser weisen gute

Brechungseigenschaften auf. Dies ist insbesondere für optische Analysen vorteilhaft. Unter den Polymeren sind besonders Cyclo-Olefin-Copolymere (COC) sehr gut geeignet. Cyclo- Olefin-Copolymere sind in vorteilhafter Weise biokompatibel, chemisch sehr resistent, thermisch resistent, haben sehr gute mechanische Eigenschaften, eine sehr geringe

Doppelbrechung. Darüber hinaus stellen Cyclo-Olefin-Copolymere ein sehr günstiges Material dar. Eine chemische, mechanische und thermische Resistenz ist insbesondere sehr vorteilhaft für das Reinigen und Sterilisieren der Mikrochips.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems, wobei man die Abdeckung des

mikrofluidischen Systems mittels eines biokompatiblen Photoresist-Lacks insbesondere auf Epoxidharz-Basis, befestigt.

Unter dem Begriff "biokompatibel" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden, dass der Photoresist-Lack frei von Klebstoff und/oder Weichmachern ist. Insbesondere ist bevorzugt, dass keine die Biopartikel beeinflussenden Substanzen, insbesondere kein

Klebstoff und Weichmacher, aus dem Photoresist-Lack an das Fluid abgegeben werden. Insbesondere Klebstoffe oder Polymere geben häufig Additive ab, die die Zellphysiologie und die angeschlossene sensitive Spurenanalytik erheblich beeinflussen können.

Ein bevorzugter Photoresist-Lack auf Epoxidharz-Basis ist beispielsweise SU-8-Negativ- Photoresistlack, beispielsweise erhältlich bei der Firma Microchem Corp. Der SU-8-Negativ- Photoresistlack ist insbesondere biokompatibel. Ein weiterer bevorzugter Photoresist-Lack ist der AZ ® nLof 2070 Fotolack, beispielsweise erhältlich bei der Firma Micro Chemicals GmbH. Weiterer bevorzugte Photoresist-Lacke sind Lacke ausgewählt aus der Megaposit™ SPR™220 i-Line photoresist Produktline, beispielsweise erhältlich bei der Firma

MEGAPOSIT, MICROPOSIT, MF, Shipley Company, L.L.C.. Weiterer bevorzugte

Photoresist-Lacke sind ausgewählt aus den ma-N 400 und ma-N 1400-Negativ Photoresist Produktserien, beispielsweise erhältlich bei der Firma Micro Resist Technology GmbH.

Photoresistlacke mit positiven oder negativen Belichtungseigenschaften können mittels photo lithographischer Verfahren strukturiert werden. Dies erlaubt eine Verbindung der Abdeckung des mikrofluidischen Systems, ohne dass ein Klebstoff zu einer weiteren Erhöhung der Kanäle führt. Die Verwendung eines Photoresistlacks erlaubt insbesondere eine Tiefe der Mikrokanalstrukturen von < 20 μηι. Durch ein definiertes Aufspinnen und

Lithografieren insbesondere des für den ersten Aushärtungsschritts aufgebrachten Lackes, kann in vorteilhafter Weise die Tiefe der Kanäle in einem Bereich zwischen 2 μηι und 20 μηι mit einer Genauigkeit von +/- 0,1 μιη eingestellt werden.

In bevorzugten Ausführungsformen wird der Photoresist-Lack während der Herstellung des mikrofluidischen Systems in weiteren Mikrokanälen, die insbesondere parallel zu den Kanälen für die Fluidik des mikrofluidischen Systems liegen, vorgelegt. Dies kann durch Lithografieren einer zweiten Kanalstruktur in Fotolack erfolgen. Vorzugsweise sind die weiteren Mikrokanäle beidseitig von den später im mikrofluidischen System vorhandenen Fluidkanälen angelegt. Insbesondere können diese um die späteren Fluidikkanäle vollständig herumführen. Diese zusätzlichen Kanäle können mit Photoresistlack gefüllt werden. Durch bevorzugtes leichtes Überdosieren kann beim Ausrichten des Deckglases durch Kapillarkräfte der Lack gleichmäßig in die Spalten gezogen werden. Hierbei können mikroskopische Totvolumina bis zu einem größeren Kanalvolumen ausgefüllt werden. Der gedeckelte Chip wird vorzugsweise zum Aushärten des flüssigen Lacks belichtet. Dies ermöglicht das Verbinden oder Verkleben ohne die üblichen Klebstoffe. Insbesondere ist vorteilhaft, dass ein Lack im Gegensatz zu einem Klebstoff nur vernachlässigbar dünne Schichten zu der Kanalhöhe beiträgt, so dass dies eine insgesamt sehr geringe Tiefe der Kanäle herzustellen erlaubt. Die Verwendung eines Photoresistlacks erlaubt insbesondere eine Tiefe der Mikrokanalstrukturen von < 20 μιη.

Es können in den weiteren Mikrokanälen für den Photolack Überlaufkanäle, die insbesondere von der Mikrofluidikkanalstruktur weg gerichtet sind, eingebracht vorgesehen sein. Dies ermöglicht ein leichteres Dosieren des Lackes, da überschüssiger Photolack abfliessen kann, ohne die späteren Mikrofluidikkanäle zu verunreinigen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems in einem integrierten mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-System.

Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes mikrofluidischen System, beispielsweise in einem integrierten mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-System, in der Medizintechnik und

Mikrobiologie, beispielsweise in der medizinischen Analytik, verwendet werden. Weiterhin kann ein erfindungsgemäßes mikrofluidischen System, beispielsweise in einem integrierten mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-System, in der Biotechnologie zur Entwicklung industrieller Produktionsstämme verwendet werden. Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes mikro fiuidisches System zur Analyse von Krebszellen oder Keimen verwendet werden. Eine spezielle Bedeutung hat die Erfindung insbesondere auch für zukünftige Entwicklungen der synthetischen Biologie. Da eine Zelle die minimale Funktionseinheit des Lebens darstellt, liefert diese direkte Genom - Funktions - Beziehungen ohne eine Vermischung der zu analysierenden Biomoleküle wie bei Experimenten auf Populationsbasis.

Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes mikro fiuidisches System zur metabolischen Analyse mit isotopomeren-markierten Medienbestanteilen verwendet werden, um eine gezielte Zellstammoptimierung vorzunehmen. Hierbei können Stoffwechselwege mit definierten Einzelzell-Manipulationen identifiziert werden, welche zum Beispiel einen Einfluss auf die Ausbeute oder/ Selektivität eines biotechnologischen Prozesses haben.

Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches System zur Lyse und Isolation der DNA oder anderer Zellbestandteile einer Einzelzelle genutzt werden. Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches System auch genutzt werden um Moleküle, wie Biomoleküle, z.B. DNA nicht-invasiv in separierte Einzelzellen einzubringen und wieder zu einer Population für z.B. einen Biotechnologischen Prozess heranwachsen zu lassen. Weiterhin kann ein erfindungsgemäßes mikro fluidisches System zur gezielten Differenzierung und anschließender Analyse embryonaler oder adulter Stammzellen verwendet werden. Die mikrofluidische Zelle kann insbesondere in einen mikrofluidischen Chip integriert sein. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher einen Chip umfassend ein

erfindungsgemäßes mikrofluidisches System.

Insbesondere kann das mikrofluidische System in eine Mikrochipperipherie zur Ansteuerung der Elektronik, Fluidik, der Zu- und Abführung der Biopartikel und/oder der Regulation der Temperatur integriert sein.

Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben. Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.

Hierbei zeigen die Figuren 1 bis 3 schematische Ansichten der wesentlichen Schritte der dielektrophoretischen Vorseparation, der fluidische Separation und Untersuchung, des separierten Biopartikels gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Weiter zeigt die Figur 5 schematische Querschnittansichten der wesentlichen Herstellungsschritte des Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Systems.

Figur 1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform der Mikrokanalstruktur eines

mikrofluidischen Systems.

Figur 2 stellt den Verfahrensschritt der dielektrophoretischen Vorseparation eines polarisierbaren Biopartikels dar.

Figur 3 stellt den Verfahrensschritt der fluidische Separation des ausgewählten

Biopartikels dar. Figur 4 stellt den Verfahrensschritt der Untersuchung des separierten Biopartikels dar.

Figur 5 zeigt schematische Querschnittansichten der wesentlichen

Herstellungsschritte des Verfahrens zur Herstellung eines mikrofluidischen Systems.

Figur 6 zeigt ein beispielhaftes Chipdesign.

Figur 7 zeigt eine Ausführungsform eines Chips umfassend ein mikrofluidisches

System.

Figur 8 zeigt eine mikroskopische Aufnahme der Kultivierung einer einzelnen

Corynebacterium glutamicum-Zelle.

Figur 1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform der Mikrokanalstruktur eines

mikrofluidischen Systems 1. Ein Vorseparationsraum 10 weist eine erste Zuleitung 12 zur Zuführung eines die polarisierbaren Biopartikel enthaltenden Fluids und eine erste Ableitung 14 zum Abführen wenigstens eines Teils des die polarisierbaren Biopartikel enthaltenden Fluids auf. Ein Separationsraum 16 ist über eine aus dem Vorseparationsraum 10

ausmündende Zuleitung 18 mit dem Vorseparationsraum 10 verbunden. Eine zweite

Ableitung 20 zum optionalen Abführen eines weitere polarisierbare Biopartikel enthaltenden Fluids, mündet aus dem Separationsraum 16 aus. Ein Kultivierungsraum 22 ist über eine aus dem Separationsraum 16 ausmündende Zuleitung 24 mit dem Separationsraum 16 verbunden. Eine aus dem Kultivierungsraum 22 ausmündende Ableitung 26 dient zur Ableitung der Analyte. Eine Zuleitung 28, die in den Separationsraum 16 einmündet, kann zur Zuführung eines Fluids dienen.

Die äußere Struktur 30 zeigt exemplarisch, eine vor dem Verbinden der Chipplatten mit Lack befüllte Kanalstruktur. Ein Belichtungsschritt ermöglicht das Verbinden der Kanalstruktur mit einem Deckelglas, so dass Klebstoffe mit Eigenhöhen vermieden werden können und sehr flache, weniger als < 20 μιη hohe Kanäle auch bei Mehrkomponentenmikrochips erreicht werden können, die das stabile Manipulieren von Mikroorganismen oder kleineren

Einzelzellen einer Größe von 0,5 μιη bis 5 μιη mit nDEP-Chips ermöglicht werden.

In einem ersten Pump-Modus können zunächst kontinuierlich Zellen in den Eingang 40 gepumpt werden. In dem Vorseparationsraum 10 kann eine Zelle isoliert und in einem

Separationsraum 16 beispielsweise in einem Feldkäfig festgehalten werden. Durch Eingang 40 kann anschließend zellfreies Medium gefördert werden, um andere Zellen aus dem Chip zu entfernen. Anschließend kann ein zweiter Pump Modus aktiviert und Medium in Eingang 50 gepumpt werden, um die zu analysierende Einzelzelle in dem Kultivierungsraum 22 nahe dem Analytikausgang 60 in einem Feldkäfig oder in einer Hakenelektrode zu kultivieren und zu analysieren. In der Kultivierungskammer kann die Temperatur und die Zusammensetzung des Mediums durch Eingang 50 für Pertubationsanalysen variiert werden. Neben möglichen optisch-basierten Analysen beispielsweise Fluoreszenzmessungen etc., können über Ausgang 60 Einzelzellproben während der Kultivierung gesammelt und analysiert werden.

Anschließend kann ein dritter Pumpmodus aktiviert werden, welcher die Einzelzelle durch Einbringen von Medium in Eingang 70 durch Ausgang 80 pumpen kann, um sie in ein Kultivierungsgefäß führen zu können. Anschließend können für die nächste Analyse erneut Zellen durch Eingang 40 in den Chip eingebracht werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Mikrokanalstruktur können die

Ableitungen 14 und 20 zu den Ausgängen 32 und 34 zu einem gemeinsamen Ausgang verbunden sein. Dies hat den Vorteil, dass das Split- Verhältnis des Fluidikstroms im

Vorseparationsraum konstant bleibt. Weiterhin kann diese Ausführungsform einen

Fluidanschluss für den Chip einsparen.

Dielektrophoretische Vorseparation

Figur 2 stellt den Verfahrensschritt der dielektrophoretischen Vorseparation von einzelnen Zellen aus einer Zelllösung, z.B. aus einem Bioprozessreaktor, dar. Nachdem eine Zellsuspension in eine erste Zuleitung 12 eingeleitet wurde, wurden, wie aus Figur 2A ersichtlich ist, eine so genannte Zaun- Elektrode 120, Tor 1 -Elektrode 122 und Tor 2-Elektrode 124 angesteuert, um zu verhindern, das andere als die ausgewählte Zelle 130 in die aus dem Vorseparationsraum 10 ausmündende Zuleitung 18 zum Separationsraum strömen können. Es wurden beide Torelektroden 122 und 124 mit unterschiedlichen

Frequenzen angesteuert. Zur Abtrennung einer ausgewählten Zelle 130 wurden die Barriere- Elektrode 126 und Ablenk-Elektrode 128 eingeschaltet. Hierdurch wurden nachkommende Zellen zurückgehalten und die ausgewählte Zelle 130 in den Strömungsprofilbereich zur Einzelzellabtrennung gelenkt, wie aus Figur 2B ersichtlicht ist. Die Tor 1 -Elektrode 122 wurde abgeschaltet. Hierdurch wurden mehrere Zellen an der Tor 2-Elektrode 124 abgelenkt. Wie aus Figur 2C ersichtlicht ist, wurde die Tor 1 -Elektrode 122 wieder eingeschaltet um nachkommende Zellen abzulenken, nachdem die ausgewählte Zelle 130 die Tor 1 -Elektrode passierte. Wie aus Figur 2D ersichtlicht ist, befand sich die ausgewählte Zelle 130 dadurch als letzte Zelle im Strom und wurde bis vor die Spitze der Zaun Elektrode 120 abgelenkt, wo die Tor 2-Elektrode 124 ausgeschaltet wurde um die ausgewählte Einzelzelle 130 aus dem Vorseparationsraum 10 durch die aus diesem ausmündende Zuleitung 18 in den

Separationsraum 16 zu führen. Mit dem Wiedereinschalten der Tor 2-Elektrode 124 wurde die Barriere Elektrode 126 automatisch ausgeschaltet, wie aus Figur 2E ersichtlicht ist. Figur 2F zeigt, dass nachdem die Zelle 130 im Separationsraum 16 in einem dielektrophoretischen Feldkäfig fixiert wurde, frisches Medium zugeführt wurde um alle anderen Zellen aus dem Chip zu entfernen.

In einer alternativen Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Torelektrode 124 in der Länge lediglich geringfügig über die Spitze der Zaun-Elektrode 120 in die Ableitung 14 hineinreicht. In vorteilhafter Weise kann auch bei dieser Länge eine sichere Ableitung der Zellen gewährleistet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Zaun-Elektrode 120 nach der Ausbildung der hakenförmige Spitze in Richtung der Ableitung 14 nicht durchgeführt ausgeführt ist, sondern lediglich eine Hakenspitze ausbildet. Weiterhin kann vorgesehen sein, die hakenförmige Spitze der Zaun-Elektrode 120 mit möglichst kleinen Elektrodenflächen auszubilden, beispielsweise mit einer Breite der Elektroden von 10 μιη, vorzugsweise von 8 μιη. Es konnte festgestellt werden, dass diese Breite für eine gute Ablenkwirkung ausreicht. In vorteilhafter Weise kann eine Verringerung der Kontaktfläche eine Verbesserung der Ablenkung erzielen. Weiterhin können möglichst geringe nicht isolierte Kontaktflächen der Elektroden vorgesehen sein. Weiter kann vorgesehen sein, dass die Isolation der Zaun-Elektrode 120 nur wenig über den

Eintrittsbereich der Elektrode 120 in den Mikrokanal hinausreicht. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann vorgesehen sein, den Verfahrensschritt der dielektrophoretischen Vorseparation nicht durch die Ablenk- Konfiguration der Elektroden 120, 122, 124 und 128 durchzuführen, sondern durch einen dielektrophoretischen Feldkäfig mittels einer Oktupol Elektrode. Fluidische Separation einer einzelnen Zelle

Figur 3 stellt den Verfahrensschritt der fluidischen Separation der ausgewählten Zelle durch Fixieren der Zelle in einem ersten dielektrophoretischen Feldkäfig und Umströmen mit Fluid dar.

Nach der Vorseparation zeigt Figur 3A wie die ausgewählte Einzelzelle 130 mit

Trichterelektroden 218 auf das Zentrum 222 des Feldkäfigs gelenkt wurde. Nach dem

Passieren der Trichterelektroden 218 und dem Vorliegen der Zelle 130 im Zentrum 222 des Oktupols, wurde der ersten dielektrophoretischen Feldkäfig 230 eingeschalte, so dass die Zelle durch das nD EP-Kraftfeld im Strom gehalten wurde, wie Figur 3B zeigt. Beim

Einschalten des ersten dielektrophoretischen Feldkäfigs 230, wurden die Trichterelektroden 218 automatisch deaktiviert. Durch eine partielle Freilegung der auf den Elektroden haftenden Isolation, insbesondere einer Glasbeschichtung, entstand ein kugelförmiges Kraftfeld 230 um die freigelegten Elektroden, welches verhindert, dass eventuell in der Vorseparation mit abgetrennte Zellen ebenfalls eingefangen wurden. Die nachkommenden Zellen wurden um den Oktupol-Feldkäfig 230 herum abgelenkt und aus der Ableitung 20 zum optionalen Abführen weitere polarisierbarer Zellen, die aus dem Separationsraum 16 ausmündet, aus dem Chip gespült, wie Figur 3C zeigt. Nach der Isolation der ausgewählten Einzelzelle wurde diese nach der Aktivierung eines geeigneten Pumpmodus und Ausschalten des ersten dielektrophoretischen Feldkäfigs durch Einbringen von frischem Medium durch eine

Zuleitung 28, die in den Separationsraum 16 einmündet, durch eine aus dem Separationsraum 16 ausmündende Zuleitung 24 in den Kultivierungsraum überführt, wie die Figur 3D zeigt.

In einer alternativen Ausführungsform kann die Zuleitung 18 zum Separationsraum wie die Ableitung 24 eine Breite von etwa 200 μιη aufweisen. In vorteilhafter Weise ist die

Kanalkreuzung des Separationsraums möglichst klein ausgebildet. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn die Seitenlängen der Kreuzung ca. 200 μιη betragen. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die Elektroden des Oktupols möglichst exakt auf dem Kreuzungspunkt der Kanäle, die den Separationsraum ausbilden, liegen. Weiter ist bevorzugt, dass die Elektroden auf die Kanten der Zu- und Ableitungen geführt sind. Weiter ist bevorzugt, dass die

Elektroden lediglich an den Kanten isoliert sind, wobei die Freilegung der Isolation der Elektroden bereits an den Ecken der Kreuzung beginnt. Dies kann den Vorteil bewirken, dass ein gutes Kraftfeld 230 ausgebildet werden kann, welches ermöglicht, dass eine Separation ohne die Trichterelektroden 218 ermöglicht wird.

Kultivierung und Pertubation einer einzelnen Zelle

Nach dem Einbringen der Zelle 130 in den Kultivierungsraum 22 wie in Figur 4A gezeigt, wurde wie in Figur 4B gezeigt die Einzelzelle 130 mit Trichterelektroden 310 auf das Zentrum 312 eines Oktupols zugeleitet und mit einem spezifischen Feldmodus und Spannung angesteuert, um die Zelle in einem zweiten dielektrophoretischen Feldkäfig zu kultivieren und zu analysieren. Die Temperatur wurde während der Kultivierung über einen

Widerstandssensor 316 gemessen. Alternativ kann die Zelle auch, wie in Figur 4C gezeigt ist, in einer Hakenelektrode 318 mit Hilfe der Mikro Strömung kontaktlos im Medium kultiviert, pertubiert und analysiert werden. Nach optisch oder nicht-optisch basierten Analysen wurde ein weiterer Pumpmodus aktiviert und die Zelle, wie in Figur 4D gezeigt ist, für die

Vermehrung zu einer Population lebend in ein Kultivierungsgefäß abführt. Figur 5 zeigt schematische Querschnittansichten der wesentlichen Herstellungsschritte zur Herstellung eines mikrofluidischen Systems.

Figur 5A zeigt eine vorgefertigte, nicht gedeckelte Chipstruktur mit einem Glassubstrat 400, einer Glasisolierung 402, einem Mikrofluidikkanal 404, Elektroden 406, einem Reservoir 408 für den biokompatiblen Photoresist-Lack, eine Füllkammer 410 für biokompatiblen oder nicht biokompatiblen Lack oder Klebstoff 420 sowie Spacer 412. Die Füllkammer 410 kann für eine weitere Haftungsoptimierung des oberen Deckgläschen mit nicht zwingend

biokompatiblem Photoresist-Lack befüllt werden und dient zusätzlich der weiteren

mechanischen Stärkung des aus der Fertigung resultierenden Chips. Die Spacer 412 und 442 können zur Einstellung der Mikrofluidkanaltiefe verwendet werden. Dieses ermöglicht ein vorheriges definiertes Aufspinnen mit definierter Lackviskosität und Fließeigenschaften. Der Spacer 412 kann wie der Spacer 442 vorzugsweise aus biokompatiblem Photoresist-Lack ausgebildet sein. Eine zweite Kanalstruktur 414 kann um die Mikrokanalstruktur 408 für die Fluidik als Überlaufreservoir für den biokompatiblen Lack 430, beispielsweise durch

Lithografieren, angelegt werden, wie Figur 5 A zeigt. In bevorzugten Ausführungsformen können zwischen dem Reservoir 408 und dem Kanal 414 Überlaufkanäle für den Photolack vorgesehen sein. Dies ermöglicht, dass überschüssiger Photolack abfließen kann, ohne die Mikrofluidikkanäle 404 zu verunreinigen. Die den Mikrofluidikkanal 404 umgebende Kanalstruktur 408 kann mit biokompatiblem Photoresist-Lack 430, insbesondere auf Epoxid- Harz-Basis beispielsweise SU-8, gefüllt werden, wie in Figur 5B gezeigt. Die Füllkammer 410 kann mit nicht biokompatiblem oder biokompatiblen Lack 420 gefüllt werden.

Figur 5C zeigt die Positionierung eines Deckgläschen 440 mit oberer Isolierung 403, oberer Elektrode 407 und am Deckglas aufgebrachten Spacer 442. Der Spacer 442 wird auf den unteren Spacer 412 aufgelegt und kann ebenfalls zu Kanaltiefeneinstellung dienen. Nach dem Positionieren und Auflegen des Deckgläschen 440, wurde der biokompatible Photoresist-Lack 430 durch Kapillarkraft aus dem Reservoir-Mikrokanal gezogen und dichtet die

Mikrof uidikkanäle ab. Durch leichtes Überdosieren kann beim Ausrichten des Deckglases durch Kapillarkräfte der Lack gleichmäßig in die Spalten gezogen werden und hierbei mikroskopische Totvolumina bis zum größeren Kanalvolumen ausfüllen, wie in Figur 5D gezeigt ist. Figur 5E zeigt die Belichtung des gedeckelten Chips und das Aushärten des flüssigen Lacks. Vorzugsweise wird der belichtete Chip noch auf für den Lack geeignete Temperaturen erwärmt. Vorzugsweise ist der untere Spacer 412 aus dem Photolack ausgebildet, der zum Verbinden der Chipstruktur mit dem Deckgläschen 440 verwendet wird. Durch die Verwendung des Photoresist-Lacks 430 wird ein Verbinden ohne die üblichen Klebstoffe ermöglicht. Die Spacerhöhe ist in dieser Ausführungsform der alleinige

Abstandshalter zwischen den Elektroden. Der Abstand der Elektroden kann somit mit der Schichtdicke auf eine +/-0,1 μιη Genauigkeit eingestellt werden und erlaubt einen sehr geringen Abstand von weniger als 20 μιη, vorzugsweise von mindestens 2 μιη. Dies ist beispielsweise abhängig von der Viskosität des Lackes und der beim Aufspinnen des Lackes verwendeten Umdrehungszahl. In einem Bereich von > 2 μιη bis < 20 μιη ist ein insbesondere gutes Manipulieren insbesondere von Bakterien und anderen Mikroorganismen oder kleineren Zellen mit einer Größe von 0,5 μιη bis 5 μιη mittels negativer Dielektrophorese möglich. Die Dosierung des Lacks erfolgt abhängig von der vorliegenden Kanalstruktur.

Figur 6 zeigt ein beispielhaftes Chipdesign. Vergrößert gezeigt ist eine

Mikroskopaufnahme einer Barriereelektrode 126, einer Anordnung von Zaun-Elektrode 120, Tor 1 -Elektrode 122, Tor 2-Elektrode 124 und Ablenkelektrode 128 im

Vorseparationsraum 10, ein Oktupol sowie eine Trichterelektrode in einem

Separationsraum 16, sowie eine Anordnung einer Trichterelektrode, eines weiteren

Oktupols und einer Hakenelektrode in einem Kultivierungsraum 122. Ebenfalls vergrößert gezeigt ist eine mikroskopische Aufnahme 500 einer im Zentrum des Oktupols kultivierten und sich teilenden Corynebakterium gluatmicum-ZellG.

Figur 7 zeigt eine Ausführungsform eines Chip 600 umfassend ein mikrofluidisches

System 1.

Figur 8 zeigt eine vergrößerte mikroskopische Aufnahme der kontaktfreien Kultivierung einer Corynebacterium glutamicum-ZellG 700 im Zentrum eines Oktupols. Das Verfahren wird weiter anhand des folgenden Ausführungsbeispiels der Separation einer Mikrobe erläutert.

Experimenteller Aufbau:

Verwendet wurde ein Chip wie er in Figur 7 gezeigt ist mit einer Kanalstruktur des mikrofluidischen Systenms wie in Figur 1 gezeigt ist, wobei abweichend die Ableitungen 14 und 20 (siehe Figur 1) zu einem gemeinsamen Ausgang verbunden waren.

Der Chip wurde in eine Chipkopplung (Kortmann H, Blank LM, Schmid A. 2009. A rapid, reliable, and automatable lab-on-a-chip interface. Lab Chip 9: 1455-60) eingebaut, um den Chip mikrofluidisch und elektrisch zu verbinden. Die Chipkopplung erlaubte die

Temperatureinstellung über Peltierelemente. Der in die Kopplung integrierte Chip wurde auf einem Mikroskop (1X71, Olympus, Japan) auf einem XY-Tisch befestigt. Für die

Ansteuerung der in dem Chip implementierten Mikroelektroden wurde der Chip über ein 37 poliges Kabel an einen Generator (Cytocon 400, Perkin Elmer, USA) angeschlossen. Der Generator war mit einem Computer (PC) verbunden und wurde zur Kontrolle der Spannungen und Frequenzen der elektrischen Wechselfelder mit der Software Switch (PerkinElmer, USA) kontrolliert. Für alle beschriebenen Zellmanipulationen wurden die Elektroden mit einer Wechselspannungsfrequenz von 6,25 MHz betrieben und Effektivspannungen zwischen 0,7 und 4,2 V verwendet.

Über die Kopplung wurden drei Spritzenpumpen (SP210IWZ, World Precision Instruments Inc., USA) angeschlossen. Pumpe 1 war mit einer 200 μΐ Hamilton Glasspritze (ILS

Innovative Labor Systeme GmbH, Deutschland) ausgestattet und an dem in Figur 1 gezeigten Eingang 40 des mikrofluidischen Systems angeschlossen. Pumpe 2 war mit einer 10 μιη Hamilton Glasspritze (ILS Innovative Labor Systeme GmbH, Deutschland) ausgestattet und an Eingang 50 (siehe Figur 1) angeschlossen. Pumpe 3 war mit einer 10 ml

Hamilton Glasspritze (ILS Innovative Labor Systeme GmbH, Deutschland) ausgestattet und an Eingang 70 (siehe Figur 1) angeschlossen. Die in die Pumpen eingebauten Spritzen waren mit dem gleichen und für den Zelltyp verwendeten BHI (Brain Heart Infusion)- Komplexmedium gefüllt. Das BHI-Medium wurde hergestellt, indem 37 g BHI-Pulver (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) in 1 L demineralisiertem (VE)-Wasser gelöst und autoklaviert wurden.

Hinter allen Ausgängen wurden Ventile angebracht. Für die Zellinjektion wurde zwischen Eingang 40 (Figur 1) und Pumpe 1 ein Vierwegeventil (1120, Omnift, Deutschland) eingebaut. Ein drehbarer Kanal in dem Ventil konnte mit einer Zellensuspension gefüllt werden. Anschließend wurde der Ventilkanal gedreht um Pumpe 1 mit dem Chip zu verbinden. Dies erlaubte das Einspülen eines definierten Volumens an Zellsuspension. Die Pumpen waren mit einem Computer verbunden und wurden zur Kontrolle der

Volumenströme mit der Software Switch (PerkinElmer, USA) kontrolliert. Das im Folgenden beschriebene Verfahren wurde im 20 μιη Elektrodendesign, die für eine Kanalhöhe von 20 μιη ausgelegt waren, durchgeführt.

Separiert wurde eine Mikrobe des bakteriellen Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Sowohl fur Vorkulturen wie für die Einzelzellmanipulationen im Chip wurde Brain Heart Infusion (BHI) Medium (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) verwendet.

Vor dem Injizieren von Zellen wurde der Chip mit der zuvor beschriebene Kopplung eingebaut und alle Kanäle und Verbindungen mit 70 %igem Ethanol, steril filtriertem Wasser und Medium gespült um das System zu reinigen, sterilisieren und für die Zellmanipulationen vorzubereiten. Anschließend wurden alle verbundenen Ventile geschlossen.

Für die Vorkultur wurden 3 ml BHI-Komplexmedium mit einer Bakterien- Kolonie von BHI- Agarplatten inokuliert und über Nacht in Reagenzgläsern in einem Kompaktschüttler (KS 15 control, Edmund Bühler GmbH, Hechingen, Deutschland) bei 30°C und 300U/min kultiviert. Danach wurden 0,5 ml der Kultur in 2,5 ml BHI Komplexmedium überführt und 3 Stunden bei 30°C und 300U/min inkubiert. Aus dieser Vorkultur wurden 0,1 ml mit einer 0,2 ml Einwegspritze aufgenommen und direkt in das Vierwege-Drehventil injiziert. Das

Innenvolumen von dem Drehventilkanal betrug 9,6 μί. Durch das Verstellen des Drehventils wurde der mit 9,6 Zellsuspension gefüllte Kanal mit Pumpe 1 und dem Chipeingang 40 (Figur 1) verbunden. Nachfolgend wurden die Ventile am Ausgang der Ableitungen 20 und 14 (Figur 1) geöffnet und ein Fördervolumen von 200 pL/s mit Pumpe 1 eingestellt und der Vorseparationsraum (Vorseparationsraum 10, Figur 2) mit dem Mikroskop (1X71, Olympus, Japan) betrachtet.

Die Elektroden 120, 126 und 128 in der Vorseparation wurden mit einer Effektivspannung von 3,5 V angesteuert. Vor Ankunft der ersten Zellen wurden nur die Elektroden 120, 122 und 124 mit 3,5 V aktiviert, wodurch die Zellen zunächst nur über die Ableitung 14 zum Ausgang geführt wurden. Die Aktivierung der Elektrode 128 bewirkte eine Ablenkung der Bakterien vor die Elektrode 122. Nach Ankunft der Zellen wurde mit der Aktivierung von Elektrode 126 die Anzahl an Corynebakterien vor den Elektroden 122 und 124 reduziert. Die Corynebakterien befanden sich in unterschiedlichen Wachstumsphasen und hingen typisch für diese Bakterien teilweise noch mit ihren Tochterzellen in einer V-Form

zusammen. Um einzelne nicht in V-Form zusammenhängende Zellen aus dem Zellgemisch abzutrennen und in den Separationsraum (Separationsraum 16, Figur 1) zu führen, wurde die Spannung von 3,5 auf 1,4 V für 5 Sekunden reduziert. Dies bewirkte, dass Einzelzellen in den Separationsraum geleitet wurden, während Zellagglomerate und zusammenhängende Zellen über die Ableitung 14 zum Ausgang geführt wurden. Nach dem Ableiten der Zellfraktion in den Separationsraum wurden alle Elektroden bis auf Elektrode 120,122 und 124 deaktiviert und die Spannung von Elektrode 120,122 und 124 auf 4,24 V erhöht um einem eventuellen Einströmen weiterer Zellen in den Separationsraum vorzubeugen.

In dem Separationsraum war Elektrode 218 zur Fokussierung der Zellfraktion auf das Oktupolzentrum (Oktupolzentrum 222, Figur 3) aktiviert. Alle Elektroden im

Separationsraum wurden mit einer Effektivspannung von 2,83 V kontrolliert. Entweder wurde eine Zelle direkt durch das Aktivieren des Feldkäfigs im Oktupol-Feldkäfig 230 kontaktlos mit negativer Dielektrophorese eingefangen und nachkommende Zellen durch abwechselndes Betreiben im ACC und ROT X Modus um den Feldkäfig herum abgetrennt und über die Ableitung 20 ausgespült, oder die abgetrennte Zellfraktion wurde durch eine konstant ROT X Modus Ansteuerung zunächst vor dem Feldkäfig akkumuliert und anschließend durch den Feldmodus ACB durch das Feldkäfigzentrum nacheinander aufgereiht. Nach dieser

Aufreihung der Zellen konnte durch den Wechsel in den Feldmodus ROT X eine Zelle isoliert werden und die restlichen Zellen vor dem Oktupol wiederum durch den Wechsel der Kraftfeld Modi (ACC und ROT X, Muller T, Pfennig A, Klein P, Gradl G, Jager M, Schnelle T. 2003. The potential of dielectrophoresis for single-cell experiments. IEEE Eng. Med. Biol. 22:51- 61; Schnelle T, Muller T, Fuhr G. 2000. Trapping in AC octode field cages. J Electrostat 50: 17-29) über die Ableitung 20 aus dem Chip gespült werden. Nach der Isolation einer ausgewählten Einzelzelle wurde Pumpe 1 gestoppt, der Ausgang der Ableitungen 14 und 20 geschlossen und Ausgang 60 (Figur 1) geöffnet. Nach der Aktivierung von Pumpe 2 mit einem Volumenstrom von 80 pL/s wurden alle Elektroden in dem

Separationsraum deaktiviert und die isolierte Zelle in die Kultivierungskammer

(Kultivierungsraum 22, Figur 4)gespült. In der Kultivierungskammer wurden alle Elektroden mit einer Spannung von 2,83 V angesteuert. In der Kultivierungskammer wurde die Zelle mit der Trichterelektrode 310 auf das Zentrum 312 der Oktupol-Elektrode fokussiert und im Zentrum der Elektrode mit dem ROT X-Modus einer Ansteuerung im Flüssigkeitsstrom durch die resultierende negative dielektrophoretische Kraft gehalten. Durch die beschriebene Chipkopplung wurde zuvor die Temperierung so eingestellt, dass im Zentrum 312 der Oktupolelektrode nach der Aktivierung im ROT X Modus eine Temperatur von 30 °C vorherrschte. Die Zelle wurde über einen Zeitraum von ca. 3 Stunden durch das Mikroskop gefilmt und das Wachstum beobachtet. Während dieser Zeit wurde das die Zelle

umströmende und hinter Ausgang 60 austretende Medium in einer angeschlossenen

Glaskapillare aufgefangen. Nach den 3 Stunden befanden sich aufgrund von Zellteilung ca. 10 Zellen im Feldkäfig. Abschießend wurde Pumpe 2 gestoppt und Ausgang 60 (Figur 1) geschlossen und die Zellen durch Öffnen des Ventils 80 und Aktivieren der Pumpe 3 mit einem Volumenstrom von 10 nL/s in ein externes Kultivierungsgefäß gespült. Die isolierten und kontaktlos kultivierten Einzelzellen wuchsen in der kontrollierten

Mikroumgebung stabil und sehr schnell. Verglichen mit den maximalen exponentiellen Wachstumsraten in Kulturen zeigten die Bakterienzellen in dem Chip ein bis zu 32 % schnelleres Wachstum. Weiterhin konnte das Wachstum der Zellen ohne

Oberflächenbeeinflussung beobachtet werden. Dies stellt einen großen Vorteil dar, da bislang Zellen lediglich auf Oberflächen gehalten werden konnten.

Ferner konnten Einzelzellen gut und vollständig getrennt werden. Darüber hinaus konnten die Zellen einer abgetrennten Zellfraktion akkumuliert und anschließend nacheinander aufgereiht werden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass Einzelzellen vollständig vereinzelt und kontaktlos gehalten werden konnten. Dies erlaubt, dass isolierte und kontaktlos kultivierte Einzelzellen in einer kontrollierten Mikroumgebung gezielt manipulierbar sind. Das Verfahren zur Separation polarisierbarer Biopartikel wurde wie vorstehend beschrieben mit Corynebakterium glutamicum MH 20-22 B (Forschungszentrum Jülich), dem

eukaryotischen Stamme Hansenula polymorpha RBl 1 (M. Piontek, ARTES 2 Biotechno logy, Langenfeld, Deutschland) und humanem Blut wiederholt. Für die Bakterien wurde für Vorkulturen und die Einzelzellmanipulationen im Chip Brain Heart Infusion (BHI) Medium verwendet. Für die Eukaryonten wurde YPD-Medium (10 g Bacto-yeast extract (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland), 20 g 2% Bacto- peptone (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und 20 g 2% Dextrose (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) in 1 L demineralisiertem (VE)-Wasser gelöst und autoklaviert) verwendet. Für die Anwendung des Verfahrens auf Blutzellen wurden ca. 10 Blut durch Anstechen einer Zeigefingerspitze mit dem Ascensia Micro let Lanzetten System (Bayer, Deutschland) in 0,5 ml isotonische sterile Kochsalzlösung (9 g NaCl (Carl Roth GmbH, Deutschland) auf 1 L demineralisiertes (VE)-Wasser) gegeben. Alle Lösungen wurden vor der Verwendung steril filtriert.

Es zeigte sich, dass die Eukaryonten und Blutplättchen ebenfalls vollständig vereinzelt und kontaktlos gehalten werden konnten.