MÉTODO, SEQUÊNCIAS, COMPOSIÇÕES E ESTOJO PARA DETECÇÃO DE MUTAÇÕES

NO PROMOTOR DO GENE Utert

Domínio técnico da invenção

A presente invenção refere-se a um método ultrassensivel de detecção das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Utert, composições de reacção que compreendem iniciadores ou "primers" para amplificação e sondas para genotipagem, cujas sequências, SEQ ID nr .1 a SEQ ID nr.6, foram concebidas para apresentar elevada especificidade para essas mutações, bem como a um estojo compreendendo essas composições para realização do referido método.

A presente invenção pode ser vantajosamente utilizada para detectar quantidades vestigiais das referidas mutações C.-1240T e C.-1460T presentes em amostras biológicas in vitro devido à elevada sensibilidade do método e especificidade das sequências genéticas criadas, permitindo assim a detecção precoce, identificação, detecção de recorrência ou previsão e monitorização de patologias associadas a este tipo de mutações, como por exemplo carcinomas da bexiga, tiróide, epidermóide, das células basais, melanoma, gliomas e hepatocarcinomas , entre outros e, eventualmente servir de base para a definição de tratamento adequado.

Desta forma, a presente invenção insere-se na área técnica da medicina, farmacêutica, biologia molecular, bioquímica, genética humana e afins .

Estado da técnica

As mutações somáticas, que ocorrem durante a replicação do ADN que precede uma divisão mitótica, estão na origem de determinadas patologias humanas, em particular de determinados tipos de cancros. A presença da enzima telomerase foi verificada numa elevada percentagem de linhas tumorais, cerca de 75-80%. Recentemente, foram identificadas mutações recorrentes no promotor do gene que codifica esta enzima, o gene TERT, nomeadamente as mutações nas posições c.-124C>T e C.-1460T (a partir do ATG) . Estas mutações foram associadas a diferentes neoplasias, tais como do sistema nervoso central (43-51%), da bexiga (59-66%), carcinoma hepatocelular (59%), da tiróide (10%), da pele (melanoma 29%-73%; BCC 73% e SCC 45%) e GISTs (4%) [1-7].

O facto das mutações no promotor da telomerase estarem presentes numa frequência relati amente elevada em determinados tipos de cancro faz com que sejam potenciais biomarcadores para detecção precoce, diagnóstico, prognóstico, detecção de recorrência ou previsão/monitorização da resposta à terapia de tumores tais como gliomas e glioblastomas , carcinomas da bexiga, hepatocelular, tiroide, de células escamosas, das células basais, melanoma, entre outros. Por exemplo, no cancro da bexiga, as mutações somáticas nas posições c.-124C>T e c.-146C>T (a partir do ATG) do gene da telomerase apresentam uma prevalência que chega aos 85% e, juntamente com as mutações R248C e S249C no gene FGFR3 [9], constituem os biomarcadores mais fidedignos para o cancro da bexiga .

No entanto, para ser utilizado em amostras in vitro de fluidos biológicos (por exemplo urina, plasma, fluido cérebroespinal , citologias aspirativas, entre outros), o método de detecção das mutações nas posições c-124 C>T e c-146 (a partir do ATG) do gene da telomerase deve ter elevada sensibilidade analítica por forma a detectar quantidades vestigiais dos alelos mutados, mesmo quando estes estão "diluídos" numa amostra com maior abundância dos alelos "wild-type" .

O documento WO2015153808 divulga métodos e composições úteis na detecção de algumas patologias, em particular cancerígenas, mais especificamente cancro da tiróide, relacionadas com mutações nas posições c-124 C>T e c-146 do gene TERT . Contudo, as sequências de nucleótidos divulgadas neste documento são utilizadas para detecção das referidas mutações por métodos de amplificação directa, dependente da sequência e têm uma sensibilidade limitada quando a presença de sequências normais é muito abundante relativamente às sequências mutantes. Por outro lado, são susceptíveis à ocorrência de amplificação não específica, de forma que não apresentam elevada especificidade para este tipo de mutação, o que faz com que, no geral o respectivo método não seja suficientemente sensível e específico.

O documento WO2014160834 divulga métodos e composições úteis na detecção e tratamento de diferentes tipos de cancro da tiróide, relacionadas com mutações nas posições c-124 OT e c-146 do gene TER . No entanto, neste documento as sequências de nucleótidos divulgadas também não apresentam elevada sensibilidade quando a presença de sequências normais é muito abundante relativamente às sequências mutantes pois o método proposto para utilização das sequências divulgadas neste documento baseia-se na sequenciação de ADN usando "Big Dye terminator v3.1 cycle sequencing ready kit da Applied Biosystems e um equipamento ABI PRISM 3730 ", que tem uma sensibilidade limitada na detecção de alelos raros na reacção. Por outro lado, a presença da mutação tem de ser confirmada por sequenciação em ambos os sentidos, sense e antisense, o que torna o método pouco prático e trabalhoso e aplicável exclusivamente a cancros da tiróide.

Desta forma, é necessário desenvolver um método com sensibilidade e especificidade suficientes que permita a detecção deste tipo de mutações em amostras biológicas mesmo em condições em que os alelos mutados estejam presentes em quantidades muito baixas.

A presente invenção propõe um método ultrassensivel que permite a detecção das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, através da concepção de iniciadores e sondas cu a sequências são especificas para este efeito.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a um conjunto de sequências de iniciadores e de sondas (SEQ ID nr .1 a SEQ ID nr.6), para amplificação e hibridização de ADN de amostras biológicas, que foram concebidas de forma a apresentarem elevada especificidade na detecção das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, de acordo com a reivindicação 1.

Estes iniciadores e sondas genéticas, por terem elevada especificidade na detecção das referidas mutações permitem serem utilizadas num método de elevada sensibilidade para detecção dessas mutações .

A presente invenção diz também respeito a composições para ampliação e hibridização de ADN, através de técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction) que compreendem as referidas sequências de iniciadores e de sondas genéticas, de acordo com a reivindicação 2.

Estas composições são aplicáveis à detecção de mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, podendo estar vanta osamente pré-preparadas ou serem preparadas no momento da realização do método de detecção da invenção.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito a composições para detecção de mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, que compreendem as composições para PCR e adicionalmente ADN humano proveniente de uma amostra biológica a testar para essa mutação de acordo com a reivindicação 7.

Nestas composições, a quantidade de amostra de ADN a testar pode ser bastante baixa, dado a elevada especificidade dos iniciadores e sondas da presente invenção concebidas para esse efeito.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um estojo que compreende as composições de iniciadores e sondas genéticas especificas para a detecção de mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, pré-preparadas, de acordo com a reivindicação 9.

Este estojo tem a vantagem de desenvolver um método ultrassensivel de detecção in vitro das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, de uma forma rápida e fiável, através da adição de uma amostra de ADN humano a testar para a detecção da referida mutação.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método de detecção in vitro das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, que utiliza composições de reacção que compreendem iniciadores para amplificação e sondas para genotipagem, cujas sequências são especificas para estas mutações, de acordo com a reivindicação 11.

Este método pode ser vantajosamente utilizado para detectar quantidades vestigiais das referidas mutações C.-1240T e C.-1460T presentes em amostras biológicas devido à sua elevada sensibilidade, conferida pelas sequência genéticas concebidas para esse efeito e que apresentam elevada especificidade para este tipo de mutações. Assim, a presente invenção pode ser aplicada na detecção precoce, identificação, detecção de recorrência ou previsão e monitorização de patologias associadas a este tipo de mutações, como por exemplo carcinomas da bexiga, tiróide, epidermóide, das células basais, melanoma, gliomas e hepatocarcinomas , entre outros e eventualmente servir de base para a definição de tratamento adequado.

Desta forma, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método de tratamento em que é administrada uma quantidade adequada de um inibidor promotor do gene Htert a um individuo que teste positivo cu a amostra biológica tenha assinalado positivo no teste de detecção das mutações c-124 c>t e/ou c-146 c>t no promotor do gene Htert da presente invenção, de acordo com a reivindicação 15.

Descrição da invenção

A presente invenção refere-se a um método para detecção in vitro das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert. O referido método utiliza composições de reacção que compreendem iniciadores para amplificação e sondas para genotipagem, cujas sequências (SEQ ID nr .1 a SEQ ID nr.6) são especificas para estas mutações .

Desta forma, são criadas sequências de iniciadores para amplificação e sondas para genotipagem a fim de construir as bases para a referida reacção de amplificação, como por ex . um ensaio de PCR em tempo real (RT-PCR) ou de PCR em Tempo Digital. Foram criadas 6 sequências de iniciadores e de sondas, tal como é apresentado na lista de sequências. Esta compreende as sequências para os seguintes objectivos: a) Deteção da mutação localizada a -124 bases a montante do ATG do gene hTERT

SEQ ID nr .1 Iniciador F

SEQ ID nr.2 Iniciador R

SEQ ID nr.3 Sonda -124C

SEQ ID nr.4 Sonda b) Deteção da mutação localizada a -146 bases a montante do ATG do gene hTERT

SEQ ID nr .1 Iniciador F

SEQ ID nr.2 Iniciador R

SEQ ID nr.5 Sonda -146C

SEQ ID nr .6 Sonda -146T

As sequências acima indicadas podem ser preparadas pelo método de síntese de nucleótidos em fase sólida utilizando fosforamidites de nucleosídeos como descrito na publicação: Beaucage, S. L . ; Iyer, R. P. (1992) . "Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach". Tetrahedron 48(12) : 2223. A síntese pode ser realizada em colunas coluna empacadas com o suporte sólido

(vidro de poro controlado ou poliestireno) funcionalizado com a primeira base da extremidade 3' de cada oligonucleótido . A preparação de cada oligonucleótido segue depois um conjunto de ciclos de síntese, cada um composto por reacções químicas, tipicamente quatro reacções químicas: i) desbloqueio

( destritilação ) , ii) acoplamento, iii) protecção e iv) oxidação. Em cada ciclo são adicionados, no terminal 5' da cadeia em crescimento, os resíduos de nucleótidos correspondentes à sequência dese ada .

Estas podem ainda ser modificadas, nas extremidades 5' e 3' das sequências das sondas, por correspondes à adição de fluoróforos, como por exemplo FAM, Yakima yellow, quencher (TAMRA) , etc. conhecidas pelo perito na especialidade, para efeitos de reacções de amplificação e hibridização em PCR Multiplex. Desta forma, fluoróforos adequados no âmbito da presente invenção são, por exemplo os compostos conhecidos por Alexa Fluor, FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Os nucleótidos referem-se a nucleótidos de origem natural ou sintética, com a capacidade de hibridização por emparelhamento de bases com nucleótidos complementares, podendo incluir, sem limitação, DNA, RNA, assim como análogos de nucleótidos (por exemplo ácidos nucleicos com conformação fechada, conhecidos por "locked nucleic acids" - LNA) ou nucleótidos sem ligações inter- nucleotídicas do tipo fosfodiéster (por exemplo ácidos nucleicos peptídicos - PNAs ) ou ácidos nucleicos com ligações tiodiester, ou outros similares para o mesmo efeito. As composições para ampliação e hibridização de ADN (composições para PCR) foram preparadas pela adição de soluções reagente para PCR, disponíveis no mercado, com diferentes nucleótidos com as sequências SEQ ID Nr .1 a SEQ ID nr.6 em diferentes concentrações, e com água bi-destilada e água bi-desionisada .

As soluções reagente para PCR a utilizar variam com o tipo de reacção de amplificação desejada. Exemplos de soluções reagente para PCR adequadas para a realização da presente invenção são por exemplo a solução "TaqMan® Universal PCR Master Mix" da empresa Thermofi scher Scientific ou soluções similares para efeitos de amplificação e hibridização de ADN.

As concentrações das sondas referem-se à concentração molar na solução, correspondendo ao número de moles de cada sonda por volume da solução, em que nanoMolar (nM) corresponde a lxlCT ⁹ moles por Litro .

As composições para PCR foram preparadas compreendendo várias combinações de diferentes concentrações das sondas com as sequências SEQ ID nr .3 a SEQ ID nr.6. Como mencionado anteriormente, as sondas, cujas sequências se encontram definidas por SEQ ID nr .3 e SEQ ID nr .4 foram concebidas para a detecção específica da mutação c-124 c>t no promotor do gene Htert, enquanto as sondas com as SEQ ID nr .5 e SEQ ID nr.6 foram concebidas para a detecção específica da mutação c-146 c>t no promotor do gene Htert.

Assim, as composições para PCR da invenção podem compreender apenas um ou os dois conjuntos de sondas acima mencionados, i.e. as composições para PCR da invenção podem compreender apenas as sondas com SEQ ID nr . 3 e SEQ ID nr .4 (conjunto C-124), as sondas com as sondas com as SEQ ID nr .5 e SEQ ID nr.6 (conjunto C-146) ou com todas as sondas com as SEQ ID nr .3 a SEQ ID nr.6 (conjuntos C-124 + conjunto C-146) .

Nos casos em que as composições da invenção compreendem apenas um conjunto de sondas, conjunto C-124 ou conjunto C-146, então são específicas para a detecção apenas da respectiva mutação c-124 c>t ou c-146 c>t. No caso em que os dois conjuntos de sondas estão presentes nas composições para PCR, então essas composições são específicas para detecção de ambas as mutações c-124 c>t e c-146 Ot .

A concentração das sondas de nucleótidos da presente invenção é ajustada nas soluções para PCR, de forma a promover a sensibilidade do método da invenção na detecção das referidas mutações. Preferencialmente, a concentração final de cada sonda é ajustada para valores de 400 a 1600nM, mais preferivelmente numa concentração final com valores de 800 a 1600nM e ainda numa realização preferida da invenção os valores da concentração final de cada sonda é de aproximadamente a 1600nM.

Desta forma, é possível obter composições para PCR que compreendem as diferentes combinações de valores de concentração final de cada uma das sondas definidas pelas SEQ ID nr.3 a SEQ ID nr .6.

Assim, de uma forma preferencial, as composições para PCR compreendem as seguintes concentrações das sondas com as SEQ ID nr .3 a SEQ ID nr .6 : i) de 250nM a 500nM de SEQ ID nr.3, de 400nM a 1600nM de SEQ ID nr.4, de 250nM a 500nM de SEQ ID nr .5 e de 400nM a 1600nM de SEQ ID nr .6, ou ii) de 250nM a 500nM de SEQ ID nr.3, de 800nM a 1600nM de SEQ ID nr.4, de 250nM a 500nM de SEQ ID nr .5 e de 800nM a 1600nM de SEQ ID nr.6.

As composições das misturas de reacção para detecção das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert foram preparadas pela adição de ADN da amostra biológica a testar às composições para PCR acima mencionadas.

O ADN a testar pode ser obtido a partir de tecido, urina, circulante, germinativo, ou de outras fontes biológicas utilizando métodos comuns conhecidos na arte, tais como o QIAamp® comercializado pela empresa Qiagen ou métodos similares. A quantidade de ADN a testar pode estar presente na composição para detecção das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert, em concentrações inferiores a 500ng, inferiores a lOOng, a 50ng e superiores a lng. O referido ajuste na concentração das sondas usadas tem como objectivo potenciar a sensibilidade analítica do método da presente invenção, inferida pelo número mínimo de alelos mutantes (ADN-MUT) detectados relativamente ao número de alelos "wild-type" (ADN-WT) . Supõe-se que o aumento a sensibilidade analítica resulta do incremento das concentrações de sondas utilizadas na reacção através do favorecimento da amplificação do alelo mutado.

Simultaneamente foi reduzida a eficácia de amplificação e hibridização do alelo "wild-type" como forma de manter tanto quanto possível o balanço da reacção em favor da amplificação do alelo mutado .

Desta forma, foi possível desenvolver um método em que diferentes combinações de diferentes concentrações das sondas utilizadas dão origem a condições que potenciam a sensibilidade analítica e permitem detectar níveis muito baixos de alelos mutantes.

Até certos níveis, este aumento na concentração de sondas mutadas não resulta na detecção inespecífica do alelo "Wild-Type", como é comprovado pela ausência de sinal das sondas -124T e -146T quando se utiliza apenas DNA-WT como amostra (Fig. 5 - painéis C e D) . Desta forma, tendo por base a manipulação das concentrações de sondas utilizadas, é possível calibrar a sensibilidade analítica do método enquanto é mantida a sua especificidade.

Em reflexo deste aumento da eficiência na detecção dos alelos mutados -124T e -146T, é possível incrementar significativamente a sensibilidade analítica do método, passando para valores mínimos de detecção a ser de 1,56% no caso do alelo -124T e a ser de 0,78% no caso do alelo -146T (Fig. 6 A e B, respectivamente) .

Desta forma, o método da presente invenção compreende os passos de: i) preparação de uma de uma composição para detecção de mutações c-124 c>t e/ou c-146 c>t no promotor do gene Htert, tal como descrito anteriormente, ii) pela promoção do contacto de ADN extraído de uma amostra biológica, a testar para a referida mutação, com uma composição para amplificação e hibridização por PCR igualmente como o descrito anteriormente, iii) amplificação e hibridação do ADN da amostra da composição para detecção de mutações c-124 c>t e/ou c-146 c>t no promotor do gene Htert através de reacção por PCR, PCR em Tempo Real ou PCR em Tempo Digital ou ainda em reacção PCR Multiplex, e iv) análise das curvas de amplificação assim obtidas.

A presença de mutação c-124 c>t e/ou c-146 c>t no promotor do gene Htert da amostra em análise é verificada pela existência de crescimento exponencial de um sinal de fluorescência, o que corresponde à positividade para a presença de pelo menos uma das referidas mutações.

O método da presente invenção é útil na detecção de quantidades vestigiais das mutações C.-1240T e C.-1460T em diversos fluidos biológicos, por exemplo urina, plasma, fluido cérebroespinal , citologias aspirativas, entre outros, tendo como entrada, ADN obtido destas diferentes fontes. Nestes exemplos, a vantagem é a de poder realizar uma determinação a partir de um tipo de amostra menos invasiva sem ter de recorrer à biópsia ou à cirurgia.

Pode ser aplicado na vigilância de doentes com cancro da bexiga, através de uma análise baseada em ADN obtido de uma amostra de urina. Esta aplicação tem como fundamento o facto de as mutações C.-1240T e C.-1460T serem altamente frequentes no cancro da bexiga e poderem ser detectadas em ADN derivado da urina (Fig.7) . Para os doentes que estão em vigilância clinica pois têm 50-70% de probabilidade de recorrência, a possibilidade de detectar recorrência por um teste de urina apresenta vantagens relativamente ao método convencional baseado na cistoscopia por ser totalmente não invasivo e muito mais cómodo para o doente.

O método da presente invenção pode ainda ser aplicado na detecção de outros tipos de cancro em que as mutações do gene TERT estão presentes e com outras finalidades clinicas. Um exemplo disso é através da análise de aspirados de agulha fina de nódulos da tiróide com a finalidade e fornecer informação prognóstica útil para decidir a necessidade de tratamento ablativo ou extensão de esvaziamento ganglionar.

Outro exemplo de aplicação da presente invenção relaciona-se com a detecção precoce, diagnóstico, prognóstico, detecção de recorrência ou previsão/monitorização da resposta à terapia, de tumores tais como gliomas e glioblastomas , carcinomas da bexiga, hepatocelular, tiróide, de células escamosas, das células basais, melanoma, entre outros . A presente invenção pode ainda ser útil na análise de tecido tumoral ou de ADN circulante no contexto da "biópsia liquida", para eventual selecção e tratamento de doentes candidatos, previsão da resposta ao tratamento e monitorização do respectivo tratamento com, por exemplo inibidores da Telomerase ou promotor do gene tert.

Breve descrição das figuras

Figura 1: Demonstração da capacidade do ensaio detectar a mutação TERTp c-124 OT.

Nesta figura pode verificar-se que o ensaio é especifico para a detecção dos alelos na posição -124. O desempenho do ensaio é confirmado pela realização de análises para detecção da mutação c- 124 OT em amostras de ADN heterozigóticas para a mutação c-124 OT (ADN HET124) e casos "wild-type" (ADN W ) . Os resultados mostram que a sonda especifica para o alelo mutado (Sonda -124T) gera um sinal na amostra de ADN HET-124 e não na amostra de ADN WT e que a sonda para o alelo "wild-type" (Sonda-124C) gera um sinal de amplificação em ambas as amostras.

1 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124C (alelo "wild- type") em ADN WT .

2- Curva de amplificação obtida com a sonda -124C (alelo "wild- type") em ADN HET-124.

3 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T (alelo mutante) em ADN HET-124.

4 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T (alelo mutante) em ADN WT .

Figura 2: Demonstração da capacidade do ensaio detectar a mutação TERTp c-146 OT

Nesta figura pode verificar-se que o ensaio é especifico para a detecção dos alelos na posição -146. O desempenho do ensaio na detecção da mutação c. -146 OT é confirmado pela análise de amostras de ADN heterozigóticas para a mutação c-146 OT (ADN HET146) e casos wild-type (ADN WT) . Os resultados mostram que a sonda especifica para o alelo mutado (Sonda -146T) gera um sinal na amostra de ADN HET-146 e não na amostra de ADN WT e que a sonda para o alelo "wild-type" (Sonda-146C) gera um sinal de amplificação em ambas as amostras .

1 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146C (alelo "wild- type") em ADN WT . 2 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T (alelo mutante) em ADN HET-146.

3- Curva de amplificação obtida com a sonda -146C (alelo "wild- type") em ADN HET-146.

4 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T (alelo mutante) em ADN W .

Figura 3: Avaliação da especificidade analítica dos ensaios:

(A) detecção específica da mutação TERTp c-124 OT

(B) detecção específica da mutação TERTp c-146 OT

Nesta figura pode verificar-se que o ensaio não apresenta reactividade cruzada entre as mutações interrogadas .

Fig. 3-A: uma amostra de ADN heterozigótica para a mutação TERTp - 1460T não é amplificada pela Sonda -124T e a única sonda a emitir fluorescência é de facto a Sonda-124C (que corresponde ao alelo "Wild-Type" na posição -124)

Fig. 3-B Por outro lado, uma amostra de ADN heterozigótica para a mutação TERTp -1240T não é amplificada pela Sonda -146T e a única sonda a emitir fluorescência é de facto a Sonda-146C (que corresponde ao alelo "Wild-Type" na posição -146) .

1 - Curva de amplificação obtida com a Sonda -124C (alelo "wild- type") em ADN HET-146.

2- Curva de amplificação obtida com a Sonda -124T (alelo mutante) em ADN HET-146.

3 - Curva de amplificação obtida com a Sonda -146C (alelo "wild- type") em ADN HET-124.

4 - Curva de amplificação obtida com a Sonda -146T (alelo mutante) em ADN HET-124.

Figura 4: Avaliação da sensibilidade analítica para detecção dos alelos -124T (A) e -146T (B) em condições que mimetizam amostras de DNA derivado de fluidos biológicos, em que existem quantidades reduzidas de alelos mutados num contexto global onde predominam alelos "wild-type". Foram utilizadas amostras de DNA com mutação C.-1240T ou amostras com a mutação C.-1460T "diluídas" sucessivamente em amostras de DNA "wild-type".

Nesta figura pode verificar-se a eficiência e sensibilidade do ensaio na detecção dos alelos mutados -124T e -146T.

1 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 50% de ADN MUT124/ADNWT .

2 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 25% de ADN MUT124/ADNWT .

3 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 12,5% de ADN MUT124/ADNWT .

4 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 6,25% de ADN MUT124/ADNWT . 5 - Curva de amplificação obtida 124T em 3, 125% de ADN MU 124/ADNW .

6 - Curva de amplificação obtida 146T em 50% de ADN MU 146/ADNW .

7 - Curva de amplificação obtida 146T em 25% de ADN MU 146/ADNW .

8 - Curva de amplificação obtida 146T em 12, 5% de ADN MU 146/ADNW .

9 - Curva de amplificação obtida 146T em 6,25% de ADN MU 146/ADNW .

Figura 5: Potenciação da sensibilidade analítica na detecção dos alelos -125T (A) e -146T (B) .

Foram utilizadas amostras de DNA com mutação C.-1240T ou amostras com a mutação C.-1460T "diluídas" sucessivamente em amostras de DNA "wild-type" numa proporção de 25% de DNA-MUT/DNA-WT .

É possível observar que, em condições de baixa concentração da sonda para o alelo "wild-type" (por exemplo 250nM) a utilização de uma maior concentração da sonda para os alelos mutados -124T e - 146T ( 400-800- 1600nM) resulta num aumento significativo do sinal de detecção dos alelos mutados (Fig. 5 painéis A e B, respectivamente) .

Nos painéis C e D desta figura pode verificar-se que até certos níveis, o aumento na concentração de sondas mutadas não resulta na detecção inespecífica do alelo "Wild-Type", como é comprovado pela ausência de sinal das sondas -124T e -146T quando se utiliza apenas DNA-WT como amostra.

1 - Curva de amplificação da sonda -124T (mutante) usada à concentração de 400nM.

2 - Curva de amplificação da sonda -124C (wild-type) usada concentração de 250nM.

3 - Curva de amplificação da sonda -124T (mutante) usada concentração de 800nM.

4 - Curva de amplificação da sonda -124C (wild-type) usada concentração de 250nM.

5 - Curva de amplificação da sonda -124T (mutante) usada concentração de 1600nM.

6 - Curva de amplificação da sonda -124C (wild-type) usada concentração de 250nM.

7 - Curva de amplificação da sonda -146T (mutante) usada concentração de 400nM. 8 - Curva de amplificação da sonda -146C (wild-type) usada à concentração de 250nM.

9 - Curva de amplificação da sonda -146T (mutante) usada à concentração de 800nM.

10 - Curva de amplificação da sonda -146C (wild-type) usada à concentração de 250nM.

11 - Curva de amplificação da sonda -146T (mutante) usada à concentração de 1600nM.

12 - Curva de amplificação da sonda -146C ("wild-type") usada à concentração de 250nM.

13 - Curva de amplificação da sonda -124T (mutante) usada à concentração de 1600nM.

14 - Curva de amplificação da sonda -124C ("wild-type") usada à concentração de 250nM.

15 - Curva de amplificação da sonda -1246T (mutante) usada à concentração de 400nM.

16 - Curva de amplificação da sonda -146C ("wild-type") usada à concentração de 250nM.

Figura 6: Avaliação da sensibilidade analítica para detecção dos alelos -124T (A) e -146T (B) quando se aumenta a concentração da sonda para o alelo mutado e se reduz a concentração de sonda utilizada para o alelo "wild-type". Esta alteração na composição relativa de sondas resulta num aumento da sensibilidade analítica. Nesta figura pode verificar-se o aumento da eficiência e sensibilidade na detecção dos alelos mutados -124T e -146T: os valores mínimos de detecção passaram a ser de 1,56% no caso do alelo -124T e de 0,78% no caso do alelo -146T) .

1 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 25% de ADN MU 124/ADNW .

2 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 12,5% de ADN MU 124/ADNW .

3 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 6,25% de ADN MU 124/ADNW .

4 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 3,125% de ADN MU 124/ADNW .

5 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T em 1,56% de ADN MU 124/ADNW .

6 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 50% de ADN MU 146/ADNW .

7 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 25% de ADN MU 146/ADNW . 8 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 12,5% de ADN MU 146/ADNW .

9 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 6,25% de ADN MU 146/ADNW .

10 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 3,125% de ADN MU 146/ADNW .

11 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 1,56% de ADN MUT 124 /ADNWT .

12 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T em 0,78% de ADN MUT 146/ADNWT .

Figura 7: Demonstração da capacidade do ensaio detectar as mutações TERTp C.-124 OT e c—1460T em amostras de urina de doentes com cancro da bexiga. Nesta figura pode verificar-se a detecção da mutação c-124 OT ou da mutação c-146 OT em amostras de urina. Os resultados mostram que, neste tipo de amostras, obtidas de doentes com cancro da bexiga, são detectados os alelos mutados para a mutação -124 (A) ou para a mutação -146 (B) , assim como sinais para os correspondentes alelos "wild-type".

1 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124C (alelo "wild- type") em ADN obtido de uma amostra de urina de um doente com cancro da bexiga.

2 - Curva de amplificação obtida com a sonda -124T (alelo mutante) em ADN obtido de uma amostra de urina de um doente com cancro da bexiga .

3 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146C (alelo "wild- type") em ADN obtido de uma amostra de urina de um doente com cancro da bexiga.

4 - Curva de amplificação obtida com a sonda -146T (alelo mutante) em ADN obtido de uma amostra de urina de um doente com cancro da bexiga .

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Preparação das sequências de iniciadores e de sondas

Foram preparadas 2 sequências de iniciadores, SEQ ID nr .1 a SEQ ID nr.2, e outras 4 sequências de sondas, SEQ ID nr .3 a SEQ ID nr .6 da seguinte forma:

As sequências acima indicadas foram preparadas pelo método de síntese de nucleótidos em fase sólida utilizando fosforamidites de nucleosídeos . A síntese foi realizada em colunas coluna empacadas com o suporte sólido funcionalizado com a primeira base da extremidade 3' de cada oligonucleótido . A preparação de cada oligonucleótido seguiu depois um conjunto de ciclos de síntese, cada um composto por quatro reacções químicas: desbloqueio (destritilação) ; acoplamento; protecção e Oxidação. Em cada ciclo foram adicionados, passo a passo, no terminal 5' da cadeia em crescimento, os resíduos de nucleótidos correspondentes à sequência dese ada .

A concentração das sondas foi ajustada para valores de 400 a 1600nM através de diluição da preparação liofilizada em água bi-destilada e água bi-desionisada .

Exemplo 2 - Preparação das composições de reacção PCR

Foram preparadas várias composições de reacção PCR compreendendo uma mistura nucleótidos de acordo com as sequências SEQ ID nr .1 a SEQ ID nr.6, em diferentes concentrações (como por ex . 400nM, 800nM, 1600nM), e tal como o descrito a seguir. Para efeitos comparativos foram também preparadas soluções com concentração alternativa da sonda para o alelo "wild-type" (por exemplo, 250nM, 500nM) .

I - Composições para detecção da mutação localizada a -124 bases a montante do codão de iniciação ATG do gene hTERT

Composição inventiva Ia:

^■ Solução reagente para PCR em Tempo-Real "TaqMan® Universal PCR Master Mix" à concentração de IX;

^■ Oligonucleótido com a sequência: SEQ ID nr . 1, a uma concentração de 900nM;

^■ Oligonucleótido com a sequência: SEQ ID nr . 2, a uma concentração de 900 nM;

^■ Sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 3, a uma concentração de 250nM, contendo modificações, como por exemplo o composto conhecido por YAKIMA YELLOW® e tetra- metil-rodamina (TAMRA) nas extremidades 5' e 3', respectivamente ;

^■ Sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 4, a uma concentração de 1600nM, contendo modificações, como por exemplo 6-carboxi-fluoresceina (6-FAM) e tetra-metil-rodamina (TAMRA) nas extremidades 5' e 3', respectivamente;

Água bi-destilada e bi-desionisada .

Composição inventiva Ib:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Ia estando contudo a sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 4, presente numa concentração de 800nM.

Composição inventiva Ic:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Ia estando contudo a sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 4, presente numa concentração de 400nM.

Composição comparativa Id:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Ia estando contudo a sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 3, presente numa concentração de 500nM.

II - Composições para detecção da mutação localizada a -146 bases a montante do codão de iniciação ATG do gene hTERT

Composição inventiva lia:

Solução reagente para PCR em Tempo-Real "TaqMan® Universal PCR Master Mix" à concentração de IX;

Oligonucleótido com a sequência: SEQ ID nr . 1 uma concentração final de de 900nM;

Oligonucleótido com a sequência: SEQ ID nr . 2 uma concentração de 900 nM;

Sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 5, uma concentração de 250nM, contendo modificações, nas extremidades 5' e 3' ;

Sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 6, uma concentração de 1600nM, contendo modificações nas extremidades 5' e 3' ;

Água bi-destilada e bi-desionisada; As modificações mencionadas nas extremidades 5' e 3' das sequências das sondas são as modificações correspondes à adição dos fluoróforos (FAM, Yakima yellow) e quencher (TAMRA) , etc. conhecidas pelo perito na especialidade.

Composição inventiva Ilb:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição I estando contudo a sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ nr . 6, presente numa concentração de 800nM.

Composição inventiva IIc:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição I estando contudo a sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ nr . 6, presente numa concentração de 400nM.

Composição comparativa Ild:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição estando contudo a sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ nr . 5, presente numa concentração de 500nM.

III- Composições para detecção simultânea daas mutações localizada a -124 e a -146 bases a montante do codão de iniciação ATG do gene hTERT:

Composição inventiva Illa:

^■ Solução reagente para PCR em Tempo-Real "TaqMan® Universal PCR Master Mix" à concentração de IX;

^■ Oligonucleótido com a sequência: SEQ ID nr . 1 a uma concentração final de de 900nM;

^■ Oligonucleótido com a sequência: SEQ ID nr . 2 a uma concentração de 900 nM;

^■ Sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 3, a uma concentração de 250nM, contendo modificações nas extremidades 5 ' e 3 ' ;

^■ Sonda oligonucleotidica com a sequência: SEQ ID nr . 4, a uma concentração de 1600nM, contendo modificações nas extremidades 5' e 3' ; Sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 5, a uma concentração de 250nM, contendo modificações, nas extremidades 5' e 3' ;

Sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 6, a uma concentração de 1600nM, contendo modificações nas extremidades 5' e 3' ;

Água bi-destilada e bi-desionisada;

Composição inventiva Illb:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Illa estando contudo a sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 4, presente numa concentração de 800nM.

Composição inventiva IIIc:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Illa estando contudo a sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 4, presente numa concentração de 400nM.

Composição inventiva Illd:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Illa estando contudo a sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 6, presente numa concentração de 800nM.

Composição inventiva Ille:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Illa estando contudo a sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 6, presente numa concentração de 400nM.

Composição comparativa III f :

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Ia estando contudo a sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 3, presente numa concentração de 500nM.

Composição comparativa Illg:

Esta composição foi preparada de forma semelhante à composição Ia estando contudo a sonda oligonucleotídica com a sequência: SEQ ID nr . 5, presente numa concentração de 500nM. Exemplo 3 - Preparação das composições para detecção de mutações

As composições das misturas de reacção para detecção das mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert foram preparadas pela adição de ADN da amostra biológica a testar, cerca de lOOng de ADN, (podendo ser utilizado uma quantidade menor, por exemplo de 1 ng até 500ng) às composições para PCR acima mencionadas, sendo a concentração das sondas, com as sequências SEQ ID nr.3 a SEQ ID nr.6, ajustada para valores de 400 a 1600nM, tal como descrito no exemplo anterior. As composições para detecção foram assim preparadas com amostras de ADN com mutação C.-1240T ou amostras com a mutação C.-1460T "diluídas" sucessivamente em amostras de ADN "wild-type".

Da mesma forma foram preparadas composições para detecção para efeitos comparativos, através da adição de ADN da amostra biológica a testar a soluções comparativas do exemplo anterior.

Exemplo 4 - Método para detecção de mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert

Para realização do método da presente invenção foram preparadas diversas composições para detecção de mutações de acordo com o descrito no exemplo anterior.

Neste exemplo foi utilizado ADN de linhas celulares ou ADN de tecido tumoral, fresco ou fixado em formol e embebido em parafina.

As composições de detecção do exemplo anterior foram submetidas a processos de amplificação e hibridização em PCR em Tempo Real e em PCR em Tempo Digital. As composições foram igualmente submetidas a ensaios em simultâneo (Multiplex) , usando-se na mesma reacção sondas para ambas as mutações em análise, sendo as sondas marcadas com fluoróforos distintos. Entre os fluoróforos mais comuns encontram-se os compostos conhecidos por Alexa Fluor, FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5. Para realização do método em PCR em Tempo Real foi utilizado o aparelho ABI Prism® 7500 Fast comercializado pela empresa ThermoFi scher Scientific.

Condições de amplificação e hibridização : I ^a fase: 1 ciclo de 10 minutos a 95°C

2 ^a fase: 45 ciclos compreendendo 30 segundos a 92°C, 1 minuto a 60°C, com descida da temperatura de 0,2°C por ciclo a partir do ciclo 25

3 ^a fase: 1 ciclo de 1 minuto a 57°C, com aquisição de sinal

Exemplo 5 - Método para detecção de mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert numa amostra de urina

Foram obtidas amostras de urina de doentes com cancro da bexiga ou de doentes em programas de vigilância clinica (por cistoscopia) para a eventual recorrência do tumor. A urina foi centrifugada a uma força superior a 1000 vezes a força gravitacional (1000G) durante um intervalo de tempo superior a 5 minutos, por forma a sedimentar as células escamadas do epitélio da bexiga presentes na urina. A partir das células sedimentadas foi obtido ADN utilizando métodos comuns conhecidos na arte, tais como o QIAamp® comercializado pela empresa Qiagen ou métodos similares. Entre 1 e 500ng do ADN assim obtido foram adicionadas às composições de amplificação para detecção de mutações preparadas de acordo com o descrito nos exemplos 1, 2 e 3.

As composições de detecção do exemplo 3 foram submetidas a processos de amplificação e hibridização em PCR em Tempo Real e em PCR em Tempo Digital. As composições foram igualmente submetidas a ensaios em simultâneo (Multiplex) , usando-se na mesma reacção sondas para ambas as mutações em análise, sendo as sondas marcadas com fluoróforos distintos. Entre os fluoróforos mais comuns encontram-se os compostos conhecidos por Alexa Fluor, FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Para realização do método em PCR em Tempo Real foi utilizado o aparelho ABI Prism® 7500 Fast comercializado pela empresa ThermoFi scher Scientific.

Condições de amplificação e hibridização: I ^a fase: 1 ciclo de 10 minutos a 95°C

2 ^a fase: 45 ciclos compreendendo 30 segundos a 92°C, 1 minuto a 60°C, com descida da temperatura de 0,2°C por ciclo a partir do ciclo 25

3 ^a fase: 1 ciclo de 1 minuto a 57°C, com aquisição de sinal

Utilizando este método, as mutações c-124 c>t e c-146 c>t no promotor do gene Htert foram detectadas tanto em doentes com cancro da bexiga, quer de baixo como de alto grau, assim como em doentes com recorrência do cancro da bexiga (Figura7) .

Em conclusão :

Foi verificada a especificidade das sondas, isto é, foi avaliado se as sondas para a mutação -1240T (Sondas com SEQ ID nr .3 e SEQ ID nr .4 ) não produzia amplificação numa amostra de ADN heterozigótica para a mutação -1460T (ADN MUT 146) e vice-versa (com sondas com SEQ ID nr .5 e SEQ ID nr.6) (Fig.3A e 3B) , ou seja verifica-se que não existem fenómenos de falsa detecção ou detecção cruzada entre as referidas sondas e as respectivas mutações.

Nas amostras de ADN derivado de fluidos biológicos, em que existem quantidades reduzidas de alelos mutados num ambiente onde predominam alelos "Wild-Type", a sensibilidade analítica das sondas -124T e -146T, numa concentração final de 400nM, na sua capacidade de detecção das respectivas mutações, é mantida até um limite de 3,125% no caso da Sonda -124T e 6,25% no caso da Sonda -146T (Figura 4-A e B, respectivamente), o que claramente demonstra a elevada eficácia das sondas para a detecção das respectivas mutações em condições de elevada diluição em alelos "wild-type" e, por isso, a ultra sensibilidade do método da presente invenção.

Em condições em que se utilizaram 25% de ADNMUT/ADNWT , é possível observar, que em condições de baixa concentração da sonda para o alelo "wild-type" (por exemplo 250nM) a utilização de uma maior concentração da sonda para os alelos mutados -124T e -146T (400- 800-1600nM) resulta num aumento significativo do sinal de detecção dos alelos mutados (Fig. 5 painéis A e B, respectivamente), o que claramente indica que através da manipulação da concentração das sondas é possível ajustar a sensibilidade do método da presente invenção para a detecção das mutações em causa.

Ao aumento da eficiência na detecção dos alelos mutados -124T e - 146T, correspondeu um aumento significativo da sensibilidade analítica do método da invenção, passando para valores mínimos de detecção de 1,56% no caso do alelo -124T e de 0,78% no caso do alelo -146T (Fig. 6 A e B, respectivamente), o que claramente indica que através da manipulação da concentração das sondas é possível potenciar a sensibilidade analítica do método da presente invenção para a detecção das mutações em causa, mantendo a sua especificidade .

Referências :

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Lisboa, 2 de maio de 2016