本発明は、アルカリ剤、界面活性剤、酵素� ��の少なくとも1つを含む低温溶液で真空浸透 することを特徴とする、絹糸腺内に外来タン パク質を含むトランスジェニックカイコが吐 糸した繭を生糸とする方法に関する。また本 発明は、遺伝子組換え生糸の製造方法に関す る。
 より具体的には本発明は、以下の工程を含� ��絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランス� ��ェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする� ��法に関する。また本発明は、以下の工程を� ��む遺伝子組換え生糸の製造方法に関する。
(a)絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランス ジェニックカイコが吐糸した繭を概ね80℃以� ��の条件下にて、真空条件下にて、又は常温� ��つ真空条件下にて乾燥させる工程、
(b)工程(a)の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、 又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬す る工程、
(c)工程(b)の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、 又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空 浸透する工程、
(d)工程(c)の繭を真空脱水する工程、
(e)工程(d)の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、 又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空 浸透する工程、
(f)工程(e)の繭を水に浸漬する工程、及び
(g)工程(f)の繭を低温(概ね50℃以下)の条件下� �繰糸する工程。

(1)トランスジェニックカイコが吐 糸した繭
 本発明ではまず、絹糸腺内に外来タンパク� ��を含むトランスジェニックカイコを取得す� ��。絹糸腺内に外来タンパク質を含むトラン� ��ジェニックカイコは、例えば、後部絹糸腺� ��異的に発現するタンパク質をコードするDNA( 例えば、フィブロインH鎖またはL鎖のタンパ� ��質をコードする遺伝子)に、外来タンパク質 をコードするDNAを繋ぎ、この融合遺伝子を有 するトランスジェニックカイコを作ることに よって取得することができる。当業者であれ ば、例えば以下の文献に開示された内容に従 い、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトラン スジェニックカイコを以下の文献に記載の公 知の手法によって製造、取得することが出来 るがこれらの方法に限定されない。
・ 特開2006-137739
・ WO2008/081922
・ Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T.,  Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.L., Ma uchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Pru dhomme, J.C., Couble, P., Toshiki, T., Chantal, T.,  Corinne, R., Toshio, K., Eappen, A., Mari, K., Natuo , K., Jean-Luc, T., Bernard, M., Gerard, C., Paul,  S., Malcolm, F., Jean-Claude, P. and Pierre, C. (200 0) Germline transformation of the silkworm Bombyx mor i L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat� �Biotechnol, 18, 81-84
・ Tomita, M., Munetsuna, H., Sato, T., Adachi, T.,  Hino, R., Hayashi, M., Shimizu, K., Nakamura, N.,  Tamura, T. and Yoshizato, K. (2003) Transgenic silkwo rms produce recombinant human type III procollagen in  cocoons. Nat Biotechnol, 21, 52-56.
・ Yamao, M., Katayama, N., Nakazawa, H., Yamakawa,� �M., Hayashi, Y., Hara, S., Kamei, K. and Mori, H.� �(1999) Gene targeting in the silkworm by use of a� �baculovirus. Genes Dev, 13, 511-516.
・ Kojima K, Kuwana Y, Sezutsu H,Kobayashi I, Uchin o K, Tamura T, Tamada Y. 2007. New Method for Modi fication of Fibroin Heavy Chain Protein in Transgenic  Silkworm. Biosci BiotechnolBiochem.71, 2943-2951.
・ Kurihara H, Sezutsu H, Tamura T, YamadaK. 2007.� �Production of an active feline interferon in the co coonof transgenic silkworms using the fibroin H-chain� �expression system.Biochem. Biophys. Res. Commun. 355,� �976-980.
・ Tamura, T., Kuwabara, K., Uchino, K.,Kobayashi, I ., and Kanda,T. 2007 An Improved DNA Injection Metho d forSilkworm Eggs Drastically Increases the Efficienc y of ProducingTransgenic Silkworms. J. Insect Biotechn ol. Sericol.76,155-159.
・ Yanagisawa S, Zhu Z, Kobayashi I,Uchino K, Tamad a Y, Tamura T, Asakura T. 2007. Improving Cell-Adhes iveProperties of Recombinant Bombyx mori Silk by Inco rporation of Collagen or Fibronectin Derived Peptides� �Produced by Transgenic Silkworms. Biomacromolecules8(11 ), 3487-3492.等

 本発明のトランスジェニックカイコは、絹� ��腺内に外来タンパク質を有する。絹糸線内� ��含まれる外来タンパク質としては、例えばC FP、GFP、YFP、DsRed、KO、KikGr、Kaede、Dronpa等の� �光・色素タンパク質、コラーゲンやフィブ� �ネクチン、細胞の成長因子等の細胞付着活� �を有するタンパク質、アスパラギン酸、グ� �タミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジ� �等の酸性及びアルカリ性のアミノ酸を主と� �るペプチド、クモやヤママユガ、真珠貝等� �イコ以外の生物由来のフィブロインタンパ� �質及びセリシンタンパク質及びその一次構� �に由来するペプチド等が挙げられるがこれ� �に限定されない。
 絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランス� ��ェニックカイコが取得されれば、当業者で� ��れば容易に当該カイコから繭を得ることが� ��来る。

(2)繭の乾燥
 本発明では、絹糸腺内に外来タンパク質を� ��むトランスジェニックカイコが吐糸した繭� ��概ね80度以下(例えば79度、78度、77度、76度� �75度、74度、73度、72度、71度が挙げられるが� ��れらに限定されない)の条件下で乾燥させる 。より好ましくは70度以下、さらに好ましく� ��60度以上70度以下(例えば61度、62度、63度、64 度、65度、66度、67度、68度、69度が挙げられ� �がこれらに限定されない)、特に好ましくは5 5度以上65度以下(例えば56度、57度、58度、59度 、60度、61度、62度、63度、64度が挙げられる� �これらに限定されない)の条件下で繭を乾燥� ��せる。
 繭の乾燥は、熱風式乾燥機を使用して乾燥� ��せることが出来るほか、真空式乾燥機、マ� ��クロウェーブ(電磁波)を使用して行うこと� �出来る。
 繭を乾燥させる程度は、その品種や性状に� ��って異なるが、36-44%(例えば36%、37%、38%、39% 、40%、41%、42%、43%、44%が挙げられるがこれら に限定されない)の乾燥歩合が得られるまで� �燥させることが好ましい。あるいは、20~24時 間程度(例えば20時間、21時間、22時間、23時間 、24時間が挙げられるがこれらに限定されな� ��)乾燥させることが好ましい。乾燥歩合は、 当業者であれば繭の性状に応じて適切に決定 することが出来る。例えば「春嶺×鐘月」等� ��普通蚕繭では、42-43%の乾燥歩合が適切であ� ��が、繭層重の割に蛹重が重い場合はより小� ��い乾燥歩合を選択することが出来る(例えば 36-38%程度の乾燥歩合とすることが出来る)。� �お本発明においては、繭の乾燥は一定温度� �条件下で行うことが好ましい。

 また本発明では、絹糸腺内に外来タンパク� ��を含むトランスジェニックカイコが吐糸し� ��繭を概ね80度以下の条件下で乾燥させる代� �りに、真空条件下、又は常温かつ真空条件� �で乾燥させることも可能である。80度以下、 真空条件下、あるいは常温かつ真空条件下で の乾燥は、上述とおり、熱風式乾燥機を使用 して乾燥させることが出来るほか、真空式乾 燥機、マイクロウェーブ(電磁波)を使用して� ��うことも出来る。例えば、繭を60℃の一定� �度で乾燥させる場合、図1に示すように、24� �間程度の時間をかけることにより、約45%の� �燥歩合にもっていくことが出来る。このよ� �にして得られる繭は、黴が生えることなく� �存が可能となる。
 なおこのような方法で繭を乾燥させる場合� ��蛹から出た水分を早く乾燥機の外へはき出� ��必要がある。乾燥機の中が湿気で満たされ� ��と繭糸の解れ(解じょ)が悪くなるためであ� �。真空条件下で乾燥する場合、温度をかけ� �がら真空にすることにより、熱風のみによ� �て乾燥させる場合に比べ、効率よく乾燥さ� �ることが出来る。

(3)アルカリ剤、界面活性剤、酵素 等を含む溶液への浸漬
 本発明では、繭をアルカリ剤、界面活性剤� ��酵素等の少なくとも1つを含む溶液に浸漬す る。より好ましくは、繭をアルカリ剤及び界 面活性剤を含む溶液、又は酵素及び界面活性 剤を含む溶液に浸漬する。

 本発明のアルカリ剤としては、炭酸ナト� ��ウム及び炭酸水素ナトリウムが挙げられる� ��これらに限定されない。

 また本発明の界面活性剤としてはノニオン� ��界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチ� ��ン系界面活性剤、及び両性界面活性剤が挙� ��られるがこれらに限定されない。
 ノニオン系界面活性剤としては、例えばポ� ��オキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸� ��ルビタンエステル、アルキルポリグルコシ� ��、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモ� ��グリセリルエーテルなどが挙げられるがこ� ��らに限定されない。
 アニオン系界面活性剤としては、例えば脂� ��酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩、アル� ��ルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベ� ��ゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩� ��どが挙げられるがこれらに限定されない。
 カチオン系界面活性剤としては、例えばア� ��キルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキ� ��ジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジ� ��ジメチルアンモニウム塩などが挙げられる� ��これらに限定されない。
 両性系界面活性剤としては、例えばアルキ� ��ジメチルアミンオキシド、アルキルカルボ� ��シベタインなどが挙げられるがこれらに限� ��されない。

 また本発明の酵素としてはタンパク質分� ��酵素が挙げられるがこれに限定されない。� ��ンパク質分解酵素としては、例えばセリン� ��ロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ� ��システインプロテアーゼ、金属プロテアー� ��、パパイン酵素、アルカラーゼなどが挙げ� ��れるがこれらに限定されない。

 浸漬処理は、例えば以下のようにして行う� ��とが出来るが、これに限定されない。金属� ��の網籠へ入れた繭を例えば炭酸ナトリウム0 .15%、ノニオン系界面活性剤0.3%混合溶液(処理 水)へ20分浸漬する。これにより、繭層表面に 水分が浸み込む状態とすることが出来る。炭 酸ナトリウム、界面活性剤の濃度、及び処理 時間は、当業者であれば繭の性状によって適 宜調整することが出来る。
 なお本発明においては、酵素及び界面活性� ��を含む溶液がより好ましい。酵素及び界面� ��性剤の組み合わせとしては、本明細書に記� ��の酵素及び界面活性剤より特定可能なあら� ��る組み合わせが含まれる。

(4)アルカリ剤、界面活性剤、酵素 等を含む溶液中での真空浸透
 本発明では繭を、アルカリ剤、界面活性剤� ��酵素の少なくとも1つを含む溶液中で真空浸 透する。より好ましくは、繭をアルカリ剤及 び界面活性剤を含む溶液、又は酵素及び界面 活性剤を含む溶液に浸漬する。アルカリ剤、 界面活性剤、酵素としては、上述のものが挙 げられる。
 真空浸透処理(減圧浸透処理)は、例えば以� �の方法により行うことが出来る。浸漬処理� �た繭を処理水へ入れたまま真空装置へ移動� �、真空とする。真空度は-620mmHg程度(例えば-6 40mmHg~-600mmHg、より好ましくは-630mmHg~-610mmHg程� ��)が適当であるがこれに限定されない。真空 度が例えば-620mmHgに到達した時点で、5分~10分 かけて常圧まで復圧する。こうすることによ り、繭腔内外の圧力差により処理水が徐々に 繭層内へ浸透する。このときに急激に復圧す ると一気に処理水が繭腔内へ入ろうとするた め、繭が圧力差により潰れる場合がある。ま た処理水が繭層の薄い部分や繭層通り易い部 分を通るため、均一な煮繭ができない場合が ある。従って、急激な復圧は避けるべきであ る。当業者であれば、繭の性状に応じて適切 な復圧時間を設定することが出来る。
 なお本発明においては、アルカリ剤及び界� ��活性剤を含む溶液で前述の浸漬処理を行っ� ��場合、真空浸透処理もアルカリ剤及び界面� ��性剤を含む溶液で行うことが好ましい。ま� ��酵素及び界面活性剤を含む溶液で前述の浸� ��処理を行った場合、真空浸透処理も酵素及� ��界面活性剤を含む溶液で行うことが好まし� ��。
 また本発明において真空とは、絶対真空に� ��定されず、減圧も含む。

(5)真空脱水
 本発明では、アルカリ剤、界面活性剤、酵� ��の少なくとも1つを含む溶液中で真空浸透し た繭を真空中で脱水する。真空脱水の方法は 特に限定されるものではないが、例えば以下 の方法により繭を真空中で脱水することが出 来る。真空浸透処理した繭を処理水から引き 上げ、真空装置で真空処理を行う。真空度は 上記と同様-620mmHg程度(例えば-640mmHg~-600mmHg、� ��り好ましくは-630mmHg~-610mmHgが挙げられるが� �れらに限定されない)とすることが好ましい� ��これに限定されない。この真空処理は、例� ��ば5分~10分かけるなど、徐々に行うことが好 ましい。徐々に真空処理を行うことにより繭 腔内の処理水を徐々に繭層の外に排出するこ とが出来る。急激に真空処理を行うと、溶液 が繭層の薄い所や、処理水の通り易い所を通 るため、均一な煮繭処理ができない場合があ る。

(6)アルカリ剤、界面活性剤、酵素 等を含む溶液中での真空浸透
 本発明では真空中で脱水した繭に対して、� ��度、アルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素� ��び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透処理� ��行う。真空浸透処理は、例えば上述の方法� ��よって行うことが出来るがこの方法に限定� ��れない。
 真空浸透と真空脱水を繰り返すことにより� ��繭糸の解離性を増すことができる。一方、� ��空浸透と真空脱水を繰り返すことにより上� ��糸が増加し、生糸量歩合が減少するなどの� ��害も生ずる。従って、真空浸透と真空脱水� ��回数は繭特性により調整することが肝要で� ��る。例えば、真空浸透、真空脱水、真空浸� ��のサイクルを1回あるいは2回繰り返しとす� �ことが出来る。
 なおこの処理も、上記(4)と同様、真空処理� ��よって繭腔内へ処理水を浸透させる時には� ��真空状態から常圧への復圧は時間をかけて� ��々に行うことが好ましい。逆に真空処理に� ��って繭腔内の処理水を繭腔外へ排出する時� ��は、時間をかけて真空状態へ移行すること� ��好ましい。煮繭処理においては、繭層の繭� ��の膠着部位のセリシンを徐々に膨潤軟和さ� ��ることが重要である。本発明においては、� ��ルカリ剤や酵素等がセリシンの膨潤軟和の� ��目を担い、界面活性剤が繭層繭糸の膠着部� ��への浸透の役目を担う。
 なお、アルカリ剤及び界面活性剤を含む溶� ��で前述の浸漬処理や真空浸透処理を行った� ��合、再度の真空浸透処理もアルカリ剤及び� ��面活性剤を含む溶液で行うことが好ましい� ��また酵素及び界面活性剤を含む溶液で前述� ��浸漬処理や真空浸透処理を行った場合、再� ��の真空浸透処理も酵素及び界面活性剤を含� ��溶液で行うことが好ましい。

(7)繭の水への浸漬
 本発明の方法では次に、繭を水に浸漬する� ��(6)までの煮繭処理により得られた繭は、そ� ��表面がアルカリで覆われている。そのまま� ��置しておくと、繭層表面に付着しているア� ��カリによりセリシンが膨潤する傾向となり� ��緒糸が多くなる。そのため、常温水に浸漬� ��、繭層表面のセリシンを収斂させる必要が� ��る。繭の水への浸漬は、繭層表面に付着し� ��いるアルカリがとれ、繭層表面のセリシン� ��収斂するまで(例えば10分から20分程度)行う� ��

(8)繰糸
 本発明では、60℃以下の条件下で繰糸を行� �。より好ましくは50度以下、より好ましくは 35度から45度の条件下(例えば35度、36度、37度� ��38度、39度、40度、41度、42度、43度、44度、45 度が挙げられるがこれらに限定されない)で� �糸を行う。繰糸は自動繰糸機、多条繰糸機� �しくは座繰器により行うことが出来る。
 繰糸は、上記方法により繭層セリシンを膨� ��軟和させた繭から繭糸を引き出し、それを� ��本、セリシンで抱合させながら1本の生糸と するものである。繰糸に先立ち、概ね80℃以� ��の温湯内で索緒箒(稲穂を束ねたもの)で、� �の表面をこすり、数本の繭糸を引き出した(� ��緒と称す)後に、1本の糸口になるまで、更� �引き出して正緒とする(抄緒と称す)。その繭 (正緒繭)から引き出した繭糸を目的の太さに� ��るように数本合わせ集緒器(例えば陶器等で 作られたもので、ボタン形状でその中心に細 い孔の開いたもの)を通過した生糸を、集緒� �上に設けられた二つの鼓車で再び集緒器近� �に戻し、集緒器から上がってきたばかりの� �条と縒り合わせて(ケンネル縒りと称す)小枠 に巻き取る。座繰器、多条繰糸機は目的繊度 にあうように一定の繭数で繰糸を行い(定粒� �)、自動繰糸機では繊度感知器により一定の� ��さとなるように繊度制御を行う(定繊式)。� �糸については、文献(総合蚕糸学 日本蚕糸� �会編 P.358-369. 1979.、日本製糸技術史 加藤� �一著 P.59-144. 1976.)も参照される。

 また本発明は、以下(a)から(g)の工程を含む� ��糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジ� ��ニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方� ��を提供する。また以下(a)から(g)の工程を含� ��遺伝子組換え生糸の製造方法を提供する。
(a)絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランス ジェニックカイコが吐糸した繭を概ね80℃以� ��の条件下にて、真空条件下にて、又は常温� ��つ真空条件下にて乾燥させる工程、
(b)工程(a)の繭を低温湯水(概ね80℃以下)に浸� �する工程、
(c)工程(b)の繭を低温湯水中(概ね80℃以下)で� �空浸透する工程、
(d)工程(c)の繭を真空脱水する工程、
(e)工程(d)の繭を低温湯水中(概ね80℃以下)で� �空浸透する工程、
(f)工程(e)の繭を水に浸漬する工程、及び
(g)工程(f)の繭を低温(概ね50℃以下)の条件下� �繰糸する工程。

 上記方法においてトランスジェニックカイ� ��の繭の取得、繭の乾燥、繭の低温湯水への� ��漬、繭の真空浸透、繭の真空脱水、繭の水� ��の浸漬、繭の繰糸は上述の方法によって行� ��ことが出来る。
 本発明においては、80度以下(例えば79度、78 度、77度、76度、75度、74度、73度、72度、71度� ��挙げられるがこれらに限定されない)の低温 湯水、より好ましくは70度以下(例えば69度、6 8度、67度、66度、65度、64度、63度、62度、61度 が挙げられるがこれらに限定されない)の低� �湯水、さらに好ましくは55度以上60度以下(例 えば56度、57度、58度、59度が挙げられるがこ� ��らに限定されない)の低温湯水が用いられる 。

 また本発明は、上記方法によって得られ� ��生糸を提供する。さらに本発明は当該生糸� ��ら得られる編み物及び織物を提供する。加� ��て本発明は、当該生糸から得られる立体構� ��物を提供する。本発明の立体構造物の例と� ��てはランプシェード、ワンピース・ジャケ� ��ト・ショール等の洋装品、着物、帯、洋服� ��パネル、壁紙、椅子のシート、名刺、本の� ��装等が挙げられるがこれに限定されない。� ��ンプシェード、ワンピース・ジャケット・� ��ョール等の洋装品、着物、帯、洋服、パネ� ��、壁紙、椅子のシート、名刺、本の表装等� ��周知の方法によって作成することが出来る� ��

 さらに本発明は、本発明の方法によって得� ��れる生糸から作成される医療用資材を提供� ��る。医療用資材としては手術用縫合糸、人� ��血管、人工皮膚、人工腱、人工骨、角膜培� ��のフィルム等が挙げられるがこれらに限定� ��れない。本発明の生糸の医療用資材用に使� ��するための加工等は、当業者に公知の方法� ��よって行うことが出来る。
 なお本明細書において引用された全ての先� ��技術文献は、参照として本明細書に組み入� ��られる。