ZHANG QINZHOU (CN)
WO2000073326A2 | 2000-12-07 |
上海精晟知识产权代理有限公司 (CN)
权 利 要 求 书 -WO 2014/190665- -PCT/CN2013/086071- 1. 一种将多肽稳定为 alpha螺旋二级结构的方法, 其特征在于, 该方法包括如下步骤: ( 1 ) 将多肽的氨基端连接非天然氨基酸, 并乙酰化封尾; (2)将步骤 (1 ) 的产物经过巯基-烯反应获得硫醚侧链修饰的多肽化合物, 该硫醚侧链 偶联氨基酸的位置为 i/i+4; (3)将硫醚侧链修饰的多肽化合物氧化, 获得 R型或 S型亚砜侧链修饰的多肽化合物; (4) 将步骤 (3) 的产物分离纯化, 获得 R型亚砜侧链修饰的多肽化合物。 2. 如权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 (1 ) 中的非天然氨基酸具有如下 结构式: 肌 ^HiTcooH ( I ), 其中 R6为氢或亚甲基, n为 1~6的正整数。 3. 如权利要求 1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤 (2) 中的巯基 -烯反应是先将步骤 ( 1 )的产物与半胱氨酸或半胱氨酸衍生物进行光聚合反应, 然后通过酰胺键的形成合成硫醚 则链修饰的多肽化合物。 4. 如下: 化合物 4 Α,Β两种异构体 权 利 要 求 书 WO 2014/190665 PCT/CN2013/086071— 5. 一种带有侧链修饰的多肽化合物, 其特征在于, 该多肽化合物具有如下结构式: ( II ) , 其中, 和 各自独立地为氢或甲基, R2〜R4各自独立地为氨基酸残基, n为 1~6的 正整数, 亚砜的构型为 R。 6. 如权利要求 5所述的多肽化合物, 其特征在于, 所述多肽的长度不大于 20个氨基酸。 7. 如权利要求 5所述的多肽化合物, 其特征在于, 所述 n为 3或 4。 8. 如权利要求 5所述的多肽化合物的制备方法, 其特征在于, 该方法包括如下步骤: ( i )将多肽的氨基端连接非天然氨基酸, 并乙酰化封尾, 所述非天然氨基酸具有如下 结构式: ^HiTcooH ( I ), 其中 R6为氢或亚甲基, n为 1~6的正整数; ( ϋ ) 将步骤 ( i ) 的产物经过巯基-烯反应获得硫醚侧链修饰的多肽化合物, 该侧链 偶联氨基酸的位置为 i/i+4; ( iii)将硫醚侧链修饰的多肽化合物氧化,获得 R型或 S型亚砜侧链修饰的多肽化合物; ( iv ) 将步骤 (iii) 的产物分离纯化, 获得 R型亚砜侧链修饰的多肽化合物。 9. 如权利要求 8所述的多肽化合物的制备方法, 其特征在于, 所述步骤(ii ) 中的巯基 -烯反应是先将步骤( i ) 的产物与半胱氨酸或半胱氨酸衍生物进行光聚合反应, 然后通过酰 胺键的形成合成硫醚侧链修饰的多肽化合物。 10. 如权利要求 8所述的多肽化合物的制备方法, 其特征在于, 所述步骤 (ii ) 和步骤 权 利 要 求 书 -WO 2014/190665- PCT/CN2013/086071- (iii) 的反应式如下: 化合物 4 Α,Β两种异构体 |
技术领域
本发明属于多肽结构稳定技术领域。 更具体地说, 本发明涉及一种通过构建侧链来稳定 多肽 alpha螺旋的方法以及由该方法构建的带有侧链 饰的多肽化合物。 背景技术
研究发现: 在一个蛋白质中真正起到结合作用的往往只有 很小的一段序列, 而其他部分 往往是为了达到这一序列的结构专一性而存在 的。 alpha-helix 构象作为蛋白最重要的二级构 象之一, 在细胞生理过程起着至关重要的作用, 如很多蛋白 -蛋白相互作用的区域多为 alpha 螺旋构象。 此外, 使多肽具有稳定的 alpha螺旋构象还能大幅提升多肽的抗蛋白降解 力和 穿膜能力。
为了使多肽具有稳定的 alpha螺旋构象, 研究人员开发了各种各样的多肽构象稳定技术 , 如盐桥、 金属螯合、 HBS、 构建共价侧链等。 其中构建共价侧链是其中较为常用的方法, 最 早出现的是以酰胺键的形成作为侧链构建方法 。 此后二硫键, 碳碳双键的形成等均被用于构 建侧链以稳定多肽的 alpha构象。
在侧链共价键的构建过程中偶联的侧链一般在 alpha螺旋的同一面上, 所以侧链偶联氨 基酸的位置一般为 i/i+3, i/i+4, i/i+7, i/i+ll等。 其中应用较多的是 i/i+4与 i/i+7。
但是每种稳定方法都有其一定的局限性, 例如在酰胺键稳定技术中, 由于酰胺键本身易 水解所以在体内可能很容易被水解掉而无法发 挥作用; 以两个半胱氨酸为侧链形成基础的稳 定技术中的侧链结构往往含有芳香基团, 其对多肽本身的性质影响较大; 基于叠氮与炔反应 的侧链形成的三氮唑本身就是一个药效基团, 其对多肽成药性影响可能更大。
所以至今为止并没有一种侧链技术是普适性的 , 故而需要开发多种多肽稳定技术以便于 研发人员针对不同情况选择适合的技术。 发明内容
本发明的目的是提供一种通过构建新型的含有 手性亚砜的侧链来稳定多肽的 alpha螺旋 的方法。
本发明的另一目的是提供一种具有稳定 alpha 螺旋结构的带有侧链修饰的多肽化合物及 其制备方法。 进而, 本发明提供了一种将多肽稳定为 alpha螺旋二级结构的方法, 它包括如下步骤:
( 1 ) 将多肽的氨基端连接非天然氨基酸, 并乙酰化封尾;
(2)将步骤 (1 ) 的产物经过巯基-烯反应获得硫醚侧链修饰的 肽化合物; 该硫醚侧链 偶联氨基酸的位置为 i/i+4 ;
(3) 将硫醚侧链修饰的多肽化合物氧化, 获得 R型或者 S型亚砜侧链修饰的多肽化合 物;
(4) 将步骤 (3) 的产物分离纯化, 获得 R型亚砜侧链修饰的多肽化合物。
在一优选例中, 所述步骤 (1 ) 中的非天然氨基酸具有如下结构式: ( 1 ),
其中 R 6 为氢或亚甲基, n为 1~6的正整数。
在另一优选例中, 所述步骤 (2) 中的巯基 -烯反应是先将步骤 (1 ) 的产物与半胱氨酸或 者半胱氨酸衍生物进行光聚合反应,然后通过 酰胺键的形成合成硫醚侧链修饰的多肽化合物 。
在另一
化合物 4
Α,Β两种异构体
本发明第二方面是提供了一种带有侧链修饰的 多肽化合物, 该多肽化合物具有如下结构
( II ) ,
其中, !^和 R 5 各自独立地为氢或甲基, R 2 〜R4各自独立地为氨基酸残基, n为 1-6的 正整数, 亚砜的构型为 R。
在一优选例中, 所述多肽的长度不大于 20个氨基酸。
在另一优选例中, 所述 n为 3或 4。
本发明还提供了上述多肽化合物的制备方法, 它包括如下步骤:
( i ) 将多肽的氨基端连接非天然氨基酸, 并乙酰化封尾, 所述非天然氨基酸具有如下 结构式: ( I ),
其中 R 6 为氢或亚甲基, n为 1~6的正整数;
( ii )将步骤(i)的产物经过巯基-烯反应获得硫醚 链修饰的多肽化合物, 该侧链偶联 氨基酸的位置为 i/i+4 ;
( iii)将硫醚侧链修饰的多肽化合物氧化, 获得 R型或者 S型亚砜侧链修饰的多肽化合 物;
( iv ) 将步骤 (iii) 的产物分离纯化, 获得 R型亚砜侧链修饰的多肽化合物。
在一优选例中, 所述步骤(ϋ ) 中的巯基 -烯反应是先将步骤(i) 的产物与半胱氨酸或者 半胱氨酸衍生物进行光聚合反应, 然后通过酰胺键的形成合成硫醚侧链修饰的多 肽化合物。
在另一优选例中, 所述步骤 (ϋ ) 和步骤 (iii) 的反应式如下:
Α,Β两种异构体
本发明的其它方面由于本文的公开内容, 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明
图 1 为 η = 3时, Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide A和 B在 lOmM ph=7.4 的
PBS 缓冲液里的 CD图。
图 2为 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide B在 PBS 禾卩 50%TFE溶液里的 CD图。 图 3 为 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide B (ASOB) ,
Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AGAC-NH 2 sulfoxide B(GSOB), Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AIAC-NH 2 sulfoxide B(ISOB)的 CD图。
图 4为 n = 4时, Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide A和 B在 lOmM ph=7.4 的
PBS 缓冲液里的 CD图。
图 5 为纯化 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 的 HPLC色谱图。
图 6 为多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 的 LC-MS色谱图。
图 7 为多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide A的 LC-MS色谱图。
图 8 为多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide B的 LC-MS色谱图。
图 9 为多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide A的 LC-MS色谱图。
图 10 为多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide B的 LC-MS色谱图。
图 11 为多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide A和 B的 HPLC色谱图。 具体实 式
研究证实, 多肽分子具有小分子药物所不具有的大接触面 积和低毒性, 但多肽往往不具 有蛋白的二级或三级结构。 此外, 在生理环境下少于二十个氨基酸的短肽往往不 具有稳定的 构象。所以如何使少于 20个氨基酸的多肽在水相中具有稳定构象一直 多肽化学中的研究热 点。 alpha螺旋是蛋白中最重要的二级结构之一, 在很多重要的生理过程, 如信号传导、 蛋白 -蛋白相互作用等中起着重要作用, 所以如果能够使多肽具有稳定的 alpha螺旋结构将会使这 些过程更加容易调控。 以构建共价键的侧链来稳定多肽 alpha 螺旋构象是其中应用最多的策 略之一。
本发明人以五肽为模型, 通过构建一种新的侧链使得多肽 alpha 螺旋的稳定性有明显提 高, 而且这一侧链具有很高的序列耐受能力。 这一新型的多肽稳定方法将具有良好的运用前 景。 首先, 本发明人运用 thiolene反应构建硫醚侧链稳定的多肽化合物, 并进一步将硫醚氧 化成含手性亚砜。之后通过 CD证明了这一手性亚砜侧链对稳定多肽的 alpha螺旋二级结构效 果很好, 而且对多肽序列有良好的耐受性。
所述侧链在多肽化合物中的位置有如下结构通 式:
( II )
通式中!^和 R 5 各自独立地为氢或甲基, R 2 〜R 4 各自独立地为二十种天然氨基酸的残基, n为 1~6的正整数, 较优选地, n为 3或 4, 亚砜的构型为 R。
制备上述侧链稳定的多肽化合物的核心反应步 骤如下:
化合物 4
Α,Β两种异构体
化合物 1是将多肽的氨基端连接非天然氨基酸, 并乙酰化封尾而得。 其中的天然氨基酸 是由 Fmoc (芴甲氧羰基) 保护的固相接肽完成, 所述非天然氨基酸 (简称为 m 0n0 S n+2 ) 的 结构式如下:
NH- 所述非天然氨基酸可通过固相接肽连接到树脂 上, 其中 R 6 可以为氢或亚甲基。
n可以为 1〜6中的任何一个正整数。 在本发明的一个优选例中, 以 n=3或 4为示例进行 表述。
化合物 2, 是由化合物 1与半胱氨酸 (Cys-amide) 及其衍生物进行反应而得。 反应条件 设定为:取化合物 1 0.5mmol,加入光引发剂 DMPA 1.5mmol, Cys-amide衍生物 1.5-2.5mmol, 然后加入 10ml DMF作溶剂, 脱气于 365nm紫外光下反应 3h, 滤掉反应液洗涤即可得化合 物 2。
将上一步得到的化合物 2加入 10ml三氟乙酸 (TFA) /三异丙基硅垸 (TIS) /水 (H 2 0) (9.5: 0.25: 0.25体积 /体积) 的剪切液中反应 3h, 用氮气将剪切液吹干, 10ml乙醚 /正己垸 (4: 1 ) 沉淀; 将沉淀抽干后溶于 200ml Ν,Ν'-二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 脱气,冰浴下加入 l.Og 2- (7-偶氮苯并三氮唑) -Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HATU), 0.9ml二异丙基乙胺 (DIEA),缓慢升至室温反应 36h; LCMS检测反应完全后, 将溶剂旋干, HPLC纯化, 冻干, 得到干净的化合物 3, 即硫醚侧链修饰的多肽化合物。
将化合物 3溶于 4ml水中加入 lml 30%双氧水反应 3h。 HPLC纯化得化合物 4, 即亚砜 侧链修饰的多肽化合物。 化合物 4含有两个异构体, 其中出峰在前的称为化合物 4A, 出峰在 后的为化合物 4B。
将得到的化合物溶于 10mM pH=7.4的磷酸盐缓冲液中测 CD谱。 化合物 4B具有良好的 alpha螺旋, 与传统的酰胺键稳定方法相比, 相同序列下可以有更高的螺旋含量。
本发明人进而通过 CD结果证实了这一手性亚砜侧链对稳定多肽的 alpha螺旋二级结构效 果很好, 而且对多肽序列有良好的耐受性。
综上所述, 本发明提供了一种通过构建新型的侧链稳定多 肽 alpha螺旋的方法, 而且该 方法在一定范围内可通过调节链长来控制 alpha螺旋的含量。通过与酰胺键稳定 alpha螺旋对 比, 该方法可以产生更好的 alpha螺旋稳定效果。 其侧链简单、 螺旋含量高、 序列耐受性好 以及螺旋含量通过链长调节在一定范围内可调 等优点是目前本领域的其他稳定方法所不具备 的。
下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照常规条件中所 述的条件, 或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学 用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外, 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发明中。 文中所述的较佳实 施方法与材料仅作示范之用。 实施例 1 n =3时, 手性亚砜侧链稳定的多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide 的合成:
^H 2
monoSs的结构式为: ^^^COOH · 首先是以 Fmoc固相多肽合成法合成 Ac-monoS 5 AAA-CTC树脂:
具体路线如下: 树脂 IT^ S ¾; 5 " Ρ =1 7 : 2: 1 , F置- TC 树脂
2 ' |||¾ H2 a-CTC树脂
3 .
25%吗啡啉 _ ^„ M Δ1 Δ 1 「 T Fmoc-Ala-OH/HCTU/DIEA.
4 ·室温鼓 Ν 2 30ηή H 2 N-Ala-Ala-CTC树月日 in NMP ,室温鼓 50ηώ ^
' Fmoc-Ala-Ala-Ala-CTC树脂
25%吗啡啉 ™^ Η ^ Fmoc-monoS,-OH/HCTU/DI¾A
5 .室温鼓 Ν 2 30ηώί H 2 N-Ala-Ala-Ala-CTC树月曰 ίη NMP ,室温 ¾? 2 , 90min ¾
Fmoc-monoS -Ala-Ala-Ala-CTC树脂
具体操作为:
1. 接第一个氨基酸: 称取 l.Og CTC树脂于 100ml接肽管中, 加入 20ml N-甲基吡咯垸酮 (NMP)鼓氮气溶胀 30min;滤掉溶剂加入用 9331mg Fmoc-Ala-OH,9.6mlNMP及 2.11mlDIEA 配制成的溶液, 鼓氮气 3.0h ; 洗涤: 将接肽管中的溶剂抽干, 将树脂用 NMP ( 10ml*3 )洗涤 三次, 每次一分钟; 封闭: 洗涤结束后, 滤掉反应液, 加入 NMP/MeOH/DIEA (体积比 17/2/l)10mL鼓氮气 5min, 滤掉反应液, 洗涤并进行下一步反应。
2. 接第二个氨基酸: 脱保护: 加入体积比为 25%吗啡啉的 NMP溶液,鼓氮气 30min, 洗 涤; 连接反应: 将配制好的 Fmoc-Ala-OH (0.4M in NMP)溶液, 6-氯苯并三氮唑 -1,1,3,3-四甲 基脲六氟磷酸酯 (HCUT)(0.38M in NMP), DIEA 按 7.5ml/7.5ml/lml 混匀加入树脂中鼓氮气 50min ; 滤掉反应液, 洗涤然后进行下一步操作。
3. 接第三个个氨基酸: 操作同 2接第三个 Ala
4. 接非天然氨基酸 monoS 5 :脱保护, 加入 Fmoc-monoS 5 -OH (0.4M in NMP) 溶液, HCUT(0.38M in NMP), DIEA 按 5.0ml/5.0ml/0.71ml混匀加入树脂中鼓氮气 120min,滤掉反应 液进行下一步反应。
5. 乙酰化封尾: 脱保护, 洗涤, 滤掉 NMP; 加入 10ml Ac2O/DIEA/NMP(l : 3 16)的混 合液, 鼓氮气 50min
6.滤掉反应液,将树脂依次用 NMP(lOml),二氯甲垸(DCM) (10ml),甲醇(MeOH) (10ml) 交替洗涤, 抽干保存或用于下一步反应。
切害 IJ :取 30mg树脂于 1.5ml eppendof管中,加入 0.5ml TFA/TIPS/H 2 0(体积比 9.5: 0.25 0.25)震荡反应 0.5h; 沉淀: 树脂过滤除去, 用氮气把剪切液吹干, 然后加入冷的 1ml 乙醚 / 正己垸 (4:1 ) 的混合液; 离心去上清, 将固体沉淀抽干。
将产物溶于 0.5ml氘代 DMSO中进行核磁检测:
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 7.9 Ηζ,ΙΗ), 7.81 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.80 - 5.71 (m, 1H), 5.02 - 4.89 (m, 2H), 4.23 - 4.15 (m, 4H) 1.82 (s, 3H), 1.59 (d, J = 9.4 Ηζ,ΙΗ), 1.45 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 1.39 - 1.28 (m, 2H), 1.28 - 1.13 (m, 11H).
通过 thiol-ene反应 (巯基-烯反应) 来完成侧链构建。
首先进行光聚合反应:
Ac-monoS -Ala-Ala-Ala-CTC树脂 Ac-monoS 5 (Cys-NH 2 )-Ala-Ala-Ala-CTC
365nm光照 3h
所获得反应中间体的结
具体操作为: 称取 l.Og Ac-monoS 5 AAA-CTC树脂于 25ml烧瓶中,依次然后加入 780mg Cys-amide, 380mg DMPA, 50ml DMF; 用氮气换气三次除掉溶剂中的氧;将该烧瓶置 高压汞 灯 20cm处搅拌下反应 3h;将反应树脂转入接肽管中,滤除反应液,用 DMF(10ml), DCM(10ml), MeOH(lOml)交替洗涤, 抽干得 Ac-monoS 5 (Cys-NH 2 ) AAA-CTC树脂。
取 30mg Ac-monoS 5 (Cys-NH 2 ) AAA-CTC 树脂切割, 沉淀, 核磁检测, 通过观察氢谱 上 5.80 - 5.71 (m, 1H), 5.02 - 4.89 (m, 2H)两处的双键峰来检测反应是否进行完全,如 仍有双键 峰则重复 thiol-ene反应。 如双键峰消失说明反应完全, 将剩余的树脂用 10ml切割液反应 3h, 氮气吹干切割液, 加 10ml冻乙醚 /正己垸(4:1 ) 10ml沉淀, 离心去上清, 最后将所得固体抽 干保存。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.14 (s, 3H), 8.08 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.05 - 7.96 (m, 2H), 7.93 - 7.85 (m, 2H), 7.67 (s, 1H), 4.30 - 4.11 (m, 5H), 2.93 - 2.91 (m, 1H), 2.87 - 2.77 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.65 - 1.54(m, 1H), 1.54 - 1.39 (m, 3H), 1.39 - 1.16 (m, 13H). 然后通过酰胺键的形成合成环状多肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 。
具体操作: 将 thiol-ene反应中所得的固体转移到 1000ml烧瓶中, 加入 500ml DMF,氮气 换气三次; 氮气保护下冰浴加入 l.Og 接肽试剂 HATU, 搅拌 lOmin后加入 0.9ml DIEA,缓慢 升至室温反应 12h。
反应液旋干之后用 HPLC纯化, 250*10mm C18 反相色谱, A液: 0.1% TFA H 2 0, B液: 0.1 TFA 乙腈; 溶剂梯度: 0-45min 5-50% ; R t =31.492。 HPLC色谱图 (图 5) 及 LCMS检 测 (图 6) 。
图 5的具体结果如表 1所示。
表 1 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 的 HPLC分析结果
峰名称 保留时间 高度 峰开始 峰结束 面积%
P 31.492 2712473 30.808 31.983 10.7948 产物冻干后取 2mg溶于 0.5ml氘代 DMSO中核磁检测:
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.38 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 7.8 Hz, IH), 7.95 (d, J = 8.1 Hz, IH), 7.39 (d, J = 6.4 Hz, IH), 7.21 (s, IH), 7.08 (s, IH), 4.29 - 4.05 (m, 5H), 2.84 (dd, J = 13.9, 4.4 Hz, 1H), 2.76 - 2.65 (m, 1H), 1.82 (s, 3H), 1.74 - 1.69 (m, 1H), 1.62 - 1.12 (m, 18H).
将产物环肽 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 3mg溶于 4ml水中然后加入 1ml 30% H 2 0 2 反应 3h HPLC 纯化, 得到侧链含有手性亚砜的两种环肽非对应异构 体: Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide A, Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide B. 如图 11 :
图 11的具体结果如表 2所示。
Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide A和 B的 HPLC分析结果
峰名称 保留时间 高度 峰开始 峰结束 面积%
A 22.860 31087340 22.483 23.850 41.0151
B 27.398 44707504 27.050 28.600 58.9849
两个产物用 LC-MS分析 (图 7, 图 8 ) , 及核磁氢谱分析:
Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide A
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.36 (d, J = 7.5 Hz, IH), 8.22 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 8 Hz, IH), 7.53 (d, J = 5 Hz, IH), 7.18 (d, J = 7.5Hz, 2H), 4.51 - 4.39 (m, IH), 4.25 - 4.19 (m, 2H), 4.01 - 3.95 (m, 1H), 3.15 - 3.03 (m, 2H), 2.87 - 2.81 (m,lH), 2.70 - 2.64 (m, 1H), 1.81 (s, 3H), 1.75- 1.62 (m, 2H), 1.45 - 1.34 (m, 5H), 1.32 (s, 3H), 1.25 - 1.21 (m, 9H).
Ac-cyclo(l ,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide B
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.42 (d, J = 6.9 Hz, IH), 8.12 (d, J = 6.2 Hz, IH), 8.07 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 7.20 (s, 1H), 4.57 (t, J = 8.4 Hz, IH), 4.13 (dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 3H), 4.06 - 3.97 (m, IH), 3.08 - 2.94 (m, 2H), 2.87 (dd, J = 13.2, 7.1 Ηζ, ΙΗ), 2.70 - 2.60 (m, IH), 1.87 (s, 3H), 1.79 (dd, J = 18.3, 11.6 Hz, 2H), 1.60 - 1.47 (m, 3H), 1.32 (s, 3H), 1.24 (t, J = 6.5 Hz, 9H).
将 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide两种异构体 ASOA/ASOB溶于 lOmM PBS 溶液中测定 CD图谱: 取 0.1-0.5mg样品分别溶于 0.5ml lOmmol PBS 中测 CD波长为
190nm-250nm处的色谱图, 然后根据以下公式计算得 alpha螺旋含量; 结果如表 3。
alpha螺旋计算公式:
[6]obs2i 5= 6 /(10*C* N p *1)
[Θ] ∞215 = ( -44000 + 250T) (1 - κ/Ν ρ ) [Q]c= 2220 - 53T = 1054
T=22°C , κ=4.0, Ν ρ =6 (对于五肽), l=0.1(cm),C为样品摩尔浓度 M。
从 CD (图 1 )可以看出两种异构体只有在 HPLC分离中出峰靠后的异构体 B具有稳定的 alpha螺旋。
对比 Ac-cyclo(l,5)-monoS 5 AAAC-NH 2 sulfoxide B在 PBS 禾卩 50%TFE缓冲液中的 CD 图可发现, TFE缓冲液对这一异构体没有 alpha螺旋的提高, 说明这一侧链稳定方法已经将 短肽的 alpha螺旋提高到了最佳值。
改变五肽的中间氨基酸为不利于 alpha螺旋的 G和 I得到 Ac-cyclo(l ,5)-monoS 5 AGAC-NH 2 sulfoxide B(GSOB) , Ac-cyclo(l ,5)-monoS 5 AIAC-NH 2 sulfoxide B(ISOB)结果同样有很高的 alpha螺旋含量 (表 3, 图 3 )
将本发明的方法与传统的酰胺键稳定方法进行 对比, 表 3中 ASOA/对照, 结果表明相同 中间序列情况下, 这一稳定方法相对于酰胺键侧链稳定多肽 alpha螺旋稳定效果提高 14%。 表 3 多肽在 pH=7.4 22 °C 10mM PBS中的相对 alpha螺旋含量
多肽 [θ] 2 15 [θ]207 [Θ] ΐ90 [θ] 215/[θ] 207 相对 alpha螺旋含量 *
ASOA 672 -4667 -14594 -0.14 -0.04
ASOB -15666 -16054 25987 0.98 1.00
GSOB -7920 -7777 9121 1.02 0.51
ISOB -13558 -15556 26306 0.87 0.87
对照 -13537 -13684 39352 0.99 0.86**
*以 ASOB为标准 [θ] 215 (χ) /[θ] 215 (ASOB) 为相对 alpha螺旋含量
**control为酰胺键侧链的环肽 Ac-(cyclo2,6)-R[KAAAD]-NH 2 实施例 2 n=4时亚砜侧链稳定的多肽的合成及 CD图谱的测定
将 mon 0 S 5 换成多一个碳原子的 m 0n0 S 6 用同样的合成路线, 我们得到了两个非对映异构 体, 同样根据 HPLC上出峰时间的先后命名为 Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide A 禾口 Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide B, LCMS鉴定 (图 9, 图 10) , 及核磁氢谱:
Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide A
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.42 (d, J = 7.6 Hz, IH), 8.33 (d, J = 8.2 Hz, IH), 8.19 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.24 - 7.16 (m, 3H), 4.68 - 4.61 (m, 1H), 4.30 - 4.08 (m, 4H), 3.17 (dd, J = 13.8, 3.0 Hz, 1H), 3.02 (dd, J = 13.9, 9.3 Hz, 1H), 2.71 (dd, J = 13.7, 6.5 Hz, 2H), 1.81 (s, 3H), 1.76 - 1.67 (m, IH), 1.67 - 1.52 (m, 2H), 1.52 - 1.40 (m, 3H), 1.40 - 1.18 (m, 13H).
Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide B
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.41 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.20 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.54 (t, J = 9.7 Hz, IH), 4.29 - 4.13 (m, 4H), 3.08 - 2.93 (m, 2H), 2.74 (td, J = 13.3, 6.4 Hz, 2H), 1.82 (s, 3H), 1.64 (t, J = 18.4 Hz, 3H), 1.44 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.38 - 1.17 (m, 13H).
测定 Ac-cyclo(l,5)-monoS 6 AAAC-NH 2 sulfoxide A/ B的 CD (图 4), 同样只有 B异构体 才有 alpha螺旋稳定效果。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。 然而, 应理解的是, 在不偏离本发明精神之前 提下, 本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰, 所述改变和修饰同样落入本专利申请所 附权利要求的覆盖范围。
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