BAREDA GÓMEZ, Gabriel (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
FERNÁNDEZ GONZÁLEZ, José Andrés (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
ASTIGARRAGA ARRIBAS, Egoitz (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
ARANZABE GARCÍA, Ana (Fundación Tekniker, Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
MARCAIDE RODRÍGUEZ, Arrate (Fundación Tekniker, Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
GÓMEZ PLAZA, David (Fundación Tekniker, Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
FUNDACIÓN TEKNIKER (Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
RODRÍGUEZ PUERTAS, Rafael (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
BAREDA GÓMEZ, Gabriel (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
FERNÁNDEZ GONZÁLEZ, José Andrés (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
ASTIGARRAGA ARRIBAS, Egoitz (Universidad Del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, Leioa - Vizcaya, E-48940, ES)
ARANZABE GARCÍA, Ana (Fundación Tekniker, Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
MARCAIDE RODRÍGUEZ, Arrate (Fundación Tekniker, Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
GÓMEZ PLAZA, David (Fundación Tekniker, Avda. Otaola 20, Eibar - Guipúzcoa, E-20600, ES)
REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la modificación química de una superficie de un soporte, en el que dicha superficie contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de metales o aleaciones metálicas, que comprende el tratamiento de dicha superficie con ácido orto-fosfórico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha superficie es una superficie de vidrio o de un material polimérico.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende el tratamiento de dicha superficie con una solución acuosa de ácido orto-fosfórico con una concentración comprendida entre aproximadamente 10% en peso y aproximadamente 85% en peso.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho tratamiento de la superficie con ácido orto-fosfórico se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20 0 C y aproximadamente 100 0 C.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, una o más etapas de lavado y secado de la superficie a tratar previas al tratamiento con ácido orto-fosfórico.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de lavado se realiza con un disolvente orgánico.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho disolvente orgánico es un alcohol o una cetona de cadena corta.
8. Un soporte sólido que comprende una superficie tratada según el procedimiento definido en las reivindicaciones 1 a 7.
9. Soporte sólido según la reivindicación 8, configurado en forma de un portaobjetos de vidrio.
10. Un método para inmovilizar un producto en una superficie de un soporte sólido, en el que dicho producto se selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una célula y una sección de un tejido, y dicha superficie contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de metales o aleaciones metálicas, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto dicho producto con dicha superficie de vidrio tratada según el procedimiento definido en las reivindicaciones 1 a 7.
11. Método según la reivindicación 10, que comprende, además, someter la combinación (producto inmovilizado)-(superficie tratada) a una etapa de secado.
12. Método según la reivindicación 10, en el que dicha biomolécula es un polinucleótido, una proteína, un lípido, una combinación de un lípido con una proteína y/o con un polinucleótido, o un sustrato o cofactor de dicho compuestos.
13. Un soporte sólido que comprende una superficie tratada según el procedimiento definido en las reivindicaciones 1 a 7 y un producto inmovilizado sobre dicha superficie tratada, en donde dicho producto se selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una célula, una sección de un tejido y sus mezclas.
14. Soporte sólido según la reivindicación 13, configurado en forma de un portaobjetos de vidrio. |
PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO DE SUPERFICIES DE
SOPORTES SóLIDOS
CAMPO DE LA INVENCIóN La presente invención se encuadra dentro de la tecnología de inmovilización de productos (biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células o tejidos) sobre soportes sólidos, y, en concreto, en métodos basados en la modificación química de las superficies de dichos soportes sólidos para inmovilizar dichos productos.
La invención es aplicable, entre otras, en las áreas de Biotecnología, Proteómica, Genómica, Farmacología e Histología, ya que permite la realización de todo tipo de estudios sobre los productos inmovilizados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN
La inmovilización de biomoléculas es un proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de las biomoléculas mediante su unión a un soporte insoluble en agua. Los aspectos fundamentales a considerar en la inmovilización de biomoléculas son el soporte y el mecanismo de inmovilización seleccionados.
La elección del soporte es determinante ya que se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibilidades de contaminación microbianas. Además, el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y debe ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Los soportes empleados hasta el momento son de tipo orgánico (polímeros naturales y polímeros sintéticos) o de tipo inorgánico. Los soportes de tipo orgánico presentan la desventaja de ser poco estables térmicamente. Los soportes de tipo inorgánico más empleados son los soportes manufacturados con óxidos de metales (oro, titanio, silicio, etc.) y vidrio [Kikukawa T. et al., .(2005), Journal of Membrane Science, vols 259, 161-166; Shin D. et al., (2003), Biosensors and Bioelectronics, 19, 485-494].
En cuanto a los métodos de inmovilización, la adsorción es uno de los más sencillos. Mediante este método, la biomolécula se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y/o puentes de hidrógeno. En
este tipo de métodos se emplean diversos compuestos tales como la polilisina y la gelatina. Estos métodos tienen la ventaja de su bajo coste, preparación sencilla y estabilidad de los derivados en medios de trabajo con bajo contenido en agua. Sin embargo, entre los inconvenientes que presentan se encuentran la poca estabilidad de los derivados desde el punto de vista mecánico, una débil unión al soporte y la aplicación de medidas de conservación de los soportes recubiertos.
Los métodos de inmovilización por unión química más empleados son los que transcurren mediante la formación de uniones covalentes y se basan en el empleo de agentes de acoplamiento que se unen covalentemente al soporte por un lado y, por otro, a la biomolécula a inmovilizar a través de grupos funcionales. Se conocen diversos agentes de acoplamiento para realizar las uniones covalentes al soporte e inmovilizar la biomolécula dependiendo de los grupos funcionales reactivos disponibles, grupos amino, tiol, aldehido, epoxi, etc.
El grupo funcional amino constituye la primera opción ya que es el acoplador químico más general. La mayoría de las macromoléculas contienen grupos amino, los cuales pueden ser utilizados como acopladores químicos. Este tipo de acopladores son menos adecuados en el caso de ligandos ácidos donde el grupo amino constituye un centro activo y en el caso de moléculas que poseen muchos grupos amino.
La posibilidad de utilizar tiol como grupo funcional de acoplamiento depende, sobre todo, de la disponibilidad de los grupos tiol en el ligando. La unión química del tiol es más fuerte que la de la amina, así que las condiciones del grupo funcional son menos críticas. Los agentes de acoplamiento basados en grupos funcionales tiol no se pueden utilizar bajo condiciones reductoras fuertes, puesto que el enlace disulfuro es inestable en dichas condiciones. El grupo funcional aldehido se utiliza en casos específicos, por ejemplo con polisácáridos y glicoconjugados que tienen cis-cis-dioles y con el ácido salicílico. Estos grupos son oxidados por los aldehidos con relativa facilidad.
El grupo funcional epoxi permite una adecuada reacción con diversas matrices orgánicas termoplásticas y una gran estabilidad de enlace a lo largo del tiempo. Los silano-derivados constituyen un grupo de agentes de acoplamiento muy utilizado. En ese tipo de derivados, un extremo de la molécula (el grupo silano) se une covalentemente al soporte inerte y el otro extremo que contiene el grupo funcional
químico, e.g., el grupo amino, tiol, aldehido, epoxi, etc., se une a la biomolécula a inmovilizar.
En otros casos, cuando las opciones anteriores son inadecuadas se opta por utilizar el par de unión estreptavidina-biotina. En general, este tipo de métodos presenta algunas ventajas, tales como la estabilidad de las biomoléculas inmovilizadas y un elevado nivel de control de la inmovilización de las biomoléculas, y algunas desventajas ya que los procesos son laboriosos, costosos, se utilizan compuestos altamente corrosivos y su utilidad depende de la naturaleza de la biomolécula a inmovilizar. A pesar de que se han descrito diferentes métodos para el tratamiento de superficies de soportes destinados a la inmovilización de biomoléculas, sigue existiendo todavía una gran necesidad de diseñar métodos alternativos que permitan proporcionar soportes con las propiedades ópticas y mecánicas deseadas de una manera sencilla y económicamente conveniente.
COMPENDIO DE LA INVENCIóN
La presente invención proporciona un procedimiento alternativo para el tratamiento de soportes sólidos, tales como los soportes destinados a la inmovilización de productos de diversa naturaleza (e.g., biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células o secciones de tejidos), que comprende el tratamiento de dichos soportes con ácido orto-fosfórico. Las superficies de los soportes que pueden ser sometidos a dicho tratamiento presentan grupos hidroxilo disponibles y carecen de metales o aleaciones metálicas. Ejemplos ilustrativos de soportes que pueden ser sometidos a dicho tratamiento incluyen soportes cuyas superficies son de vidrio o de un material polimérico, etc., siempre y cuando cumpla dichas condiciones de presencia de grupos hidroxilo disponibles y ausencia de metales o aleaciones metálicas.
El procedimiento para el tratamiento de superficies proporcionado por esta invención constituye una alternativa a la silanización, es sencillo, permite obtener superficies homogéneas, no presenta problemas de conservación y utiliza compuestos que resultan más aceptables desde el punto de vista medioambiental. Además, permite su aplicación sobre soportes, e.g., portaobjetos, de tamaño y composición estándar que se utilizan para múltiples aplicaciones en los campos de la biomedicina y la biotecnología.
Por tanto, un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para la modificación química de la superficie de un soporte que comprende el tratamiento de dicha superficie con ácido orto-fosfórico. Dicho soporte puede ser un soporte sólido apropiado para inmovilizar productos de diversa naturaleza (e.g., biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejidos, etc.).
La superficie de dicho soporte modificada químicamente según el procedimiento previamente descrito, así como los soportes que la incorporan, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido, tal como un soporte sólido para inmovilizar dichos productos de naturaleza diversa, que comprende una superficie tratada según el procedimiento previamente descrito. En una realización particular, dicha superficie es una superficie de vidrio, tal como la superficie de un portaobjetos de vidrio.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inmovilizar un producto (e.g., biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejidos, etc.) en un soporte sólido que comprende una superficie tratada según el procedimiento de modificación química de superficies previamente descrito, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto dicho producto con dicha superficie tratada según el procedimiento previamente descrito. En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido que comprende una superficie tratada según el procedimiento de modificación química de superficies previamente descrito y, al menos, un producto (e.g., biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejidos, etc.) inmovilizado sobre la superficie tratada de dicho soporte sólido.
BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una representación esquemática que ilustra el tipo de unión covalente del ácido orto-fosfórico a una superficie de un soporte que contiene grupos hidroxilo disponibles, e.g., vidrio. La Figura 2 es una representación esquemática que muestra el tipo de unión mediante puentes de hidrógeno del ácido orto-fosfórico a una superficie de un soporte que contiene grupos hidroxilo disponibles, e.g., vidrio.
La Figura 3 ilustra la inmovilización de membranas celulares aisladas y muestra la estimulación de la fijación basal de [ 35 S]GTPgammaS ([ 35 S]GTPγS) en arrays de tejido en ausencia de ligando. Se muestran los resultados obtenidos utilizando portaobjetos de vidrio sometidos a distintos tratamientos, concretamente, a tratamiento con ácido fosfórico (AF), gelatina (G), gamma-aminopropil-trietoxisilano (APTS), ácido nítrico y gelatina (AN), ácido nítrico y kuzú (AN+KUZú), ácido nítrico y lignina (AN+LIGNINA) o ácido nítrico y pectina (AN+PECTINA).
La Figura 4 ilustra la inmovilización de membranas celulares aisladas y muestra la estimulación de la fijación de [ 35 S]GTPyS en arrays de tejido en presencia del agonista cannabinoide WIN-55,212-2 [Ejemplo 2]. Se muestran los resultados obtenidos sometiendo portaobjetos de vidrio a distintos tratamientos, concretamente, a tratamiento con ácido fosfórico (AF), gelatina (G), APTS, ácido nítrico y gelatina (AN), ácido nítrico y kuzú (AN+KUZú), ácido nítrico y lignina (AN+LIGNINA) o ácido nítrico y pectina (AN+PECTINA). La Figura 5 ilustra la inmovilización de membranas celulares aisladas y muestra la estimulación de la fijación de [ 35 S]GTPyS en arrays de tejido en presencia del agonista muscarínico carbacol. Se muestran los resultados obtenidos sometiendo portaobjetos de vidrio a distintos tratamientos, concretamente, a tratamiento con ácido fosfórico (AF), gelatina (G), APTS, ácido nítrico y gelatina (AN), ácido nítrico y kuzú (AN+KUZú), ácido nítrico y lignina (AN+LIGNINA) o ácido nítrico y pectina (AN+PECTINA).
La Figura 6 ilustra la inmovilización de membranas celulares aisladas y muestra la fijación de [ 35 S]GTPyS en ausencia (basal) y en presencia de diferentes ligandos de receptores de galanina [Galanin, Galnon, Gal(2-l l), M 15, M35, M40 y combinaciones de los mismos, tales como Galanin+M15, Galanin+M40, Galnon+M35, Galnon+M40 y Gal(2-1 l)+M40]. La fijación no específica se determina en presencia de GTPyS 10 μM (NS). En la esquina inferior derecha se muestra el estándar de 14 C y los valores en nCi/gt.e asignados a cada color.
La Figura 7 es un diagrama de. barras representativo de los porcentajes de estimulación sobre la fijación basal de [ 35 S]GTPyS en presencia de diferentes ligandos de los receptores de galanina [Galanin, Galnon, Gal(2-l l), M15, M35, M40 y combinaciones de los mismos, tales como Galanin+M 15, Galanin+M40, Galnon+M35,
Galnon+M40 y Gal(2-1 l)+M40] en riñon, estómago y pituitaria cuantifícados en arrays de tejido.
DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN En un aspecto, la invención se dirige a un procedimiento para la modificación química de la superficie de un soporte, en adelante "procedimiento de la invención", que comprende someter dicha superficie a tratamiento con ácido orto-fosfórico.
Los soportes que pueden ser sometidos a dicho tratamiento son soportes cuyas superficies presentan las siguientes características: (i) contienen grupos hidroxilo disponibles (es decir, poseen grupos -OH capaces de reaccionar con el ácido orto-fosfórico); y
(ii) carecen de metales o aleaciones metálicas (debido a que el ácido orto- fosfórico ataca a los metales y a las aleaciones metálicas).
Dichos soportes pueden ser utilizados para inmovilizar productos de diversa naturaleza, por ejemplo, biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejido, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de soportes que pueden ser sometidos al tratamiento con ácido orto-fosfórico según la presente invención incluyen soportes cuyas superficies están constituidas total o parcialmente por vidrio o por un material poliméríco que satisface las condiciones (i) y (ii) previamente mencionadas, e.g., material plástico, (poli)metacrilato, etc. La amplia oferta de mercado existente, y su bajo precio, hacen del vidrio un material de soporte interesante para la inmovilización de biomoléculas.
Dicho soporte puede estar conformado en cualquier forma y tamaño adecuados para los fines a los que va destinado; no obstante, en una realización particular, dicho soporte presenta una superficie dimensional, lisa o sustancialmente plana, y uniforme. En una realización particular, dicho soporte es un portaobjetos, de tamaño y composición estándar, del tipo utilizado en aplicaciones de Biomedicina y Biotecnología. Por tanto, en una realización particular, dicho soporte comprende una superficie constituida por vidrio. Prácticamente cualquier superficie de vidrio de tipo borosilicatado de uso estándar como material de laboratorio puede ser modificada mediante el tratamiento con ácido orto-fosfórico propuesto por esta invención para
dotarla de afinidad y capacidad para inmovilizar productos de diversa naturaleza, por ejemplo, biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejido, etc. Dicha superficie de vidrio puede formar parte de un soporte sólido o de un dispositivo o aparato, constituyendo la totalidad o una parte del mismo. En una realización particular, dicha superficie de vidrio está conformada en forma de un portaobjetos (soporte) de vidrio del tipo utilizado habitualmente en aplicaciones biomédicas o biotecnológicas.
El ácido orto-fosfórico (PO 4 H 3 ) es un producto conocido y comercialmente disponible que presenta una estructura tetraédrica. Durante el tratamiento de la superficie del soporte con ácido orto-fosfórico se producen dos reacciones competitivas, por una parte, una unión covalente a través de los grupos hidroxilo presentes en la superficie del soporte con eliminación de agua, y, por otra parte, una adhesión a dicha superficie que contiene grupos hidroxilo por formación de puentes hidrógeno (Figuras 1 y 2). Como resultado de ambas reacciones, que incluyen la formación de enlaces covalentes, uniones por puentes de hidrógeno y eliminación de agua, se logran superficies homogéneas recubiertas de ácido orto-fosfórico con fuertes puentes de hidrógeno. De este modo, se produce una disminución de la hidrofilia de la superficie del soporte dotándola de una elevada afinidad y capacidad de inmovilizar productos de diversa naturaleza, por ejemplo, biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejido, etc.
La concentración del ácido orto-fosfórico utilizado para la puesta en práctica del procedimiento de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo. En una realización particular, se emplea ácido orto-fosfórico en solución acuosa con una concentración comprendida entre aproximadamente 10% en peso y aproximadamente 85% en peso, preferentemente entre 40% en peso y 85% en peso. En una realización concreta, se emplea ácido orto-fosfórico concentrado (85% en peso) en solución acuosa. Para la puesta en práctica del procedimiento de la invención, la superficie del soporte a tratar se pone en contacto con ácido orto-fosfórico. El tratamiento de dicha superficie con ácido orto-fosfórico se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20 0 C y aproximadamente 100 0 C, preferentemente entre 20 0 C y 60 0 C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 24 horas, preferentemente entre 5 y 15 horas.
Si se desea, el procedimiento de la invención comprende, además, una o más etapas previas al tratamiento con ácido fosfórico con el fin de lavar y/o desengrasar la superficie a tratar.
Por tanto, en una realización particular, antes del tratamiento con ácido orto- fosfórico, la superficie del soporte a tratar se pone en contacto con un disolvente, tal como un disolvente orgánico, para lavar y/o desengrasar dicha superficie, y, a continuación, se seca. Para ello, dicho disolvente se aplica sobre la superficie del soporte a tratar por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante pulverización, rociado, etc., o bien la superficie del soporte se sumerge en dicho disolvente orgánico. Como disolvente puede utilizarse cualquier disolvente inerte para la superficie a tratar, es decir, que no ataque o afecte adversamente a dicha superficie; ventajosamente, dicho disolvente presenta un gran poder desengrasante y un alto índice de evaporación, tal como un alcohol o una cetona de cadena corta, por ejemplo, un alcohol o una cetona de 1-6 átomos de carbono, preferentemente, un alcohol o una cetona de 1-4 átomos de carbono, e.g., etanol, isopropanol, acetona, etc. En una realización concreta, la superficie a tratar es una superficie de vidrio y el disolvente se selecciona entre una cetona (e.g., acetona) y un alcohol (e.g., isopropanol). El posterior secado de la superficie o del soporte puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante una corriente de aire sintético o en estufa. En una realización particular, el secado se realiza mediante una corriente de aire sintético a una presión comprendida entre aproximadamente 0,1 bar (10 4 Pa) y aproximadamente 0,01 bar (10 5 Pa), preferentemente entre 0,3 bar (3x10 4 Pa) y 0,6 bar (6x10 4 Pa), durante un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 10 minutos, preferentemente entre 2 y 6 minutos. El aire sintético no debe contener más de 3 ppm de agua ni más de 3 ppm de hidrocarburos totales [THC] (como CH 4 ). El secado mediante estufa se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 100 0 C y aproximadamente 160 0 C, preferentemente entre HO 0 C y 140 0 C, durante un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 3 horas, preferentemente entre 1 y 2 horas. En una realización concreta, el disolvente orgánico utilizado en este tratamiento es acetona.
En otra realización particular, después de dicho primer lavado de la superficie del soporte con un disolvente orgánico y secado, se efectúa un segundo lavado de dicha superficie, para lo cual la superficie del soporte a tratar se pone en contacto con un
segundo disolvente orgánico y, a continuación, se seca. Para ello, el segundo disolvente orgánico se aplica sobre la superficie del soporte a tratar por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante pulverización, rociado, etc., o bien dicha superficie se sumerge en dicho disolvente orgánico. Como se ha mencionado previamente, dicho disolvente no debe atacar la superficie del soporte a tratar y, ventajosamente, debe presentar un gran poder desengrasante y un alto índice de evaporación; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de disolventes que cumplen tales condiciones incluyen los alcoholes y cetonas de cadena corta, por ejemplo, alcoholes o cetonas de 1-6 átomos de carbono, preferentemente, de 1-4 átomos de carbono, e.g., etanol, isopropanol, acetona, etc. El posterior secado de la superficie o del soporte puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante una corriente de aire sintético o en estufa. En una realización particular, el secado se realiza mediante una corriente de aire sintético a una presión comprendida entre aproximadamente 0,1 bar (10 4 Pa) y aproximadamente 0,01 bar (10 5 Pa), preferentemente entre 0,3 bar (3x10 4 Pa) y 0,6 bar (6x10 4 Pa), durante un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 10 minutos, preferentemente entre 2 y 6 minutos. El aire sintético no debe contener más de 3 ppm de agua ni más de 3 ppm de THC (como CH 4 ). El secado mediante estufa se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 100 0 C y aproximadamente 160 0 C, preferentemente entre 1 1O 0 C y 14O 0 C, durante un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 3 horas, preferentemente entre 1 y 2 horas. En una realización concreta, el disolvente orgánico utilizado en este segundo lavado es isopropanol, ventajosamente, isopropanol anhidro.
El soporte sólido obtenido según el procedimiento de la invención, que comprende una superficie tratada según el procedimiento de la invención constituye un aspecto adicional de la invención. En una realización particular, dicho soporte sólido que comprende una superficie tratada según el procedimiento de la invención es un portaobjetos de vidrio.
Mediante el procedimiento de la invención se logra modificar químicamente la superficie del soporte así tratada, dotándola de afinidad y capacidad para inmovilizar productos de diversa naturaleza, por ejemplo, biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejido, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inmovilizar un producto en una superficie de un soporte sólido, en el que dicho producto se selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una célula, una sección de un tejido, y sus mezclas, y dicha superficie contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de metales o aleaciones metálicas, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto dicho producto con dicha superficie tratada según el procedimiento de la invención.
La naturaleza del producto a inmovilizar sobre la superficie del soporte sólido puede ser muy variada, por ejemplo, una biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una célula o una sección de un tejido. Si se desea y fuera posible, se pueden combinar distintos productos en un mismo soporte.
El término "biomolécula", tal como aquí se utiliza, se refiere a una molécula orgánica o inorgánica tanto constituyente como generada por los seres vivos e incluye polinucleótidos o ácidos nucleicos (e.g., ADN, ARN, monocatenarios o bicatenarios, etc.), proteínas (e.g., enzimas, hormonas, inmunoglobulinas, anticuerpos, ribozimas, etc.), lípidos (e.g., ácidos grasos, triglicéridos, fosfolípidos, glucolípidos, etc.), combinaciones de lípidos con proteínas y/o con polinucleótidos (e.g., colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL-colesterol), colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL-colesterol), etc), sustratos o cofactores de los compuestos anteriormente mencionados (e.g., azúcares, coenzimas, metabolitos, etc.), etc.
Alternativamente, el producto a inmovilizar sobre la superficie tratada según el procedimiento de la invención incluye membranas celulares (e.g., fragmentos de membranas plasmáticas o de membranas de orgánulos celulares), liposomas (de cualquier tipo), células (e.g., wild-type, transformadas, transfectadas, etc.), secciones (fragmentos) de tejido, etc.
En una realización particular, dicha biomolécula es un polinucleótido, una proteína, un lípido, una combinación de un lípido con una proteína y/o con un poljnucleótido, un sustrato o cofactor de los compuestos anteriormente mencionados, un fragmento de una membrana celular, un liposoma, una célula o una sección de un tejido, susceptibles de ser inmovilizados para realizar ensayos que supongan la existencia y/o detección de reacciones químicas específicas [e.g., fijación de anticuerpos o radioligandos a moléculas de membrana, estudios de actividad de receptores y de sus
sistemas efectores: activación de proteínas G, adenilil ciclasa, fosfolipasas, etc., así como la determinación de segundos mensajeros tales como adenosin-3'-5'-monofosfato cíclico (AMPc), inositol 3 fosfato (IP3), diacilglicerol (DAG), guanosin-3'-5'- monofosfato cíclico (GMPc), etc.]. Para la puesta en práctica de dicho método para inmovilizar productos de diversa naturaleza (e.g., biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células o secciones de tejido) sobre una superficie tratada de un soporte sólido, el producto a inmovilizar se pone en contacto con dicha superficie tratada según el procedimiento de la invención (en adelante, "superficie tratada") bajo condiciones que permiten la inmovilización de dicho producto sobre dicha superficie tratada mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante pulverización, rociado, etc. de una solución o suspensión de dicho producto sobre la superficie tratada y se deja actuar durante un periodo de tiempo, a una temperatura apropiada (dependiendo del producto a inmovilizar, del disolvente en el que se encuentre si está en solución o suspensión, etc); alternativamente, dicha superficie tratada (o el soporte sólido que la contiene) se sumerge en una solución o suspensión del producto a inmovilizar durante un periodo de tiempo apropiado para que dicho producto se inmovilice sobre la superficie tratada. Tras la aplicación del producto sobre la superficie tratada, la combinación (producto inmovilizado)-(superficie tratada), se deja secar con el fin de consolidar la unión del producto a la superficie tratada contenida en dicho soporte sólido (el tiempo y la temperatura variarán en función del tipo de producto que se pretenda inmovilizar y de los estudios en los que se vayan a utilizar dichas muestras).
En una realización particular, el producto a inmovilizar es una biomolécula, e.g., un polinucleótido, una proteína, un lípido, una combinación de un lípido con una proteína y/o con un polinucleótido, o un sustrato o cofactor de los compuestos anteriormente mencionados. Dicha biomolécula puede encontrarse bien en forma de solución o suspensión en un medio apropiado (e.g., en estado sólido o liofilizada, formando parte de liposomas o membranas celulares, disuelta o suspendida en tampón de ensayo, agua destilada, disolventes orgánicos, etc.). En otra realización particular, el producto a inmovilizar es una biomolécula, membrana celular (e.g., una membrana celular (plasmática o de un orgánulo celular) procedente de un tejido celular, una membrana de una célula transfectada, una membrana de un microorganismo opcionalmente transformado, una membrana lipídica,
etc.), un liposoma, una célula o una sección de tejido. En una realización concreta, dicho producto a inmovilizar se encuentra en estado sólido o en forma de una suspensión en un medio apropiado (e.g., en estado sólido o liofilizado, formando parte de liposomas o membranas celulares, disuelto o suspendido en tampón de ensayo, agua destilada, disolventes orgánicos, etc.).
El método para inmovilizar productos proporcionado por esta invención permite inmovilizar productos mediante su unión a una superficie tratada previamente con ácido orto-fosfórico contenida en un soporte sólido de forma suficientemente fuerte pero sin afectar los centros activos de dicho producto. Dicho método para inmovilizar productos de diversa naturaleza proporcionado por esta invención es un método sencillo, de bajo coste y no requiere la aplicación de medidas de conservación especiales de los soportes sólidos tratados.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido que comprende una superficie tratada según el procedimiento de la invención y un producto inmovilizado sobre dicha superficie tratada, en donde dicho producto se selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una célula, una sección de un tejido y sus mezclas. Dicho soporte sólido que comprende dicho producto inmovilizado sobre dicha superficie tratada puede obtenerse mediante un método para inmovilizar productos como el descrito previamente. En una realización particular, dicho soporte sólido que comprende un producto inmovilizado sobre dicha superficie tratada es un portaobjetos de vidrio, e.g., un portaobjetos de vidrio del tipo utilizado habitualmente en microscopía.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y, por ello, no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Tratamiento de una superficie de vidrio
Como soporte se utilizaron unos portaobjetos de vidrio ("portas") (MENZEL®) con las características que se mencionan a continuación y como modificador químico se utilizó ácido orto-fosfórico concentrado.
Características de los portas Composición química: SiO 2 : 72,20% Na 2 O: 14,30% K 2 O: 1,20%
CaO: 6,40% MgO: 4,30% Al 2 O 3 : 1,20% Fe 2 O 3 : 0,03% SO 3 : 0,30%
Coeficiente de expansión medio: 90,3 x 10 "7 /°C (20-300 0 C) índice refracción: 1,513-1,523 (medido en el intervalo 546,7 nm-643,85 nm)
Densidad: 2,47+0,01 kg/dm 3
Características del modificador químico
Como modificador químico se utilizó ácido orto-fosfórico. Las características de dicho modificador químico eran las siguientes:
ácido orto-fosfórico 85% PANREAC ® Límite máximo de impurezas:
Riqueza: 85-88%
Sustancias precipitables por NH 4 OH: sin especificar Acido hipofosforoso y fosforoso: sin especificar Cloruros: 0,005% Nitratos: sin especificar
Sulfates: 0,01%
Metales pesados (en Pb): 0,001% As: 0,0002% Cu: 0,001% Mg: 0,01%
Pb: 0,001% Ca: 0,01% Fe: 0,005%
Ni: 0,001%
Tratamiento de los portas con el modificador químico
Los portas fueron sometidos al siguiente tratamiento: 1. Inmersión de los portas (en posición vertical) en acetona (grado químico) durante 5-10 minutos.
2. Secado de los portas con aire.
3. Inmersión de los portas (en posición vertical) en isopropanol anhidro durante 5-10 minutos. 4. Secado de los portas con aire.
5. Inmersión de los portas (en posición vertical) en ácido orto-fosfórico concentrado (85%) durante 24 horas.
6. Lavado con agua destilada (Millipore).
7. Secado en aire.
Comprobación de la funcionalización de la superficie de vidrio tratada
Para comprobar la funcionalización de las superficies de los portas se midió el ángulo (θ) de contacto con agua. El ángulo de contacto (θ) se define como el ángulo formado entre la superficie y la línea tangente al punto de contacto entre la gota de líquido y la superficie del sustrato. El valor de dicho ángulo depende, entre otras cosas, de la energía superficial del sustrato (la capa adherida de ácido orto-fosfórico) y de la tensión superficial del líquido de prueba (en este caso, el líquido de prueba utilizado ha sido agua desionizada o agua DI).
La medición del ángulo de contacto proporciona información sobre el grado de hidrofilia/hidrofobia que presenta una superficie al entrar en contacto con un líquido. En general, se dice que un líquido moja (es hidrófilo) a un sólido cuando el ángulo de contacto es inferior a 90° mientras que, en el caso contrario, un líquido no moja (es hidrófobo) cuando el ángulo de contacto es mayor a 90°. Sin embargo, es muy común hablar de "grados de hidrofilia o de mojado", es decir, de si una Superficie A es más hidrófoba/hidrófila que una Superficie B si el ángulo de contacto (θ) de dicha Superficie A es mayor/menor que el que tiene una Superficie B".
La variación del ángulo de contacto (θ) a través de la modificación química de superficies significa que la energía superficial de la superficie ha variado, es decir, ha
variado la tendencia que tiene la superficie sólida [portas (en este caso)] a atraer o repeler moléculas de otra sustancia (e.g., biomoléculas). Por ejemplo, cuando el ángulo de contacto (θ) aumenta comparado con el de la superficie de referencia [portas MENZE L® sin tratar], se ha logrado una disminución de la energía superficial de la superficie sólida; la superficie tiene menos fuerza o capacidad de atraer a otras moléculas del líquido de prueba, y, por lo tanto, el líquido moja menos, y, por ello, el ángulo de contacto (θ) es mayor.
Para medir el ángulo de contacto (θ) se ha utilizado un equipo SURFTENS universal. El equipo consta de un banco óptico, trasladadores accionados con tornillos micrométricos, una cámara de video y una fuente de iluminación de luz. Para ello, brevemente, el ángulo de contacto (θ) se determinó depositando con una jeringuilla una pequeña gota de agua DI sobre la superficie de los portas. La gota se iluminó con una fuente de luz difusa para producir una imagen de bordes nítidos y la imagen producida se captó con una cámara de vídeo. A continuación, a través de un software especializado, se midió automáticamente el ángulo de contacto (θ) que forma el líquido sobre la superficie sólida.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes: el ángulo de contacto (θ) formado por el agua DI sobre la superficie de vidrio tratada con ácido orto-fosfórico de acuerdo con el procedimiento previamente descrito fue de 30,2°, mientras que el ángulo de contacto (θ) formado por el agua DI sobre la superficie de vidrio sin tratar (superficie de referencia) fue de 16,1°.
Estos resultados ponen de manifiesto que la modificación química de la superficie de los portas mediante tratamiento con ácido orto-fosfórico ha producido una variación en la energía superficial del sustrato (la capa adherida de ácido orto-fosfórico) lo que significa que la superficie tratada de los portas con ácido orto-fosfórico es más hidrófoba (30,2°) que la superficie de los portas sin tratar (16,1°).
EJEMPLO 2 Inmovilización de membranas celulares aisladas
La eficacia del método de tratamiento de soportes sólidos destinados a la inmovilización de biomoléculas proporcionado por esta invención ha sido comprobada mediante la inmovilización de membranas celulares aisladas.
Materiales y Métodos Animales
5 ratas macho Sprague Dawley (250-275 g) fueron anestesiadas y sacrificadas de acuerdo con la guía aprobada por el Comité ético de la Facultad de Medicina de la
Universidad del País Vasco siguiendo las directrices internacionalmente aceptadas
(86/609/EEC). Posteriormente, se procedió a la extracción de los órganos y tejidos que iban a ser utilizados en el experimento (páncreas, estómago, intestino delgado, bazo, corazón, pulmón, hígado, testículo, conducto deferente, riñon, glándulas suprarrenales, médula y cerebro: corteza frontal, estriado, tronco cerebral, pituitaria, núcleos olfativos, hipocampo, hipotálamo, tálamo, colículo y cerebelo). Estas muestras fueron almacenadas a -70 0 C hasta la realización del experimento.
Preparación de membranas Las muestras de tejido (1 g) fueron homogeneizadas utilizando un homogeneizador de teflón-vidrio (10 golpes a 1.500 rpm) en 30 volúmenes de tampón de homogeneización [ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 1 mM, MgCl 2 3 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM y Tris-HCl 50 mM, pH 7,4] suplementado con sacarosa 0,25 mM. El homogeneizado crudo fue centrifugado a 3.000 x g y a 4°C durante 5 minutos y el sobrenadante resultante fue nuevamente centrifugado a 40.000 x g durante 10 minutos (4°C). El pellet fue lavado en 20 volúmenes de tampón de homogeneización y re-centrifugado en las mismas condiciones. Se realizaron alícuotas y se almacenaron a -70 0 C. El contenido proteico fue determinado de acuerdo con el método de Bradford [Bradford MM., Anal Biochem 1976; 72:248-54] usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.
Preparación de los arravs de tejido
Se tomaron alícuotas de 1 mg/ml de cada tejido y con esta suspensión se realizaron micropuntos de 1 μl sobre soportes de vidrio (portas) sometidos a los siguientes tratamientos: a) Tratados con ácido orto-fosfórico (AF) según el procedimiento del Ejemplo i ; b) Gelatinizados (G);
c) Recubiertos con gamma-aminopropiltrietoxisilano (APTS); d) Tratados con ácido nítrico y gelatinizados (AN); e) Tratados con ácido nítrico y posteriormente con lignina (AN+lignina); f) Tratados con ácido nítrico y posteriormente con pectina (AN+pectina); o g) Tratados con ácido nítrico y posteriormente con kuzú (AN+kuzú).
La lignina (Lignin, Organosolv, Ref. 8068-03-9, Aldrich Chemical Company Inc.), pectina (Apple Pectin Powder, Ref. 0120. Solgar Laboratoires, EEUU) y kuzú (Mitoku Organic Kuzu) utilizados en el tratamiento de los portas son productos comerciales. Los arrays fueron congelados a -7O 0 C hasta la realización del experimento.
Autorradiografía de r 35 S!GTPγS
Se dejaron secar los portaobjetos con las secciones de tejido durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se preincubaron las secciones de tejido en tampón de ensayo a pH 7,4 [Tris-HCl 50 mM, MgCl 2 3 mM, EGTA 0,2 mM, NaCl 100 mM, adenosina deaminasa 3 mU/ml] durante 20 minutos a temperatura ambiente para eliminar, en lo posible, la presencia de neurotransmisores endógenos; tras ello, se procedió a preincubar las secciones de nuevo en el tampón de ensayo suplementado con guanosindifosfato (GDP) (2 mM) y DTT (1 mM). A continuación, se procedió a incubar los portaobjetos durante 2 horas a 30 0 C en el tampón de ensayo anterior, al cual se le añadieron las siguientes sustancias en función de las diferentes condiciones del experimento: Basal: [ 35 S]GTPyS 0,04 nM Activado: [ 35 S]GTPyS 0,04 nM + agonista Inhibido: [ 35 S]GTPyS 0,04 nM + agonista + antagonista
Inespecífico: [ 35 S]GTPyS 0,04 nM + GTPyS 10 μM
Una vez transcurrido ese tiempo se realizaron 2 lavados de 15 minutos en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 a 4 0 C. Tras el segundo lavado se sumergieron las secciones en agua destilada a 4°C para eliminar las sales y se procedió al secado de los portaobjetos mediante la aplicación de una corriente de aire frío.
Posteriormente, los portaobjetos con las secciones correspondientes fueron expuestos a una película radiosensible (Kodak Biomax MR) que se reveló de forma similar a una película fotográfica. El mareaje se cuantifícó transformando las diferentes
densidades de grises a nCi/g de equivalente de tejido. Para ello cada película se expuso junto con estándares comerciales previamente calibrados (Amersham). La cuantifícación se realizó con resolución anatómica microscópica en un sistema de análisis de imagen computerizado, utilizando el software NIH-image. Las sustancias añadidas en los diferentes ensayos fueron las siguientes:
(A) Para estudiar la fijación de [ 35 S]GTPyS en ausencia (basal) y en presencia de agonistas, se utilizaron los siguientes agonistas:
(i) el agonista cannabinoide WIN 55,212-2 [(R)-(+)-[2,3-dihidro-5- metil-3-[(4-morfolinil)metil]pirrolo[l,2,3-£/,e]-l,4-benzox azin-6-il]- (1-naftalenil) metanona mono-metanosulfonato] [D'Ambra TE et al.
(1992) J Med Chem. 135(l):124-35; Kuster JE, et al., (1993) J Pharmacol Exp Ther. 264(3): 1352-63], producto suministrado por Tocris Cookson (Bristol, Reino Unido); y
(ii) el agonista muscarínico carbacol (H 2 N-C(O)O-(CH 2 ) 2 -N(CH 3 ) 3 ) + (Cl) " (Merck Index 13 a Edición Merck and Co., Inc.; Referencia N°
1786); y
(B) Para estudiar la fijación de [ 35 S]GTPyS en ausencia (basal) y en presencia de ligandos de receptores de galanina, se utilizaron los siguientes ligandos: galanina, galnon, gal(2-l 1), Ml 5 [galanin-(l-13)-sustancia P-5-1 1 amida], M35 [galanin-(l-13)-bradikini,-(2,9) amida] y M40 [galanin-(l-13)-Pro-Pro-Ala-
Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala amida].
Resultados
Fijación de [ 35 S]GTPyS en ausencia (basal) y en presencia de agonistas En la Figura 3 se muestran los resultados de la fijación basal de [ 35 S]GTPyS; en dicha figura se puede observar cómo los soportes tratados con ácido orto-fosfórico o con ácido nítrico y posterior tratamiento con lignina o kuzú presentan una fijación inespecífica menor que con otros soportes (e.g., APTS). Sin embargo, cuando se realiza el mismo experimento en presencia del agonista cannabinoide WIN 55,212-2 (Figura 4) se observa que los portaobjetos con menor fijación inespecífica son los tratados con ácido orto-fosfórico. Este efecto también se observa en el experimento realizado en presencia del agonista muscarínico carbacol (Figura 5). Además, se puede observar que los depósitos de membranas realizados sobre este soporte presentan menos halos que el
resto de soportes utilizado, y que el porcentaje de efecto es máximo en los portaobjetos tratados con ácido orto-fosfórico [tratamiento a)]. Otra ventaja observada fue que la adhesión de la muestra se mantenía durante todo el proceso experimental en los portaobjetos tratados con ácido orto-fosfórico. Este mismo fenómeno se observó en presencia de otros fármacos diferentes ensayados.
Fijación de [ 35 S]GTPyS en ausencia (basal) y en presencia de diferentes ligandos de gal aniña
Utilizando como soportes los portaobjetos tratados según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 se estudió una batería de ligandos de los receptores de galanina con el fin de determinar la actividad específica de cada molécula (Figura 6). En dicha figura se puede observar cómo en algunos tejidos (e.g., pituitaria) se produce un aumento de la fijación de [ 35 S]GTPyS en presencia de galanina, galnon, gal(2-l 1), M15, M35 y M40, sin embargo, la acción del galnon es antagonizada por M35 y M40 (Figura 7).
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que los portaobjetos que han sido tratados con ácido orto-fosfórico según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 fijan membranas celulares de manera que las proteínas insertas mantienen su funcionalidad. Estas membranas se mantienen durante todo el experimento adheridas al soporte. Por tanto, los portas tratados de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 permiten realizar experimentos de autorradiografía de [ 35 S]GTPyS (Figuras 6 y 7). Además los arrays fabricados con los soportes tratados de esta forma presentan una menor fijación inespecífica que el resto de superficies tratadas con otros compuestos como se puede observar en las Figuras 3, 4 y 5.
Next Patent: EXPANDED POLYSTYRENE BLOCK WITH REINFORCING ANCHORS FOR CONSTRUCTION ENCLOSURES