MEMORIA DESCRIPTIVA

Un gran número de productos de condensación con destino fin en la alimentación, química fina o industria farmacéutica s normalmente sintetizados por procedimientos químicos, donde require habitual ente el empleo de cosolventes muy contaminante La necesidad de proteger al medio ambiente ha motivado un gr incremento en la búsqueda de rutas alternativas men contaminantes. En este marco, la ingeniería enzimática se reve como una posible alternativa.

En el caso de los antibióticos se isintéticos, el empleo Penicilina G Acilasas para su síntesis tiene, además, una ser de ventajas. Entre ellas podemos destacar que no hay necesidad proteger el grupo carboxilo del núcleo antibiótico, ni el gru en a del donador de acilo (como por ejemplo en el caso de fenilglicina, ácido homoptálico, etc) o los grupos en cualquie de las otras posiciones (sustituyentes del anillo de much tiazoles, i idazoles, etc) , que la reacción es estereospecifi (importante cuando el donador de acilo es quiral como fenilglicina o el mandélico) , que las condiciones de reacción s suaves...

La Penicilina G Acilasa es el enzima empleado habitualmen por las industrias farmacé ticas como catalizador de la reaci de hidrólisis de Penicilina G para la obtención de ácido aminopenicilámico (6APA) , punto de partida para la síntesis muchos antibióticos β lactá icos. Desde hace años, la Penicili G Acilasa se ha intentado utilizar como catalizador de la segun

HOJ A SU STITU I DA

La Penicilina G Acilasas puede c _at .ii _» . i antibióticos semisintéticos se _g un varias e"" *"

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En la síntesis cinéf ^•if***«** '> ^g nte controlada _, se utiliza un donador de acilo activado ⁽ en forma de amida o, más habitualmente, de ester ⁾ para alcanzar un rendimiento máximo transitorio de producto alejado de las concentraciones de equilibrio. Esta es una de las estrategias más populares (V. Kasche en Biotechnology Letters, 1985, Vol 7 No 12 ;T. Takahashi, K. Kato , Y. Yamazaki y M. Isono en The Japanese Journal of Antibiotics dec. 1977,.. ₎ , debido fun ^d amentalmente a las suaves condiciones de reacción utilizadas, que permiten la utilización de enzimas y derivados enzi áticos sin estabilizar, y a la elevada actividad que el enzima muestra en estas comdiciones. Un hecho a resaltar es que los rendimientos máximos transitorios obtenidos dependen del enzima utilizado. Esta estrategia de síntesis no ha conseguido hasta el momento resultados suficientemente buenos ₍ T.A. Savidge en Drugs and the Phar aceutical Sciences, Vol 22, 1984 ₎ . Una via para mejorarlos parece ser el empleo de cosolventes orgánicos en el medio de reacción, lo que supone unas condiciones de reacción más dráticas en las que la estabilidad del enzima comienza a tener importancia. Pocos trabajos se han orientado en esta dirección. (Kasche en Methods in Enzimology , 19 ₈ 7, Vol 136, ₍ 26 ₎ y en Biotechnology Letters Vol 7 No 12 ₍ 877-882) ₎ .

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La otra estrategia de síntesis que consideraremos es l ter odinamicamente controlada. En ella el rendimiento conseguid viene dado solo por la constante termodinámica. Podemos realiza la reacción sin necesisdad de activar el donador de acilo .S utilizamos un sustrato activado,podremos mejorar notablemente l velocidad del proceso. Este tipo de estrategia tiene do modalidades principales, dependiendo de que el sistema se monofásico o bifásico. En este caso el empleo de un derivado d acilasa u otro (ya sea distinta fuente bacteriana del enzima método de preparación del derivado) solo variará la velocidad d la reacción.

En la síntesis termodinam-if-*τnf-nte controlada en sistema bifásicos, se emplea un cosolvente inmiscible con el agua en e que el antibiótico tenga una mejor solubilidad que en el agua, elevando de esta forma el rendimiento al retirar del medio d reacción el producto. En esta estrategia se requiere un contro muy fino de la actividad agua.

En la monofásicos, se emplean mezclas agua / cosolventes orgánico miscibles para desplazar el equilibrio en el sentido de l síntesis, partiendo de los dos sustratos sin modificar. Consideramos que este tipo de sistemas es el de elección, siempre que sea posible utilizarlo.

La principal ventaja que tiene frente a las otras dos estrategias de síntesis es su mayor simplicidad, lo que permite un mejor diseño del reactor y de la reacción.

Así, frente a la síntesis cinéticamente controlada, podemos decir que la síntesis termodinamicamente controlada:

i HOJA SU ST IT U I DA ¡

1.- No requiere la activación del donador de acilo, con lo que en todo momento solo hay en el medio el anillo antibiótico, el donador de acilo y el antibiótico. En l cinéticamente controlada habría que añadir el ester o l anida del donador de acilo.

2.-En el caso de utilizar un donador de acilo activado en forma de ester o de amida, podremos conseguir una velocid del mismo orden que los sistemas cinéticamente controlad y al final la concentración del donador de acilo será mu baja, si se elije de forma cuidadosa el activador. En la síntesis cinéticamente cotrolada, normalmente el máximo rendimiento puede alcanzarse todavía una gran cantidad de donador de acilo quede en el medio.

3.-El rendimiento conseguido es estable, frente al rendimien transitorio que se alcanza en la síntesis cinéticamente controlada.

4.-El rendimiento que se alcanza es constante al no depende del estado del catalizador. La desactivación de este sol modificará la velocidad con que se alcance el equilibrio En la síntesis cinéticamente controlada el rendimiento podría variar a lo largo del tiempo, según se desactive enzima.

5.- El rendimiento global de la reacción puede mejorarse elevando la concentración de los dos sustratos simultáneamente, o puede mejorarse el rendimiento respec al núcleo antibiótico aumentando la concentración del donador de acilo (más barato, estable y, en muchos cas soluble) . En la síntesis cinéticamente controlada solo puede mejorarse aumentando la concentración de anillo antibiótico.

H OJA SUSTITU I DA

6.-Las condiciones de reacción pueden variarse a lo largo d un proceso con vistas a mejorar la velocidad de la reaci sin perder rendimiento, en la síntesis cinéticamente controlada esto dificultaría aún más el diseño del reacto

7.- Muchos antibióticos parecen ser casos muy favorables pa este tipo de estrategia de síntesis al no tener los pk d carboxilo y del amino muy alejados (como veremos más adelante esto es muy importante para que los rendimient en este tipo de síntesis sean aceptables) .

8.- Si conseguimos, según el punto 4, rendimientos cercanos a 100% para el núcleo antibiótico, la separación del antibiótico de la mezcla de reacción será muy sencilla: solo habrá que separar el antibiótico del exceso de donador de acilo.

Respeco a la síntesis termodinámicamente controlada e sistemas bifásicos, la síntesis termodinámicamente controlada e sistemas monofásicos tiene las siguientes ventajas:

1.- El control del pH es mucho más sencillo en los sistemas monofásicos que en los sistemas bifásicos.

2.-La concentración de agua en los sistemas monofásicos pued considerarse constante a lo largo de la reacción, mientra que requiere un control muy fino en los sistemas bifásicos

3.-La síntesis en sistemas bifásicos debe realizarse en estático con una fuerte agitación, la síntesis en sistema monofásicos admiten el diseño en continuo o en estático.

4.-En el sistema bifásico una gran parte del volumen del reactor puede no ser aprovechada, ya que en muchos casos l

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relacción agua/cosolvente debe de ser muy alta y por tant la proporción de tanque donde podemos situar el enzima puede encontrarse muy disminuida.

DISEÑO DE LA REACCIÓN DE SÍNTESIS.

Hasta hoy, los resultados conseguidos con esta estrategia d síntesis han sido muy pobres (B. McDougall, P. Dunmil and M.D. Lilly en Enzyme Microb. Technol. ,1982,Vol 4,(114-115)) a pesar d las buenas perspectivas iniciales. Consideramos que solo u diseño conjunto de los derivados de Penicilina G Acilasa y de l reacción de síntesis permite trabajar en un margen de condicione suficientemente amplio para conseguir buenos resultados, como y veremos a lo largo de esta introducción.

La reacción que presentamos en esta patente puede expresarse de forma general, como:

PA NÚCLEO ANTIBIÓTICO + DONADOR DE ACILO <« + ANTIBIÓTICO + g ₂

La constante de esta reacción seria:

(ANTIBIÓTICO) . (H ₂ 0)

Kap = (NÚCLEO) ₀ . (DONADOR) ₀

(ANTIBIÓTICO) . (H ₂ 0) ^er ^""** " ^* (NÚCLEO. NH ₂ ) • (DONADOR. COOH)

(NÚCLEO . H ₂ ) . (DONADOR. COOH)

Si hacemos F= (NÚCLEO) ₀ . (DONADOR) ₀

\ HOJA SUSTITU I DA |

Kap :er

Por lo tanto , debemos tener en cuenta que solo las formas iónicas intervienen en el equilibrio . Por lo tanto , l diferencias entre los pKs de los dos sustratos deben de ser más pequeñas posibles , el ideal seria que el pK del amino fue inferior al pK del carboxilo . En unas condiciones dadas , dos s las principales opciones que tenemos para mejorar el rendimient

. Disminuir la concentración del producto no deseado , en este caso el H20.

. Tener un F lo más próximo a 1 posible, de forma que la constante aparente se parezca lo más posible a la constan termodinámica real .

Estos dos efectos se consiguen añadiendo al medio cosolvente orgánicos: disminuiremos la actividad agua y aumentaremos e porcentaje de formas no ionizadas , fundamentalmente del donado de acilo, como consecuencia del aumento de su pK _ap por la mayo apolaridad del medio , lo que estabiliza las formas no iónicas .

El segundo de estos efectos es el principal y será mayo cuanto mayor sea la apolaridad del cosolvente y su concentración De esta forma podemos conseguir elevar el pK del carboxilo po encima del pK del amino , pudiendo encontrar condiciones de pH e las que prácticamente todo el amino este como forma no ionizada pero en las que tengamos una cantidad muy grande de carboxilo protonados .

Sin embargo, a la hora de realizar el diseño de una reacció -con un enzima, se hace necesario considerar los posibles efecto deletéreos del cosolvente sobre el propio enzima .

H OJA SUST IT U I D A

Estos posibles efectos podemos dividirlos en dos tipos:

. Aquellos que efectan a la estructura tridimensional del enzima, bien de forma inmediata, provocando la cam _b ios en la actividad del enzima, bien variando la velocidad de lo cambios a largo plazo, provocando cambios en la estabilidad.

. Las posibles interacciones uni o multipuntuales directas con ciertos residuos del enzima involucrados en la actividad catalítica del enzima, provocando su inhibición. Este efecto tiene una gran importancia en el caso _d e la - Penicilina G Acilasa.

Desafortunadamente, los efectos deletéreos de los cosolventes so ^b re la Penicilina G Acilasa van en el mismo senti _d o que su efecto positivo sobre la constante termodinámica: se hacen más drásticos a medida que aumentamos la apolaridad y la concentración de los mismos. (G. Alvaro, Tesis doctoral Universidad Autónoma, 1988) .

Por lo tanto, la elección adecuada del cosolvente es un factor crítico a la hora de efectuar un diseño adecuado de esta reacción de síntesis.

El empleo de derivados estabilizados protegerá al enzima de parte de los primeros efectos, pero solo por azar podrá evitar los segundos.

En el caso de los núcleos antibióticos, además, hay que tener muy en cuenta la solubilidad de estas moléculas, asi como su esta ^b ili ^d ad, en las diversas condicones de reacción.

Por todo ello, consideramos que un diseño de esta reacción que tenga utilidad práctica, debe de considerar al menos cinco

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puntos :

.1-.Actividad del derivado enzi ático.

DISEÑO DEL CATALIZADOR

.2-.Estabilidad del derivado enzimatico.

.3-.Solubilidad del núcleo antibiótico.

.4-.Estabilidad del núcleo DISEÑO DE LA REACCIÓN antibiótico y del antibiótico.

.5.-Termodinámica del proceso.

Evidentemente, cuanto mayor sea la estabilidad y actividad nuestros derivados, menos peso tendrán los puntos l y 2 en ingeniería de la reacción y mayores serán las posibilidades encontrar las condiciones adecuadas de los puntos 3, 4 y 5 pa cada antibiótico.

En cada caso, dependiendo del donador de acilo y del núcl antibiótico, habrá que estudiar de forma integrada l condiciones óptimas para los cinco puntos anteriores: pH. T, % naturaleza del cosolvente, fuerza iónica..., llegando situaciones de compromiso, que normalmente no recogerán l óptimos de ninguno de los parámetros en particular.

Resulta evidente que unas condiciones en las que la vi operativa del reactor sea muy corta deberán de ser rechazada por muy buenos rendimientos que se obtengan (como ocurriría introducimos Penicilina G Acilasa soluble en una mezcla 70% cosolvente apolar / 30% acetato, a pH 5 y 50"C). Lo mis ocurrirá si en unas determinadas condiciones tenemos una eleva estabilidad del derivado enzimático, pero las solubilidades los sustratos o los rendimientos son bajos (esto es lo que ocur en agua o en mezclas agua / cosolventes suaves) . En cuanto a l

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actividad , unas condiciones en las que la inhibición de los cosolventes , productos o sustratos bloqueen la actividad enzimática , ni siquiera permitirá llegar a las condiciones de equilibrio .

Si no empleamos ningún cosolvente, la estabilidad delenzima es buena, su actividad también, pero solo se obtendrán unos rendimientos aceptabless en unos margenes de pH muy restringidos (J. 0*Sullivan and C. A. Aklonnis en The Journal of Antibiotics, Julio 1984) .

El uso de cosolventes suaves, como glicerina, etilenglicol polietilenglicol, no amplia apenas el margen de condiciones e los que nos podemos mover aún a altas concentraciones (45% d etilenglicol, B. McDougall, P. Dunnill and M. D. Lilly en Enzym Microb. Technol., 1982, Vol 4), al no afectar apenas los pKs d los donadores de acilo con lo que los resultados obtenidos no so suficientemente buenos para su aplicación a escala idustrial.

Tampoco el uso de cosolventes muy apolares, pero a baja concentraciones es suficiente para lograr resultado satisfactorios (20% de acetona o dimetil sulfoxido: V. Kasche e Methods in Enzimology, 1987, Vol 136 (26)).

Consideramos, por lo tanto, que a pesar de los graves efecto deletéreos de los cosolventes apolares, se hace imprescindibl trabajar con ellos (metanol, butanodiol, etanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano, dimetilformamida, dioxano, dimetilsulfóxido...) a concentraciones elevadas, entre el 30 y e 90%. Solamente estas drásticas condiciones tendrán un efect suficiente sobre elos pKs de los donadores de acilo ( R Fernández-Lafuente, G. Alvaro y J. M. Guisan, manuscritos e preparación) . Lógicamente, solo derivados de Penicilina G Acilas con una elevada estabilidad y actividad podrán ser utilizados escala industrial e incluso, en muchos casos, a escala d

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laboratorio . De esta forma podemos conseguir buenos rendimientos en una amplia escala de pH , T, etc . que permitan encontrar valores prácticos de solubilidad y estabilidad de sustratos y productos .

Las condiciones de pH y T óptimas para la solubilidad y estabilidad de sustratos y productos , así como la constante termodinámica, serán muy variables dependiendo del antibiótico en cuestión, según el caso pueden oscilar entre pH 4 , 5 y _pH 8 , 5 _y 0 una temperatura entre -10 *C y 50 »C.

Volvemos remarcar que solo con derivados de Peninicil ina G Acilasa muy estables y activos será posible evitar que - estos factores limiten de forma muy drástica estos márgenes .

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A titulo orientativo , pero no limitativo de la invención se exponen a continuación los siguientes ejemplos:

EJEMPLO i 0

^S e preparan 1 ⁰⁰ mi de una disolución 10 mM de ₆ APA y 4 ₀₀ mM de ac ⁱ do fenilacético, en 50% de dioxano / 50 de acetato 50m M, a pH 7. Al msimo tiempo se prepara una columna termostatizada a ₃₇ . _C con 10 mi de derivado de K. citrophila preparado según patente

^S e dejan pasar 5 ⁰ mi a un flujo de 50 ml/h para equilibrar la columna y en ese momento se pone a recircular la mezcla de reacc ⁱ ón. El _P H se mantiene con ayuda de un pHstato. _S e sigue la reacción por HPLC, utilizando una columna C-18, y como fase móvil 35% metanol / 0, ⁰ 67 M fosfato 0,067 M 65% pH 4,7, midiendo la absorvancia a 260 nm. Se deja recircular hasta que se alcance el equ ⁱ l ⁱ br ⁱ o ⁽ consideramos equilibrio a la no variación en la concentración de sustratos o productos durante 1 hora ₎ . En estas cond ⁱ ciones se consiguen rendimientos en torno al ₉₀ % de

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conversión del 6-APA a penicilina G .

WEKPW 2

Se prepara una disolución 15 mM de 7 ACÁ y 400 mM de ácid tienilacético en 50% dioxano / 50% acetato 50 mM, a pH 6. L columna se termostatiza a 25 ^β C, el flujo y volumen de derivado e igual que en el ejemplo 1. La fase móvil que empleamos para e HPLC es 30% de metanol/70% fosfato 0,067 M a pH 4,7, el resto d las condiciones se mantienen como en el ejemplo 1. Tras alcanza el equilibrio , el grado de conversión de 7-ACA en cefalotina s sitúa por encima del 95%.

EJEMPLO 3

Se prepara una disolución 10 mM de 6 APA y 120 mM de ácid tienil acético en una mezcla de 65% de acetona/ 35% acetato 70mM a pH 5,5. La columna se termostatiza a 4*C, todo lo demás s mantiene como en los anteriores ejemplos. Las condiciones par HPLC son como las del ejemplo 2. En estas condiciones, tra alcanzar el equilibrio, los rendimientos de conversión del 6 AP obtenidos son superiores al 95%.

EJEMPLO 4

Se prepara una disolución 40 mM de 6 APA y 200 mM de ácid fenilacético en 50% butanodiol / 50% acetato 50 mM, a pH 6,5. L columna se termostatiza a 4*C, el resto de las codiciones como e el ejemplo 1. En estas condiciones, el grado de conversión del APA a Penicilina G es superior al 85%.

EJEMPLO 5

Se prepara una disolucióne 4 mM de 7 ADCA y 80 mM de ácid

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acético en 70% etanol / 30% acetato 85 mM a pH 7,5. L temperatura de reacción se sitúa en 15 ^, C .El resto de la condiciones como en el ejemplo 4. En el equilibrio el grado d conversión de 7 ADCA es superior al 90%

Se prepara una disolución 110 mM de ácido fenilacético y 5,5 mM de ácido 7 aminodeacetoxicefalosporanico 2 (5-metil-l,3,4 tiadiazol) (ADACAT) en 60% dimetilsulfóxido / 40% acetato 65 mM, a pH 7,5. La tempertura a la que se realiza la reacción es d 20 ^β C, el resto de las condiciones como en los demás ejemplos. E el equilibrio el grado de conversión del 7 ADACAT era de más del 95%.

EJEMPLO 7

Se prepara una disolución 10 mM de 6 APA y 10 mM de ácido fenilacético en 50% dimetilformamida / 50% acetato 50 mM, a pH 5.

La temperatura de reacción era 4 ^β C. Todas las demás condiciones como en el ejemplo anterior. El grado de conversión de 6 APA conseguido fue mayor del 55%.

E HPI/Q 8

Se prepara una disolución 4,5 mM de 7 AC y 200 mM de ácido tienil acético en 65% dioxano / 35% acetato 70 mM, a pH 8. La temperatura a la que se realiza la reacción es 10 ^β C. Las demás condiciones como en el ejemplo 2. El grado de conversión del 7

ACÁ logrado supera el 95%.

g EMPIfl 9

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Se prepara una disolución 10 mM de 6 APA y 10 mM d fenilacetatil glicina en 50% dimetilformamida / 50% acetato 50 mM, a pH 5. La temperatura de reacción era 4 ^β C. Todas la demás condiciones como en el ejemplo anterior. El grado d conversión de 6 APA conseguido fue mayor del 55%.

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