CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se engloba dentro del campo de la síntesis de fragmentos de DNA monocatenario y sus aplicaciones.

ESTADO DE LA TÉCNICA Desde los primeros experimentos de hibridación (Pardue ML and GaIl JG.

Proc.Natl.Acad.Sci USA 64: 600-604 [1969]) se observó que la hibridación in situ era una de las técnicas que más harían avanzar el conocimiento científico de todas las ciencias biológicas.

Mediante esta técnica se puede conseguir visualizar la presencia de genes y secuencias sobre el DNA tanto en cromosomas extendidos como durante la interfase. También mediante esta técnica es posible visualizar los genes que se expresan en una célula determinada y durante una fase concreta de su ciclo biológico; lo cual establece una ventaja sobre las técnicas de procesamiento de "arrays" de nucleótidos ya que éstas no permiten determinar con exactitud qué genes del cultivo expresan en cada momento. La técnica de hibridación consiste en la obtención o fabricación de una cadena de ácido nucleico de determinada longitud que sea complementaria a la secuencia que se desea estudiar, bien sea DNA o RNA.

Las dos cadenas hibridan mediante la ley de pares de bases de Watson y Crick, es decir, que tanto la cadena diana como la cadena fabricada o "sonda" tienen que ser monocatenarias.

El ácido ribonucleico (RNA) en condiciones habituales se encuentra en forma monocatenaria. Existen diversas técnicas para la fabricación de sondas de RNA (Sambrook and Russell. Molecular Cloning, vol 2:9.29. 3 ^a Edición. CSHL PRESS), aunque la tecnología es compleja, consume tiempo y el rendimiento en cuanto a cantidad no es muy alto. En cuanto a la producción de sondas de DNA monocatenario (ssDNA), varios autores han reportado el sistema utilizado en el presente estudio y que permite obtener la mayor eficiencia en el estado actual de la técnica.

Kitazawa (In situ hybridization with polymerase chain reaction-derived single-stranded DNA probé and Sl nuclease. Histochemistry CeIl Biology, 1998, VoI

111), describe una preparación del fragmento de DNA molde de doble cadena (dsDNA) a partir de una reacción de PCR convencional seguida de otra PCR lineal. Esta segunda

PCR está alimentada por un único cebador específico que dirige la amplificación unidireccional de una sola de las hebras del DNA molde amplificado. El uso en esta segunda etapa de desoxinucleótidos marcados (digoxigenina-11-dUTP) permite la obtención de sondas de hibridación ssDNA que pueden ser utilizadas para la detección in situ de mRNA específico en muestras de tejidos biológicos mantenidos en parafina.

Antes, Konat G.W. ("Generation of high efficiency ssDNA hybridization probes by linear polymerase chain reaction. Scannning Micros. Suppl., 1996, VoI.10), ya había puesto a punto el método de obtención de sondas con nucleótidos marcados con radiactividad o con digoxigenina (dig-11-dUTP) para poder ser utilizadas en muestras de tejidos biológicos.

An S.F. et al. ("Generation of digoxigenin-labelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase chain reaction", Mol. CeIl. Probes, 1992, VoI. 6. Nr. 3), obtiene sondas específicas marcadas con biotina o digoxigenina para hibridar con el virus de la hepatitis B (HBV), y su utilización en tejido de biopsia hepática.

El procedimiento había sido originalmente descrito por Finchk U. et al. ("Producing single-stranded DNA probes with the Taq DNA polymerase: a high yield protocol". Biotechniques, 1991, VoI. 10, No 1), en el que documentan el método de la doble PCR y el mareaje de la segunda con biotina- 11-dUTP y biotina-21-dUTP.

El sistema más extendido para la conservación de cultivos de tejidos es mantenerlos en parafina. Pero este sistema plantea el problema de que destruye la mayor parte de los ácidos nucleicos; el mRNA queda reducido a una cantidad aproximada de la décima parte y suele estar además deteriorado. Esto dificulta la hibridación mediante sondas e impide que éstas puedan ser más resolutivas. La presente invención aporta una solución a la potenciación de señal utilizando sondas cromáticas para la detección de secuencias de mRNA.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención trata de un procedimiento para la síntesis de fragmentos coleados de DNA monocatenario marcados con un hapteno, obtenidos con PCR asimétrica utilizando un cebador universal. Este cebador reconoce una secuencia plasmídica vecina a un inserto y hace factible su utilización "in situ" como sonda sobre tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Así, la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de sondas coleadas de DNA monocatenario, caracterizado porque comprende:

1. la inserción de un fragmento de DNA, obtenido por técnica de PCR y réplica de una secuencia diana, en un vector de expresión y su almacenamiento en una bacteria hospedadora, 2. la amplificación por PCR del fragmento de DNA almacenado según el paso anterior usando cebadores propios del vector,

3. la amplificación del fragmento obtenido en el paso anterior en una segunda PCR asimétrica que utiliza un único cebador descrito en el paso 2 y oligonucleótidos marcados.

En una realización concreta de la invención, el vector de expresión del paso 1 es el plásmido PG&T. En una realización preferida de la invención, el inserto se sitúa entre las secuencias T7F y SP6R del plásmido. En una realización más preferida de la invención, los cebadores del paso 2 son dos oligos complementarios a dichas secuencias T7F y SP6R.

Tras la amplificación del fragmento comprendido entre los dos cebadores según el paso 2 se obtiene un DNA de doble cadena (dsDNA). Dicho dsDNA comprende la secuencia problema junto con una secuencia adicional de nucleótidos que corresponde originalmente al vector. En una realización concreta de la invención, el producto de esta primera amplificación sirve de molde para una segunda amplificación por PCR. En una realización preferida de la invención, dicha segunda amplificación es una PCR asimétrica en la que sólo se utiliza uno de los cebadores utilizados en la amplificación anterior.

En una realización concreta de la invención, en la segunda PCR se introducen nucleótidos marcados. En otra realización concreta, el nucleótido marcado es la desoxiuridina (dUTP). En una realización concreta de la invención, se marca con un hapteno. En otra realización concreta el hapteno está seleccionado entre digoxigenina, biotina o fluoresceína.

En una realización preferente de la invención, en la segunda amplificación se introduce dUTP marcada con digoxigenina.

El resultado de esa segunda amplificación asimétrica es un DNA monocatenario que contiene la secuencia problema junto con una cola de secuencia propia del plásmido.

Esa cola de secuencia no es hibridante pero sí está marcada con nucleótidos de uridina como lo está todo el producto de esta amplificación, de forma que actúa como potenciadora de la señal de la secuencia que híbrida.

En una realización preferente de la invención, los fragmentos de DNA marcados se utilizan como sonda para la detección de expresión génica; entendiéndose como "sonda" un fragmento de DNA empleado para detectar e identificar secuencias correspondientes en ácidos nucleicos mediante su hibridación selectiva con ellas. Así, la presente invención se refiere también a una sonda de DNA monocatenario obtenida por el procedimiento descrito. En una realización concreta de la presente invención, dicha sonda de DNA monocatenario reconoce mRNA que se expresa en una célula diana, tal como se enuncia en el "Estado de la Técnica" de la presente descripción.

En un aspecto concreto, la presente invención se refiere al uso de la sonda de DNA monocatenario previamente definida en un método para la detección de la expresión génica mediante hibridación in situ. En una realización preferente, dicha hibridación se realiza sobre cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. En una realización concreta de la invención, dicho método para la hibridación in situ emplea como tampón PBS a pH 7,4. En una realización preferente, este procedimiento está caracterizado porque además emplea un tampón de hibridación con la siguiente composición: - 0, 1 - 1 % en peso/volumen de DNA de esperma de salmón.

- tampón PBS a pH 7,4.

En una realización concreta de la invención, las sondas de DNA monocatenario preparadas según este procedimiento se liofilizan para su comercialización.

Este sistema de hibridación in situ mediante el uso de sondas de DNA monocatenario obtenidas por el procedimiento descrito resulta ventajoso frente al estado de la técnica por funcionar especialmente bien en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Resuelve el problema de la destrucción de la gran parte del RNA presente descrito en "Estado de la Técnica". En este sentido, una evolución preferida de la presente invención consiste en la posibilidad de hibridar entre sí las colas marcadas de las sondas.

El método descrito elimina pasos innecesarios establecidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, los lavados con formamida y el uso de ci trato sódico salino, que se ha comprobado que produce fondo tisular. Así, sólo se utiliza PBS a pH 7,4 como soporte líquido a lo largo de todo el procedimiento.

De este modo, el proceso de hibridación in situ resulta sencillo y rápido y con alta especificidad; potencia la señal de los fragmentos hibridados, y una incubación de 1 hora es suficiente para que la sonda hibride con el mRNA presente en la muestra de tejido. La estimación de tiempo total desde la desparafinación del tejido hasta su visualización por el microscopio óptico no excede de las 3 horas.

Asimismo, el método utiliza un oligo universal que híbrida con el polilinker del plásmido y que se puede utilizar para clonar cualquier secuencia en el inserto; lo cual estandariza las condiciones del experimento y la eficiencia de los resultados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: En el esquema se muestra la posición de anillamiento de los oligos y las secuencias de las regiones que flanquean al fragmento clonado de interés. Figura 2: Numerosos islotes eritroides se observan teñidos en marrón. Médula ósea. Histosonda Hemoglobina. 10Ox. Figura 3: Las células eritroides muestran una intensa tinción citoplasmática en marrón.

Histosonda Hemoglobina. 40Ox. MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

EJEMPLO 1 Para el diseño y síntesis de una sonda según la invención se llevan a cabo los pasos que se detallan a continuación.

Una vez inmortalizado el fragmento de interés SEQ ID NO: 1 (que será el fragmento que se utilizará para generar la histosonda) se amplificará mediante PCR utilizando dos oligos que flanquean la región clonada. Estos oligos se denominan SP6R y T7F de acuerdo a los genes con los que hibridan. Corresponden a la SEQ ID NO: 2 (SP6R) y SEQ ID NO: 3 (T7F).

La amplificación del fragmento de interés (PCR molde) se lleva a cabo en las siguientes condiciones:

Buffer 1OX [500 mM Tris/HCl, 100 mM KCl, 5OmM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , pH 8,3/25°C] lOμl, MgCl ₂ (25 mM) 6μl, oligo SP6R 0,2μg, oligo T7F 0,2μg, dNTPs Mix (1OmM) lμl, Taq DNA Polimerasa (5U/μl) 0,4μl, DNA plasmiprep molde 3μl (200ng-400ng) y agua 77,6 μl sumando todo un volumen final de lOOμl.

Para generar mas volumen de PCR molde únicamente se deberá multiplicar cada componente de manera proporcionada en función del volumen final deseado que se quiera obtener.

Una vez realizada la mezcla, se somete al siguiente ciclo en el termociclador:

95°C 10 min.

40 ciclos 72°C 2 min.

El tiempo al que se mantendrá la muestra a 72°C durante los ciclos podrá variar en función del tamaño del fragmento que se va ha amplificar (aproximadamente 1 min. por Kb de DNA molde).

El resultado de este proceso es obtener DNA molde para la segunda PCR.

Una vez finalizado el proceso se hará una electroforesis en un gel de agarosa con porcentaje variable (0,8% - 3% p/v) en función del tamaño del fragmento amplificado, para comprobar que el fragmento amplificado es del tamaño correcto. La electroforesis se lleva a cabo en tampón TBE 0,5X (v/v) o TAE IX (v/v) a un voltaje que oscila entre 6OV y 180V hasta obtener una separación de las bandas que permita la comprobación de su tamaño. Una vez comprobado, el siguiente paso será la fabricación de la sonda que se desarrollará en las siguientes condiciones:

El volumen final será de lOOμl. Si es necesario generar más volumen se harán los múltiplos apropiados de los componentes para obtener el volumen final deseado. Una vez realizada la mezcla se someterá al siguiente ciclo:

95°C 5 min. 95 ⁰ C 1 min. 52°C 2 min. -60 ciclos 72°C 2 min 72°C 2 min.

El producto final obtenido es la histosonda, un DNA monocatenario marcado con dUTP más un hapteno, que es complementaria a un fragmento de RNA de interés.

Todo lo que se ha descrito hasta ahora sería llevado a cabo para la generación de histosondas siempre que el fragmento de interés clonado se inserte en el plásmido de clonación en la dirección 5' a 3'; pero puede suceder que el fragmento se inserte en dirección contraria por lo que se llevara a cabo todo el proceso de la misma manera excepto para la generación de la sonda, que será necesario el oligo T7F.