Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden und Glykosylierung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, jeweils eine Saccharidgruppe auf ein Akzeptormolekül zu übertragen, beispielsweise eine Hydroxylverbindung, wie ein Saccharid, Peptid, oder ein Arzneimittel.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt in einem ersten Schritt vorzugsweise die enzymatische Synthese zur Herstellung eines ß-D-Fructofuranosyl-α-D-Aldopyranosids aus Saccharose, das in einem zweiten Schritt als Substrat für die enzymatische übertragung eines der Saccharidreste auf ein Akzeptormolekül eingesetzt wird.

überdies stellt die Erfindung eine Kombination von Edukten und Enzymen bereit, mit der das erfindungsgemäße Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden durchgeführt werden kann.

Stand der Technik

Die EP 0 130 054 offenbart die Verwendung einer Fructosyltransferase zum Transfer des Fructosylrests von Saccharose. Beispielhaft dient Galactose oder ein Glucosederivat als Akzeptormolekül für den aus Saccharose übertragenen Fructosylrest, so dass eine am Pyranosidrest derivatisierte Fructose erhalten wird. Durch anschließendes Halogenieren wird ein halogeniertes Disaccharid erzeugt, das als Süßstoff Verwendung findet. Die übertragung des Fructosylrestes von Fructose mittels der Fructosyltransferase soll auch auf andere Akzeptormoleküle, beispielsweise Arabinose, Lactose, Maltose oder Glycerin möglich sein.

Als Alternativen zu Oligosacchariden menschlicher Milch mit präbiotischer Wirkung werden unter anderem Galacto-, Fructo-, Xylo- und Galacturono-Oligosaccharide getestet. Galacto- Oligosaccharide werden mittels Transglycosylierung durch ß-Galactosidase von Lactose (Boehm et al., Nutrafoods 51-57 (2005)) erhalten. Fructo-Oligosaccharide werden gegenwärtig hauptsächlich aus Zichorie extrahiert (Boehm et al., Acta Paediatrica 18-21 (Suppl. 449, 2005)

Weiterhin ist es bekannt, entsprechend des natürlichen Biosynthesewegs Oligosaccharide durch Verwendung der Transglykosylierung eines als Akzeptormolekül dienenden Saccharids mit aktivierten Saccharidderivaten herzustellen. Diese aktivierten Saccharidderivate sind durch Bindung eines Nukleosiddiphosphats an das C 1 aktiviert. Dieses Syntheseverfahren ist dahingehend nachteilig, dass die aktivierten Glycoside sehr teuer sind und nicht in den für Umsetzungen im technischen Maßstab erforderlichen großen Mengen zur Verfügung stehen.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die Bindungsenergie von ß-D-Fructofuranosyl-α- Aldopyranosiden, allgemein ß-D-Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosiden, als Substrate für die enzymatisch katalysierte übertragung eines der beiden Glycosylreste, nämlich des Ketofuranosylrestes oder des Aldopyranosylrestes, auf ein Akzeptormolekül (siehe beispielsweise Figuren 4 und 7). In der bevorzugten Ausführungsform wird das ß-D- Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosid, von dem ein Glycosidrest auf ein Akzeptormolekül übertragen wird, durch enzymatisch katalysierten Transfer des zu übertragenden

Glycosidrests auf Fructose erzeugt, wobei das Saccharose- Analogon erzeugt wird und Glucose freigesetzt wird (siehe beispielsweise Figur 3). Auf diese Weise ist es möglich, die in der Saccharose- Analogon enthaltene Bindungsenergie in einem Maße zu erhalten, das für die übertragung eines Glycosidrests auf ein Akzeptormolekül ausreicht. Dieser übertragene Glycosidrest ist erfindungsgemäß ursprünglich nicht in Saccharose enthalten.

Als Alternative zur Synthese der Analoga aus Saccharose, bei der der natürliche Fructosylrest durch einen anderen Ketoiuranosylrest ersetzt wird, oder der Glucosidrest durch einen anderen Aldopyranosidrest, kann die Synthese auch anstelle der Saccharose mit einem anderen Zucker durchgeführt werden, der eine ausreichende Bindungsenergie eines Ketofuranosylrests und eines Aldopyranosids aufweist, um das Analogon herzustellen, und anschließend einen dieser Reste auf einen Akzeptor enzymatisch zu übertragen. Ein Beispiel für einen solchen Zucker ist die Raffinose (α-D-Galactopyranosyl-(l,6)-α-D-glucopyranosyl- (l,2)-ß-D-fructofuranosid), bei der anstelle des Glucosidrests der Saccharose ein Galactopyranosyl-(l,6)-α-D- Glucopyranosylrest in 1,2-Bindung mit dem ß-D- Fructofuranosylrest verbunden ist. In der Beschreibung der Erfindung gelten alle Bezugnahmen auf Saccharose und Saccharose- Analoga auch für Raffinose und deren Analoga.

Als Akzeptormoleküle kommen (PoIy-) Hydroxylverbindungen, beispielsweise Saccharide, und Thiolverbindungen in Betracht, sowie Peptide, Proteine oder Arzneimittel. Beide Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich durch mehrfaches Anwenden auf ein Akzeptormolekül dazu einsetzen, mehrere gleiche oder verschiedene Ketofuranosylreste oder Aldopyranosidreste nacheinander zu übertragen, so dass Oligosaccharide mit unterschiedlicher Molmasse erzeugt werden.

In einer ersten Ausführungsform dient das Verfahren zur übertragung des Ketofuranosylrestes auf Akzeptormoleküle, die zumindest eine Hydroxylgruppe als Akzeptor aufweisen, jedoch nicht notwendigerweise reine Glycosidverbindungen sein müssen. Als Beispiel für Substratmoleküle, die Glycoside sind, können ß-D-Ketofuranosyl-D- Aldopyranoside und Derivate von ß-D-Fructofuranosylverbindungen genannt werden. In dieser ersten Ausführungsform wird erfindungsgemäß der derivatisierte Fructosylrest auf das Akzeptormolekül übertragen. Eine solche Reaktion wird durch Ketofuranosyltransferasen, so

wie Fructosyltransferasen katalysiert, beispielsweise durch die Fructosyltransferase aus Bacillus subtilis oder durch eine Glycosyltransferase.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die als Substrat eingesetzte ß-D-Ketofuranosyl-D- Aldopyranosid- Verbindung, in der der Ketofuranosylrest ein Isomer der Fructose in Form einer derivatisierten Fructofuranosylverbindung ist, enzymatisch aus Saccharose hergestellt wird. Dies kann durch Umsetzung von Saccharose mit dem erwünschten Fructosederivat erreicht werden, sodass ein Saccharose- Analogon resultiert, bei dem der ursprüngliche Fructosylrest durch ein Fructosylderivat ersetzt ist. Zur Katalyse kann eine Glycosyltransferase, z.B. eine Fructosyltransferase eingesetzt werden.

Für die Zwecke der Erfindung werden unter dem Begriff derivatisierte Fructofuranosylverbindung bzw. Fructosylderivat Substituenten verstanden, die den Fructosylrest der Saccharose ersetzen können, vorzugsweise in enzymatisch katalysierter Reaktion aus Saccharose. Beispiele für derivatisierte Fructofuranosylreste sind andere Ketofuranosyle, beispielsweise Fructosylderivate und Psicosyl-, Sorbosyl- und Tagatosylreste, sowie Derivate dieser.

In einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung die übertragung des D- Aldopyranosidrestes aus ß-D-Ketofuranosyl-α- Aldopyranosiden auf ein Akzeptormolekül. Als Akzeptormolekül kommen Hydroxyl- und Thiolverbindungen in Frage, beispielsweise Saccharide. Die übertragung des Aldopyranosidrestes wird durch eine spezifische Glycosyltransferase katalysiert. Beispiele für spezifische Glycosyltransferasen sind solche, die spezifisch einen in α 1-2 an einen Ketofuranosylrest, beispielsweise Fructofuranosylrest, gebundenen Mannopyranosyl-, Galactopyranosyl-, Fucopyranosyl- oder Rhamnopyranosylrest oder einen derivatisierten Glycopyranosylrest auf Akzeptormoleküle übertragen. Als Akzeptormoleküle können Kohlenhydrate, Peptide, Proteine, Alkohole, Pharmazeutika und Naturstoffe verwendet werden, die eine Hydroxylgruppe und/oder Thiolgruppe tragen.

In der zweiten Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, dass die ß-D-Ketofuranosyl- D-Aldopyranosidverbindung enzymatisch aus Saccharose hergestellt wird, nämlich durch Umsetzung von Saccharose mit der erwünschten Aldopyranose unter Katalyse durch beispielsweise eine Fructosyltransferase (siehe beispielsweise Figur 3). Auf diese Weise lässt

sich der Glucosidrest der Saccharose durch einen anderen Aldopyranosidrest ersetzen, der in einem nachfolgenden enzymatischen Katalyseschritt auf das Akzeptormolekül übertragen wird (Figur 4).

Das erfindungsgemäße Syntheseverfahren lässt sich in der zweiten Ausführungsform dazu einsetzen, Disaccharide und längerkettige Oligo- oder Polysaccharide gezielt herzustellen, wobei ein Akzeptormolekül, beispielsweise ein Mono- oder Disaccharid jeweils um den Aldopyranosidrest eines ß-D-Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosids verlängert wird. Dabei kann der Aldopyranosidrest in aufeinander folgenden Reaktionen gleich oder verschieden sein, so dass eine Oligosaccharidkette aus gleichen und/oder unterschiedlichen Aldopyranosidbausteinen aufgebaut wird.

Entsprechend kann das erfindungsgemäße Syntheseverfahren dazu eingesetzt werden, Disaccharide und längerkettige Oligosaccharide gezielt herzustellen, wobei ß-D- Ketofuranosidreste bzw. Aldopyranosidreste auf ein Akzeptormolekül übertragen werden. In aufeinander folgenden Reaktionen können so gleiche oder unterschiedliche derivatisierte Ketofuranosid- und/oder Aldopyranosidreste übertragen werden, sodass eine Oligosaccharidkette aus gleichen und/oder unterschiedlichen Ketofuranosyl- und/oder Aldofuranosyleinheiten aufgebaut wird.

Erfindungsgemäße Oligosaccharide, in insbesondere Fructo-Oligosaccharide sind insbesondere zur Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel mit präbiotischer Wirkung geeignet. Denn im Unterschied zu Saccharose, Maltose und anderen Glycosiden, werden die Fructosyl-Oligosaccharide nicht im sauren Millieu des Magens oder enzymatisch leicht hydrolysiert, sondern gelangen zumindest zu einem wesentlichen Teil vom Dünndarm in den Dickdarm. Hier können sie ihre präbiotische Wirkung entfalten, da sie dort von den probiotisch wirksamen Bifidobakterien verstoffwechselt werden, wie beispielsweise durch den Abbau zu kurzkettigem Fettsäuren. Auf diese Weise fördern die erfindungsgemäßen Oligosaccharide Fortbestand und Wachstum von Bifidobakterium, das wichtige physiologische Funktionen des Verdauungsapparates unterstützt und aufrechterhält. Weiterhin lässt sich nachweisen, dass bei Aufnahme erfindungsgemäßer Oligosaccharide im menschlichen Verdauungsapparat die Absorption von Mineralien, beispielsweise Calcium-, Eisen (III) - und Zinkionen begünstigt wird, was auf einen präventiven Effekt für die Osteoporose darstellt. Desweiteren wirken sich insbesondere erfindungsgemäße Fructo-

Oligosaccharide auf den Fettstoffwechsel aus und führen zu einer Senkung des Plasmaspiegels von Cholesterin, sowie zu einer Erhöhung des HDL/LDL - Cholesterin- Verhältnisses, was zu einer Minderung des Risikos arteriosklerotischer Gefäßerkrankungen führt.

Zusammenfassend führt daher die präbiotische Wirkung erfindungsgemäßer Oligosaccharide, insbesondere von Fructosyl - Oligosacchariden, die als Kopfgruppe vorzugsweise eine Aldopyranose tragen, die nicht Glucose ist, direkt oder über die Förderung des Wachstums probiotischer Bifidobakterien zu einer gesundheitsfördernden Wirkung, insbesondere weil die erfindungsgemäßen Oligosaccharide im wesentlichen unverdaubar sind. Als Kopfgruppe sind insbesondere Galactose, Mannose, Fucose, Xylulose, jeweils in D- oder L- Konfiguration, L- Glucose, L-Rhamnose und insbesondere Galactosylmelibiose bevorzugt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

In der ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren und eine Zusammenstellung von Stoffen zur Durchführung dieses Verfahrens bereitgestellt, mit dem ein Ketofuranosylrest, nämlich der Fructosylrest oder ein derivatisierter Fructosylrest, aus einem derivatisierten ß-D-Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosid als Saccharose- Analogon, auf ein Akzeptormolekül übertragen wird. Als Akzeptormolekül können hydroxylgruppen- oder thiolgruppenhaltige Verbindungen dienen, beispielsweise Saccharide, darunter das Saccharose- Analogon selbst, Peptide, Arzneimittel, synthetische oder natürliche Polymere. Für die Transferasereaktion sind dann die entsprechenden Ketofuranosylderivate des Aldopyranosids, vorzugsweise des Glucopyranosids, einzusetzen. Sofern die Spezifität der bevorzugt einzusetzenden Fructosyltransferase für den Transfer eines Ketofuranosylrests, d.h. eines derivatisierten Fructosylrests nicht geeignet sein sollte, so können geeignete spezifische Ketofuranosyl-Transferasen durch Mutagenese und Screenen hergestellt und identifiziert werden, wie dies in analoger Weise nachfolgend für die Herstellung und Identifikation von Glycosyltransferasen beschrieben wird, die für Aldopyranoside spezifisch sind. Dabei ist als Substrat anstelle des jeweiligen Aldopyranosidderivats das jeweils spezifische Ketofuranosylderivat einzusetzen.

Entsprechend betrifft die erste Ausführungsform auch Oligo- bzw. Polysaccharide, die durch übertragung des Ketofuranosylrests erhältlich sind. Wenn für die Transferasereaktion Saccharose- Analoga eingesetzt werden, deren Fructosylrest derivatisiert ist, wird ein Oligomer mit derivatisierten Fructosylbestandteilen erhalten. Erfindungsgemäße Verbindungen der ersten Ausfuhrungsform sind daher Oligo-/Poly-(ketoiuranosyl)- verbindungen, in denen die Ketofuranosylgruppen Fructosyle und/oder derivatisierte Fructosyle sind.

Wenn in der Transferasereaktion Saccharose- Analoga umgesetzt werden, deren Aldopyranosidrest nicht der Glucoserest ist, kann mit geeigneten Glycosyltransferasen der Fructosylrest übertragen werden, so dass ein Oligo- bzw. Polyfructosid mit dem jeweiligen Aldopyranosidrest als Kopfgruppe erhalten wird, der mit Fructosylresten versehen ist. Diese letztere Variante ist dazu geeignet, Oligo- bzw. Polyfructosyl-Aldopyranosid-verbindungen, die auch als Pyranosyloligofructosid oder Pyranosylpolyfructosid bezeichnet werden, unter Katalyse einer Fructosyltransferase herzustellen. Bei diesem Verfahren sind Enzymaktivitäten außerhalb der erwünschten Fructosyltransferase im Unterschied zu einer Polyfructosylierung aus Saccharose nicht störend, wie beispielsweise eine Dextransucrase. Dabei nutzt die Erfindung den Umstand, dass die enzymatisch aktivere Dextransucrase den derivatisierten bzw. formal gegen Glucose ausgetauschten Aldopyranosidrest nicht polymerisiert, während die enzymatisch weniger aktive Fructosyltransferase ohne wesentliche Einschränkung den Fructosylrest vom Saccharose- Analogon auf einen Akzeptor überträgt. Eine geeignete Fructosyltransferase ist aus Leuconostoc mesenteroides oder Bacillus subtilis bekannt. Zu den erfindungsgemäßen Verbindungen der ersten Ausführungsform zählen daher auch Oligo- /Polyfructosyl- Verbindungen, die durch Umsetzung eines Fructosyl-Aldopyranosids erhältlich sind, in denen das Aldopyranosid nicht Glucose ist und freigesetzt wird.

Bevorzugte Pyranosyloligofructoside oder Pyranosylpolyfructoside enthalten im Bereich von 2 bis 10 ⁶ , bevorzugt 2 bis 100, besonders bevorzugt 5 bis 20 oder 10 Fructosyleinheiten auf. Die Frucstosyleinheiten sind untereinander vorzugsweise in C2-C6 und/oder C2-C1 glycosidisch verknüpft. Die C2-C1 Verknüpfung kann beispeilsweise durch eine Inulosucrase katalysiert werden. Der Pyranosidrest ist vorzugsweise endständig in ß- 1,2 an eine Fructoseeinheit glycosidisch gebunden.

In einer zweiten, bevorzugten Ausfϊihrungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden bzw. zur Glykosylierung hydroxylgruppenhaltiger und/oder thiolgruppenhaltiger Akzeptormoleküle bereitgestellt, mit dem ein Aldopyranosidrest aus einer ß-D-Ketoiuranosyl-α-D-Aldopyranosidverbindung übertragen wird. Das bevorzugte ß-D-Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosid ist die Saccharose, bevorzugt ein Saccharosederivat, das anstelle des Glucoserests als Aldopyranosid den Rest einer anderen Aldopyranose oder ein Glycosidderivat enthält.

Entsprechend betrifft die zweite Ausführungsform auch Oligo- bzw. Polysaccharide, die durch übertragung des Aldopyranosidrests erhältlich sind. Wenn für die Transferasereaktion Saccharose- Analoga eingesetzt werden, deren Aldopyranosidrest ein derivatisierter Glucosidrest oder ein anderer Aldopyranosidrest als Glucose ist, wird ein Oligomer oder Polymer mit den derivatisierten bzw. anderen Aldopyranosidbestandteilen als Glucose erhalten. Erfindungsgemäße Verbindungen der zweiten Ausführungsform sind daher Oligo- /Poly-(aldopyranosyl)-verbindungen, in denen der Aldopyranosylrest derivatisiertes Glucosyl oder ein anderes Aldopyranosyl als Glucosyl ist.

Für die Zwecke der Erfindung werden Derivate der Saccharose, bei denen der Fructosylrest durch ein Derivat des Fructosylrests oder einen anderen Ketofuranosidrest und/oder der Glucosidrest durch ein Derivat des Glucosidrests oder einen anderen Aldopyranosidrest formal ersetzt ist, als Saccharose- Analoga bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Umsetzung der Erkenntnis, dass die Bindungsenergie der glycosidischen Bindung von Saccharose (-23 kJ/Mol) ausreicht, um in einer kinetisch kontrollierten Synthese den Ketofuranosylrest oder den Aldopyranosidrest auf ein Akzeptormolekül zu übertragen, auch wenn in den Saccharose- Analoga nur einer dieser beiden Reste durch formalen Austausch des Ketofuranosylrests gegen ein Fructoseisomer oder ein Fructosylderivat und/oder der Glucopyranosidrest durch einen anderen Aldopyranosidrest ersetzt ist.

Für diese Transferasereaktion sind daher die Dauer der Reaktion und die während der Transferasereaktion herrschenden Konzentrationen an Edukten und Produkten so einzustellen, dass die Transferasereaktion im Wesentlichen nach Erreichen der höchsten Konzentration an Produkt beendet wird. Diese kinetisch kontrollierten Transferreaktionen für die erste und

zweite Ausführungsform lassen sich in geeigneten Reaktortypen, beispielsweise durch Verwendung immobilisierter Enzyme und angemessene begrenzte Kontaktzeiten, und/oder Steuerung der Konzentrationen von Edukten und Produkt durchfuhren und regeln (Böker et al., Biotech. Bioeng. 43, 856-864 (1994)).

Die für das erfindungsgemäße Verfahren einzusetzende Glycosyltransferase, die für einen Ketofuranosidrest bzw. einen Aldopyranosidrest, bzw. Derivate dieser Glycosidreste spezifisch ist, d.h. einen gewünschten Ketofuranosidrest bzw. einen Aldopyranosidrest aus einer ß-D-Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosid- Verbindung, z.B. einem Saccharose- Analogon auf ein Akzeptormolekül übertragen kann, kann im Screening- Verfahren identifiziert werden. So können bekannte Enzyme, beispielsweise Fructosyltransferase oder Dextransucrase auf ihre Spezifität für einen bestimmten Ketofuranosidrest bzw. Aldopyranosidrest in einem ß-D- Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosid dadurch identifiziert werden, dass das Enzym in vitro das spezifische ß-D-Ketofuranosyl-α-D-Aldopyranosid umsetzt. Die Umsetzung führt bei einem Enzym mit der gesuchten Spezifität zur übertragung des Ketofuranosidrests bzw. des Aldopyranosidrests auf ein Akzeptormolekül, beispielsweise zur Oligomerisierung unter gleichzeitiger Freisetzung des Aldopyranosidrests bzw. des Ketofuranosylrests des als Substrat eingesetzten Saccharose- Analogons. Die Aktivität eines spezifischen Enzyms lässt sich daher beispielsweise durch colorimetrischen und/oder photometrischen Nachweis des Hydrolyseprodukts bestimmen. Bei der Freisetzung von Fructose nach übertragung eines Aldopyranosidrests aus einem ß-D-Fructofuranosyl-α-D-Aldopyranosid kann die Fructose als freies Hydrolyseprodukt nach Isomerisierung durch Glucoseisomerase zu Glucose, Phosphorylierung mittels Hexokinase und Oxidation durch Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase bei gleichzeitiger Reduktion von NADP zu NADPH spektrophotometrisch bestimmt werden. Dieses Testsystem ist auf verschiedene Aldopyranosid-Derivate anwendbar, d.h. beispielsweise Saccharose- Analoga, bei denen der Glucosidrest ersetzt ist, beispielsweise durch ein anderes Aldopyranosid oder ein Derivat des Glucosidrests.

In weiter bevorzugter Ausführung der Erfindung werden die ß-D-Ketofuranosyl-α-D- Aldopyranoside enzymatisch hergestellt. In der zweiten Ausführungsform der Erfindung wird, vorzugsweise ausgehend von Saccharose, ein erwünschtes ß-D-Ketofuranosyl-α-D- Aldopyranosid als ß-D-Fructosyl-α-D- Aldopyranosid hergestellt, in dem der Glucosidrest der Saccharose gegen den erwünschten Aldosidrest ausgetauscht wird. Dies kann von einer Fructosyltransferase katalysiert werden, beispielsweise der Fructosyltransferase aus Bacillus

subtilis (NCIMB 11871). Derartige ß-D-Fructosyl-α-D-Aldopyranoside können auch als Saccharose- Analoga bezeichnet werden, da die Saccharidbindung der Saccharose erhalten bleibt, jedoch der ursprüngliche Glucosidrest durch einen neuen Pyranosidrest ausgetauscht ist.

Für die erste Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, Saccharose- Analoga enzymatisch herzustellen, bei denen der Fructosylrest formal gegen ein Fructosylderivat oder einen anderen Ketofuranosylrest ausgetauscht ist. Diese Reaktion kann durch eine Glucosyltransferase katalysiert werden.

Erfindungsgemäß einzusetzende Saccharose- Analoga sind dabei beispielsweise solche Verbindungen, in denen der Fructosylrest der Saccharose durch einen Rest ersetzt ist, der ausgewählt ist unter einem Ribulose-, Lyxose-, Xylulose-, derivatisiertem Fructose-, Ribulose-, Psicose-, Sorbose-, Tagatoserest oder eine andere an das C 1 des Glycosidrests glycosidisch gebundene Pentose, Hexose, Heptose, jeweils in D- oder L-Konfiguration, oder substituierte Derivate der vorgenannten Reste.

Beispiele für Saccharose- Analoga, die in der zweiten Ausführungsform der Erfindung eingesetzt werden können, sind ß-D-Fructosyl- Verbindungen, die am C2 des Fructosylrests einen Ribose-, Arabinose-, Xylose-, Lyxose-, Allose-, Altrose-, Galactose-, Mannose-, Gulose-, Idose-, Talose-, Fucose-, 2-N-Acetylglucosamin-, 2-N-Acetylgalactosamin-, 2- Deoxyglucose-, 3-Deoxyglucose-, 4-Deoxyglucose-, 6-Deoxyglucose-, 2-Deoxygalactose-, 3- Deoxygalactose-, 3-Ketoglucose-, 4-Ketoglucose-, Sialinsäure-, N-Acetyl-Neuraminsäure- Rest, jeweils in D- oder L-Konfiguration, L-Glucose, oder eine andere glycosidisch gebundene Pentose, Hexose, Heptose oder substituierte Derivate der vorgenannten Reste, z.B. einen derivatisierten Glucoserest aufweisen.

Als Akzeptormoleküle können alkoholische Hydroxylgruppen von Kohlenhydraten, Steroiden, Terpenen, Polyketiden, Hydroxyaminosäuren, Hydroxynitrilen, andere Stoffwechselprodukten von Mikroorganismen, Diglyceride, Ceramide, enolische und/oder phenolische Hydroxygruppen von Phenolen, Flavonoiden sowie Mercaptogruppen und Amidgruppen, beispielsweise von Asparagin, Threonin, Serin, Cystein, beispielsweise als Bestandteil von Peptiden, Purinen, Pyrimidinen, Benzimidazol oder Nicotinsäureamid ausgewählt werden.

Erfindungsgemäß ist in bevorzugter Ausführung vorgesehen, dass die Saccharose- Analoga, die zur Herstellung von Pyranosyloligofructosiden oder Pyranosylpolyfructosiden eingesetzt werden, die durch enzymkatalysierte Umsetzung der Pyranose mit Saccharose erzeugt werden, entsprechend den anderen Ausführungsformen der Erfindung.

Die Erfindung wird nun detailliert anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen

• Figur 1 eine schematische Darstellung des Screenens geeigneter Aldopyranosid- Transferasen zeigt,

• Figur 2 eine schematische Darstellung des Screenens geeigneter Ketofuranosid- Transferasen zeigt,

• Figur 3 eine schematische Darstellung der bevorzugten Synthese der Saccharose- Analoga ist,

• Figur 4 eine schematische Darstellung der Glycosylierung eines Akzeptormoleküls (acceptor) mit einem Glykosid ist, das zunächst in ein Saccharose- Analogon überführt wurde,

• Figur 5 eine schematische Darstellung der übertragung eines Fructosylrests von einem Aldosylfructosid auf einen Alkohol ist,

• Figur 6 eine schematische Darstellung der übertragung eines Fructosylrests von einem Aldosylfructosid auf ein Aminosäurederivat ist,

• Figur 7 eine schematische Darstellung der Synthese eines Xylosyl-Oligofructosids aus Xyl-Fru mit einer Fructosyltransferase aus Bacillus subtilis ist,

• Figur 8 die schematische Darstellung der Synthese eines Galacto-Oligofructosids aus dem Saccharose- Analogon Gal-Fru mit einer Fructosyltransferase aus Leuconostoc mesenteroides ist,

• Figur 9 Dünnschichtchromatogramme über den Verlauf der Synthese zu erfindungsgemäßen Polysacchariden (PS) zeigen, unter a) Gal-Fru-(Fru) _n , b) Gal-Fru- (Fru)„ und c) Fuc-Fru-(Fru)„,

• Figur 10 das ESI-MS Spektrum einer erfindungsgemäßen Transfructosylierungs- reaktion für Xyl-Fru-(Fru) _n und deren Reaktionsschema zeigt,

• Figur 11 ein Dünnschichtchromatogramm der Synthese von Mannosyl-Oligofructosid aus D-Man-Fru zeigt,

• Figur 12 Dünnschichtchromatogramme über den Verlauf der Synthese zu erfindungsgemäßen Polysacchariden zeigen,

• Figur 13 eine schematische Darstellung der Glycosylierung eines am polymeren Träger immobilisierten Akzeptormoleküls mit anschließendem Nachweis des synthetisierten Oligosaccharids ist,

• Figur 14 eine schematische Darstellung der übertragung eines Furanosidrests von einem Saccharose- Analogon (Galactosylfructosid) auf ein Saccharid zur Herstellung eines Oligosaccharids ist,

• Figur 15 eine schematische Darstellung der Oligomerisierung bzw. Polymerisation von Pyranosidresten, die aus einem Saccharose- Analogon stammen, ist und

• Figur 16 eine schematische Darstellung der Oligomerisierung von Furanosidresten ist, die aus einem Saccharose- Analogon stammen.

Beispiel 1 : Herstellung und Identifikation einer spezifischen Glvcosyltransferase Für die vorliegende Erfindung ist es bevorzugt, eine spezifische Glycosyltransferase für die übertragung des Ketofuranosylrests bzw. des Aldopyranosidrests aus einem Saccharose- Analogon auf ein Akzeptormolekül einzusetzen. Zur übertragung von Aldopyranosidresten aus Saccharose- Analoga wurden zunächst Mutanten von Dextransucrase erzeugt. Für die Mutagenese wurden die Gene der Glycosyltransferase GtfR aus Streptococcus oralis ATTC 10557, DsrS aus Streptococcus mesenteroides (Fujiwara et al., 2000), GtfB und GtIC (Streptococcus mutans), mit induzierbaren Promotoren gekoppelt. Als induzierbarer Promotor wurde ein IPTG-abhängiger Promotor, alternativ ein mit Arabinose oder durch Dihydrotetracyclin regulierbarer Promotor verwendet.

Die Glycosyltransferasegene wurden einer statistischen Mutagenese unterworfen, vorzugsweise durch regiospezifische PCR, die einzelne Segmente der Gene betraf, beispielsweise die an der Substratbindung beteiligten Domänen. Auf diese Weise konnten einzelne Segmente der Glycosyltransferasegene mutiert werden, die anschließend eine Genbibliothek mutierter Gensequenzen bildeten und kombinatorisch miteinander zu neuen Glycosyltransferasegenen verknüpft wurden. Alternativ wurden die Bibliotheken von Gensegmenten verwendet, um das entsprechende Segment in der Wildtyp- Sequenz zu ersetzen. Zum Screenen der erhaltenen Substratspezifitäten der mutierten Glycosyltransferasegene wurden diese in E. coli (BL21) exprimiert.

Das Screenen erfolgte durch Zusetzen des jeweiligen Saccharose- Analogons und colorimetrische oder spektrophotometrische Bestimmung des freigesetzten reduzierenden Zuckers. Denn bei Vorliegen einer Spezifität für den Fructosylderivatrest bzw. Aldopyranosidrest eines Saccharose- Analogons wird als Nebenprodukt der nicht übertragene Saccharidrest freigesetzt. Dieser freigesetzte Saccharidrest ist reduzierend und kann durch herkömmliche Verfahren spektrophotometrisch bestimmt werden.

Durch Screenen mutierter Glycosyltransferasegene konnten für die hier allgemein und konkret bezeichneten Saccharose- Analoga spezifische Transferasen gefunden werden und insbesondere für die folgenden Saccharose- Analoga mit hoher spezifischer Transferase- Aktivität, wobei jeweils nur der gegenüber der Saccharose formal ersetzte Saccharidrest angegeben ist: α-D-Mannosid, α-D-Galactosid, α-D-Xylosid (spektrophotometrische Messung freigesetzter Fructose bzw. Glucose).

Für eine genauere Charakterisierung der erhaltenen Glycosyltransferasemutanten wurden diese einem sekundären Screening unterworfen, bei dem Transferasen mit einem Akzeptormolekül und dem spezifischen Substrat inkubiert werden. Gebildete Produkte werden anschließend in der Dünnschicht-Chromatographie, durch HPLC-MS sowie NMR analysiert.

Zur Identifikation von Glycosyltransferasen, die Lektin bindende Oligosaccharide synthetisieren, kann ein Screeningverfahren eingesetzt werden, bei dem ein Lektin, für das ein spezifisch bindendes Oligosaccharid gesucht wird, zur Identifikation des an einer Festphase synthetisierten Oligosaccharids eingesetzt wird. Für ein einfaches Nachweisverfahren ist das Lektin mit einer Reportergruppe gekoppelt, beispielsweise einem fluoreszierenden Molekül. Zur Festphasen-gebundenen Synthese des Oligosaccharids, das von der Glycosyltransferase aus den Saccharose- Analoga synthetisiert wird, wird ein Akzeptormolekül eingesetzt, das an eine Festphase gekoppelt ist und eine freie Hydroxylgruppe aufweist. Diese kann beispielsweise die phenolische Hydroxylgruppe sein, wie sie schematisch für das Screeningverfahren in Figur 1 dargestellt ist.

Für die Identifikation geeigneter Glycosyltransferasen werden bekannte Enzyme oder Mutagneseprodukte dieser gescreent, wie beispielsweise Dextransucrasen, Fructosyltrans- ferasen oder Mutanten von Glycosyltransferasen. Ein Screeningverfahren ist schematisch in

Figur 1 dargestellt, wobei die Spezifität der Transferase dadurch identifiziert wird, dass ein Lektin mit Spezifität für das erwünschte Oligosaccharid zur Identifikation der Oligosaccharide verwendet wird, die aus den als Cosubstraten zur Verfügung gestellten Saccharose- Analoga synthetisiert werden.

Für eine einfache Analyse ist der Akzeptor festphasengekoppelt, sodass auch das synthetisierte Oligosaccharid mit der festen Phase verbunden ist und auf einfache Weise von den übrigen Bestandteilen der Reaktion abgetrennt werden kann. Nach Reaktion mit dem Lektin kann die spezifische Bindung durch Nachweis einer mit dem Lektin gekoppelten Gruppe, beispielsweise eines fluoreszierenden Moleküls, nachgewiesen werden. In dem in Figur 1 dargestellten Fall werden Saccharose- Analoga eingesetzt, bei denen der Glucosidrest gegen einen anderen Bestandteil ausgetauscht ist, beispielsweise gegen einen anderen Aldopyranosidrest oder einen derivatisierten Glucosidrest.

Das Screeningverfahren von Figur 1 lässt sich auch mit Saccharose- Analoga durchführen, die anstelle des Fructosylrests einen derivatisierten Fructosylrest bzw. einen anderen Ketofuranosidrest aufweisen, um eine Transferase zu identifizieren, die den jeweiligen Ketofuranosidrest spezifisch überträgt.

Ein Beispiel für das Screenen nach einer Fructosyltransferase mit Spezifität für die übertragung eines Ketofuranosidrests aus einem Saccharose- Analogon ist in Figur 2 dargestellt. Das Akzeptormolekül ist ebenfalls durch Bindung an einen polymeren Träger immobilisiert und die Spezifität der Fructosyltransferase wird dadurch analysiert, dass bei Einsatz eines Saccharose-Analogons, bei dem der Fructosylrest gegen einen anderen Ketofuranosidrest bzw. ein Derivat des Fructosylrests ausgetauscht ist, durch anschließende Hydrolyse des am Akzeptormolekül synthetisierten Oligosaccharids reduzierende Zucker bestimmt werden.

Auch dieses Verfahren zum Screenen kann unter Verwendung von Saccharose- Analoga, die anstelle des Glucosidrests eine andere Aldopyranose bzw. ein Derivat des Glucosidrests aufweisen, zum Screenen von Glycosyltransferasen eingesetzt werden, die für den jeweiligen Rest des Saccharose-Analogons spezifisch ist, der den ursprünglichen Glucosidrest ersetzt.

Am Beispiel der Glycosyltransferase R aus ATCC 10557 (enthalten als Seq. -ID Nr. 5) (Fujiwara et al, Infect. Immun. 68: 2475-2483 (2000)), zugänglich unter AB025228; BAA 95201.1 (EMBL) ließ sich zeigen, dass einzelne Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren das Substratspektrum der als Wildtyp als Glucosyltransferase bezeichneten Enzyms verändert werden konnte. Mit dem vorangehend beschriebenen Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese wurden Varianten der Wildtyp- Sequenz erzeugt, die andere Substratspezifitäten aufwiesen und in Tabelle 1 zusammengefasst sind.

Tabelle 1: Neue Glvcosyltransferasen auf Basis der Glucosyltransferase R aus ATCC 10557

Die Numerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die vorgenannte veröffentlichte Wildtyp- Sequenz, die eingeführten Mutationen sind unterstrichen.

Beispiel 2: Synthese eines Disaccharids mit immobilisierter Glvcosyltransferase Zur Immobilisierung von Glycosyltransferasen können bekannte Träger, beispielsweise Eupergit-C (Röhm&Haas) eingesetzt werden. Eine weitere geeignete Methode zur Immobilisierung ist der Einschluß in Alginat, was als Verfahren dem Fachmann bekannt ist. Solchermaßen immobilisierte Enzyme können in Durchflußreaktoren oder Batchreaktoren eingesetzt werden, wie dies im Stand der Technik allgemein bekannt ist (Reischwitz et al., Enz. Microb. Technol. 19, 518-524 (1996)).

Beispiel 3: Synthese von Saccharose- Analoga

Für die enzymatische Synthese von erfindungsgemäß einzusetzenden ß-D-Fructofuranosyl-α-

D-Aldopyranosiden wird der Glucosidrest der Saccharose durch das gewünschte

Aldopyranosid ersetzt. Diese Reaktion wurde durch die Fructosyltransferase aus Bacillus subtilis NCIB 11871 durchgeführt und es konnte gezeigt werden, dass bei Zuckerkonzentrationen in der Reaktionslösung von 10 bis 400 g/L, bevorzugt 100-300 g/L Saccharose- Analoga hergestellt werden können. Die Produkte können an Ionentauschern aufgetrennt werden.

Der schematische Ablauf der Synthese von Saccharose- Analoga ist in Figur 3 am Beispiel der Ersetzung des Glucosylrests durch einen frei wählbaren Aldopyranosidrest gezeigt. Dabei wird Saccharose mit einer Aldopyranose als Cosubstrat, katalysiert durch Fructosyltransferase, unter Freisetzung von Glucose zum Aldopyranosid- 1,2-ß-D-Fructosylfuranosid umgesetzt.

In den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 sind die für die Umsetzung von Saccharose eingesetzten Cosubstrate und die mit der Fructosyltransferasereaktion erhaltenen Saccharose- Analoga als Disaccharide bzw. Trisaccharide aufgeführt:

Tabelle 1 : Aus Saccharose synthetisierte Disaccharid-Saccharose- Analoga

ortsetzung Tabelle 1 :

Tabelle 2: Aus Saccharose synthetisierte Trisaccharid-Saccharose-Analoga

ortsetzung Tabelle 2:

Beispiel 4: Glykosylierung eines Akzeptors durch übertragung des Pyranosidrests aus einem Saccharose- Analogon

In Figur 4 ist schematisch dargestellt, wie erfindungsgemäß der Aldopyranosidrest eines Saccharose- Analogons auf einen Akzeptor, der hier eine Hydroxylgruppe aufweist, übertragen wird. Mit Hilfe einer bekannten oder durch Mutagenese modifizierten Glycosyltransferase wird der Aldopyranosidrest auf die Hydroxylgruppe des Akzeptormoleküls übertragen, wobei Fructose freigesetzt wird. Im Ergebnis wird ein ein- bis mehrfach mit dem Aldopyranosidrest glycosyliertes Akzeptormolekül als Produkt erhalten.

Beispiel 5: Fructosylierung durch übertragung des Fructosidrests aus einem Saccharose- Analogon auf einen hydroxylgruppenhaltigen Akzeptor

Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Fructosylderivats ist schematisch in Figur 5 am Beispiel der übertragung des Fructoserests von dem Saccharose- Analogon Galactosylfructosid auf Alkohole dargestellt. Unter Katalyse der ß-Glucosidase wird der Fructosidrest auf die Hydroxylgruppe des Cosubstrats Alkohol übertragen, so sodass ein fructosylierter Alkohol erhalten wird. Der Galactsidrest wird als Galactose freigesetzt. Durch Fortführung der Reaktion kann eine Oligo- bzw. Polyfructosylierung des Akzeptors erzielt werden, wobei jeweils eine weitere Fructosylgruppe auf den Akzeptor übertragen wird.

Beispiel 6: Fructosylierung durch übertragung des Fructosidrests aus einem Saccharose- Analogon auf eine Aminosäure

In Figur 6 ist schematisch die übertragung des Fructosylrests aus einem Saccharose- Analogon, hier ein Galactosylfructosid, auf eine Aminosäure gezeigt. Die Aminosäure ist

derivatisiert, nämlich Serin, dessen Carboxyl- und Amingruppe jeweils eine Schutzgruppe aufweisen. Dieses geschützte Serin ist stellvertretend für Aminosäuren gezeigt, die in einem Peptid gebunden sind und für die Fructosylierung geeignete reaktive Akzeptorgruppen haben. Dies können neben der gezeigten Hydroxylgruppe Thiolgruppen und Amingruppen sein. Unter Katalyse der ß-Glucosidase wird der Fructosylrest auf die Hydroxylgruppe des Serins übertragen, sodass ein fructosyliertes Serinderivat, stellvertretend für fructosylierte Peptide, erhalten wird.

Beispiel 7: Synthese von Pyranosyloligofructosiden Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Pyranosyloligofructosids oder Pyranosylpolyfructosids ist schematisch in Figur 7 am Beispiel des Xylosyl-di- bzw. poly- Fructosids mit 4 Fructosyleinheiten durch Umsetzung von Xylosylfructosid mit Fructosyltransferase aus Bacillus subtilis gezeigt. Der Fructosylrest des Saccharose- Analogons Xylosylfructosid wird durch die Fructosyltransferase auf Xylosylfructosid übertragen, so dass unter anderem das gezeigte Xylosyldifructosid, und bei Fortsetzung der Transferasereaktion ein penta-Glycosid mit beispielsweise der gezeigten Struktur von 4 Fructosylresten und 1 Xylosyl erhalten wird. Durch Fortsetzen der Reaktion lassen sich längere Fructosylketten erhalten, die wenigstens 5 bis 100 Fructosyleinheiten aufweisen. Die Bindungen der Fructosyleinheiten sind C2-C6, teils auch C2-C1. Der endständige Pyranosidrest, hier Xylosyl, ist entsprechend des Saccharose- Analogons in α- Stellung am Cl mit dem C2 der nächsten Fructosyleinheit in ß- Stellung gebunden.

Figur 8 zeigt schematisch die übertragung des Fructosylrests aus Gal-Fru mit Hilfe der Fructosyltransferase aus Leuconostoc mesenteroides. Entsprechend der Synthese des Xylosyl- oligo-Fructosids wird ein Galacto-oligo- bzw. -polyfructosid erhalten.

Für die Synthese erfindungsgemäßer Oligosaccharide wurden als Substrat Fructosyl- Aldopyranoside eingesetzt, die durch Umsetzung von Saccharose mit der jeweils den Glukoserest ersetzenden Aldopyranose erhalten worden waren. Zur Katalyse wurde eine Fructosyltransferase eingesetzt.

Neben D-Gal-Fru wurde auch D-Fuc-Fru eingesetzt, um mittels der Fructosyltransferase aus L. mesenteroides (FTF-I) oder B. subtilis (NCIMB 11871, FTF-2) D-GaI-FrU-(FrU) _20-100 und D-Gal-Fru-(Fru)> ₁₀₀ bzw. D- Fuc-Fru-(Fru)2 _O-1 oo ^un ^ D- Fuc-Fru-(Fru)> ₁₀₀ herzustellen. Der

Verlauf der Synthese ist in Figur 9 anhand von Dünnschichtchromatogrammen gezeigt, in der unter a) der Syntheseverlauf mit FTF-I (137U/L) und unter b) der Syntheseverlauf mit FTF-2 (2860 U/L) der Umsetzung von D-Gal-Fru gezeigt ist, unter c) der Syntheseverlauf mit FTF-2 (2860 U/L) der Umsetzung von D-Fuc-Fru. Es ist jeweils erkennbar, dass über die dargestellte Zeit das vorgenannte Polysaccharid (PS) synthetisiert wird, wobei Oligosaccharide (OS) nicht aufgetrennt werden konnten und längerkettige PS am Auftragspunkt (unten eingefügt in die Chromatogramme) verblieben.

Ebenfalls mit FTF-2 synthetisiert wurde XyI-FrU-(Fm) _1-S o aus Xyl-Fru, wie in Figur 10 schematisch gezeigt. Das ESI-MS-Spektrum von XyI-FrU-(Fm) _1-S o ist in Figur 10 dargestellt, in dem die Signale 335,1, 497,1, 659,2, 821,2, 983,3, 1145,3, 1307,4, 1469,4, 1631,4 ([M + Na] ⁺ ) Oligosaccharide des Typs XyI-(Fm) _n mit n 1 - 9 anzeigen. Höhere Molekulargewichte als die in Figur 10 angegebenen wurden in Dünnschichtchromatogrammen abgeschätzt.

Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Synthese zeigt sich darin, dass ein Zusatz von Dextransucrase nicht zur Erzeugung von Dextran führt. Dies wird darauf zurückgeführt, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Saccharose- Analoga, deren Glucosidrest derivatisiert oder gegen einen anderen Rest ausgetauscht ist, beispielsweise gegen eine andere Hexose, kein Substrat für Dextransucrase darstellt. Daher lassen sich aus Saccharose- Analoga Oligo- oder Polyfructoside herstellen, ohne dass durch Nebenreaktionen Dextran bzw. ein Polymer der Aldopyranosidreste als Verunreinigung auftreten.

Ein weiteres Beispiel für die übertragung des Fmctosylrests aus einem Saccharose- Analogon ist die übertragung des Fmctosylrests aus D-Man-Fru mit der FTF-2. Für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Mannosyl-Oligofructosids des Typs (D-Man-Fru-(Fru) _1-8 ) wurde D- Man-Fru mit der FTF-2 inkubiert, wobei dieses Saccharose- Analogon sowohl als Akzeptor als auch als Substrat für die übertragung des Fmctosylrests dient. Zur Unterdrückung der Nebenreaktion, die als Hydrolyse des Saccharose- Analogons auftreten kann, kann grundsätzlich eines der Hydrolyseprodukte zugesetzt werden, vorzugsweise das Aldopyranosid, hier D-Mannose. Unter ansonsten identischen Reaktionsbedingungen kann die Ausbeute durch diesen Zusatz zur Reaktionsmischung erhöht werden.

Das Ergebnis der Umsetzung von D-Man-Fru zu deren Fructosylierung mit demselben Saccharose- Analogon als Substrat ist im Dünnschicht-Chromatogramm in Figur 11 gezeigt, wobei mit der Bezugsziffer 1 die D-Mannose identifiziert wird, mit der Bezugsziffer 2 das Saccharose- Analogon und mit der Bezugsziffer 3 die D-Mannosyl-Oligofructoside (D-Man- Fru-(Fru) _1-8 ). Die Angaben zu den einzelnen Spuren der Dünnschicht-Chromatographie geben die Reaktionsdauer in Minuten an. Der Ausschnitt mit Bezugsziffer 4 deutet an, dass selbst nach einer Reaktionsdauer von drei Tagen noch Saccharose- Analogon als Substrat nachgewiesen werden kann.

Diese Beispiele zeigen weiterhin, dass die Bindungsenergie der erfindungsgemäß einzusetzenden Saccharose- Analoga ausreicht, um jeweils einen der beiden Glycosidreste unter Freisetzung des anderen Glycosidrests zu übertragen.

Beispiel 8: Synthese erfindungsgemäßer Oligosaccharide aus L-Aldopyranosyl- Polvfructosid Als Beispiel für Polyfructoside, die als Hauptgruppe eine Aldopyranose in L-Konfiguration tragen, wurden jeweils L-Glucose, L-Galactose, L-Xylulose und L-Glucose-Fructosid (Vergleichsbeispiel) unter Katalyse von Fructosyltransferase (FTF- 2) durch Umsetzen der jeweiligen L- Aldopyranose mit Saccharose hergestellt.

Der Verlauf der Synthese ist in Figur 12 anhand von Dünnschichtchromatogrammen dargestellt, wobei unter a) die Oligo fructosylierung von L-Fuc-Fru (Spuren 1, 5, 9, 13), von L-Gal-Fru-Fru (Spuren 2, 6, 10, 14), von L-Xyl-Fru (Spuren 3, 7, 11, 15) und von L-Glu-Fru (Spuren 4, 8, 12, 16) nach 0 min (Spuren 1 bis 4), nach 5 min (Spuren 5 bis 8), nach 10 min (Spuren 9 bis 12) und nach 20 min (Spuren 13 bis 16) gezweigt sind, unter b) dieselben Reaktionen nach 30 min (Spuren 1 bis 4) nach 60 min (Spuren 5 bis 8), nach 120 min (Spuren 9 bis 12) und nach 240 min (Spuren 13 bis 16) und unter c) nach 1220 min, in Spur 1 L-Fuc- Fru, Spur 2 L-Gal-Fru-Fru, Spur 3 L-Xyl-Fru und Spur 4 L-Glu-Fru. Diese Ergebnisse wurden mittels Ionentauscher-Chromatographie (Dionex) bestätigt.

Beispiel 9: Transfer des Aldopyranosidrests aus einem Saccharose- Analogon auf ein Peptid oder Naturstoff

Figur 13 zeigt schematisch den Transfer eines Aldopyranosidrests am Beispiel des Glucosylrests auf eine hydroxylgruppenhaltige Verbindung, die ein Peptid oder ein anderer Naturstoff sein kann. Dieses Akzeptormolekül ist zur einfacheren Handhabung und Kontrolle

der Transferreaktion an einen polymeren Träger gekoppelt. Der Aldopyranosidrest, hier im Beispiel als Glucosylrest dargestellt, ist erfindungsgemäß durch ein Derivat des Glucosylrests oder eine andere Aldopyranose zu ersetzen.

Die Katalyse wird durch eine modifizierte Dextransucrase als Glycosyltransferase ermöglicht, die den Aldopyranosidrest auf die Hydroxylgruppe des Peptids bzw. Naturstoffs einfach oder mehrfach überträgt. Der Aufbau des Oligosaccharids am Peptid bzw. Naturstoff wird dadurch kontrolliert, dass im Anschluss an eine begrenzte Reaktionszeit eines ersten Saccharose- Analogons, das einen ersten Aldopyranosidrest enthält, gewaschen wird, um die Transferreaktion des ersten Aldopyranosidrests nach vorbestimmter Zeit abzubrechen. Auf diese Weise lässt sich die gewünschte Anzahl der übertragenen ersten Aldopyranosidreste anhand der Reaktionszeit vorbestimmen. In einem zweiten Reaktionsschritt kann dann ein zweiter Aldopyranosidrest übertragen werden, wenn der Glycosyltransferase ein zweites Saccharose- Analogon als Cosubstrat zur Verfügung gestellt wird, das den zweiten Aldopyranosidrest aufweist. Nach nochmaligem Waschen zur Entfernung des zweiten Cosubstrats lassen sich weitere gleiche oder verschiedene Aldopyranosidreste durch Umsetzen mit dem jeweiligen Saccharose- Analogon, das einen bestimmten Aldopyranosidrest aufweist, gezielt aufbauen.

Zur Abspaltung des mit einem Oligosaccharid versehenen Peptids bzw. Naturstoffs vom polymeren Träger wurde das Verbindungsmolekül hydrolysiert und photometrisch nachgewiesen.

Zur Analyse der Oligosaccharidkette, die an das Peptid bzw. den Naturstoff synthetisiert wurde, kann unmittelbar NMR oder MS eingesetzt werden, oder es kann alternativ nach Hydrolyse des Oligosaccharids vom Peptid bzw. Naturstoff das Oligosaccharid analysiert werden. Die Hydrolyse des Oligosaccharids vom Peptid bzw. Naturstoff kann durch wässrige Natronlauge, Säure oder Glycosidasen erfolgen. Das Oligosaccharid kann spektrophotometrisch analysiert werden, beispielsweise durch Reaktion mit Glucoseisomerase und Hexokinase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in Anwesenheit von NADP und ATP, sodass NADPH ₂ spektrophotometrisch gemessen werden kann. Durch diese Analyse lässt sich die Substratspezifität der eingesetzten Transferase bestimmen, insbesondere bei einem Gemisch aus Saccharose- Analoga als Cosubstrat.

Beispiel 10: Synthese von Oligosacchariden durch übertragung des Aldopyranosidrests aus ß-D-Fructosyl-α-D-Galactosid

Dieses Beispiel zeigt schematisch in Figur 14 die Synthese eines Oligo- bzw. Polyaldopyranosyl-Fructosids. So wird ß-D-Fructosyl-α-D-Galactosid als Saccharose- Analogon, entsprechend Beispiel 3 aus Saccharose und Galactose hergestellt, mit einer Glycosyltransferase umgesetzt, die gemäß Beispiel 1 durch Mutagenese und Screenen aus einem Glycosyltransferasegen erzeugt worden ist. Die Analyse ergab, dass der Galactosidrest unter Freisetzung von Fructose übertragen wurde, sodass ein Oligogalacto-Fructosid erhalten wurde.

Wie in Figur 15 schematisch gezeigt ist, überträgt die Katalyse durch erfindungsgemäß einzusetzende Glycosyltransferase-Mutanten, die beispielsweise nach Beispiel 1 erhältlich sind, jeweils den Aldopyranosidrest, der kein Glucosid ist, eines Saccharose- Analogons auf ein Oligosaccharid, wobei der Fructosylrest freigesetzt wird. So kann aus dem Saccharose- Analogon, hier Gal-Fru, mit der Dextransucrase aus Bacillus subtilis ein Oligoaldopyranosyl- Fructosid, hier ein Oligogalactosyl-Fructosid hergestellt werden.

Beispiel 11 : Synthese von Oligosacchariden durch übertragung des Ketofuranosylrests aus ß- D-Furanosyl-alpha-D-Glucosid

Das Saccharose- Analogon ß-D-Ketofuranosyl-alpha-D-Glucosid wurde entsprechend Beispiel 3 durch Umsetzung von Saccharose mit einer Ketofuranose erhalten. Durch Katalyse von Fructosyltransferase- Varianten, die nach Beispiel 1 erhältlich sind, lässt sich unter Freisetzung von Glucose der Ketofuranosylrest auf ein Akzeptormolekül, beispielsweise ein Oligosaccharid, übertragen. Ein Schema dieser Transferreaktion ist allgemein in Figur 16 dargestellt. Als Produkt wird ein Glucosyl-oligo- bzw. -polyfuranosid erhalten.

Beispiel 12: Chromatographische Auftrennung von Sacchariden Zur Trennung von Edukten und Produkten sowohl bei der enzymatischen Synthese von Saccharid- Analoga, als auch nach der Synthese von Oligosacchariden, wurden verbleibende Edukte und Produkt durch Chromatographie an Ionenaustauschern (kommerziell erhältlich Purolite, Lavatite, Amberlite XAD) aufgetrennt. Die Elution erfolgte mit destilliertem Wasser (Berensmeier et al., Separation and Purification Technology, 38, 129-138 (2004)).