L'invention concerne un nouveau procédé de synthèse de peptides, les nouveaux dérivés d'acides aminés mis en oeuvre dans ce procédé et leurs procédés de préparation. Les peptides sont des enchaînements d'acides ami¬ nés. Ils sont obtenus dans la plupart des cas au moyen de la condensation avec élimination d'une molécule d'eau d'un groupe carboxyle d'un acide aminé avec le groupe amine d'un autre acide aminé. L'enchaînement peut être effectué en additionnant un autre acide aminé à l'en¬ chaînement précédemment obtenu ou en condensant des fragments de peptides préalablement formés. Pendant toutes ces condensations les groupes aminés et car- boxyles qui ne participent pas à la réaction sont en général bloqués par des groupes protecteurs qui doivent être fixés facilement, être stables pendant la réaction de condensation et être éliminés de façon sélective l'un par rapport à l'autre, si les acides aminés qui consti¬ tuent le peptide ont des chaînes latérales qui contien¬ nent des groupes fonctionnels réactifs tels que des groupes amino, carboxy, hydroxy, thiol, le problème de la protection devient très difficile à résoudre car il faut que les groupes protecteurs de ces groupes fonc¬ tionnels soient stables non seulement pendant l'opé¬ ration de condensation mais également pendant les étapes de déprotection du groupe amino en α d'une part et du groupe carboxyle en α d'autre part. Il faut également qu'ils puissent être éliminés à la fin du procédé et que l'on puisse récupérer le peptide intact. De nombreux groupes protecteurs ont été proposés mais on est confronté en particulier pour la synthèse de peptides à longue chaîne au problème de trouver des types de

groupes protecteurs qui soient indépendants les uns des autres. Dans de nombreuses synthèses de peptides, la phase de récupération du peptide consiste à soumettre le peptide bloqué à un traitement avec un acide fort qui enlève tous les groupes protecteurs. Des acides tels que l'acide fluorhydrique, l'acide trifluorométhane- sulfonique, trifluoroaσétique sont par exemple employés. Cependant ce traitement n'est pas sans inconvénient. On a observé de nombreuses réactions secondaires, par exemple, lorsqu'on utilise les groupes protecteurs ben- zyle ou tertiobutyle, des carbocations benzyliques ou tertiobutyliques se forment et réagissent de façon tout à fait imprévisible avec les groupes fonctionnels gui ont été libérés, des réactions de déshydratation ou d'al ylation se produisent également. Il en résulte de grandes difficultés pour récupérer le peptide non modi¬ fié et ce d'autant plus qu'il est plus compliqué.

Il existait donc un besoin d'un procédé de prépa¬ ration de peptides qui soit simple et qui ne présente pas les inconvénients des procédés antérieurs.

L'invention a pour objet un nouveau procédé de pré¬ paration de peptides en solution ou en phase solide qui est caractérisé

- en ce qu'on forme la liaison peptidique en condensant un premier dérivé d'un acide aminé ou d'un peptide à allonger dans lequel la fonction amine en a est pro¬ tégée par un groupe choisi parmi le tert-butyloxy- carbonyle (Boc) , le 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), le méthoxybenzyloxycarbonyle (Moz), l'α,α-di- méthyl-3,5-diméthoxybenzyloxycarbonyle (Ddz) et le 2- nitrophénylsulfényle (Nps), et dans lequel le(s) groupe(s) fonctionnel(s) présent(s) et à protéger dans la ou les chaîne(s) latérale(s) de l'acide aminé ou du eptide es (sont) bloqué(s) par le groupe Y de formule R ¹ -CH=CH-CH2-, R ¹ représentant un atome d'hydrogène ou

un groupe alkyle en Ci à C4, sous forme de carbonates lorsque ce sont des groupes fonctionnels -OH alcool, de thiocarbonates ou de thiométhylènecarbamates lorsque ce sont des groupes fonctionnels -SH, d'éthers ou de carbonates lorsque ce sont des groupes fonc¬ tionnels -OH phénolique, de carbamates lorsque ce sont des groupes fonctionnels amino ou imino et d'esters lorsque ce sont des groupes fonctionnels -COOH, avec un second dérivé d'un acide aminé ou d'un peptide à allonger dans lequel la fonction acide -COOH en α est protégée sous la forme d'un groupe ester -C00R ² dans lequel R ² est un radical alkyle en C à CIQ, ^un radical aryle ou aralkyle substitué ou non sur le noyau aromatique ou le radical phénacyle, ou sous la forme d'un groupe amide -CONR ³ R ⁴ dans lequel R ³ et R ⁴ identiques ou différents représentent un atome d'hy¬ drogène, un radical alkyle en Ci à CIQ ^{OU un} radical aryle ou aralkyle substitué ou non sur le noyau aromatique, les radicaux R ² , R ³ et/ou R ⁴ pouvant être reliés ou non à un polymère de type polystyrène ou polyacrylique, et dans lequel le(s) groupe(s) fonc¬ tionnel(s) présent(s) et à protéger dans la ou les chaîne(s) latérale(s) de l'acide aminé ou du peptide est(sont) bloqué(s) par le groupe Y de formule R ¹ -CH=CH-CH2-, R ¹ représentant un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci à C4, sous forme de carbonates pour les groupes fonctionnels -OH alcool, de thiocar¬ bonates ou de thiométhylènecarbamates pour les groupes fonctionnels -SH, d'éthers ou de carbonates pour les groupes fonctionnels -OH phénolique, de carbamates pour les groupes fonctionnels amino ou imino et d'esters pour les groupes fonctionnels -COOH, on forme éventuellement une dernière liaison pepti- tique en condensant le peptide précédemment obtenu avec un dérivé d'acide aminé ou d'un peptide dans

lequel la fonction amine en α est protégée si néces¬ saire par un groupe protecteur habituel et dans lequel le(s) groupe(s) fonctionnel(s) présent(s) et à protéger dans la ou les chaîne(s) latérale(s) de l'acide aminé ou du peptide est(sont) bloqué(s) par le groupe Y comme indiqué précédemment, - on élimine si nécessaire le groupe protecteur de la fonction amine en a éventuellement présent et/ou les groupes protecteurs Y des groupes fonctionnels des chaînes latérales et/ou le groupe protecteur de la fonction acide en α ; les groupes protecteurs de la fonction amine en α, autres que de type Y, et de la fonction acide en α étant enlevés de façon connue, les groupes protecteurs Y étant enlevés tous en même temps par une catalyse douce au moyen d'un composé d'un métal noble tel qu'un métal du groupe du platine, ruthénium, rhodium, osmium, iridium, platine ou palladium.

Le procédé selon l'invention permet de préparer des peptides qui contiennent en partie ou totalement des restes d'acides aminés dont les chaînes latérales portent un ou plusieurs groupes fonctionnels réactifs.

Tous les acides aminés naturels ou synthétiques connus peuvent être utilisés et particulièrement ceux dont la chaîne latérale porte un ou plusieurs groupes fonctionnels ainsi que les peptides qui en sont consti¬ tués. Ils peuvent être sous forme D, L ou DL. Par exemple on peut citer comme acides aminés portant des groupes fonctionnels, l'arginine (Arg) , l'acide aspar- tique (Asp) , la cystéine (Cys) , l'acide glutamique (Glu), l'histidine (His) , la lysine (Lys), l'hydroxy- lysine, l'hydroxyproline (Hyp) , la serine (Ser) , la thréonine (Thr) , le tryptophan (Trp) , la tyrosine (Tyr) , la thyroxine (Thy) , l'ornithine (Orn) , l'acide α-amino- pimélique et l'acide α-aminosubérique.

Le procédé peut être réalisé en phase liquide ou en phase solide.

De préférence le groupe Y qui protège les groupes fonctionnels des chaînes latérales est le groupe de formule CH2=CH-CH2-, désigné par le terme Ail. Lorsque les groupes fonctionnels sont des groupes -OH phéno¬ lique, ils sont de préférence protégés sous forme d'éthers.

Les groupes protecteurs préférés de la fonction amine en α du premier dérivé d'acide aminé ou du peptide à allonger sont le groupe tert-butyloxycarbonyle (Boc) et le groupe 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) .

Ces dérivés α-amino protégés sont obtenus à partir des acides aminés en introduisant d'abord le groupe pro- tecteur de la fonction amine en α et ensuite le ou les groupe(s) protecteur(s) Y ou inversement, selon des méthodes connues ou selon les procédés qui seront décrits plus loin.

La fonction acide en α de l'autre dérivé d'acide aminé ou du peptide à allonger est protégée sous forme d'esters ou d'amides par des groupes connus pour être stables lors de l'élimination des groupes protecteurs précédemment cités de la fonction amine en α et en particulier lors de l'élimination des groupes Boc et Fmoc protecteurs de cette fonction, comme indiqué dans les publications concernant les peptides telles qu'en particulier "Methoden der organischen Chemie" Houben- Weyl, vol 15/1 et /2, Synthèses von Peptiden, 1974; et "Principle of Peptide Synthesis" par M. Bodansky, Springer-Verlag, 1984. Le plus souvent la fonction acide est protégée sous forme d'esters par un radical alkyle en Ci à C5 ou benzyle.

Lorsqu'on utilise la synthèse en phase solide décrite par Merrifield, les groupes protecteurs de la fonction acide peuvent être reliés à une résine

insoluble pendant les différentes opérations au moyen de groupes liants également stables dans les conditions de déprotection du groupe amino en α. De nombreuses combi¬ naisons sont possibles et bien décrites dans la littê- rature comme par exemple dans "Solid-phase peptide synthesis : a silver anniversary report" par G. Barany & Co, 1987, Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 705-739 et dans "Solid phase peptide synthesis" par J.M. Stewart et J.D. Young (1984). La résine est généralement un polystyrène, par exemple un polystyrène greffé par 1% de divinylbenzène ou de type polyacrylique par exemple un copolymère réti¬ culé de N-acrylylpyrrolidine et de l'ester méthylique du N-acrylyl-β-alanine. La préparation de ces dérivés dans lesquels la fonction acide en α et les groupes fonctionnels des chaînes latérales sont protégés, est réalisée selon les méthodes usuelles ou de préférence à partir des dérivés précédents α-aminoprotégés, par une réaction d'estéri- fication ou d'amidification éventuellement suivie par une étape de fixation sur une résine si l'on souhaite opérer en phase solide, puis ensuite par une dépro¬ tection de la fonction amine en α.

La formation de la liaison peptidique entre les deux dérivés d'acides aminés ou de peptides s'effectue par les méthodes connues généralement au moyen de dérivés anhydrides, esters actifs ou de réactifs de couplage spécifiques. Ces méthodes sont tout à fait standardisées et elles ne seront pas décrites ici en détail. Elles sont en particulier développées dans les publications précédemment citées.

On peut éventuellement former une dernière liaison peptidique en fixant un dernier dérivé d'acide aminé ou d'un peptide dans lequel la fonction amine en α est protégée si nécessaire par un des groupes protecteurs

connus habituellement utilisés en synthèse peptidique, par exemple tel qu'un des groupes protecteurs cités précédemment, le groupe benzyloxycarbonyle (Z) oμ le groupe allyloxycarbonyle et dans lequel le(s) groupe(s) fonctionnel(s) présent(s) et à protéger dans la ou les chaîne(s) latérale(s) de l'acide aminé ou du peptide est (sont) bloqué(s) par le groupe Y comme indiqué pré¬ cédemment. Par exemple, des composés tels que l'acide pyroglutantique ou des dérivés N-acétyl d'acides aminés ou peptides peuvent être utilisés comme composé N- terminal.

Pendant la formation des liaisons peptidiques les groupes fonctionnels ne participant pas à la réaction restent bloqués. A la fin de la synthèse, les groupes protecteurs de la fonction amine en α et/ou de la fonction acide en α et/ou des groupes fonctionnels des chaînes latérales du peptide formé peuvent être éliminés si nécessaire, de façon indépendante et dans un ordre quelconque. Le groupe protecteur de la fonction amine en α, est géné¬ ralement enlevé par acidolyse modérée pour les groupes Boc, Moz, Ddz, Nps ou par clivage basique pour le groupe Fmoc.

De préférence lorsque le groupe protecteur est le groupe Boc, il est éliminé au moyen d'un acide fort, tel que l'acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane ou l'acide chlorhydrique gazeux dans du dioxanne. Le groupe Fmoc est lui généralement éliminé par une amine secon¬ daire dans un solvant et de préférence par de la pipéri- dine dans le diméthylformamide ou dans la N-méthyl- pyrrolidone.

Les groupes de type allylique, tels que ceux qui protègent les groupes fonctionnels des chaînes laté¬ rales, sont enlevés tous en même temps, en particulier au moyen d'une quantité catalytique d'un composé du

rhodium (I) et de préférence d'un composé du palladium (O) ou (II) , dans un solvant ou un système de solvants approprié en présence d'accepteurs nucléophiles ou de donneurs de protons comme par exemple la orpho- line, la dimédone ou d'autres composés à hydrogène mobile aisément déprotonables.

Un procédé convenant bien pour cette déprotection consiste à faire réagir le peptide avec l'hydrure de tributylétain en présence d'une quantité catalytique de palladium (O) tétrakis(triphénylphosphine) ou de palla¬ dium (II) dichlorobis(triphénylphosphine) et d'un composé faiblement acide tel que l'acide acétique, le p- nitrophénol ou l'acétate de pyridinium ou d'eau, dans un milieu solvant. Des solvants très variés peuvent être utilisés tels que benzène, toluène, éther diéthylique, tétrahydrofuranne, dichlorométhane, acétone, acétate d'éthyle et diméthylformamide.

On peut également effectuer cette déprotection au moyen d'une quantité catalytique de palladium (O) tétra- kis(triphénylphosphine) en présence de N,N- diméthylsilylamine et d'acétate de triméthylsilyle dans un milieu solvant à bas point d'êbullition et aprotique tel que le dichlorométhane, en faisant réagir ensuite le composé obtenu avec du êthanol. L'élimination du groupe protecteur de la fonction acide en α du peptide est généralement effectuée de façon classique, par exemple par acidolyse avec de l'acide fluorhydrique, de l'acide trifluorométhane- sulfonique ou de l'acide trifluoroacétique. Lorsqu'on veut récupérer le peptide libre de toute protection, on préfère enlever en premier le groupe protecteur de la fonction amine en α, s'il n'est pas de type allylique. Pendant cette opération les groupes protecteurs de type allylique dan? les chaînes latérales ne sont pas attaqués. On enlève ensuite en même temps

tous les groupes protecteurs de type allylique et en dernier s'il n'a pas été éliminé au cours d'un des traitements précédents on enlève le groupe protecteμr de la fonction acide en α. Le procédé selon 1'invention permet d'obtenir des peptides très purs. L'élimination du groupe protecteur de la fonction amine en α peut s'effectuer sans modifier les groupes protecteurs des groupes fonctionnels des chaînes latérales et par conséquent sans apparition de réactions secondaires et les groupes fonctionnels des chaînes latérales sont tous libérés par un même traitement.

L'invention a également pour objet les nouveaux dérivés d'acides aminés mis en oeuvre dans le procédé. Ces nouveaux dérivés ont la formule générale

X - N - CH - COT (I)

dans laquelle X représente le groupe tert-butyloxy- carbonyle (Boc) , 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) , méthoxybenzyloxycarbonyle (Moz), α,α-diméthyl-3,5-dimé- thoxybenzyloxycarbonyle (Ddz) ou 2-nitrophénylsulfényle (Nps) ,

T représente le groupe OH, le radical -OR ² dans lequel R ² représente un radical alkyle en Ci à CIQ _/ un radical aryle ou aralkyle substitué ou non sur le noyau aroma¬ tique ou le radical phénacyle ou T représente le radical -NR ³ R ⁴ dans lequel R ³ et R ⁴ identiques ou différents représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci à Cio ou un radical aryle ou aralkyle substitué ou non sur le noyau aromatique,

R' représente un atome d'hydrogène et R représente le reste de la chaîne latérale d'un acide aminé qui contient au moins un groupe fonctionnel -0H,-SH, NH, ≈NH, -NH2, -COOH ou bien R' et R sont liés et forment le

reste d'un acide aminé cyclique qui porte au moins l'un des groupes fonctionnels précédents,

Y ¹ représente le radical Y-O-C-, dans lequel Y a pour

O formule R -CH=CH-CH2~, R représentant un atome d'hydro¬ gène ou un groupe alkyle en Ci à C4, lorsque Y ¹ remplace l'atome d'hydrogène du ou des groupe(s) fonctionnel(s) -OH, -SH, ^ H, =NH, ou -NH2 contenu(s) dans le reste R ou le reste formé par R lié à R', sauf lorsque X est le radical tert-butyloxycarbonyle, T représente le groupe -OH et R représente le reste de la chaîne latérale de la lysine, ou Y ¹ représente le groupe Y-0-C-NH-CH2- (appelé

O également dans la présente description méthylène- carbamate) , Y ayant la signification indiquée ci-dessus, lorsque Y ¹ remplace l'atome d'hydrogène du ou des groupe(s) fonctio. _ιel(s) -SH contenu(s) dans le reste R ou le reste formé par R lié à R' , ou bien Y ¹ représente le radical Y ayant la signifi¬ cation indiquée ci-dessus, lorsque Y ¹ remplace l'atome d'hydrogène du ou des groupe(s) fonctionnel(s) -COOH et/ou -OH phénolique contenu(s)dans le reste R ou le reste formé par R lié à R' , sauf lorsque X est le radical tert-butyloxycarbonyle, T représente le groupe -OH et R représente le reste de la chaîne latérale de l'acide aspartique, de l'acide glutamique ou de la tyrosine, n ≈ 1 lorsque R ne contient qu'un seul groupe fonc¬ tionnel ou n = 1 ou 2 lorsque R contient deux groupes fonctionnels.

Les nouveaux dérivés selon l'invention peuvent être sous forme D, L ou DL. Lorsque T représente le groupe OH, ils peuvent être sous forme de sels avec les

composés habituellement utilisés en synthèse peptidique, par exemple avec la dicyclohexylamine.

Les radicaux R seuls ou en combinaison avec R' représentent les restes de tous les acides aminés connus naturels ou synthétiques qui contiennent au moins un groupe fonctionnel -OH, -SH, ^NH, =NH, -NH2,- COOH dans leur chaîne latérale. Parmi les acides aminés qui contiennent de tels groupes on peut en particulier citer : l'arginine (Arg) , l'acide aspartique (Asp) , la cystéine (Cys) , l'acide glutamique (Glu), l'histidine (His) , la lysine (Lys), l'hydroxylysine, l'hydroxy- proline (Hyp) , la serine (Ser) , la thréonine (Thr) , le tryptophan (Trp),la tyrosine (Tyr) , la thyroxine (Thy) , l'ornithine (Orn) , l'acide α-aminopimélique et l'acide α-aminosubérique.

Les dérivés préférés sont ceux dans lesquels Y représente le radical allyle CH2=CH-CH2-. Plus particu¬ lièrement ce sont ceux dans lesquels X représente le groupe Boc ou Fmoc et T est le groupe -OH ou le radical -OR ² dans lequel R ² représente un radical alkyle en Ci à C5 ou le radical benzyle.

Comme composés particulièrement utiles on peut citer les composés suivants : Boc-Ser(Alloc)-OH, Boc- Thr(Alloc)-OH, Boc-Thr(Alloc)-OCH ₃ , Boc-His(Alloc)-OH, Boc-Arg(Alloc)-OH, Boc-Arg(Alloc)2""0H, Boc-Cys(Alloc)- OH, Fmoc-Asp(OAll)-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-Cys- (Alloc)-OH, Fmoc-Lys-(Alloc)-OH, Fmoc-Tyr(All)-OH, Fmoc- Ser(Alloc)-OH, Fmoc-Thr(Alloc)-OH, Fmoc-His(Alloc)-OH, Fmoc-Arg-(Alloc)-OH, Fmoc-Arg(Alloc)2-0H, Boc-Cys(Alloc- am)-OH Fmoc-Cys(Allocam)-OH. La désignation Alloc représente le groupe CH2=CH-CH2-0-C- et la désignation

0 Allocam représente le groupe CH2=CH-CH2-0-C-NH-CH2-.

°

Ces nouveaux dérivés peuvent être préparés de dif¬ férentes façons.

Lorsque Y ¹ représente le radical Y-O-C- dans lequel

Y a pour formule R ¹ -CH=CH=CH2~, R ¹ ayant les signifi¬ cations précédemment indiquées, ils sont de préférence préparés par réaction du chloroformiate de formule Y-O-C-Cl sur le composé de formule X-N-CH-COT

O R'R dans lesquelles Y, X, T, R et R' ont les significations précédemment indiquées, en milieu anhydre ou en milieu aqueux neutre ou basique selon le(s) groupe(s) fonc¬ tionnel(s) présent(s) dans le reste R ou dans le reste formé par R lié à R', à une température comprise entre 0 ^e et 50°C.

En particulier lorsque le groupe fonctionnel laté¬ ral à protéger est un groupe amino ou imino, les deux composés de départ sont mis à réagir dans un milieu aqueux à pH basique compris entre 7 et 12.

Lorsque le radical R est le reste de la serine les composés sont mis à réagir en milieu aqueux neutre.

Lorsque R est le reste de la thréonine, de préfé¬ rence le milieu est anhydre et on fait réagir le chloroformiate Y-O-C-Cl sur le dérivé de la thréonine de

O formule CH3-CH-CH-COT dans laquelle X a les significa-

OH NHX tions indiquées précédemment et T représente le radical -OR ² ou -NR ³ R ⁴ , R ² , R ³ et R ⁴ ayant les significations indiquées précédemment, en présence de diméth lamino- pyridine puis on fait éventuellement un traitement enzy- matique pour libérer la fonction acide en α.

Lorsque Y ¹ représente un groupe Y tel que décrit précédemment et qu'il remplace 1*atome d'hydrogène d'un

groupe -COOH ou d'un groupe -OH phénolique, on fait réagir un composé de formule Y-Br en milieu basique sur le complexe cuivrique de l'acide aminé, éventuellement dans un solvant miscible à l'eau, de préférence l'alcool méthylique ou éthylique, à une température comprise entre 0° et 50°C puis on introduit après élimination du cuivre, le groupe protecteur X selon les procédés connus, par exemple au moyen du fluoroformiate, du chlo¬ roformiate ou du tétrachloroéthylcarbonate de X et éven- tuellement on transforme la fonction -COOH en α, en ester -COOR ² ou en amide -CONR ³ R ⁴ , R ² , R ³ et R ⁴ ayant les significations précédemment indiquées.

Lorsque Y ¹ représente le groupe Y-0-C-NH-CH2-, Y

O ayant la signification précédemment indiquée et que Y ¹ remplace l'atome d'hydrogène d'un groupe -SH, comme par exemple dans la cystéine, on fait réagir l'hydroxymé- thylcarbamate du groupe de type allyle sur l'acide aminé ou de préférence son chlorhydrate, en milieu acide à une température comprise entre 0° et 50°, éventuellement dans un solvant aprotique tel que le dichlorométhane puis on introduit le groupe protecteur X selon les pro¬ cédés connus, par exemple comme précédemment indiqué et ensuite éventuellement on transforme la fonction -COOH en α comme précédemment.

Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter.

Dans tous les exemples les acides aminés et leurs dérivés sont sous forme (L) .

Exemple 1 : Préparation de Boc-His(Alloc)-OH

5,1 g de Boc-His-OH (0,02 mol) sont dissouts dans 10 ml de NaOH 2N et 10 ml d'eau. Le mélange est refroidi à 0°C et agité. On ajoute 2 ml de chloroformiate

d'allyle (0,019 mol) petit à petit en maintenant le pH à 7-7,5 avec NaOH 2N. Puis on continue à agiter à 0°C pendant 1 heure. La solution est lavée une fois par de l'éther éthylique (Et2θ) puis acidifiée avec HC1 concen- tré jusqu'à pH 2-3. Le produit est extrait trois fois par EtOAc, lavé par H2O, séché sur MgSθ4 _# On obtient après évaporation du solvant, 3,9 g du produit souhaité sous forme d'un solide-mousse (rendement 57%) .

Deux taches sont obtenues par chromatographie en couche mince (CCM) dans le solvant CHCI3/CH ₃ OH/ACOH (90/8/2) par révélation au réactif ninhydrine (après le clivage habituel du groupe Boc par vaporisation d'acide chlorhydrique) . Les structures des deux isomères ir et T sont confirmées par RMN.

Exemple 2 : Préparation de Boc-Arg(Alloc)2-OH et Boc-Arg(Alloc)-OH

5,48 g de Boc-Arg-OH (0,02 mol) sont dissouts dans un mélange de 40 ml de NaOH 2N et 12 ml de dioxanne à 0°c et agité. Le pH de la solution est environ 14. On ajoute jusqu'à pH 12 environ 5 ml de chloroformiate d'allyle. Puis on continue à ajouter 5 ml de chloro¬ formiate d'allyle en ajustant le pH autour de 11,5-12 par addition de NaOH 2N. On maintient l'agitation 2 h après l'addition du chloroformiate.

La phase aqueuse est lavée deux fois par Et2θ et acidifiée ensuite par HC1 concentré jusqu'à pH 3. On extrait le produit trois fois avec EtOAc. La phase orga- nique contient 3 produits, le produit de départ, le pro¬ duit avec un seul groupe Alloc et le produit avec deux groupes Alloc. Elle est lavée par H2O à pH 3 pour éli¬ miner le produit de départ puis lavée par H2O à pH 6 pour obtenir le dérivé monoalloc dans la phase aqueuse.

La phase organique est ensuite séchée sur MgSθ ₄ . Après évaporation du solvant, on obtient 0,8 g de Boc- Arg(Alloc)2~OH sous forme d'huile.

20 [α] : + 2,l(c 1,CH ₃ 0H) D

La structure est confirmée par RMN.

La phase aqueuse précédente est saturée par NaCl.

On extrait trois fois le produit Boc-Arg(Alloc)-OH avec

EtOAc. La phase organique est séchée sur MgSθ4- On obtient 0,3 g de Boc-Arg(Alloc)-OH sous forme de mousse.

(structure confirmée par RMN)

20 [α] : - 3,8 (c l,CH ₃ OH) D Chaque produit donne une seule tache en CCM dans le solvant CHCl ₃ /CH ₃ OH//AcOH (90/8/2) par révélation au réactif ninhydrine.

Exemple 3 : Préparation de Boc-Ser(Alloc)-OH

4,1 g de Boc-Ser-OH (0,02 mol) sont dissouts dans 15 ml de NaOH 2N. On ajoute alternativement 9 ml de chloroformiate d'allyle (0,085 mol) et 80 ml de NaOH 2N dix fois de suite. On laisse réagir une heure. Le mélange réactionnel est acidifié par HC1 concen¬ tré jusqu'à pH 2-3. On extrait la phase organique avec EtOAc (3 fois) puis on lave la phase organique par de l'eau jusqu'à élimination complète de la Boc-Ser-OH.

Le solvant est évaporé et on obtient une huile (0,8 g). Cette huile est dissoute dans l'éther éthy- lique. On ajoute 1 équivalent de dicyclohexylamine (DCHA) puis de l'hexane. On obtient 1 g du produit sou¬ haité sous forme de sel de DCHA (structure confirmée par RMN) . Point de fusion : 111-113°C.

20 [α] : + 19,1 (c l,CH ₃ OH) D

Une tache en CCM dans le solvant CHC1 ₃ /MeOH/AcOH

(90/8/2) après révélation au réactif ninhydrine.

Exemple 4 : Préparation de Boc-Thr(Alloc)-OH

8,24 g de Thr-OMe.HCl (0,05 mol) sont dissouts dans 20 ml de NaOH 2N. On ajoute 10 ml d'eau et 30 ml d'acétone. On agite. On ajoute goutte à goutte 20 g de Boc-F (40% dans du diméthoxyêthane (DME) , 0,065 mol) en maintenant le pH à 7-7,5 par addition de NaOH 2N et la température de la réaction à 10-15°C. On continue l'agitation pendant 15 min après l'addition de Boc-F.

Le produit est extrait trois fois par de l'êther de tert-butyle et de méthyle (TBME) et la phase organique lavée par de l'eau puis séchée sur MgS04. On obtient après évaporation du solvant une huile incolore. On lave l'huile avec de l'hexane. On obtient 7 g (0,03 mol) de Boc-Thr-OMe. On les dissout dans 50 ml de CH2CI2 sec à 0 ^β C. On ajoute 3,66 g de diméthylaminopyridine (DMAP) (0,03 mol) et 3,82 ml de chloroformiate d'allyle (0,036 mol). Le mélange est agité à la température am¬ biante pendant 24 h. Le solvant est évaporé. On ajoute de l'éther éthylique et de l'eau. La phase organique est lavée par deux fois HC1 IN, deux fois NaHC0 ₃ à 5% et deux fois NaCl saturé. Le produit pur est séparé par chromatographie sur silice (solution éluante, CHCI3) . On obtient 4,6 g de Boc-Thr(Alloc)-OMe pur (rendement 48%).

1,123 g de Boc-Thr(Alloc)-OMe (3,5 mol) sont dis¬ souts dans 10 ml d'EtOH et 20 ml de H2O. Puis on ajoute 50 g de cysteine.HCl.H2O. Le pH est porté à 6,2 par NaOH 0,1 N. Le mélange reactionnel est thermostate à 35°C ± 2°C. On ajoute 50 mg de papaïne brute. Le pH du mélange est maintenu autour de 6,2 par l'addition de

NaOH 0,1 N. 35 ml (3,5 mol) de NaOH 0,1 N ont été con¬ sommés. Le pH est porté à 8,5. La solution aqueuse est lavée deux fois par TBME puis acidifiée par HC1 concen¬ tré jusqu'à pH 2-3. On extrait le produit au TBME. La phase organique est lavée une fois par H2O et filtré sur célite puis séchée sur MgSθ4. Le solvant est éva¬ poré. On récupère 0,7 g de produit sous forme d'huile.

L'huile est dissoute dans l'éther. On ajoute 1 équivalent de DCHA puis de l'hexane. On laisse le pro- duit au froid pendant quelques heures. On récupère 0,53 g du produit attendu sous forme de sel de DCHA qui est un solide blanc (rendement 31%) . Point de fusion : 108-109°C.

20 [α] : + 22 (C l,CH ₃ OH) D

Une tache par CCM dans le solvant CHCl ₃ /MeOH/AcOH

(90/8/2) par révélation au réactif ninhydrine.

Exemple 5 : Préparation de Boc-Cys(Alloc)-OH

2,21 g de Boc-Cys-OH (10 mmol) sont traités par NaOH 2N et de l'eau. Le pH est maintenu à 8. 1,6 ml de chloroformiate d'allyle (15 mmol) et du NaOH 2N sont ajoutés en même temps en maintenant le pH à 7-8. A la fin de l'addition, le mélange est acidifié jusqu'à pH 2,5 puis extrait trois fois avec AcOEt. La phase AcOEt est séchée sur MgSÛ4. On obtient une huile après évapo- ration du solvant. L'huile est coévaporée plusieurs fois avec de l'éther et de l'hexane. L'huile visqueuse est conservée à température ambiante. Le produit se soli¬ difie. On récupère 2,8 g du produit attendu sous forme d'un solide blanc, par filtration (rendement 92%) . La structure est confirmée par RMN. Point de fusion : 69- 71°C.

20 [α] : - 47,3 (C l,CH ₃ OH) D

Exemple 6 : Préparation de Fmoc-Lys(Alloc)-OH

1,15 g de Lys(Alloc)-OH (5 mmol) est dissout dans 10 ml d'acét __e, 10 ml de NaOH 0,5 N et 10 ml d'eau. Le pH est environ 9. On ajoute 2,23 g de carbonate de 9- fluorénylméthyle et de tétrachloroéthyle (Fmoc-OTCE) en ajustant le pH à 7-8 par l'addition de NaOH 2N. A la fin de la réaction, le pH est porté à 9-9,5. La phase aqueuse est lavée trois fois par de l'éther puis aci¬ difié jusqu'à pH ≈ 2,5. On extrait le produit trois fois avec EtOAc. La phase EtOAc est séchée sur MgSθ4« Après evaporation du solvant on obtient une mousse. La mousse est dissoute dans l'éther. On ajoute de l'hexane puis on passe le mélange à l'ultrason. Le p ^r écipité est récupéré par filtration. On obtient 1,82 g du produit souhaité (rendement 80%) . Point de fusion : 88-90°C.

20 [α] : - 11,3 (c l,dimêthylformamide (DMF)) D

Exemple 7 : Préparation de Fmoc-Tyr(All)-OH

0,44 g de Tyr(All)-OH (2 mmol) sont mis en suspen¬ sion dans un mélange de H2θ/acêtone(l/l) . Le pH est ajusté à 8 par addition de NaOH 0,5 N. 0,9 g de Fmoc- OTCE sont ajoutés en une fois. Le pH est maintenu à 7-8. Le mélange reactionnel passe de trouble à limpide puis devient une émulsion. On continue l'agitation pendant 12 h à température ambiante. Le mélange reactionnel est acidifié jusqu'à pH ≈ 2,5 et extrait par trois fois par AcOEt. On ajoute de l'eau. Le jr'î est ajusté à 9,5. La phase aqueuse est séparée et acidifié jusqu'à pH ≈ 2,5

et extraite trois fois par EtOAc. Le produit est séché sur MgSθ4 puis est précipité dans EtOAc/Et2θ/hexane.

On obtient 100 mg du produit souhaité.

Point de fusion : 75-78°C.

20 [α] : - 21,3 (c 1,DMF)

Exemple 8 : Préparation de Fmoc-Glu(OAll)-θH

1,11 g de Glu(0All)-0H.HCl (5 mmol) est dissout dans 10 ml de NaOH 0,5 N, 20 ml d'eau et 20 ml d'acétone. 2,64 g de Fmoc-OTCE sont ajoutés en une fois.

Le pH est maintenu à 7,5 par addition de NaOH I N. A la fin de la réaction le pH est ajusté à 8,5. La phase aqueuse est lavée quatre fois par Et2θ puis acidifiée jusqu'à pH ≈ 2,5. Le produit est extrait trois fois par

Et2θAc. La phase organique obtenue est lavée par trois fois H2O (pH 2,5) et H2O (pH 6) puis séchée sur gSθ4.

On évapore le solvant. Le produit est dissout dans Et ₂ θ.

De l'hexane est ajouté puis le mélange trouble est passé à l'ultrason. Un solide précipite. On obtient 1 g du produit souhaité (rendement 48%) .

Point de fusion : 102-105°C.

20 [ _α ] _: - 17,1 ( _C 1,DMF) D

Exemple 9 : Préparation de Fmoc-Asp(OAll)-OH

2,1 g de Asp(OAll)-OH.HCl (10 mmol) sont mis en suspension dans 30 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) . On ajoute 5,02 ml de Et ₃ N (36 mmol). Le mélange devient visqueux. 8,18 g de Fmoc-OTCE sont ajoutés en une fois. Le mélange reactionnel est agité pendant 18 h à 40°C sous argon. On ajoute de l'eau et EtOAc. Le pH est ajusté à 9. La phase aqueuse est séparée et ensuite

acidifiée jusqu'au pH ≈ 2,5. On extrait le produit par trois fois EtOAc . La phase EtOAC est séchée sur MgSθ4.

Une mousse est obtenue après evaporation du solvant. Le produit est précipité dans MeOH/Et2θ/hexane. On obtient

0,53 g du produit souhaité.

Point de fusion : 140°C.

20 [α] : + 5,9 (c 1,DMF)

Exemple 10 : Préparation de Fmoc-Arg(Alloc)2~0H

0,44 g de Boc-Arg(Alloc)2~OH (1 mmol) est traité par 10 ml d'acide trifluoroacétique et de CH2CI2 (1/1) pendant 30 min. Puis le solvant est évaporé à

1*évaporateur rotatif. Le résidu est coévaporé avec deux fois CH2CI2. Le résidu est dissout dans 10 ml d'acétone et 30 ml d'eau. Le pH est ajusté à 9 par NaOH 2N. On ajoute 1,2 éq. de Fmoc-OTCE en maintenant le pH à 8-9. A la fin de l'addition on obtient une émulsion. La phase aqueuse trouble est lavée par de l'éther quatre fois puis acidifiée par HC1 concentré jusqu'à pH ≈ 2,5. Le produit est extrait par trois fois AcOEt . Cette phase organique est séchée sur MgSθ4« On évapore le solvant et on obtient une huile. Cette huile est traitée par Et2θ- hexane, passée à l'ultrason. On sépare 100 mg du produit souhaité sous forme d'un solide blanc.

Point de fusion : 78-80°C.

20 [α] : - 9,1 (c 1,DMF)

Exemple 11 : Préparation de oc-Cys(Allocam)-OH

a) Préparation de HC1.Cys(Allocam)-OH On dissout 10 g de chlorhydrate de cystéine (0,063 mol) dans 60 ml d'acide trifluoroacétique. On

ajoute lentement une solution d'hydroxyméthylcarbamate d'allyle (9,04 g, 0,069 mol) dans 60 ml de CH2CI2. On agite le mélange reactionnel à température ambiante pendant 10 min. Puis on évapore le solvant. On obtient un solide blanc. On ajoute 1,1 équivalent de HC1 (1 N) . On évapore la solution puis le résidu est coévaporé avec C2H5OH. On obtient le produit attendu sous forme d'un solide qui est séché sous vide. Le rendement est de 95%. b) Préparation de Boc-Cys(Allocam)-OH On dissout 10 mmol de HCl.Cys (Allocam)-OH préparée comme précédemment dans 20 ml d'eau à pH 9. On ajoute lentement environ 12 mmol de Boc-F (40% en volume dans du DME) en maintenant le pH à 9 par addition de NaOH (2N) . Après cette addition on continue à agiter pendant 30 min. On lave la phase aqueuse 2 fois avec de l'éther éthylique puis on acidifie jusqu'à pH 3. On extrait le produit avec AcOEt, on lave avec H2O et on sèche sur MgSθ4> On évapore le solvant et on obtient le produit attendu sous forme d'une huile.

Exemple 12 ; Préparation de Fmoc-Cys(Allocam)-OH

On dissout 10 mmol de HCl.Cys(Allocam)-OH dans 50 ml d'eau et 5 ml de dioxane. On ramène le pH à 11,5 p _ar addition de NaOH (2N) . On ajoute goutte à goutte 0,9 mmol de Fmoc-F (30% en volume dans du DME) en main¬ tenant le pH à 11,5 par addition de NaOH (2N) . On continue à agiter le mélange reactionnel pendant 1 h après cette addition. On extrait le mélange 2 fois avec (j _e l'éther éthylique et on acidifie jusqu'à pH 3 avec HC1 concentré. On extrait le produit 3 fois avec AcOEt, on lave avec H2O puis on sèche sur MgSθ4. On obtient le produit attendu avec un rendement de 75%.

Exemple 13 : Préparation de Arg-Ser-Tyr-Asp-Gly-Leu

La préparation est effectuée en phase solide . avec les cycles suivants : 1er cycle : 0,5 g (0,71 méq/g) de résine Boc-Leu-PAM-P (PAM = phénylacétamidométhyl, P = polystyrène - 1% divi- nylbenzène) est placé dans un réacteur agité.

On lave deux fois avec CH2CI2 et on filtre à chaque fois. On traite avec 50% en volume d'acide trifluoro- acétique (TFA) dans CH2CI2 (1 min puis 30 min) et on filtre. On lave avec de l'isopropanol puis on filtre. On lave deux fois avec CH2CI2 et on filtre. On ajoute 2 éq.

(314 mg) de BOP (benzotriazolyl-N-oxytrisdiméthylamino- phosphoniumhexafluorophosphate) , 2 éq. (124 mg) de Boc- Gly, 7,5 ml de CH2CI2 et 0,4 ml (6,6 éq) de diéthyliso- propylamine (DIEA) . Le pH est ajusté à 9 avec une petite quantité supplémentaire de DIEA si nécessaire.

Le test de Kaiser est négatif après 30 min de couplage. on filtre et on lave 2 fois avec CH ₃ 0H et 2 fois avec CH2CI2 en filtrant à chaque fois. La résine est prête pour le second cycle. Les mêmes opérations sont répétées pour chacun des cycles en changeant seulement la nature de l'acide aminé. 2ème cycle : 2 éq. (194 mg) de Boc-Asp(OAll)-OH 3ème cycle : 2 éq. (228 mg) de Boc-Tyr(All)-OH 4ème cycle : 2 éq. (334 mg) de Boc-Ser(Alloc)-OH.DCHA 5ème cycle : 2 éq. (332 mg) de Boc-Arg(Alloc)2~0H

On traite ensuite avec 50% de TFA dans CH2CI2 1 min puis 30 min. On lave avec de 1'isopropanol (1 fois), CH2CI2 (2 fois), 10% en volume d'acide acétique (AcOH) dans CH2CI2, CH2CI2 (2 fois) en filtrant à chaque fois. On traite ensuite avec 49 mg de PdCl2(PPh ₃ )2 puis 2,5 éq. de AcOH et 7 ml de CH2CI2 puis on ajoute 2 éq. par rapport aux groupes allyle de Bu ₃ SnH. On secoue le

mélange pendant 10 min. On lave avec CH2CI2 et on filtre (2 fois). On ajoute 25 mg de PdCl2(PPh ₃ ) _2/ 1,5 éq. de AcOH et 7,5 ml de CH2CI2 puis on ajoute 1 éq. de Bu ₃ SnH et on secoue le mélange pendant 10 min. On lave ensuite avec CH ₂ C1 ₂ (5 fois) , CH ₃ OH (5 fois) , CH ₂ C1 ₂ (5 fois) en filtrant à chaque fois et on sèche la résine sous vide pendant 2 heures. On obtient ainsi 0,65 g de Peptide- PAM-P. On sépare le peptide de la résine par 10% d'acide fluorhydrique dans l'anisole. Après evaporation de HF on extrait le peptide de la résine au moyen d'une solution aqueuse d'acide acétique à 10%. La solution contenant le peptide est lyophilisée. Le peptide est obtenu avec un rendement de 52% et une pureté déterminée par chromato- graphie en phase liquide haute pression (HPLC) supé- rieure à 80%.

Exemple 14 : Préparation de Fmoc-Ala-Arg-Gly

La préparation est effectuée en phase solide. La résine Boc-Gly-P' (P' = résine "Merrifield", polystyrène chlorométhylé réticulé par 1% de divinylbenzène) est traitée par une solution de TFA (50% en volume) dans CH2CI2 pendant 30 min. Après lavage avec de 1'isopropanol (iPrOH) , du CH2CI2 puis du di éthyl- formamide (DMF) , on ajoute 2 équivalents de Boc- Arg(Alloc)2~OH, 2 équivalents de l'agent de couplage O- benzotriazolyl-N-tétraméthyluronium tétrafluoroborate (TBTU) . On ajoute ensuite de la diisopropyléthylamine (iPr2NEt) jusqu'à pH 9. On agite le mélange pendant 30 min. Le test de Kaiser est négatif. On lave deux fois la résine avec CH ₃ 0H puis CH2CI2. On enlève le groupe Boc de Boc-Arg (Alloc)2Gly-P' par traitement avec une solution de TFA (à 50% en volume) dans CH2CI2. On couple ensuite de la même façon Fmoσ-Ala-OH sur la résine.

On mélange la résine obtenue avec du PdCl2(PPh ₃ )2

(4% en mole par fonction allyle) et avec AcOH

(2,5 équivalents) dans CH2CI2. On ajoute ensuite Bu ₃ SnH

(2 équivalents) en une seule fois. On agite le mélange pendant 10 min. On filtre la résine, on la lave deux fois avec CH2CI2, CH ₃ OH puis CH2CI2. On répète l'opération deux fois encore. On traite ensuite la résine avec une solution de TFA saturé par HBr pendant

2 h à la température ambiante. Après filtration et éva- poration du solvant, on obtient le tripeptide avec un rendement de 78%.

Exemple 15 : Préparation de Z-Ala-Lys-Gly-NH2

La préparation est effectuée en phase solide. On traite la résine Boc-Gly-P' par une solution de TFA (50% en volume) dans CH2CI2 pendant 30 min. Après lavage une fois avec de l'iPrOH, deux fois avec CH2CI2 puis avec du DFM, on ajoute 2 équivalents de Fmoc-Lys(Alloc)-OH dans du DMF, et 2 équivalents de TBTU dans du DMF, on ajuste le pH du milieu reactionnel à 9 par addition de iP^ Et (environ 6 équivalents) . On suit la réaction de couplage avec le test de Kaiser. Elle est terminée au bout de 30 min. On lave la résine deux fois avec CH ₃ OH puis deux fois avec CH2CI2. On enlève le groupe Fmoc de Fmoc-Lys (Alloc)-Gly-P• avec un mélange de pipéridine (à 30% en volume) et de DMF pendant 10 min. Puis on couple de la même façon Z-Ala-OH sur la résine.

On met la résine en suspension dans un mélange de CH2CI2, PdCl2(PPh ₃ )2 (4% en mole par fonction allyle) et on ajoute AcOH (2,5 équivalents). Puis en une seule fois on ajoute Bu ₃ SnH (2 équivalents) . On agite le mélange pendant 10 min. On lave la résine deux fois avec CH2CI2, deux fois avec CH ₃ OH puis deux fois avec CH2CI2. On répète une fois l'opération de déprotection. On traite

la résine Z-Ala-Lys-Gly-P• par CH ₃ OH saturé par NH ₃ pendant 3 jours. On obtient le tripeptide après filtration et evaporation du solvant avec un rendement de 65%.