本发明关于一种产油微生物， 尤指一种 Cystofilobasidium属的产油微生 物。

背景技术

以目前来说， 生物质能源大致分为两大类， 一种为酒精， 一种为生物柴 油， 生物酒精的制备仍以谷物为原料进行后制， 但近年逐渐转为由微生物产 生酒精的研究， 已经有很多研究报导指出， 厌氧微生物生产酒精具有高度的 潜力； 生物柴油的部分则是以植物原料或废弃食用油 、 动物性脂肪来进行制 备。 植物原料大部分以油料谷物为主， 如大豆、 玉米、 油菜籽、 棕榈、 麻疯 树种子、 向日葵等； 废弃食用油和动物性脂肪则经由再次纯化萃取 提炼出生 物柴油。 但两种生物柴油都无法满足实际使用上的需求 ， 且都各有弊端， 油 料作物需要大范围的栽种土地、 作物具有季节性、 单位面积栽种所提供的生 质能源不符合经济效益、 有与民争食的问题、 萃取工序繁复且成本高， 所以 油料作物无法成为持续提供生物柴油来取代石 油的原料。 废弃食用油与动物 性脂肪更有量少、 饲养和环境污染等问题。 因此， 近年来开始着重于以微生 物生产生物柴油， 根据研究显示， 只要 1-3%的谷物栽种面积， 微生物就可以 生产提供 40%运输业所需的替代能源， 具有相当大的潜力与优势。

利用微生物产生油脂的理念并非是近年才发现 的，除了微藻类和细菌类， 在真菌中也有产油微生物， 大多数是酵母菌和霉菌， 且有些菌属兼具生产长 链饱和脂肪酸、 单元或多元不饱和脂肪酸的特性， 而这些产油酵母菌可生产 超过占生物量 40%的脂肪酸， 经由培养基的限制和调配更可以累积到 70%, 都具有相当高的产油潜力。 表 1整理出常见的真菌产油微生物 （Beopoulos, et al , 2009; Gill, Hall, & Ratledge, 1977; Ratledge, 1993 , 2002, 2004; Sergeeva la, Galanina, Andrianova, & Feofilova, 2008; Zhao, et al. , 2010 ) 。

表 1、 产油的真菌类及产油量 真菌 干重的脂肪％ ( w/w )

Aspergillus terreus 64

Cryptococcus curvatus 58

Cryptococcus albidus 65

Candida sp. 107 42

Cunn inghamella japonica >43.8

Lipomyces starkeyi 63

Penicillium spmulosum 64

Rhodosporidium toruloides 56.5

Rhodotorula glutinis 72

Rhodotorula gram in is 36

Rhizopus arrhizus 57

Schizochytrium spp. 30-50

Thraustochytrium spp. 30-50

Trichosporon pullulans 65

Yarrowia lipolytica 36 发明内容

本案的主要目的为提供一种由 Cystofilobasidium属的酵母菌生产油脂的 方法， 供作生物柴油以取代石油， 作为替代能源。

根据上述构想， 本案提供一种产油反应系统， 其包括： 一醣类； 以及一 作用菌， 其与该醣类反应以产生一油脂， 其中该作用菌的属为 Cystofilobasidium。

所述的产油反应系统， 更包括一氮源， 以供该作用菌利用， 其中该氮源 为铵钠 （Na ( N¾ ) ) 。

其中该作用菌所产生的油脂为 C14 ~ C20的中链脂肪酸。

其中该作用菌所产生的油脂为不饱和脂肪酸。

其中该作用菌所产生的油脂可作为生物柴油。 其中该作用菌具有 SEQ ID NO. 7的 18S rDNA序列。

其中该作用菌具有 SEQ ID NO. 8的 26S rDNA序列。

其中该作用菌具有 SEQ ID NO. 9的 ITS序列。

根据上述构想， 本案另提供一种产油反应系统， 其包括： 一碳源； 以及 一作用菌， 其与该碳源反应以产生一油脂， 其中该作用菌的属为 Cystofilobasidium。

其中该作用菌分解该碳源以产生该油脂。

根据上述构想， 本案再提供一种产油方法， 其利用一产油菌来产生一油 月旨, 该产油菌的属为 Cystofilobasidium„

其中该产油菌选自 由以下菌种所组成的群组： Cystofilobasidium bisporidii, Cystofilobasidium capitatum , Cystofilobasidium infirmominiatum和 其他 Cystofilobasidium属的菌种。 附图概述

图 1为光学及萤光显微镜 TN01菌株的型态及油脂染色结果（ 1000倍）； 图 2为扫瞄式电子显微镜 TN01的菌株型态；

图 3为 18S rDNA序列鉴定亲缘关系图；

图 4为 26S rDNA序列鉴定亲缘关系图；

图 5为 ITS序列鉴定亲缘关系图；

图 6为 TN01在不同盐浓度培养基中盐浓度测试及生长� �线；

图 7为 TN01最适培养的盐浓度测试；

图 8为 TN01最适培养温度测试；

图 9为 TN01培养基简单化测试；

图 10为 TN01最适培养 pH值测试；

图 1 1为 TN01最适培养的碳源测试；

图 12为 TN01最适培养的氮源测试； 图 13为 TN01高糖浓度培养基测试。 本发明的较佳实施方式

下文所述的菌种于 2011年 6月 20 日提交中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（CGMCC )进行保藏， 该保藏单位的地址为北京市朝阳区 北辰西路 1 号院中国科学院微生物研究所， 该菌种在保藏单位的保藏号为 CGMCC N0.4968

型态观察

实验菌株来源为台湾台南沿岸地区所釆集到的 样本。使用 anti-LgYPG培 养基进行第一次筛选， 挑出外观具有差异的菌落， 以光学显微镜观察， 观察 结果如图 1的 1-2所示， 菌落外观为圓形， 表面光滑平整， 像蜡质光泽， 呈 现粉红色。 并将第一次筛选后的样本以 LgYPG培养基在 20°C培养 7天， 为 第二次筛选。 将第二次筛选的菌落以尼罗红进行染色， 并用萤光显微镜进行 观察， 观察结果如图 1的 3-4所示， 具油脂的部分将呈现金黄色。 将观察后 具油脂的菌株用 GYPG培养基在 20°C培养 7天， 并重复纯化 3次后， 得到实 验菌株。

a Anti-LgYPG固态培养基

b. LgYPG培养基配方如 Anti-LgYPG, 但不加入链霉素。 c. GYPG固态培养基配方如 LgYPG, 但葡萄糖含量调整为 5%。

d. GYPG液态培养基配方如 GYPG, 但不添加洋菜。

经由多次的纯化分离， 筛选出具产油的 ϋ生物， 分别编号为 ΤΝ01~ ΤΝ09, 并经过确认为纯菌无误， 因筛选出的 ΤΝ系列非常相似， 因此在后续 实验则随机挑选 TN01做为最适化培养的研究对象。

进一步使用扫描式电子显微镜进行观察，如图 2所示， TN01为椭圓形状 菌体， 菌体表面光滑无皱褶或凸起， 并无菌丝体， 有类似出芽生殖的形式， 因此根据型态推估可能为酵母菌属。

菌种序列鉴定与亲缘关系

去氧核糖核酸萃取

a. 取菌液 1 毫升（ml )并离心， 收集菌体， 1摩尔每升（M ) 氯化钠清洗 3 次。

b. 加入 200微升（μΐ ) 裂解緩冲液和 20μ1蛋白酶 Κ, 置于 55°C隔夜。

c 补十六烷基三乙基溴化铵抽取溶液至 1 ml, 65°C反应 30分钟。

d. 加入氯仿 400μ1, 均匀混合 30秒。

e. 14000转每分钟（rpm ) 离心取上清液。

f. 加入 2倍体积的十六烷基三乙基溴化铵沉淀溶液， 并静置 60分钟。

g. 14000rpm离心后收集沉淀物， 以 350μ1的 1.2M氯化钠回溶。

h. 加入氯仿 350μ1, 均匀混合 30秒后离心取上清液。

i. 加入 0.8倍体积的异丙醇， 置于 -20°C水箱 30分钟析出去氧核糖核酸。 j . 14000rpm离心后去除上清液， 加入 70%酒精 500μ1清洗去氧核糖核酸沉淀 物， 并离心， 离心后室温干燥去氧核糖核酸。

k. 加入灭菌后 pH调整为 8的二次水 20μ1, 置于 37°C回溶。

1. 进行胶体电泳， 确认去氧核糖核酸大小。 使用的标记为 Bio-IKB DNA Ladder ( Protech ) 。 裂解緩冲液

药剂 浓度

十二基硫酸钠 2%

三（羟曱基）氨基曱烷盐酸盐 0.25M

乙二胺四乙酸二钠 0.1M

氯化钠 0.1M

以一次水溶解药剂， 溶解完成后以氯化氢或氢氧化钠调整 pH值至 8.2, 并经过高压灭菌釜灭菌备用。

十六烷基三乙基溴化铵抽取溶液

药剂 浓度 (g/L)

氯化钠 81.8

三 (羟曱基)氨基曱烷 12.1

乙二胺四乙酸二钠 7.4

十六烷基三乙基溴化铵 20

以一次水溶解药剂，溶解完成后以氯化氢或是 氢氧化钠调整 pH值至 8.0, 并经过高压灭菌釜灭菌备用。 十六烷基三乙基溴化铵沉淀溶液

药剂 浓度 (g/L)

氯化钠 2.3

十六烷基三乙基溴化铵 5

以一次水溶解药剂， 并经过高压灭菌釜灭菌备用。 聚合酶连锁反应

此实验为菌株鉴定的序列扩增， 并用了 3组引子， 序列与条件如下: 18S定序的引子：

序列 （Fell, Roeijmans, & Boekhout, 1999) 名称

18SF (顺向） 5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG - 3' 18SR (反向） 5'- GGTCCGTGTTTCAAGACG - 3'

ITS定序的引子：

名称 序列 （Gadanho & Sampaio, 2002)

ITS1 (顺向） 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3， ITS4 (反向） 5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'

26S D1/D2 定序的引子：

名称 序列 （Fell, et al.， 2000)

F63 5'- GCATATCAATAAGCG GAGGAAAAG -3'

LR3 (反向） 5'- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3'

聚合酶连锁反应内含物:

反应物 体积 最终浓度 去氧核糖核酸 4 μ1

三磷酸去氧核苷酸 8 μΐ 2.5 mM

10倍緩冲液 5 μΐ - 引子 （顺向） 1 μΐ - 引子 （反向） 1 μΐ -

Taq 0.1 μΐ 1 U 二次水 30.9 μΐ - 总和 50 μΐ - 聚合酶连锁反应扩增条件： 温度 时间

94 V 5分钟

94 V 1分钟

35次

循环 57 °C 1分钟

72 °C 2分钟

72 °C 10分钟

i.各条件扩增后， 以 1% 的洋菜胶进行电泳确认大小

ii.使用的标己为 Bio-IKB DNA Ladder (Protech)

序列比对分析

经过 18S rDNA、 26S rDNA D1/D2 , ITS的聚合酶连锁反应扩增后， 其大 小皆约为 1200 个碱基对， 经过 BLAST 比对后， 发现 TN01 的序列与 Cystofilobasidium属最为接近。

各序列经过 ClustalW工具模组排整后， 以生物分析软体 MEGA 4进行分 析， 并使用 bootstrap test和 neighbor-joining分类方法后， 建立 TN系歹 ¹ J与标 准菌株的亲缘关系图， 18S rDNA序列亲缘关系为图 3 , 26S rDNA D1/D2序 列亲缘关系为图 4 , ITS序列亲缘关系为图 5 ,其中 Rhodotorula lamellibrachiae 为另一种产油酵母菌， 做为控制组。 各图皆可看出 TN 系列与标准菌株 Cystofilobasidium属最为相近， 但仍有些许差异。

生理生化测试

将分离出来的实验菌株与标准菌株进行碳源的 生理生化测试，使用 Yeast identification system , ID 32C (REF 32 200) , 购买自 bioM rieux®公司 (http://www.biomerieux.com)。

a.将实验菌株与标准菌株培养在含 3 ml GYPG液态培养基的试管中， 20 °C ,

150 rpm培养两天。

b.并依其套组操作手册执行实验步骤。

c.置于 20 °C培养箱培养三天， 将培养液从孔盘取出并加入二次水至 1 ml, 以

OD ₆ QQ测定浓度， OD值小于 0.2为无反应 (-) , 0.2-0.3为讯号弱 (W) , 0.4-0.6 为讯号强 (+), 大于 0.6为最高讯号 (++)。 结果为表 2 , 碳源种类为表 3 , 在碳源利用上 TN 01与标准菌株比较， 则 与 C. bisporidii菌的碳源利用种类最相近， 差异的碳源分别是乳酸 (LAT)、 曱 基 -D-吡喃葡萄糖甙 (MDG)、 异麦芽酮糖 (PLE)、 葡萄糖醛酸钠 (GRT) , 与其他 标准菌株则差异较大。

表 2、 TN01生理生化测试

TN 01 C. bisporidii C. capitatum C. infirmominiatum

GAL ++ ++ + +

ACT - - - -

SAC ++ ++ ++ +

NAG - - - -

LAT W + W +

ARA ++ ++ ++ ++

CEL ++ ++ ++ ++

RAF ++ ++ ++ ++

MAL ++ ++ ++ ++

TER ++ ++ ++ ++

2KG ++ ++ ++ ++

MDG - W - -

MAN ++ ++ ++ ++

LAC - - - +

ION ++ ++ ++ ++

0 - - - -

SOR ++ ++ ++ ++

XYL ++ ++ + ++

RIB ++ ++ - ++

GLY ++ ++ ++ ++

RHA ++ ++ - ++

PLE w + - ++

ERY - - - -

MEL + + - - GRT + ++ ++ ++

MLZ ++ ++ ++ ++

GNT ++ ++ + ++

LVT - - - -

GLU ++ ++ ++ ++

SBE ++ ++ ++ -

GLN - - - -

ESC - - - - 表 3、 ID 32C碳源种类

测验

GAL D-半乳糖

ACT 放线菌酮

SAC D-蔗糖

NAG N-乙酰葡萄醣胺

LAT 孔酸

ARA L-阿拉伯糖

CEL D-纤维二糖

RAF D-棉籽糖

MAL D-麦芽糖

TER D-海藻糖

2KG 2-酮葡糖酸钾

MDG 曱基 -D-吡喃葡萄糖甙

MAN D-甘露醇

LAC D-乳糖 （牛来源）

ION 肌醇

0 无基质

SOR D-山梨醇

XYL D-木糖

RIB D-核糖 GLY 甘油

RHA L-鼠李糖

PLE 异麦芽嗣糖

ERY 赤藻糖醇

MEL D-蜜二糖

GRT 葡萄糖醛酸钠

MLZ D-松三糖

GNT 葡萄糖酸钾

LVT 乙酰丙酸

GLU D-葡萄糖

SBE L-山梨糖

GLN 葡萄糖胺

ESC 栗糖苷 最适化培养条件的探讨

首先从固态培养基挑一菌落到含 3 ml GYPG液态培养基的试管， 置于 20 °C , 150 rpm震荡培养两天， 再从此吸取 500 μΐ的菌液至含 50 ml GYPG液 态培养基的三角锥形瓶（型号， 125 ml), 置于 20°C , 150 rpm震荡培养两天， 为最终接种液。 再由最终接种液取 500 μΐ菌液接种至各条件的培养液中， 每 个培养条件皆为重复三次， 培养天数由生长曲线决定， 在菌株生长平緩期收 集菌液， 离心后进行冷冻干燥。 脂肪酸萃取

脂肪酸萃取为各实验组收集培养的菌液，经由 冷冻干燥后得到干燥菌粉， 再使用干燥菌粉进行实验。 因为在生物体内脂肪酸是以三酸甘油酯的形式 存 在， 为三个游离脂肪酸以酯化的形式跟甘油结合， 因此需要进行转酯化反应， 以曱醇与脂肪酸重新进行酯化， 使的形成单一的脂肪酸曱酯， 才能进行分析。 如下为转酯化反应的化学方程式： CH2 OCORi _st CH ₂ OH Ri ^OOCHs

CH2 OCOR2 + 3HOCH3 « ^{3 3 yS} " CH ₂ OH + R2 -COOCHs

CH2 OCORs CH2 OH R3 H:OOCH3

Triglyceride Methanol Methyl esters

(parent oil) (alcohol) ^Y (biodesd)

而萃取的过程中， 需要一种定量的方式来决定菌体所含脂肪酸的 量， 而 使用气相层析仪（Gas Chromatography, GC)分析样品时， 真正会对样品进行 侦测动作的是接在其后的探测器 (Detector), 加入内标准品的目的便是要提供 一个可定量的依据， 而探测器本身无法提供一稳定的侦测结果， 气相层析仪 本身的特性导致在游离化的过程中无法产生一 致性的结果， 所以添加内标准 品来进行样品的定量动作。利用分析物与内标 所得到的比 （ratio) 来进行样本 的定量， 这个比称为 RRF (Relative Response Factor), 因内标物与样品在侦测 的过程中将呈现等比例的增减， 所以可较精确的定量。 而内标准品的选择， 大致会选择不会在待测样品中出现， 且结构、 化学性质、 沸点相似的物质来 做为内标准品， 且在生物体内大多数是偶数碳链长的脂肪酸， 奇数碳的脂肪 酸非常少， 因此釆用十九碳的脂肪酸（nonadecanioc acid)作为内标准品。 萃 取步骤如下：

a. 秤 0.05g干燥菌粉，放入 10 ml的玻璃试管，并加入氯仿： 曱醇 （2:1) 5 ml, 震荡混匀。

b. 进行超音波震碎菌体， 震碎 2分钟 （：震碎 5秒再停止 5秒， 共 4分钟；)。 c 室温静置一小时后加入 100 μΐ内标准品溶液， 标准品浓度为 10 毫克 / ml。 d. 力口水 0.5 ml, 2500 rpm离心 5 分钟， 去除上层液。

e. 力口入 TUP ( theoretical upper phase, 氯仿： 二次水： 曱醇为 47: 48: 3 ) 2.5 ml (不可摇晃)， 2500 rpm离心 5分钟， 去除上层液。

f. 重复步骤 d. 和 e.， 并在室温下氮气吹干。

g. 加入 2.5 ml 曱醇： 苯为 4:1 (V/V), 再緩慢加入乙酰氯 250 μΐ, 当转酯化 的催化剂， 震荡混匀。

h. 盖紧铁氟龙上盖， 置于 80 °C 烘箱 4小时。

i. 室温冷却后，緩慢加入 7%碳酸钾 1.5 ml终止反应， 2500 rpm离心 10分钟。 j. 取上层苯层至抛弃式离心管， 室温下氮气吹干。 k. 沿管壁加入 0.5 ml正己烷， 震荡混匀。

1. 氮气吹干后， 加入 250 μΐ正己烷， 震荡混勾后， 注入有嵌入管的样品瓶， 封口后使用气相层析仪进行分析。 气相层析 ( Gas chromatography, GC)分析脂肪酸

GC型号为， 釆用的层析管柱为极性较低的 DB-1 , 长度 60公尺， 内径 0.25 mm; 管柱内膜为聚二曱基硅氧烷 [-氧-二曱基硅 -] , 厚度为 0.25 μπι; 烘箱 起始温度为 60°C , 加热至 280°C , 注射器加热温度为 250°C ; 氮气流速为 1.2 ml/分钟，氢气流速为 30 ml/分钟，空气流速为 300 ml/分钟，样品注射量为 Ιμΐ, 使用火焰离子探测器侦测样品，设定温度为 300°C。结果使用 GC套装软体进 行积分， 并用标准品估算脂肪酸含量。 估算公式为：

单一脂肪酸％：

(单一脂肪酸积分面积 X 标准品浓度 X 100 ) ÷ 内标准品积分面积 总脂肪酸含量％：

[ (总脂肪酸积分面积-内标准品积分面积） X 标准品浓度 100 ] ÷ 内标准品积分面积 最适盐浓度试验

在培养基中稀释海水的添加量分别为 0%、 1%、 25%、 50%, 进行 5公升 发酵槽培养。 并每 24小时收集 50 ml菌液冷冻干燥后测定干重， 推估收集总 菌体与培养天数。 图 6为测试各条件盐浓度 TN 01生长的标准曲线， 菌体快 速增长期为第一天到第 5天， 在第 6天开始达到平緩， 因此后续最适化培养 收集菌体的时间订为第 6天， 而第 7-10天菌株增殖速度变慢， 但仍呈现上升 的趋势。生长最佳盐浓度为 1%的海水浓度，最差为 25%海水浓度， 0%与 50% 次之。 培养 10天后， 1%的海水浓度生长条件菌体干重达到 13.09 g/L, 0%、 25%、 50%分别为 11.84 g/L、 10.73 g/L, 11.31 g/L。

而收取第 6天的菌体进行测定干重和脂肪酸分析，结果� �图 7。 0%、 1%、 25%、 50%海水培养浓度的菌体 (50 ml)干重分别为 0.31 g、 0.39 g、 0.266 g、 0.297 g, 总脂肪酸含量分别为 50.91%、 51.24%、 44.31%、 41.76%, 比照生长 曲线结果与脂肪酸分析结果， 后续最适化实验海水浓度皆为 1%。 培养温度范围试验

将 TN 01用 50 ml GYPG培养液培养在 3种不同温度， 培养 6天后收取 菌体， 测定干重与脂肪酸分析结果为图 8, 培养于 20°C有最佳的生物量与最 好的脂肪酸百分比， 而培养于 28°C生长差， 培养 37°C几乎无法生长， 与培养 于 20°C差异甚大。 菌体培养于 20°C、 28°C、 37°C的干重分别为 0.317 g、 0.027 g、 0.023 g, 总脂肪酸含量分别为 53.1%、 4.40%、 0.63%。 培养基简单化

未来进行工业大量发酵培养时， 希望能以最简单的培养基来培养， 达到 降低成本的效果， 因此将原本 GYPG培养基先进行改良， 分别为：

使用不同简化的培养基对 TN 01生长情况及脂肪酸累积量进行测试， 将 TN 01养在 50 ml的实验培养基，培养 6天后收集菌液干燥后测定干重及分析 总脂肪酸含量， 结果为图 9, GY、 GYP, GYPG培养基培养的菌体干重分别 为 0.1750 g, 0.2450 g, 0.3010 g,总脂肪酸含量分别为 53.96%、52.35%、47.84%, 培养于 GYPG培养基有最高的干重， 但脂肪酸最低； 培养于 GY培养基则反 之， 因此考量干重差异甚大， 后续实验基础培养基仍以 GYPG培养基进行实 验。 生长 pH值试验

pH值实验设定范围为 3到 11 ,探讨 pH值对菌体的影响和生长最适合的 培养条件。 而为了扣除生物体生长时代谢物影响 pH值， 因此以 GYPG培养 基为基础， 依照各条件加入了以下缓冲剂：

pH值 緩冲剂及添加浓度

3-4 醋酸钠， 30mM

5-6 生物緩冲液（MES ), 30mM 7-8 三 (羟曱基)氨基曱烷， 30mM

9-11 3- (环己胺) -2-羟基 -1-丙磺酸， 30mM pH 3和 4使用醋酸调整 pH值； pH 5-11以氢氧化钠或氯化氢调整 pH值， 并于最佳温度， 150 rpm培养六天。

将 TN 01培养在各条件的 pH值，培养 6天后收取菌液 (50 ml),干燥后测 定其干重， 结果为图 10, pH值 3-11菌体干重分别为 0.0423 g、 0.025 g、 0.412 g、 0.45 g、 0.479 g、 0.596 g、 0.369 g、 0.168 g、 O.lg, 菌体生长最适化培养 的 pH为 pH 8。 碳源利用试验

异营微生物生长需要碳源， 对于碳源种类的利用影响了菌体的生长和油 脂的累积， 所以根据酵母菌属的代谢途径， 各种碳源包含单醣（六碳糖和五 碳糖)、 双醣、 多醣和三碳链长的碳源， 并使用甘油作为油脂类的碳源， 期望 能找到对菌体生长和油脂累积最佳的碳源。 此实验培养基成分如下：

5%碳源 + 0.1% 酵母抽出物 + 0.1%胨 + 0.1% 明胶

碳源种类： 葡萄糖、 果糖、 乳糖、 麦芽糖、 蔗糖、 甘油、 山梨醇、 淀粉、 醋酸盐。

其干重与总脂肪酸量的结果如图 11所示， TN 01最佳生物量可用的碳源 为淀粉， 干重为 0.382 g, 次之为蔗糖， 干重为 0.364 g, 而总脂肪酸最佳最培 养碳源为蔗糖， 含量为 70%, 次之为葡萄糖， 含量为 56%。 而培养于乳糖与 醋酸盐的生物量最差， 脂肪酸含量也最少。 氮源利用试验

氮源是微生物生长所必需的营养源， 研究指出不同的氮源影响了微生物 油脂的累积， 因此设计了包含有机氮源和无机氮源的种类， 观察菌体生长和 油脂累积的情形， 期望找出最佳的氮源。 此实险培养基成分如下：

5% 葡萄糖 + 0.1% 酵母抽出物 + 0.1% 氮源 + 0.1% 明胶

氮源种类： 胨、 胰化蛋白胨、 大豆胨、 硝酸铵、 硫酸铵、 氯化铵、 钠铵、 尿素、 硫代硫酸钠。 其中硫代硫酸钠并无氮源， 当作控制组。

测定干重与总脂肪酸含量的结果为图 12,菌体生物量最佳的氮源为尿素， 干重为 0.318 g, 次之分别为大豆胨、 胨、 胰化蛋白胨， 干重分别为 0.304 g、 0.296 g、 0.293 g, 脂肪酸累积最佳为控制组硫代硫酸钠 (ST), 为 66.6%, 次之 为钠铵 (SA)的 52.3%与胰化蛋白胨的 51.9%。 醣类浓度试验

碳为脂肪酸形成的基本单位，且发酵培养常用 馈料式 （fed-batch) 来调整 油脂的累积， 因此设计高糖浓度试验， 看高浓度糖当碳源时对菌体生长的影 响和脂肪酸是否有增加。 实验组以 GYPG液态培养基为基础， 葡萄糖添加量 分别为 50 g/L、 100 g/L、 150 g/L、 200 g/L。

结果为图 13 , 葡萄糖浓度 50 g、 100 g、 150 g、 200 g的菌体干重分别为

0.2680 g、 0.2580 g、 0.2900 g、 0.2960 g, 脂肪酸含量分别为 47.5%、 43.5%、 30.5%、 24.3%。 葡萄糖浓度 150 g时有最佳的生物量， 浓度 50 g时有最佳的 总脂肪酸含量。 TN 01脂肪酸种类

将 TN 01培养在 GYPG液态培养基中， 干燥后收集菌体， 经过脂肪酸萃 取后， 为了得知 TN 01脂肪酸详细种类， 因此将萃取好的样品送往信得生技 公司进行 GC-MS的分析， 发现 TN 01脂肪酸种类多为饱和度较低的脂肪酸， 如表 4所示， 大多为 C14、 C16、 C18系列， 这类脂肪酸较不易氧化， 比饱和 脂肪酸更适合做为生物柴油的制造， 因为在生物柴油制作过程中的热和氧化 剂， 可能会使饱和脂肪酸裂解， 且需额外负担加入抗氧剂的费用， 且 TN 01 未最适化前就有高达 50%的总脂肪酸，因此极具有做为生物柴油来源 的潜力。 表 4、 TN 01脂肪酸种类与占总脂肪酸的百分比 脂肪酸种类 含量（占总脂肪酸的％)

C14:0 17.34

C16:0 20.4

C18:0 4.69

C18:l 40.47

C18:2 11.47 C18:3 2.41

C20:4 0.97

TFA% 50.91

TN 01与其他 Cystofilobasidium菌种脂肪酸含量试验

将 TN 01、 Cystofilobasidium bisporidii BCRC 22462、 Cystofilobasidium capitatum BCRC 22464 与 Cystofilobasidium in firmom in iatum BCRC 22465 ( BCRC : 生物资源保存及研究中心 （Bioresource Collection and Research Center) )培养于下列培养基:

液态培养置于 20 °C：、 150 rpm震荡培养 7天， 做脂肪酸含量分析， 结果 如表 5所示， 其他 Cystofilobasidium属菌种亦确实具有产油能力， 然而产油 能力均不及 TN 01佳。 表 5、 TN 01与标准菌株脂肪酸种类与占总脂肪酸的百分� ��

C18:3 2.407

C20:0 1.14

C24:0 0.971 1.65 总脂肪酸 /生物量（％〕 50.91 33.56 33.22 17.29

本案得由熟悉本技艺的人士任施匠思而为诸 般修饰， 然皆不脱如权利 求所欲保护者。