Die vorliegende Anmeldung betrifft ein neues Verfahren zur gezielten Konjugation von Peptiden und Proteinen, das durch die paarweise C2-Verbrückung von Cystein-Aminosäuren über deren Thiol-Gruppen gekennzeichnet ist, ferner die Konjugate von Peptiden und Proteinen, die nach einem solchen Verfahren erhältlich sind, sowie die Verwendung solcher Konjugate zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen.

Die Peptid- und Proteinkonjugation hat in den letzten Jahren enorme Bedeutung in der Bereitstellung von therapeutisch wichtigen Wirkstoffen, in der Diagnostik von Krankheitsgeschehen sowie bei der Aufklärung biochemischer Mechanismen erlangt [Flygare et al., 2013; Jones et al., 2013] .

Im Wesentlichen werden durch Konjugation die Eigenschaften von Peptiden und Proteinen verändert oder moduliert. Therapeutisch relevante Peptide und Proteine können beispielsweise mit biokompatiblen Polymeren konjugiert werden, um die Halbwertszeit des betreffenden Peptids oder Proteins in der Plasmazirkulation und damit seine Wirkdauer zu verlängern oder um einer möglichen Immunogenizität entgegenzuwirken [Veronese und Maro, 2008; Roberts et al., 2002]. Weiterhin können Peptide und Proteine mit biochemischen Markern, Farbstoffen oder Reaktivgruppen konjugiert werden, die dann nach Applikation Aufschluss über das Bindungsgeschehen in gewissen Organen oder Zellregionen geben [Miller und Cornish, 2005]. Eine weiteres, breit beforschtes Feld sind Peptid- und Proteinkonjugate mit Wirkstoffen, die diese Wirkstoffe zielgerichtet in bestimmte Zell- oder Organregionen zum beabsichtigten Wirkort führen (sogenanntes Drug Targeting). Prominentes Beispiel hierfür sind Antikörper -Wirkstoff-Konjugate (sogenannte Antibody Drug Conjugates, ADCs), die gezielt an bestimmte Domänen/ Antigene binden und nach Internalisierung in die Zelle sowie anschließender Prozessierung (beispielsweise in den Lysosomen) den Wirkstoff im Kompartiment des Wirkorts freisetzen [Garnett, 2001 ; Wu und Senter, 2005; Sapra et al., 2011; Chari et al., 2014; Klinguer-Hamour et al., 2014; Tian et al., 2014].

Die Methoden zur Konjugation von Peptiden oder Proteinen sind vielfältig. So können Peptide und Proteine nach unterschiedlichen Verfahren mit reaktiven Gruppen versehen werden, die dann ihrerseits als Anknüpfungsstelle für Wirkstoffe oder Diagnostika dienen [Ramil und Lin, 2013] . Darüber hinaus können Peptide und Proteine über die Funktionalitäten ihrer Aminosäuren konjugiert werden [Widdison et al., 2006] . Die Herausforderung hierbei ist die Bereitstellung einer Methode, die eine selektive Umsetzung der gewünschten Funktionalität im Peptid oder Protein in Gegenwart der weiteren, in der Regel ungeschützten (freien) Aminosäuregruppen erlaubt.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, durch biochemische Transformationen reaktive Gruppen zu generieren, die einer nachfolgenden Konjugation zugänglich sind. Prominentes Beispiel ist die Reduktion einer oder mehrerer über Cysteine ausgebildeter Disulfid-Bindungen in einem Peptid oder Protein, um die so frei werdenden Thiol-Gruppen dann zu konjugieren. Dies kann durch Konjugation eines einzelnen Thiols geschehen, vorzugsweise mit Maleinimiden [Ghosh et al., 1990], oder durch die Überbrückung beider Thiol-Gruppen der ehemaligen Disulfid-Bindung. Für eine solche Überbrückung von Thiolen sind beispielsweise doppelte Michael-Akzeptoren beschrieben, die zu einer Cl- bzw. C3-Verbrückung führen [Liberatore et al., 1990; Godwin et al., Int. Pat. Appl. WO 2005/007197-A2, WO 2010/100430-A1], sowie bifunktionelle elektrophile Maleinimi- de, die eine C2-Verbrückung ermöglichen [Schumacher et al., 2013] :

Schema la:

Schema lb:

Schema 1: Bis-reaktive Konjugationsreagenzien: a) "equilibrium transfer alkylating cross-link" (ETAC)-Reagenz für die Disulfid-C3-Verbrückung; b) funktionelle Maleinimide zur Disulfid-C2- Verbrückung. Die in Schema la und lb skizzierten Methoden haben bei der Bereitstellung von Antikörper -Wirk- stoff-Konjugaten (ADCs) erfolgreich Anwendung gefunden. Hierbei werden interchain-Ois lüd- brücken des betreffenden Antikörpers zu freien Thiol-Gruppen reduziert und anschließend verbrückend konjugiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun eine Methode gefunden, die einen neuen Zugang zu C2-verbrückten Peptid- und Proteinkonjugaten eröffnet. Bei dieser Methode werden die beiden Thiole nach Reduktion der über Cysteine ausgebildeten Disulfid-Brücke mittels einer sogenannten Thiol-yn-Reaktion selektiv mit Alkinen umgesetzt: Schema 2:

Schema 2: Thiol-yn-Reaktion zur C2-Verbrückung von reduzierten Disulfid-Bindungen in Peptiden und Proteinen.

Thiol-yn-Reaktionen [engl, thiol-yne reaction, thiol-yne coupling (TYC)] an Peptiden und Pro- teinen sind an sich bekannt. Sie wurden bisher jedoch nicht für die C2-verbrückende Konjugation an Cysteine mit freien Thiol-Gruppen genutzt, vielmehr wurde jede Thiol-Gruppe separat und nicht-verbrückend konjugiert [Lo Conte et al., 2011 ; Lo Conte et al., 2010; Massi und Nanni, 2012; Minozzi et al., 2011 ; Krannig et al., 2013; Aimetti et al., 2010]. Weiterhin sind Thiol-yn- Reaktionen an Peptiden bekannt, die der Synthese von Cyclopeptiden dienen, indem ein lineares Vorläuferpeptid an einer geeigneten Position mit einer Alkin-Gruppe substituiert wird, welche dann mit einem freien Cystein desselben Peptids unter Cyclisierung reagiert [Aimetti et al., Int. Pat. Appl. WO 2011/156686-A2] . Das hierbei gebildete Vinylsulfid kann in einem nachfolgenden Reaktionsschritt mit einem weiteren (anderen) Thiol umgesetzt werden. Im Gegensatz zur hier beschriebenen erfindungsgemäßen Methode werden dabei jedoch nicht zwei freie Cysteine eines Peptids oder Proteins miteinander verbrückt, sondern es wird jeweils ein peptid- oder proteingebundenes Alkin mit einem Cystein dieses Peptids oder Proteins zur Reaktion gebracht. Ferner ist in der Literatur eine verbrückende Thiol-yn-Reaktion von zwei verbundenen Mercaptoessigsäure- estern mit freien Thiol-Gruppen zur Synthese von makrocyclischen Kronenether- und Rotaxan- Strukturen beschrieben [Zhou et al., 2010]. Weiterhin sind Thiol-yn-Reaktionen mit Peptiden und Proteinen beschrieben, welche dem Aufbau dreidimensionaler Netzwerke, wie zum Beispiel Hydrogelen, dienen [Anseth et al., Int. Pat. Appl. WO 2012/103445-A2; Kazantsev et al., US Pat. Appl. US 2014/0273153-A1]. Im Gegensatz zur hier beschriebenen erfindungsgemäßen Methode resultieren dabei nicht homogene Konjugate, sondern heterogene polymere Netzwerke. Wesentliches Merkmal der oben beschriebenen Cystein-Verbrückung ist, dass dabei die Stabilität bzw. Konformation des Peptids oder Proteins, welche vormals durch die entsprechende Disulfid- Brücke vermittelt wurde, weitgehend erhalten bleibt. Ferner wird durch eine C2-Brücke die Funktionalität, d.h. die Affinität zum biologischen Target des Peptids oder Proteins vielfach bewahrt [Jones et al., 2012; Gerona-Navarro et al., 2011].

Von Michael-Addukten, wie im Falle der oben beschriebenen Cl- bzw. C3 -verbrückten Konjugate (siehe Schema la), ist andererseits bekannt, dass diese unter physiologischen Bedingungen Retro- und Austauschreaktionen mit anderen Thiol- Verbindungen, wie beispielsweise Glutathion oder Serumalbumin, eingehen können und somit einem gewissen Abbau in der Plasmazirkulation unter - liegen [Baldwin und Kiick, 2011; Toda et al., 2013; Shen et al., 2012]. Um diese oftmals unerwünschte Eigenschaft zu unterdrücken, sind nachfolgende chemische Transformationen nötig. Im Falle der über Maleinimid C2 -verbrückten Konjugate (siehe Schema lb) ist eine Öffnung des Maleinimids oder im gesättigten Fall des Succinimids erforderlich, um eine gegenüber Thiolen stabile Konjugation zu erreichen [Castaneda et al., 2013]. Bei den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren über Thiol-yn-Reaktion erhältlichen Verbindungen handelt es sich nicht um Konjugate von Michael-Akzeptoren, so dass derartige Retro- und Austauschreaktionen hier nicht zu erwarten sind.

Vor dem geschilderten Hintergrund war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Methode bereitzustellen, nach der Peptide und Proteine selektiv über ihre Cystein-Gruppen verbrückend und in stabiler Form konjugiert werden können und die so für die Herstellung verschiedenartiger, definierter Peptid- und Proteinkonjugate von Nutzen ist.

Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das eine konjugierende C2- Verbrückung von Cysteinen mit freien Thiol-Gruppen in Peptiden und Proteinen auf dem Wege einer selektiven Thiol-yn-Reaktion mit Alkin-Derivaten ermöglicht. Entsprechende freie Thiole können beispielsweise durch die Reduktion von Disulfid-Bindungen generiert werden. Weiterhin können die Alkin-Derivate in geeigneter Weise mit Substituenten, funktionellen Gruppen und/oder Linker-Einheiten versehen werden, was eine entsprechende Modulation der molekularen Eigenschaften der Ziel-Konjugate erlaubt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von homogenen Peptid- und Proteinkonjugaten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Peptid oder Protein der Formel (II)

in welcher S ¹ und S ² in einer Disulfid-Brücke gebundene Cystein-Schwefelatome dieses Peptids oder Proteins darstellen, unter reduzierenden Bedingungen in ein Peptid oder Protein der Formel (ΙΠ)

überführt und dieses dann unter radikalischen Reaktionsbedingungen mit einem Alkin-Derivat der Formel (IV)

(IV) in welcher

R ¹ und R ² unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino oder Alkoxycarbonylamino stehen, wobei Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbonylamino ihrerseits ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbonylamino substituiert sein können, für eine Bindung oder eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Alkylen-, Cycloalkylen- und/oder Arylengruppen steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, durch eine Gruppe ausgewählt aus -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -N(CH ₃ )-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S0 ₂ -NH-, -NH-SO2-, -NH-NH-, -SO2-NH-NH-, -NH-NH-SO2-, -C(=0)-NH-NH-, -NH-NH-C(=0)-, -NH-C(=0)-NH-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-0- und einem 4- bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Heterocyclus mit bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe N, O, S, S(=0) und/oder S(=0)2 unterbrochen sein kann,

und A miteinander verknüpft sind und zusammen mit den Kohlenstoffatomen, die sich zwischen ihnen befinden, einen 8-gliedrigen Carbocyclus bilden, welcher mit einem 3- bis 6-gliedrigen Cycloalkyl-Ring anelliert sein kann, wobei der 8-gliedrige Carbocyclus und gegebenenfalls der anellierte Cycloalkyl-Ring ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Fluor, Alkyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl und Alkoxy substituiert sein können, für eine Bindung oder einen Linker steht, n-fach vorhanden sein kann und ein Wirkstoffmolekül, Polymer, Alkaloid, Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Nucleotid, Nucleosid, Steroid, Terpen, Porphyrin, Chlorin, Corrin, Eico- sanoid, Pheromon, Vitamin, Biotin, ein Farbstoffmolekül oder einen Kryptanden darstellt oder für Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl steht, wobei Alkyl seinerseits ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbonylamino substituiert sein kann und wobei Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl und Heteroaryl ihrerseits ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbo- nylamino substituiert sein können, und n für eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis einschließlich 10 steht, wobei im Fall, dass die Gruppe X mehrfach vorhanden ist, ihre individuellen Bedeutungen gleich oder verschieden sein können, zu einem Peptid- bzw. Protein-Konjugat der Formel (I)

in welcher R ¹ , R ² , A, L, X und n die oben angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in dem nachfolgenden Reaktionsschema zusammenfassend dargestellt:

Schema 3

(I I) (III )

[a): Reduktion; b): Thiol-yn-Reaktion].

Die in Schema 3 abgebildeten Reaktionsschritte a) und b) können entweder in separater Form, unter zwischenzeitlicher Isolierung des Intermediats (III), oder nacheinander im gleichen Reak- tionsgefäß durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Umsetzungen im zuletzt genannten "Eintopfverfahren" durchgeführt. Die Reduktion des Disulfids (Π) zum freien Dithiol (III) erfolgt bevorzugt mit Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP). Die über einen Radikalmechanismus verlaufende Thiol-yn-Reaktion des Dithiols (ΙΠ) mit dem Alkin-Derivat der Formel (IV) zum Konjugat der Formel (I) kann durch photochemische Radikalinitiatoren oder durch oxidativ erzeugte Radikale, wie beispielsweise Triethylboran mit geringen Mengen Sauerstoff, vermittelt werden. Bevorzugt werden bekannte photochemische Radikalinitiatoren, wie beispielsweise Bis(2,4,6-trimefhyl- benzoyl)phenylphosphinoxid (Irgacure ^® 819) oder Lithium-phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphos- phinat (LAP) [Gong et al., 2013], verwendet. Zur photochemischen Initiierung in Verbindung mit dem Radikalstarter eignet sich UV-Licht. Bevorzugt wird UV-Licht einer Wellenlänge zwischen 350 nm und 400 nm eingesetzt, besonders bevorzugt sind die Wellenlängen von 365 nm und 385 nm. Als inerte Lösungsmittel für die Reaktionsschritte a) und b) eignen sich vorzugsweise Wasser, wässrige Pufferlösungen oder Gemische von Wasser mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Ethanol. Die Umsetzungen erfolgen im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C; bevorzugt ist die Reaktionsführung bei Raumtemperatur.

Wenn das erfindungsgemäß zu konjugierende Peptid oder Protein bereits in der Dithiol-Form (ΙΠ) vorliegt, entfällt der oben aufgeführte Reduktionsschritt a); das erfindungsgemäße Verfahren betrifft in diesem Fall die "direkte" Umsetzung des Dithiols (ΙΠ) mit dem Alkin-Derivat (IV) zum Konjugat der Formel (I) unter den zuvor für Reaktionsschritt b) beschriebenen Bedingungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch die Herstellung von Mehrfach-Konjugaten eines Peptids oder Proteins der Formel (II) mit dem Alkin-Derivat (IV) gemäß der oben beschriebenen Reaktionssequenz in Fällen, wo in dem Peptid oder Protein der Formel (II) mehrere einer solchen Konjugation zugängliche Disulfidbrücken vorhanden sind. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptid- und Protein-Konjugate der allgemeinen Formel (I)

in welcher

S ¹ und S ² vormals in einer Disulfid-Brücke gebundene Cystein-Schwefelatome eines Peptids oder Proteins darstellen,

R ¹ und R ² unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino oder Alkoxycarbonylamino stehen, wobei Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbonylamino ihrerseits ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbonylamino substituiert sein können,

A für eine Bindung oder eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Alkylen-, Cycloalkylen- und/oder Arylengruppen steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, durch eine Gruppe ausgewählt aus -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -N(CH ₃ )-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S0 ₂ -NH-, -NH-SO2-, -NH-NH-, -SO2-NH-NH-, -NH-NH-SO2-, -C(=0)-NH-NH-, -NH-NH-C(=0)-, -NH-C(=0)-NH-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-0- und einem 4- bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Heterocyclus mit bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe N, O, S, S(=0) und/oder S(=0)2 unterbrochen sein kann, oder

R ² und A miteinander verknüpft sind und zusammen mit den Kohlenstoffatomen, die sich zwischen ihnen befinden, einen 8-gliedrigen Carbocyclus bilden, welcher mit einem 3- bis 6-gliedrigen Cycloalkyl-Ring anelliert sein kann, wobei der 8-gliedrige Carbocyclus und gegebenenfalls der anellierte Cycloalkyl-Ring ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Fluor, Alkyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl und Alkoxy substituiert sein können,

L für eine Bindung oder einen Linker steht,

X n-fach vorhanden sein kann und ein Wirkstoffmolekül, Polymer, Alkaloid, Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Nucleotid, Nucleosid, Steroid, Terpen, Porphyrin, Chlorin, Corrin, Eico- sanoid, Pheromon, Vitamin, Biotin, ein Farbstoffmolekül oder einen Kryptanden darstellt oder für Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy- carbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino, Alkoxycarbonylamino, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl steht, wobei Alkyl seinerseits ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbonylamino substituiert sein kann und wobei Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl und Heteroaryl ihrerseits ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, mit Halogen, Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, Alkylcarbonylamino und Alkoxycarbo- nylamino substituiert sein können, und n für eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis einschließlich 10 steht, wobei im Fall, dass die Gruppe X mehrfach vorhanden ist, ihre individuellen Bedeutungen gleich oder verschieden sein können. Die vorliegende Erfindung umfasst bei Peptiden oder Proteinen mit mehreren der erfindungsgemäßen Konjugationsmethode zugänglichen Disulfidbrücken auch entsprechende Mehrfach- Konjugate eines solchen Peptids oder Proteins, d.h. Konjugate, bei denen eine paarweise C2- Verbrückung im Sinne der Formel (I) an mehreren Positionen des betreffenden Vorläuferpeptids oder -proteins erfolgt ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten und Reste, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

Alkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 8, besonders bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, wo-Butyl, sec.-Butyl, ieri.-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, 1-Ethylpropyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, Neopentyl, n-Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl und n-Decyl.

Alkylen steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten, divalenten Alkylrest (Alkandiyl-Rest) mit 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 8, besonders bevorzugt 1 bis 6 Kohlen- Stoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-l,l-diyl, Ethan-1,2- diyl (1,2-Ethylen), Propan-l,l-diyl, Propan-l,2-diyl, Propan-2,2-diyl, Propan-l,3-diyl (1,3-Pro- pylen), Butan- 1,2-diyl, Butan-l,3-diyl, Butan-2,3-diyl, Butan- 1,4-diyl (1,4-Butylen), Pentan-1,5- diyl (1,5-Pentylen), Hexan- 1,6-diyl (1,6-Hexylen), Heptan-l,7-diyl (1,7-Hexylen), Octan- 1,8 -diyl (1,8-Octylen), Nonan-l,9-diyl (1,9-Nonylen) und Decan-l,10-diyl (1,10-Decylen). Hydroxyalkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der innerhalb der Kette oder endständig eine Hydroxy-Gruppe als Substituenten trägt. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Hydroxy- methyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 1 -Hydro xy-l-methylethyl, l,l-Dimethyl-2-hydroxyethyl, 1-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, l-Hydroxy-2-methylpropyl, 2-Hydroxy- 1-methylpropyl, 2-Hydroxy-2-methylpropyl, 1-Hydroxybutyl, 2-Hydroxybutyl, 3-Hydroxybutyl, 4- Hydroxybutyl, 5-Hydroxypentyl und 6-Hydroxyhexyl.

Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Meth- oxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, wo-Butoxy, sec.-Butoxy, feri.-Butoxy, «-Pentoxy, Isopentoxy, 1-Ethylpropoxy, 1-Methylbutoxy, 2-Methylbutoxy, 3-Methylbutoxy und n-Hexoxy.

Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der über eine an das O-Atom gebundene Carbonyl-Gruppe [-C(=0)-] mit dem Rest des Moleküls verknüpft ist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, n-Butoxycarbonyl und ieri.-Butoxycarbonyl.

Alkylamino steht im Rahmen der Erfindung für eine Amino-Gruppe mit einem geradkettigen oder verzweigten Alkylsubstituenten, der 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, Isopropyl- amino, n-Butylamino und ieri.-Butylamino. Dialkylamino steht im Rahmen der Erfindung für eine Amino-Gruppe mit zwei gleichen oder verschiedenen geradkettigen oder verzweigten Alkylsubstituenten, die jeweils 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: -Dimefhylamino, -Diefhylamino, -Ethyl- -mefhylamino, -Methyl- -n-propylamino, /V-Isopropyl- -methyl- amino, -rsopropyl- -n-propylamino, /V,/V-Diisopropylamino, -n-Butyl- -mefhylamino und N-ieri.-Butyl-N-methylamino.

Alkoxycarbonylamino steht im Rahmen der Erfindung für eine Amino-Gruppe mit einem geradkettigen oder verzweigten Alkoxycarbonyl-Substituenten, der 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome im Alkoxyrest aufweist und über die Carbonylgruppe mit dem N-Atom verknüpft ist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methoxycarbonylamino, Ethoxycarbonylamino, «-Propoxycarbonylamino, Isopropoxycarbonylamino, n-Butoxycarbonylamino und ieri.-Butoxy- carbonylamino.

Alkylcarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der über eine Carbonyl-Gruppe [-C(=0)-] mit dem Rest des Moleküls verknüpft ist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Acetyl, Propionyl, n-Butyryl, wo-Butyryl, n-Pentanoyl und Pivaloyl.

Alkylcarbonylamino steht im Rahmen der Erfindung für eine Amino-Gruppe mit einem geradkettigen oder verzweigten Alkylcarbonyl-Substituenten, der 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoff- atome im Alkylrest aufweist und über die Carbonylgruppe mit dem N-Atom verknüpft ist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Acetylamino, Propionylamino, n-Butyrylamino, iso- Butyrylamino, n-Pentanoylamino und Pivaloylamino.

Cycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen monocyclischen, gesättigten Carbocyclus mit 3 bis 10, bevorzugt 3 bis 8, besonders bevorzugt 3 bis 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, Cyclononyl und Cyclodecyl.

Cycloalkylen steht im Rahmen der Erfindung für einen monocyclischen, gesättigten, divalenten Cycloalkyl-Rest (Cycloalkandiyl-Rest) mit 3 bis 10, bevorzugt 3 bis 8, besonders bevorzugt 3 bis 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Cyclopropan-l,l-diyl, Cyclopropan-l,2-diyl, Cyclobutan-l,l-diyl, Cyclobutan-l,2-diyl, Cyclobutan-l,3-diyl, Cyclo- pentan-l,l-diyl, Cyclopentan-l,2-diyl, Cyclopentan- l,3-diyl, Cyclohexan-l,l-diyl, Cyclohexan- 1,2-diyl, Cyclohexan-l,3-diyl, Cyclohexan-l,4-diyl, Cycloheptan-l,l-diyl, Cycloheptan-l,2-diyl, Cycloheptan-l,4-diyl, Cyclooctan-l,2-diyl, Cyclooctan-l,5-diyl, Cyclononan-l,2-diyl, Cyclo- nonan-l,5-diyl, Cyclodecan-l,2-diyl und Cyclodecan-l,6-diyl. Heterocycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen 4- bis 10-gliedrigen, mono- oder gegebenenfalls bicyclischen, gesättigten oder eine Doppelbindung enthaltenden, nicht-aromatischen Heterocyclus mit insgesamt 4 bis 10 Ringatomen, der bis zu vier Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O, S, S(=0) und/oder S(=0)2 enthält und über ein Ring-Kohlenstoffatom oder gegebenenfalls ein Ring-Stickstoffatom verknüpft ist. Beispielhaft seien genannt: Azetidinyl, Oxetanyl, Thietanyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Pyrazolidinyl, Dihydropyrazolyl, Tetrahydrofuranyl, Thiolanyl, 1,1-Di- oxidothiolanyl, 1,3-Oxazolidinyl, 1,3-Thiazolidinyl, Piperidinyl, Tetrahydropyridyl, Piperazinyl, Tetrahydropyranyl, Dihydropyranyl, Tetrahydrothiopyranyl, 1,3-Dioxanyl, 1,4-Dioxanyl, Morpho- linyl, Thiomorpholinyl, 1,1-Dioxidothiomorpholinyl, Hexahydroazepinyl, Hexahydro-l,4-di- azepinyl, Octahydroazocinyl, Octahydropyrrolo[3,4-b]pyrrolyl, Octahydroisoindolyl, Octahydro- pyrrolo[3,4-b]pyridyl, Hexahydropyrrolo[3,4-c]pyridyl, Octahydropyrrolo[l,2-a]pyrazinyl, Deca- hydroisochinolinyl, Octahydropyrido[l,2-a]pyrazinyl, 7-Azabicyclo[2.2.1]heptanyl, 3-Azabicyclo- [3.2.0]heptanyl, 3-Azabicyclo[3.2.1]octanyl, 8-Azabicyclo[3.2.1]octanyl und 8-Oxa-3-azabicyclo- [3.2.1]octanyl. Bevorzugt ist ein 4- bis 6-gliedriger, monocyclischer, gesättigter Heterocyclus mit insgesamt 4 bis 6 Ringatomen, der ein oder zwei Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O und/oder S enthält und über ein Ring-Kohlenstoffatom oder gegebenenfalls ein Ring-Stickstoffatom verknüpft ist. Beispielhaft seien genannt: Azetidinyl, Oxetanyl, Thietanyl, Pyrrolidinyl, Pyrazolidinyl, Tetra- hydrofuranyl, Thiolanyl, 1,3-Oxazolidinyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Tetrahydropyranyl, Tetra- hydrothiopyranyl, 1,4-Dioxanyl, Morpholinyl und Thiomorpholinyl.

Aryl steht im Rahmen der Erfindung für einen aromatischen Carbocyclus mit 6 oder 10 Ring- Kohlenstoffatomen wie Phenyl und Naphthyl.

Arylen steht im Rahmen der Erfindung für einen divalenten Arylrest wie beispielsweise 1,2- Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, Naphthalin-2,3-diyl, Naphthalin- 1,4-diyl, Naphthalin- 1,5- diyl, Naphthalin-2,6-diyl und Naphthalin-l,8-diyl.

Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für einen 5- bis 10-gliedrigen, mono- oder gegebenenfalls bicyclischen aromatischen Heterocyclus (Heteroaromaten) mit insgesamt 5 bis 10 Ringatomen, der bis zu vier Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O und/oder S enthält und über ein Ring-Kohlenstoffatom oder gegebenenfalls ein Ring-Stickstoffatom verknüpft ist. Beispielhaft seien genannt: Furyl, Pyrrolyl, Thienyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Triazolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl, Tetrazolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Triazinyl, Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Benzothiazolyl, Benzotriazolyl, Indolyl, Indazolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Naphthyridinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Phthalazinyl und Pyrazolo[3,4-b]pyridinyl. Bevorzugt ist ein 5- oder 6-gliedriger, monocyclischer Heteroaryl-Rest mit insgesamt 5 oder 6 Ringatomen, der bis zu drei Ring-Heteroatome aus der Reihe N, O und/oder S enthält und über ein Ring-Kohlenstoffatom oder gegebenenfalls ein Ring-Stickstoffatom verknüpft ist. Beispielhaft seien genannt: Furyl, Thienyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isothiazolyl, Isoxazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Triazolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl und Triazinyl. Halogen schließt im Rahmen der Erfindung Fluor, Chlor, Brom und Iod ein. Bevorzugt sind Chlor, Fluor oder Brom, besonders bevorzugt Fluor oder Chlor.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt, dass für alle Reste, die mehrfach auftreten, deren Bedeutung unabhängig voneinander ist. Wenn Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sub- stituiert sind, können die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach substituiert sein. Eine Substitution mit einem oder mit zwei oder drei gleichen oder verschiedenen Substitu- enten ist bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem oder mit zwei gleichen oder verschiedenen Substituenten. Ganz besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem Substi- tuenten.

Ein "Linker" stellt im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Alkylen-, Cycloalkylen- und/oder Arylengruppen dar, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden, durch eine Gruppe ausgewählt aus -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -N(CH ₃ )-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S0 ₂ -NH-, -NH-S0 ₂ -, -NH-NH-, -SO2-NH-NH-, -NH-NH-SO2-, -C(=0)-NH-NH-, -NH-NH-C(=0)-, -NH-C(=0)-NH-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-0- und einem 4- bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Heterocyclus mit bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe N, O, S, S(=0) und/oder S(=0) ₂ sowie durch eine in vivo spaltbare Gruppe oder durch eine in vivo transient stabile Gruppe unterbrochen sein kann. Der Begriff "in vivo spaltbare Gruppe" kann unterteilt werden in Gruppen, die auf chemischem Wege in vivo spaltbar sind (z.B. durch saure Hydrolyse oder Redox-Prozesse), und in solche, die auf enzymatische Weise, d.h. unter dem Einfluss eines körpereigenen Enzyms, in vivo spaltbar sind. Beide Arten von spaltbaren Gruppen sollten im Blutkreislauf zunächst stabil sein und erst an oder in der Zielzelle durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (z.B. niedrigerer pH-Wert, erhöhte Glutathion-Konzentration, Anwesenheit lysosomaler Enzyme wie Cathepsin oder Plasmin) gespalten werden. Als chemisch in vivo spaltbare Strukturfragmente eignen sich für diesen Zweck insbesondere Disulfid-, Hydrazon-, Acetal- und Aminal-Gruppierungen. Enzymatisch in vivo spaltbare Strukturelemente sind insbesondere Oligopeptid-Einheiten aus 2 bis 8 Aminosäuren und hier vor allem Dipeptid-Gruppierungen. Solche designierten Peptid-Spaltstel- len sind in zahlreicher Form in der Literatur beschrieben. Prominente Beispiele sind die Dipeptid- Einheiten Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin-Lysin und Phenylalanin-Lysin [siehe z.B. J. J. Petersen und C. F. Meares, Bioconjugate Chem. 9, 618-626 (1998); G. M. Dubowchik und R. A. Firestone, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); G. M. Dubowchik et al, Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)] . Der oben beschriebene Linker kann auch eine in vivo transient stabile Gruppe enthalten. Solche transient stabilen Gruppen werden unter dem Einfluss der chemischen bzw. enzymatischen Umgebung beispielsweise im Blutkreislauf über einen längeren Zeitraum (von Stunden oder Tagen) hinweg gespalten [siehe z.B. Flamme et al., Int. Pat. Appl. WO 2013/064455-A1]. Als Wirkstoffmoleküle in der obigen Definition der Gruppe X kommen insbesondere Arzneimittel- Wirkstoffe zur Krebstherapie, wie Zytotoxine und Zytostatika, in Betracht. Im Detail vermögen diese Wirkstoffe die Krebszelle zu schädigen, den programmierten Zelltod einzuleiten und/oder das Zellwachstum und die Zellvermehrung zu unterbinden. Als solche Wirkstoffe zur Krebsthera- pie sind beispielsweise zu nennen: Antimetabolite wie Methotrexat, Cladribin, Fludarabin, Mer- captopurin, Tioguanin, Pentostatin, Cytarabin, Fluorouracil, Capecitabin und Gemcitabin, alkylie- rende Stoffe wie Cyclophosphamid, Ifosfamid, Mitomycin, Trofosfamid, Thiotepa, Busulfan, Treosulfan, Carmustin, Lomustin, Nimustin, Procarbazin, Dacarbazin und die Platin- Verbindungen Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin, Topoisomerase-Hemmstoffe wie Topotecan, Irinotecan, Etoposid und Teniposid, Kinase-Inhibitoren wie Sorafenib, Regorafinib, Sunitinib, Afatinib, Erlo- tinib und Gefitinib, Mitose-Hemmstoffe wie Vinblastin, Vincristin, Vinorelbin, Paclitaxol und Docetaxel sowie Antibiotika wie Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Idarubicin, Epiru- bicin, Bleomycin, Mitoxantron und Amsacrin.

Weitere vom Bedeutungsumfang der Gruppe X erfasste Wirkstoffe stellen zelltoxische Verbindun- gen und Toxine dar, wie sie experimentell und klinisch als "Toxophore" in Antikörper -Wirkstoff- Konjugaten (ADCs) insbesondere für die Krebstherapie untersucht werden. Beispielhaft zu nennen sind hier insbesondere Substanzen wie Maytansin und Maytansinoide (DM-1, DM -4), Dolastatine, Auristatine (MMAE, MMAF), Calicheamicine, Duocarmycine, Camptothecine (Topotecan, Exa- tecan, Irinotecan, SN-38), Doxorubicin, Amatoxine (Amanitin), Pyrrolobenzodiazepine (PBDs) und Kinesin-Spindel-Protein (KSP)-Inhibitoren.

Gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten die Peptide und Proteine der Formel (II) mindestens zwei Cystein-Aminosäuren, die eine Disulfid-Bindung ausbilden oder dazu befähigt sind. Zu solchen Peptiden zählen beispielsweise Peptidhormone wie Insulin, Somatostatin, Oxitocin, Terli- pressin, Adrenomedullin, Calcitonin oder Vasopressin. Als Proteine dieser Art seien beispielhaft Antikörper, Cytokine wie Interleukine sowie Albumine genannt.

Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und bezeichnet Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper), sowie Fragmente hiervon. Ein Immunglobulinmolekül stellt bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten dar, bestehend aus zwei schweren Ketten (H-Ketten, HC) und zwei leichten Ketten (L-Ketten, LC), welche typischerweise durch Disulfidbrücken (sogenannte inter- c^am-Disulfidbrücken) miteinander verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VH) und eine konstante Domäne (CH). Die konstante Domäne der schweren Kette ihrerseits kann drei (CHI, CH2, CH3) oder vier Unter-Domänen besitzen. Jede leichte Kette umfasst ebenfalls eine variable Domäne (VL) und eine konstante Domäne (CL)- Die VH- und VL-Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch komplementaritäts- bestimmende Regionen genannt ("complementarity determining region", CDR), und in Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität ("framework region", FR). Jede VH- und VL-Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen, beispielsweise vom Amino- zum Carboxy-Terminus in der Reihenfolge FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeigneten Spezies erhalten werden, z.B. Affe, Schwein, Kaninchen, Maus oder Ratte. In einer besonderen Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein solcher Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Konjugate der Formel (I) zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere zur Diagnose und/oder Behandlung von Krebs- und Tumorerkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Konjugate der Formel (I) in einem Verfahren zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere von Krebs- und Tumorerkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose und/oder Behandlung von Erkrankungen, insbesondere von Krebs- und Tumorerkrankungen, unter Verwendung eines oder mehrerer Konjugate der Formel (I).

Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Hemmen, Verzögern, Aufhalten, Lindern, Abschwächen, Einschränken, Verringern, Unterdrücken, Zurückdrängen oder Heilen einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung, der Entfaltung, des Verlaufs oder des Fortschreitens solcher Zustände und/oder der Symptome solcher Zustände. Der Begriff "Therapie" wird hierbei als synonym mit dem Begriff "Behandlung" verstanden. Der Begriff "Diagnose" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung im üblichen Sinne verstanden als (unterscheidende) Erkennung, Feststellung, Bestimmung, Beurteilung, Zuordnung und Benennung einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, eines Krankheitssymptoms, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eines der Konjugate der Formel (I), üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen, enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken. Die erfindungsgemäßen Konjugate der Formel (I) können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat oder Stent. Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Konjugate in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende, die erfindungsgemäßen Konjugate schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Konjugate in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthal- ten, wie z.B. Tabletten (nicht-überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Konjugate kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern. Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen oder -sprays, lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (z.B. Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.

Die erfindungsgemäßen Konjugate können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (bei- spielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Poly- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecyl- sulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispiels- weise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.

A. Beispiele

Abkürzungen und Akronyme: abs. absolut, von absoluter Reinheit

aq. wässrig, wässrige Lösung

Boc ieri.-Butoxycarbonyl

c Konzentration

ca. circa, ungefähr

DMF N, N-Dimethylformamid

DMPA 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon

DMSO Dimethylsulfoxid

DPBS engl. Dulbecco's phosphate buffered saline

d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)

DTT Dithiothreitol

ELSD Lichtstreudetektor (engl, evaporative light scattering detector)

eq. Äquivalent(e)

ES oder ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

FAB engl, fragment antigen-binding

h Stunde(n)

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

HRMS hochaufgelöste Massenspektrometrie

Irgacure ^® 819 Bis(2,4,6-trimethylbenzoyl)phenylphosphinoxid

konz. konzentriert (bei Lösung)

LAP Lithium-phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat

LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie

LED Licht-emittierende Diode

Lit. Literatur(stelle)

m Multiplett (bei NMR)

m/z Masse zu Ladung- Verhältnis (bei MS) min Minute(n)

MPLC Mitteldruckflüssigchromatographie (über Kieselgel; auch "flash-

Chromatographie" genannt)

MS Massenspektrometrie

NMR Kernresonanzspektrometrie

PBS engl, phosphate buffered saline

RP reverse phase (Umkehrphase, bei HPLC)

RT Raumtemperatur

R _t Retentionszeit (bei HPLC, LC/MS)

TCEP-HC1 Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid

tert. tertiär

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

TOF engl, time-of-flight (Flugzeit)-Massenspektrometrie

UV Ultraviolett(-Spektrometrie)

v/v Volumen zu Volumen- Verhältnis (einer Lösung)

LC/MS-Methoden:

Methode 1 :

Instrument: Waters Acquity SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μιη, 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -> 6.0 min 5% A -> 7.5 min 5% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 ml/min; UV-Detektion: 210-400 nm.

Methode 2:

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-Class; Säule: Waters HSS T3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 % Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 2.0 min 2% B -> 13.0 min 90% B -> 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 3:

Gerätetyp MS: Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent Poroshell 120 SB-C18 2.7 μιη, 3 x 150 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2% B— > 1.5 min 2% B -> 15.5 min 95% B -> 18.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Ausgangsverbindungen : Verbindung A

N-(2,5,8,l l,14,17,20,23-Octaoxapentacosan-25-yl)hex-5-inamid

27.8 μΐ (0.25 mmol) Hex-5-insäure und 48.3 mg (0.25 mmol) Ι,Γ-Carbonyldiimidazol wurden unter einer Argonatmosphäre in 1 ml absolutem DMF vorgelegt. Das Gemisch wurde 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 100.0 mg (0.25 mmol) 2,5,8,1 l,14,17,20,23-Octaoxapentacosan-25- amin, gelöst in 0.5 ml abs. DMF, hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht bei RT gerührt und dann bei reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer MPLC gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden eingeengt, der Rückstand wurde mit 10 ml Wasser versetzt und dann dreimal mit jeweils 10 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet (Ausbeute an Produkt: 22 mg). Die zuvor erhaltene wässrige Phase wurde lyophilisiert und das Lyophilisat durch Kieselgel-Chromatographie gereinigt (Eluent: zunächst Di- chlormethan/Methanol 100:5, dann Dichlormethan/Methanol 9: 1). Es wurden 37.8 mg eines transparenten Öls erhalten. Gesamtausbeute: 59.8 mg (51 % d. Th.)

Ή-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ): δ [ppm] = 1.87 (quin, J = 7.1 Hz, 2H), 1.99 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 2.26 (td, J = 6.9 und 2.7 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.45 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 3.55 (m, 4H), 3.60-3.71 (m, 26H), 6.18 (br. s, 1H).

¹³ C-NMR (125.78 MHz, CDC1 ₃ ): δ [ppm] = 172.21, 83.61, 71.93, 70.60, 70.56, 70.53, 70.51, 70.25, 69.87, 69.12, 59.03, 39.18, 35.00, 24.18, 17.88. Verbindung B

4-(Hex-5-in-l-yl)-4-methylmorpholiri-4-iumiodid

3.0 ml (22.7 mmol) 6-Iodhex-l-in wurden zu 2.5 ml (22.7 mmol) 4-Methylmorpholin getropft. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei RT und anschließend 10 Minuten bei 54°C gerührt. Danach wurde auf RT abgekühlt, 16 h nachgerührt und dann mit geringen Mengen Petrolether, Diethylether und zuletzt Essigsäureethylester versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck aufkonzentriert. Der daraus resultierende Niederschlag wurde abfiltriert und mit Essigsäureethylester gewaschen. Das weisse bis beigefarbene Pulver wurde im Hochvakuum ge- trocknet. Ausbeute: 593.6 mg (9% d. Th.).

Ή-NMR (400 MHz, D ₂ 0): δ [ppm] = 1.62 (quin, J = 7.3 Hz, 2H), 1.95 (m, 2H), 2.33 (td, / = 7 und 2.6 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.46-3.60 (m, 6H), 4.06 (br. s, 4H).

¹³ C-NMR (125.78 MHz, D ₂ 0): δ [ppm] = 84.64, 70.01, 66.59, 60.42, 59.64, 59.58, 24.23, 20.13, 17.11.

MS (ESpos): m/z

Ausführungsbeispiele : Beispiel 1

(5R, 12R)- 12-{ [(Benzyloxy)carbonyl] amino } -5-carboxy-8-(8-carboxyoctyl)-3-oxo-l -phenyl-2-oxa- 7,10-dithia-4-azatridecan-13-säure

In einem Zweihalsrundkolben wurden unter einer Argonatmosphäre 100.00 mg (0.19 mmol) Ν,Ν'- Bis[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystin und 79.47 mg (277.25 μιηοΐ) TCEP-HC1 in 1 ml Wasser/ Methanol (1 : 1 v/v) vorgelegt. Das Gemisch wurde 2.5 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 33.69 mg (0.19 mmol) Undec-10-insäure sowie 3.87 mg (9.24 μιηοΐ) Irgacure ^® 819 hinzugefügt. Durch einen Schliff des Zweihalskolbens wurde ein LED-UV-Stift (OmniCure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV -Licht bestrahlt. Der Umsatz gemäß HPLC (Eluent: Gradient Acetonitril/Wasser + 0.1% TFA; ELSD) war quantitativ. Die Reaktions- lösung wurde danach mit Methanol verdünnt und mittels präparativer HPLC gereinigt (Eluent: Gradient Acetonitril/Wasser + 0.1 % TFA). Es wurden 39 mg (27% d. Th., LC/MS -Reinheit 88%) der Zielverbindung erhalten.

LC/MS (Methode 1): R _t = 3.45 min; MS (ESIpos): m/z = 693 [M+H] ⁺

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 1.24-1.50 (m, 13H), 1.55-1.60 (m, 2H), 1.72-1.79 (m, 1H), 2.66-3.18 (m, 7H), 4.34-4.40 (m, 2H), 5.07-5.14 (m, 4H), 7.26-7.38 (m, 10H).

Beispiel 2A und 2B

2A: 5-[(6R,9S, 125, 155, 185,2 lR)-21 - { [( { [( Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] amino } -6- { [(25)-2-( { (25)-6-amino- 1 - [(2-amino-2-oxoethyl)amino] - 1 -oxohexan-2-yl } carbamoyl)pyrrolidin- l-yl]carbonyl}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropy l)-15-benzyl-18-(4-hydroxy- benzyl)-8,l l,14,17,20-pentaoxo-l,4-dithia-7,10,13,16,19-pentaazacyclodo cosan-3-yl]pentansäure

2B : 5-[(6R,9S,l2S, 155, 185,2 lR)-21 - { [( { [( Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] amino } -6- { [(25)-2-( { (25)-6-amino- 1 - [(2-amino-2-oxoethyl)amino] - 1 -oxohexan-2-yl } carbamoyl)pyrrolidin- l-yl]carbonyl}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropy l)-15-benzyl-18-(4-hydroxy- benzyl)-8,l l,14,17,20-pentaoxo-l,4-dithia-7,10,13,16,19-pentaazacyclodo cosan-2-yl]pentansäure

2A:

2B:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 50.17 mg (37.23 μιηοΐ) Terlipres- sin-Acetat (Fa. Bachem, Schweiz; Sequenz: H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys- Gly-NEb., als cyclisches Cys-Disulfid) in 1.1 ml Wasser vorgelegt und mit 16.01 mg (55.85 μιηοΐ) TCEP-HCl versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei RT gerührt und dann mit einer Lösung von 4.70 mg (37.23 mmol) Hept-6-insäure in 100 μΐ Methanol versetzt. Anschließend wurden 0.55 mg (1.86 μιηοΐ) LAP [hergestellt nach literaturbekanntem Verfahren (Gong et al., 2013)] in 150 μΐ Wasser hinzugefügt. Es wurde ein LED-UV-Stift (OmniCure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Danach wurden nochmals 0.55 mg (1.86 μιηοΐ) LAP hinzugefügt, und das Reaktionsge- misch wurde erneut für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter Auftrennung der isomeren Produkte mittels präparativer HPLC gereinigt (Säule: Waters X-Bridge BEH130 Prep C18 10 μηι OBD, 19 x 250 mm; Eluent A: Wasser mit 0.05% TFA, Eluent B: Acetonitril mit 0.05% TFA; Gradient: 0.0 min 5% B -> 40 min 40% B).

Isomer 1 :

LC/MS (Methode 2): R _t = 3.53 min; MS (ESpos): m/z = 1355 [M+H] ⁺ . Isomer 2:

Ausbeute: 1.3 mg (2.6% d. Th.)

LC/MS (Methode 2): R _t = 3.57 min; MS (ESpos): m/z = 1355 [M+H] ⁺

¹³ C-NMR (125.78 MHz, D ₂ 0, δ (1,4-Dioxan) = 67.4 ppm): δ [ppm] = 183.1 (S), 182.1 (S), 178.5 (S), 175.2 (3S), 174.7 (S), 174.0 (S), 173.9 (S), 172.7 (S), 172.5 (S), 171.5 (S), 170.9, 168.7, 155.2 (S), 137.0 (S), 131.4 (S), 130.0 (S), 129.7 (S), 128.8 (S), 128.2 (S), 116.3 (S), 61.7 (D), 57.1 (D), 55.6 (D), 55.3 (D), 54.5 (D), 53.4 (D), 52.6 (D), 50.7 (D), 48.8 (T), 45.7 (D), 43.2 (T), 43.0 (T), 42.9 (T), 41.3 (T), 40.1 (T), 38.8 (T), 37.0 (T), 36.6 (T), 36.4 (2T), 34.0 (T), 33.6 (T), 31.9 (2T), 30.9 (T), 30.1 (T), 27.0 (T), 26.9 (T), 26.8 (T), 25.6 (T), 25.5 (T), 22.9 (T) [entspricht einer ring- geschlossenen Struktur, da keine olefinischen Kohlenstoff atome zu detektieren sind].

Das ^-NMR-Spektrum dieses Isomers ist in Abbildung 1 wiedergegeben.

Beispiel 3A und 3B

3A: (25)- 1 - { [(6R,95, 125, 155, 185,2 lR)-21 - { [( { [(Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] - amino}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropyl)-15-be nzyl-18-(4-hydroxybenzyl)- 8,l l,14,17,20-pentaoxo-3-(27-oxo-2,5,8,l l,14,17,20,23-octaoxa-26-azatriacontan-30-yl)-l,4-di- thia-7, 10, 13, 16, 19-pentaazacyclodocosan-6-yl]carbonyl } -N- { (25)-6-amino- 1 - [(2-amino-2-oxo- ethyl)amino] -1 -oxohexan-2-yl }pyrrolidin-2-carboxamid

3B : (25)- 1 - { [(6R,95, 125, 155, 185,2 lR)-21 - { [( { [(Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] - amino}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropyl)-15-be nzyl-18-(4-hydroxybenzyl)- 8,l l,14,17,20-pentaoxo-2-(27-oxo-2,5,8,l l,14,17,20,23-octaoxa-26-azatriacontan-30-yl)-l,4-di- thia-7, 10, 13, 16, 19-pentaazacyclodocosan-6-yl]carbonyl } -N- { (2S)-6-amino- 1 - [(2-amino-2-oxo- ethyl)amino] -1 -oxohexan-2-yl }pyrrolidin-2-carboxamid

3A:

3B:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 20.64 mg (15.32 μιηοΐ) Terlipres- sin-Acetat (Fa. Bachem, Schweiz; Sequenz: H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys- Gly-N I I;, als cyclisches Cys-Disulfid) in 500 μΐ DPBS-Puffer vorgelegt und mit 13.30 mg (46.39 μ ιηοΐ ) TCEP-HCl versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei RT gerührt und dann mit einer Lösung von 7.20 mg (15.15 μιηοΐ) 7V-(2,5,8,l l,14,17,20,23-Octaoxapentacosan-25-yl)hex-5-inamid in 150 μ Ι DPBS-Puffer versetzt. Anschließend wurden 4.4 mg (14.95 μιηοΐ) LAP [hergestellt nach literaturbekanntem Verfahren (Gong et al., 2013)] in 500 μΐ DPBS-Puffer gelöst und 50 μΐ dieser LAP-Lösung zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Es wurde ein LED-UV-Stift (OmniCure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Die Zugabe von 50 μΐ der LAP-Lösung und die nachfolgende Bestrahlung für 1 h mit 365 nm UV -Licht wurden noch zweimal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels präparativer HPLC fraktioniert (Säule: Waters X -Bridge BEH130 Prep C18 10 μ ιη OB IX 19 x 250 mm; Eluent A: Wasser mit 0.1 % TFA, Eluent B: Acetonitril mit 0.1 % TFA; Gradient: 0.0 min 5% B -> 3 min 5% B -> 43 min 40% B 44.30 min 95% B 49.30 min 95% B).

Produktfraktion 1 :

Ausbeute: 6.20 mg (23% d. Th.); Reinheit nach LC7MS (Methode 3): 99%

LC/MS (Methode 3 ): K, = 7.4 1 min; MS (ESpos): m/z = 853.9101 [M+2H] ²⁺

1 IKMS: für C75H121O24N17S2 [M+2H] ²⁺ berechnet: 853.9100, gemessen: 853.9100.

Die ' I I- und "C-N K-Spektren dieser Produktfraktion sind in Abbildung 2 und 3 wiedergegeben.

Produktfraktion 2:

Ausbeute: 1.70 mg (7% d. Th.)

LC/MS (Methode 2): R, = 4.09 min; MS (ESpos): m/z = 853.9149 [M+2H] ²⁺

I IRMS: für C75H121O24N17S2 [M+2H] ²⁺ berechnet: 853.9100, gemessen: 853.9095.

Beispiel 4A und 4B

4Λ: 4-{ 4-[(6R,9S,l2S, 15S, 18S,21R)-21 - { [( { [(Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] amino } - 6-{ [(2 _l S ^r )-2-({(2 _l S')-6-amino-l-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]-l-oxohexan-2 -yl }carbamoyl)pyrrolidin- l-yl]carbonyl}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropy l)-15-benzyl-18-(4-hydroxy- benzyl)-8, 11,14, 17,20-pentaoxo-l,4-dithia-7, 10, 13,16, 19-pentaazacyclodocosan-3-yl]butyl }-4- methylmorpholin-4-ium-Trifluoracetat 4B : 4- { 4-[(6R,95,125, 155, 185,21R)-21 - { [( { [(Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] amino } - 6-j | ( 2.S ^' )-2-( j ( 2.S ^' )-6-ainiiH)- l -| (2-ainiiH)-2-()x()cthyl )aniiiH) |- l -()x()liexan-2-yl IcarbanioyDpyrrolidin- l-yl]carbonyl}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropy l)-15-benzyl-18-(4-hydroxy- benzyl)-8, 1 1 , 14, 17,20-pentaoxo-l ,4-dithia-7, 10, 13, 16, 19-pentaazacyclodocosan-2-yl]butyl }-4- methylmorpholin-4-ium-Trifluoracetat

4A:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 2 1 .54 mg (15.98 μιηοΐ) Terlipres- sin-Acetat (Fa. Bachem, Schweiz; Sequenz: H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys- Gly-N ! L. als cyclisches Cys-Disulfid) in 800 μΐ DPBS-Puffer vorgelegt und mit 6.50 mg (22.68 μιηοΐ) TCEP-HCl versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei RT gerührt und dann mit einer Lösung von 4.9 mg (15.84 μιηοΐ) 4-(Hex-5-in-l-yl)-4-methylmorpholin-4-iumiodid in 500 μΐ DPBS-Puffer versetzt. Anschließend wurden 4.70 mg (15.98 μιηοΐ) LAP [hergestellt nach literatur- bekanntem Verfahren (Gong et al, 2013)] in 500 μΐ DPBS-Puffer gelöst und 50 μΐ dieser LAP- Lösung zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Es wurde ein LED-UV-Stift (OmniCure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Die Zugabe von 50 μ Ι der LAP-Lösung und die nachfolgende Bestrah- lung für 1 h mit 365 nm UV -Licht wurden noch zweimal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels präparativer HPLC fraktioniert (Säule: Phenomenex Kinetex Prep 5 μ ιη C18 100 Ä AXIA Packed LC Column, 21.2 x 100 mm; Eluent A: Wasser mit 0.1 % TFA, Eluent B: Acetonitril mit 0.08% TFA; Gradient: 0.0 min 5% B -> 3 min 5% B -> 63 min 40% B -» 64.30 min 95% B 69.30 min 95% B). Produktfraktion 1 :

Ausbeute: 1.5 mg (4% d. Th.); Reinheit nach LC/MS (Methode 3): 65%

LC/MS (Methode 3): R, = 6.49 min; MS (ESpos): m/z = 705.8397 [M+H] ²⁺

1 IRMS: für C63H97O16N17S2 [M+H] ²⁺ berechnet: 705.8365, gemessen: 705.8361.

Das ¹ 1 l-NM R-Spektrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 4 wiedergegeben. Produktfraktion 2:

Ausbeute: 2.2 mg (8% d. Th.); Reinheit nach LC/MS (Methode 3): 87%

LC/MS (Methode 3): R, = 6.48 min; S (ESpos): m/z = 705.8401 [M+H] ²⁺

1 IRMS: für C63H97O16N17S2 [M+H] ²⁺ berechnet: 705.8365, gemessen: 705.8377.

Das Ί I-NM R-Speklrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 5 wiedergegeben. Beispiel 5A und 5B

5A: (2S)-3-[(6R,9S,l2S, 155, 18S,21R)-21 - { [( { [(Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] - amino } -6- { [(2S)-2-( { (2S)-6-amino- 1 -[(2-amino-2-oxoethyl)amino]- l-oxohexan-2-yl Jcarbamoyl)- pyrrolidin-l-yl]carbonyl}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino -3-oxopropyl)-15-benzyl-18-(4- hydroxybenzyl)-8, 11,14, 17,20-pentaoxo- 1 ,4-dithia-7, 10, 13, 16, 19-pentaazacyclodocosan-3-yl] -2- [(ierf.-butoxycarbonyl)amino]propansäure

5B : (2S)-3-[(6R,9S,l2S, 155,18S,21R)-21 - { [( { [(Aminoacetyl)amino] acetyl } amino)acetyl] - amino } -6- { [(2S)-2-( { (2^-6-amino- 1 -[(2-amino-2-oxoethyl)amino]- l-oxohexan-2-yl Jcarbamoyl)- Pyrrolidin- l-yl]carbonyl}-9-(2-amino-2-oxoethyl)-12-(3-amino-3-oxopropy l)-15-benzyl-18-(4- hydroxybenzyl)-8, 1 1.14.17,20-pentaoxo- 1 ,4-dithia-7, 10,13,16,19-pentaazacyclodocosan-2-yl] -2- [(ierf.-butoxycarbonyl)amino]propansäure

5A:

5B:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 10.16 mg (7.54 μιηοΐ) Terlipres- sin-Acetat (Fa. Bachem, Schweiz; Sequenz: H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys- Gly-N I I;. als cyclisches Cys-Disulfid) in 300 μΐ DPBS-Puffer vorgelegt und mit 3.20 mg (11.17 μιηοΐ) TCEP-HCl versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1.5 h bei RT gerührt und dann mit 200 μΐ DPBS-Puffer sowie einer Lösung von 1.6 mg (7.54 μ ιηοΐ ) /V-Boc-L-Propargylglycin in 100 μΐ DPBS-Puffer versetzt. Anschließend wurden 3.20 mg (10.87 μ mol ) LAP [hergestellt nach literaturbekanntem Verfahren (Gong et al, 2013)] in 500 μΐ DPBS-Puffer gelöst und 50 μΐ dieser LAP- Lösung zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Es wurde ein LED-UV-Stift (OmniCure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens ein- geführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Die Zugabe von 50 μΐ der LAP-Lösung und die nachfolgende Bestrahlung für 1 h mit 365 nm UV -Licht wurden noch zweimal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels präparativer HPLC fraktioniert (Säule: Phenomenex Kinetex Prep 5 μ ιη C18 100 Ä AXIA Packed LC Column, 21 .2 x 100 mm; Eluent A: Wasser mit 0.1 % 'I I A, Eluent B: Acetonitril mit 0.08% 'I TA; Gradient: 0.0 min 'A B -+ 3 min 5% B -> 63 min 40% B 65.3 min 95% B 70 min 95% B).

Produktfraktion 1 :

Ausbeute: 0.4 mg (4% cl. Th.)

LC/MS (Methode 3): K, = 7. 1 1 min; MS (ESpos): m/z = 721.8130 [M+2H] ²⁺ IKMS: für C62H93O19N17S2 [M+2H] ²⁺ berechnet: 721.8132, gemessen: 721.8130. Das Ί I-NM K-Spektrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 6 wiedergegeben. Produktfraktion 2:

Ausbeute: 1.6 mg (15% d. Th.); Reinheit nach LC/MS (Methode 3): 94% LC/MS (Methode 3): R, = 7.36 min; MS (ESpos): m z = 1442. 1 4 [M+H] ⁺ I I KMS: für C62H93O19N17S2 [M+2H] ²⁺ berechnet: 721.8132, gemessen: 721.8132. Das T I-NM K-Spektrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 7 wiedergegeben. Produktfraktion 3:

Ausbeute: 0.3 mg (3% d. Th.); Reinheit nach LC/MS (Methode 3): 89%

LC/MS (Methode 3): K, = 7.34 min; MS (ESpos): m/z = 721.8122 [M+2H] ²⁺ HRMS: für C6 ₂ H9 ₂ O ₁ 9N ₁₇ S ₂ [M+H] ⁺ berechnet: 1442.6191, gemessen: 1442.6200. Beispiel 6A und 6B

6Λ:

15-benzyl-3-(4-carboxybutyl)- 18-(4-hydroxybenzyl)-8, 1 1 , 14.1 7 ,20-pentaoxo- 1.4-dithia- 7, 10, 13,16, 19-pentaazacyclodocosan-6-carbonsäure

6B:

15-benzyl-2-(4-carboxybutyl)- 1 8-(4-hydroxybenzyl)-8, 1 1.14.17,20-pentaoxo- 1 ,4-dithia- 7,10,13,16,19-pentaazacyclodocosan-6-carbonsäure

6A:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 15.33 mg (19.78 μιηοΐ) Pressinoic Acid (Fa. Bachem, Schweiz; Sequenz: H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-OH, als cyclisches Cys-Disul- fid) in 500 μΐ 0.1 %-iger wässriger Essigsäure und 500 μΐ Acetonitril vorgelegt und mit 8.70 mg (30.35 μ mol ) TCEP-HC1 versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei RT gerührt und dann mit 200 μΐ 0.1%-iger wässriger Essigsäure, 200 μ ΐ Acetonitril sowie einer Lösung von 2.5 mg (19.82 μ ιηοΐ ) Hept-6-insäure in 100 μΐ 0.1 %-iger wässriger Essigsäure versetzt. Anschließend wurden 5.8 mg (19.72 μιηοΐ) LAP [hergestellt nach literaturbekanntem Verfahren (Gong et al., 2013)] in 500 μΐ 0.1 %-iger wässriger Essigsäure gelöst und 50 μΐ dieser LAP-Lösung zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Es wurde ein LED-UV-Stift (Omni Cure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV -Licht bestrahlt. Die Zugabe von 50 μΐ der LAP-Lösung und die nachfolgende Bestrahlung für 1 h mit 365 nm UV- Licht wurden noch zweimal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels präparativer HPLC fraktioniert (Säule: Waters X-Bridge BEI I I 30 Prep C18 10 μ ιη OBD, 19 x 250 mm; Eluent A: Wasser mit 0.1 % TFA, Eluent B: Acetonitril mit 0.08% 'I LA; Gradient: 0.0 min 5% B 3 min 5% B -> 33 min 40% B).

Produktfraktion 1 :

Ausbeute: 1 .4 mg (8% d. Th.)

LC/MS (Methode 1): R, = 1 .25 min; MS (ESpos): m/z = 903.4 [M+H] ⁺ . Das Ί I-NM K-Spektrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 8 wiedergegeben.

Produktfraktion 2:

Ausbeute: 0.6 mg (3% d. Th.)

LC/MS (Methode 1 ): K, = 1 .25 min; MS (ESpos): m/z = 903.4 [M+H] ⁺ und R, = 1.27 min; MS (ESpos): m/z = 903.3 [M+H] ⁺ . IKMS: für C40H55O12N8S2 [M+H] ⁺ berechnet: 903.3375 gemessen: 903.3371.

Produktfraktion 3:

Ausbeute: 0.7 mg (4% d. Th.)

LC/MS (Methode 1): R, = 1.27 min; MS (ESpos): m/z = 903.3 [M+H] ⁺ .

Das ¹ 1 1-N.M K-Spektrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 9 wiedergegeben. Beispiel 7A und 7B

7A: (2S)-l-{ [(3R,65,95, 125, 155, 18R,22aR,235,23a5)- 18- { [( { [( Aminoacetyl)amino] acetyl } - amino)acetyl]amino}-6-(2-amino-2-oxoethyl)-9-(3-amino-3-oxop ropyl)-12-benzyl-15-(4-hydroxy- benzyl)-23-(hydroxymethyl)-5,8,l l,14,17-pentaoxohexacosahydro-20aii-cyclopropa[5,6]cyclo- octa[ 1 ,2-b] [ 1 ,4,7, 10, 13, 16, 19]dithiapentaazacyclodocosin-3-yl]carbonyl } -N- { (25)-6-amino- 1 -[(2- amino-2-oxoethyl)amino] - l-oxohexan-2-yl }pyrrolidin-2-carboxamid

7B : (25)- 1 - { [(3R,65,95, 125, 155, 18R,22a5,23R,23aR)- 18- { [( { [( Aminoacetyl)amino] acetyl } - amino)acetyl]amino}-6-(2-amino-2-oxoethyl)-9-(3-amino-3-oxop ropyl)-12-benzyl-15-(4-hydroxy- benzyl)-23-(hydroxymethyl)-5,8,l l,14,17-pentaoxohexacosahydro-20aii-cyclopropa[5,6]cyclo- octa[ 1 ,2-b] [ 1 ,4,7, 10, 13, 16, 19]dithiapentaazacyclodocosin-3-yl]carbonyl } -N- { (25)-6-amino- 1 -[(2- amino-2-oxoethyl)amino] - l-oxohexan-2-yl }pyrrolidin-2-carboxamid

7A:

7B:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 26.24 mg (19.47 μιηοΐ) Terlipres- sin-Acetat (Fa. Bachem, Schweiz; Sequenz: H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys- Gly-N i l;. als cyclisches Cys-Disulfid) und 8.4 mg (29.31 μιηοΐ) TCEP-HCl in 1 .5 ml DPBS-Puffer vorgelegt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei KT gerührt und dann mit einer Lösung von 2.9 mg (19.32 μιηοΐ) in 200 μΐ Methanol versetzt. Anschließend wurden 5.70 mg (19.38 μιηοΐ) LAP [hergestellt nach literaturbekanntem Verfahren (Gong et al, 2013)] in 500 μ ΐ DPBS-Puffer gelöst und 50 μΐ dieser LAP-Lösung zum Reak- tionsgemisch hinzugefügt. Es wurde ein LED-UV-Stift (OmniCure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Die Zugabe von 50 μΐ der LAP-Lösung und die nachfolgende Bestrahlung für 1 h mit 365 nm UV -Licht wurden noch zweimal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels präparativer HPLC fraktioniert (Säule: Phenomenex Kinetex Prep 5 μιη C18 100 Ä AXIA Packed LC Column, 21.2 x 100 mm; Eluent A: Wasser mit 0.1% TFA, Eluent B: Acetonitril mit 0.08% TFA; Gradient: 0.0 min 5' < B— > 3 min 5% B ^ 63 min 40% B 64.30 min 95% B 69.30 min 95% B).

Produktfraktion 1 :

Ausbeute: 3.1 mg (7.5% d. Th.); Reinheit nach LC/MS (Methode 3): 65% LC/MS (Methode 3): R, = 6.92 min; MS (ESpos): m/z = 903.3 [M+H] ⁺ HRMS: für C62H91O16N16S2 [M+H] ⁺ berechnet: 1379.6235, gemessen: 1379.6244. Das Ί I-N R-Spektrum dieser Produktfraktion ist in Abbildung 10 wiedergegeben. Beispiel 8

C2-verbrückende Thiol-yn-Reaktion mit einem Antikörper-F AB -Fragment:

Unter einer Argonatmosphäre wurden in einem Zweihalskolben 108.4 μΐ einer Lösung des FAB- Fragments M14-G07 [beschrieben in Dittmer et al, US Pat. Appl. US 2014/0050743-A1, Seite 13, Abschnitte 0105, 0106 und 0113ff.] in PBS-Puffer vorgelegt (c = 46.1 mg/ml, 0.107 μιηοΐ). 4.60 mg TCEP-HC1 wurden in 400 μΐ DPBS-Puffer gelöst und 4 μΐ dieser Lösung zur Lösung des FAB-Fragments hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt und dann mit 4 μΐ einer Lösung von 1.36 μΐ (10.75 μ ιηοΐ ) Hept-6-insäure in 398 μΐ Methanol versetzt. Anschließend wurden 3.10 mg (10.53 μπιοΐ) LAP [hergestellt nach literaturbekanntem Verfahren (Gong et al., 2013)] in 500 μ ΐ DPBS-Puffer gelöst und 1 μΐ dieser LAP-Lösung zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Der Reaktionskolben wurde mittels eines Eisbads gekühlt (5°C < T < 10°C). Es wurde ein LED-UV-Stift (Omni Cure LX400, Durchmesser 12 mm; igb-tech GmbH, Deutschland) durch einen Schliff des Zweihalskolbens eingeführt (Abstand zum Reaktionsgemisch ca. 40 mm), und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. In drei aufeinanderfolgenden Intervallen wurde erneut jeweils 1 μΐ der LAP-Lösung hinzugefügt und das Reaktionsgemisch nachfolgend für jeweils 1 h mit 365 nm UV-Licht bestrahlt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit 2.384 ml DPBS-Puffer verdünnt und über eine Sephadex ^® G-25M PD-10-Säule (GE Healthcare), welche zuvor fünfmal mit jeweils 5 ml DPBS-Puffer konditioniert worden war, frak- tioniert. Die daraus resultierenden Fraktionen wurde 5 Minuten lang zentrifugiert (10°C, 4000 U/ min). Danach wurde die Lösung in Zentrifugenfiltergefäße (Ultracel ^® 30 K - Amicon ^® Ultra-4) pipettiert und 15 Minuten lang erneut zentrifugiert. Das resultierende Konzentrat wurde mehrmals mit insgesamt 2.5 ml DPBS-Puffer verdünnt.

Bestätigung und Quantifizierung des kovalent verknüpften FAB-Fragments:

Aus den erhaltenen Proben in DPBS-Puffer wurde die kovalente Verknüpfung des FAB-Fragments wie folgt quantifiziert und identifiziert:

Die Quantifizierung des kovalenten FAB-Fragments erfolgte mittels RP-Chromatographie des reduzierten und denaturierten FAB-Fragments. Zur Probenlösung (1 mg/ml, 50 μΐ) wurde Guani- dinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500 mM, 3 μΐ) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55°C inkubiert und dann über HPLC analysiert.

Die HPLC- Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase-Säule (2.1 mm x 150 mm, 8 μηι Partikelgröße, 1000 Ä; Katalog-Nr. PL1912-3802) bei einer Flussrate von 1 ml/min mit folgendem Eluentensystem verwendet: Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoressigsäure in Acetonitril; Gradient: 0 min 25% B, 3 min 25% B, 28 min 50% B.

Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (VH-CH1 = HO) des nicht-konjugierten FAB-Fragments zugeordnet. Das Signal, welches ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurde, wurde dem kovalenten, nicht- reduzierbar verknüpften FAB zugeordnet. Der prozentuale Anteil an kovalent verknüpftem FAB wurde aus den durch Integration bestimmten Signalflächen berechnet. Hierzu wurde der Quotient der Signalfläche des FAB-Fragments zur Gesamtfläche aller Signale gebildet und mit 100 multipli- ziert. Die resultierenden Chromatogramme und die berechneten prozentualen Anteile sind in Abbildung 1 1 und 12 wiedergegeben.

Zur Bestätigung des kovalent gebundenen FAB-Fragments wurde die denaturierte und reduzierte Probe massenspektrometrisch nach Online -Entsalzung über eine Grom-Sil 300 Butyl-lSt-Säule (Partikelgröße 5 μιη, Säulendimension 5 mm x 500 μιη) mittels HPLC-ESI-TOF (Impact HD, Bru- ker Daltonik) analysiert. Die Flussrate betrug 5 μΐ/min mit folgendem Eluentensystem: Eluent A: 0.1 % Ameisensäure in Wasser, Eluent B: 0.1 % Ameisensäure in 80% Isopropanol, 10% Acetonitril und 10% Wasser; Gradient: 0 min 22% B, 8 min 22% B, 10 min 24% B, 12 min 80% B, 18 min 95% B, 27 min 95% B, 30 min 22% B.

Die über das TIC (total ion chromatogram)-Signal erhaltenen Spektren wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Spezies auf Basis von MaxEnt-Dekonvolution kalkuliert. Durch Vergleich der erhaltenen Massen mit den theoretischen Massen von leichter Kette und schwerer Kette (VH-CH1) sowie des kovalent verknüpften FAB-Fragments konnte die erwünschte kovalente Verknüpfung des FAB-Fragments eindeutig bestätigt werden. Das resultierende Spektrum ist in Abbildung 13 wiedergegeben.

B. Literaturverzeichnis

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