cellulaires

Domaine de l'invention La présente invention se situe dans le domaine de l'étude de l'effet (toxique ou bénéfique) de composés, vis-à-vis de la santé des animaux et de l'homme en particulier. Elle concerne plus précisément un procédé pour préparer des composés destinés à être testés dans une dose quantifiable et utilisable pour évaluer leurs effets (toxique ou bénéfique) sur des systèmes cellulaires in vitro, ex vivo ou in vivo.

Etat de la technique

Les poudres aéroportées ou nanomatériaux peuvent être en contact avec la peau, les yeux, les cheveux, le système respiratoire, l'appareil digestif supérieur, etc. Certaines poudres sont placées sur l'organisme de façon volontaire. C'est le cas, par exemple, des produits cosmétiques, produits dentaires ou formulations respirables/aérosol pour traiter des pathologies pulmonaires. Il est important de tester l'effet bénéfique ou toxique de ces produits. Pour cela, il est nécessaire d'appliquer le composé à tester sur des animaux ou des systèmes cellulaires in vitro à différentes doses quantifiables. Pour des composés peu hydrosolubles ou non hydrosolubles, il n'existe pas de méthode pratique permettant de tester ces substances dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme.

Exposé général de l'invention

La présente invention se propose de mettre au point un procédé simple et pratique permettant la préparation d'au moins un composé destiné à être testé dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme et utilisable pour déterminer l'effet ou la toxicité de ce composé.

L'invention concerne un procédé de préparation d'au moins un composé destiné à être testé dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : i) Mélange dudit composé avec un excipient inerte dans un rapport de quantités prédéfini,

ii) Homogénéisation dudit mélange,

iii) Fabrication d'un bloc par compression dudit mélange homogénéisé.

Le bloc compressé obtenu selon l'invention peut être sous n'importe quelle forme. Il peut être également sous la forme d'une pastille, d'un cube, d'un cylindre, d'un cône, d'un prisme, d'une pyramide, d'une sphère, d'un polyèdre, etc. Il peut être hydrosoluble. De préférence, le bloc fabriqué selon le procédé de l'invention est une pastille.

Selon l'invention, le composé destiné à être testé peut être tout type de composé naturel ou de composé obtenu par synthèse chimique ou biologique, des mélanges en formulations de tels composés et dont les effets sont étudiés. Ce sont des composés qui peuvent être utilisés dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique ou encore dans tout autre domaine de l'industrie. Ils peuvent être sous la forme d'une poudre, de particules, d'un liquide. Ils peuvent être hydrosolubles, peu hydrosolubles ou non hydrosolubles.

Cette méthode permet de tester l'effet ou la toxicité de tout composé, soluble ou non, poudres et liquides à toutes les concentrations/doses voulues sur des systèmes cellulaires in vitro, ex vivo ou directement in vivo.

Afin de pouvoir tester l'effet de composés, il est nécessaire que ces composés soient dilués pour avoir à disposition des mélanges à différentes concentrations. Pour cela, les composés sont dilués dans un excipient inerte sous la forme d'un solide. Cet excipient est bien toléré par les cellules et ne réagit pas avec le composé à tester. Certains polysaccharides telle la famille du Dextran sont bien tolérés par les cellules. D'autre part, le Dextran est soluble dans l'eau et dans les milieux de cultures cellulaires, ce qui rend son utilisation propice pour les tests d'efficacité et de toxicité in vitro, ex vivo ou in vivo.

La méthode selon l'invention peut également comprendre une étape de broyage du mélange homogénéisé préalablement à la fabrication du bloc compressé.

L'étape de broyage peut être remplacée par une étape de sonication, de mélange mécanique (mixeur) ou agitation magnétique. Un autre objet de l'invention concerne un bloc compressé comprenant un excipient inerte sous la forme solide et d'au moins un composé destiné à être testé, ledit bloc étant fabriqué selon le procédé de l'invention.

Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un bloc compressé tel que défini dans la présente invention comprenant au moins un composé destiné à être testé et un excipient inerte pour tester l'effet ou la toxicité dudit composé sur un système cellulaire, ladite utilisation comprenant une étape dans laquelle on dissout le bloc selon l'invention dans un milieu aqueux comprenant le système cellulaire puis une étape de test du composé dans le milieu.

Ce système cellulaire peut être un système cellulaire in vitro, ex vivo ou in vivo. Dans le cas d'un système cellulaire in vitro, les cellules peuvent être cultivées en condition de culture submergée ou encore à l'interface air/liquide. .

Les systèmes cellulaires in vitro utilisés pour réaliser les tests peuvent être des cellules respiratoires primaires humaines.

Description détaillée de l'invention

L'invention est décrite plus en détail ci-après au moyen d'exemples illustrés par les figures suivantes : Figure 1 : Le composé destiné à être testé sous forme de poudre (1 ) et l'excipient sous forme de poudre (2) sont préalablement pesés. Ainsi, on peut faire un mélange de ces deux poudres dans un rapport de quantités prédéfini.

Figure 2 : Les deux poudres sont mélangées puis broyées énergiquement jusqu'à obtention d'un mélange homogénéisé. L'opération peut se faire de façon mécanique et automatisée.

Figure 3 : Le mélange homogénéisé est placé dans une presse.

Figure 4 : Le mélange homogénéisé est pressurisé à l'aide d'une presse pour obtenir une pastille solide compressée. Figure 5 : La pastille est récupérée, puis pesée. La pastille peut être découpée pour obtenir la masse et/ou la forme désirée.

Figure 6 : La pastille est appliquée sur un système de culture cellulaire in vitro. Figure 7 : La pastille commence à se dissoudre. Figure 8 : La pastille est dissoute. De façon pratique, le composé destiné à être testé ainsi que l'excipient sont pesés séparément (Figure 1 ) puis mélangés vigoureusement, manuellement ou mécaniquement, afin d'obtenir un mélange homogénéisé contenant une quantité connue de la molécule (ou mélange) à tester (Figure 2). Le mélange homogénéisé obtenu est ensuite compressé (Figures 3 et 4) à l'aide d'une presse pour obtenir une pastille solide compressée. Tout type de presse peut être utilisé. L'opération peut se faire de façon mécanique et automatisée.

La pastille solide obtenue (Figure 5) peut être ensuite découpée selon la forme désirée, puis pesée afin de connaître la masse exacte de l'excipient et du composé destiné à être testé. La pastille est alors prête à être déposée et est directement utilisable sur des animaux ou des systèmes cellulaires in vitro ou ex vivo. La pastille est appliquée sur un système cellulaire in vitro (Figure 6). Les cellules du système cellulaire peuvent être cultivées en condition de culture submergée ou à l'interface air- liquide. La pastille contenant le composé à tester se dissout et une étape de test de ce composé peut être entreprise.

Différents pastilles ont été réalisées pour tester, entre autre, l'effet de produits chimiques (Sodium Dodecyl sulfate, Ammonium Hexachloroplatinate, CaCI ₂ , NaCI, Naphtalene, etc.), de produits cosmétiques (extraits de plantes, émulsifiants, etc .), de produits pharmaceutiques (formulations solides, principes actifs, etc .), de nanoparticules (FeO, Ce0 ₂ , etc .), de produits métallurgiques (Ni, Fe, Zn, etc.). Les excipients suivants on été testés : dextran b 1 355; dextran b 1 355 s; dextran b-1 355; dextran b1355; dextran b-1 355-s; dextran b51 2; dextran m 70; dextran t 40; dextran t 500; dextran t 70; dextran t-40; dextran t-500; dextran 40; dextran 40000; dextran 60 ; dextran 70; dextran 75; dextran 80, Mannitol, Lactose. Des pastilles contenant une quantité de substance à tester de 10 milligrammes à 1 femtogramme ont été préparées.

Procédé de préparation

Exemple 1

Le Sodium Dodecyl sulfate (5 mg) est mélangé à du dextran 60 (495 mg) dans un rapport 1 %. Le mélange A1 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 1 % de Sodium Dodecyl sulfate.

Le mélange solide A1 (20 mg) est mélangé à du dextran 60 (1 80 mg) dans un rapport 1 0%. Le mélange A2 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0, 1 % de Sodium Dodecyl sulfate.

Exemple 2

L'Ammonium Hexachloroplatinate (5 mg) est mélangé à du dextran 60 (245 mg) dans un rapport 2%. Le mélange B1 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 2% d'Ammonium Hexachloroplatinate.

Le mélange solide B1 (20 mg) est mélangé à du dextran 60 (180 mg) dans un rapport 10%. Le mélange B2 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0,2% d'Ammonium Hexachloroplatinate.

Exemple 3

L'Oxyde de Fer (FeO) (5 mg) est mélangé à du dextran 60 (995 mg) dans un rapport 0,5% (mélange solide C1 ). Le mélange C1 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0,5% d'oxyde de Fer.

Le mélange solide C1 (10 mg) est mélangé à du dextran 60 (990 mg) dans un rapport 1 % (mélange solide C2). Le mélange C2 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0,005% d'oxyde de Fer.

Utilisation du bloc compressé

Les blocs compressés ont été appliqués directement sur des systèmes cellulaires ou dans du milieu de culture. Diverses études utilisant ces blocs on été conduites pour tester l'effet toxique (évaluation de la cytotoxicité, viabilité cellulaire et intégrité tissulaire par relargage de LDH, transformation de Resazurin, test MTT et mesure de Résistance Trans Epithéliale), l'effet sur le battement ciliaire (fréquence du battement ciliaire, clairance mucociliaire), l'effet sur le transport trans-epithelial (perméabilité), l'effet sur la modulation de canaux ioniques (chambres de Ussing) l'effet sur la modulation de facteurs solubles (cytokines, chémokines, metalloproteinases), l'effet sur la production de mucus (test ELLA).

Il va sans dire que l'invention n'est pas limitée aux exemples illustrés ci-dessus.