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Title:
METHOD FOR TRANSFERRING MATERIAL IN A CELL SYSTEM
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2001/066694
Kind Code:
A2
Abstract:
The invention relates to a method for transferring material through the membrane of at least one cell, whereby the transfer is carried out in the presence of trehalose. This method can be particularly utilized in the fields of genetic engineering and biotechnology.

Inventors:
ZIMMERMANN ULRICH (DE)
Application Number:
PCT/EP2001/002252
Publication Date:
September 13, 2001
Filing Date:
February 28, 2001
Export Citation:
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Assignee:
EPPENDORF AG (DE)
ZIMMERMANN ULRICH (DE)
International Classes:
C12N1/21; C12N13/00; C12N15/87; (IPC1-7): C12N5/00; C12N15/87
Domestic Patent References:
WO2000022147A12000-04-20
WO2000009732A12000-02-24
WO2000015032A12000-03-23
Other References:
A. EROGLU ET AL.: "Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian cells." NATURE BIOTECHNOLOGY, Bd. 18, Februar 2000 (2000-02), Seiten 163-167, XP002178806 NEW YORK, US
Attorney, Agent or Firm:
Hertz, Oliver (V. Bezold & Sozien Akademiestrasse 7 München, DE)
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Claims:
Patentansprüche
1. Verfahren zum Übertragen von Material durch die Membran mindestens einer Zelle in einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, dass die Übertragung in Gegenwart von Trehalose durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Übertragung des Materials von außen in die Zelle er folgt oder das Material zwischen mindestens zwei Zellen übertragen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ge kennzeichnet, dass die Übertragung durch Permeabilisie rung der Membran der Zelle bzw. Zellen stattfindet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran durch Anlegen eines elektrischen Feldes, Be strahlung oder chemische Behandlung permeabilisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass für die Permeabilisierung elektrische Methoden angewendet werden, zu denen die Elektrotransfektion, Elektroporation und Elektrofusion sowohl in makroskopischen Vorrichtungen als auch in Mikrosystemen/Mikrostrukturen gehören.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran durch Laserbestrahlung oder Ultraschall per meabilisiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran durch Behandlung mit Antibiotika oder Deter genzien permeabilisert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Material biologisches Material übertragen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als biologisches Material Xenomoleküle, DNA und RNA, Plasmide, Chromosomen, Chromosomenteile und künstliche Chromosomen, Proteine und Glycoproteine, Zellen, Zelltei le und Zellorganellen oder niedermolekulare Fremdstoffe, Trehalose oder ein Trehalose/SaccharoseGemisch übertra gen werden.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die bei der Übertragung ver wendeten Zellen natürliche Zellen oder membranumhüllte Vesikel sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als natürliche Zellen prokaryontische und eukaryontische Zellen verwendet werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellen menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sind.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Treha lose im wäßrigen Medium im Bereich von 1 bis 200 mM liegt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die bevorzugte Konzentration 30 bis 50 mM beträgt.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Trehalose im Gemisch mit Saccharose im Verhältnis 1 : 2 bis 1 : 10 (Trehalose : Saccharose) in einer Konzentration von 200 bis 300 mM vorliegt.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als wässriges Medium ein isoosmolares oder hypoosmolares Medium verwendet wird.
17. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Einschleu sen von biologischem Material in eine Zelle.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Material Trehalose oder Trehalose im Ge misch mit Saccharose selbst ist.
19. Verwendung nach Anspruch 16 auf dem Gebiet der Gentech nik, Biotechnologie, Hybridomatechnik und Mikrosystem technik.
Description:
Verfahren zum Übertragen von Material in einem Zellsystem Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Übertra- gen von Material durch die Membran mindestens einer Zelle so- wie die Anwendung dieses Verfahrens in der Gentechnik, Bio- technologie und Hybridomatechnik.

In den letzten Jahren haben Verfahren zum Übertragen von bio- logischen Materialien durch die Membran einer Zelle zunehmend an Bedeutung erlangt. Bei diesen Verfahren werden membranim- permeable Moleküle durch Poren, die sich durch äußere Kräfte in der Membran gebildet haben, geschleust. Diese Methoden ha- ben den entscheidenden Vorteil, dass keine Vehikel verwendet werden müssen.

Die reversible Membranpermeabilisierung durch ein elektrisches Feld oder auch die Elektroporation ist seit einiger Zeit eine etablierte Methode für die Aufnahme freier DNA in beispiels- weise Eukaryonten. Dabei setzt man die Eukaryonten in Gegen- wart von DNA einem elektrischen Feld hoher Stärke aus. Man weiß allerdings nur sehr wenig über den Mechanismus der DNA- Aufnahme während der Elektroporation. Es wird angenommen, daß sich in der Zellmembran aufgrund des Elektroschocks vorüberge- hend Poren bilden und die DNA nach Kontakt mit der Lipiddop- pelschicht der Zellmembran in die Zelle aufgenommen wird.

Anders als bei der Elektroporation, wo von außen Material in die Zelle eingeführt wird, ist die Elektrofusion zu betrach- ten, bei der mindestens zwei Zellen verschmelzen. Die Elektro- fusion erfolgt mittels elektrischer Impulse in zwei Stufen.

Zunächst werden die zu fusionierenden Zellen einem elektri- schen Wechselfeld ausgesetzt, in dem sie sich infolge von Dielektrophorese gegenseitig anziehen. Die Leitfähigkeit des Mediums sollte möglichst gering sein. Im zweiten Schritt wird die Elektrofusion durch sehr kurze elektrische Gleichstrompul- se ausgelöst. Dabei kommt es zu Interaktionen von Membrantei- len, die zur Fusion führen. Mit dieser Methode können bei- spielsweise Protoplasten fusioniert werden. Es können auch Hybride tierischer Zellen, wie Hybridomazellen, und Hefen her- gestellt werden.

So ist auch bereits seit einiger Zeit bekannt, eine Material- übertragung in eine Zelle dadurch zu bewirken, dass die Zellen zur Permeabilisierung mit Bestrahlung behandelt werden. Dabei werden die Zellen beispielsweise Laserstrahlung ausgesetzt, wonach dann das Material durch die Zellmembran diffundieren kann.

So sind auch bereits Methoden angewandt worden, bei denen die Membranen von Zellen für die Permeabilisierung mit chemischen Substanzen behandelt werden. Dazu gehören porenbildende und/ oder diffusionsfördernde Peptid-und Depsipeptidantibiotika, wie Valinomycin, und Detergenzien, wie Natriumdodecylsulfat.

Die oben beschriebenen bekannten Verfahren basieren auf dem folgenden Grundprinzip : Durch energiereiche, elektrische, e- lektromagnetische und mechanische Kräfte, wie Stromimpulse, Bestrahlung, Ultraschall und Druck, und chemische Behandlung kommt es zu lokalen Öffnungen in der Zellmembran. Es bilden sich submikroskopische Löcher bzw. Poren. Eine derartige Be- handlung ermöglicht das Einschleusen des biologischen Materi- als von außen oder, wenn zwei Zellen verschmolzen werden sol- len, zwischen den Zellen. Nach Abschwächen der Intensität die- ser von außen wirkenden Kräfte schließen sich die Poren in der Membran und das Material verbleibt in der Zelle.

Es hat sich allerdings bei diesen Verfahren herausgestellt, daß der Anteil an überlebenden Zellen, d. h. intakten, reversi- bel permeabilisierten Zellen, oftmals durch den Anteil toter Zellen übertroffen wird. Dieses ist darin zu sehen, dass die permeabilisierten Zellen nicht in der Lage sind, die Poren nach Abschwächung der äußeren Kräfte vollständig wieder zu schließen. Dabei kommt es dann zum Verlust wichtiger Zellfunk- tionen, so dass die Zelle nicht mehr in der Lage ist, ihren Stoffwechsel aufrecht zu erhalten, was letztlich zum Zelltod führt. Daher war es bei den Verfahren des Standes der Technik durchaus die Regel, mit einem Anteil toter Zellen rechnen zu müssen, was die Effizienz dieser Verfahren deutlich beein- trächtigte.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Übertragen von Material durch die Membran von Zellen zur Verfügung zu stellen, bei dem ein hoher Grad an reversibel permeabilisierten, sogenannten überlebenden Zellen erreicht wird und damit der Anteil an toten Zellen drastisch herabge- setzt wird. Die Erhöhung des Anteils an überlebenden Zellen soll auch dann erfolgen, wenn mit strikteren Reaktionsbedin- gungen, beispielsweise höheren Feldstärken, gearbeitet wird.

Diese Aufgabe wird mit dem Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungs- formen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Desweiteren werden in den Patentansprüchen besondere Anwendun- gen des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Übertra- gen von Material durch die Membran mindestens einer Zelle in einem wäßrigen Medium, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Übertragung in Gegenwart von Trehalose durchgeführt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich durch die Figuren nä- her erläutern. Es zeigen : Fig. 1 eine graphische Darstellung, worin die Propidiumio- did-Aufnahme und die Überlebensrate (% reversibel permeabilisierte Zellen) in Abhängigkeit der Feld- stärke im hypoosmolaren Medium gezeigt ist ; Fig. 2 eine graphische Darstellung, worin die"pulse effi- ciency"als Maß für die Ausbeute in Abhängigkeit der Feldstärke im hypoosmolaren Medium angegeben ist ; Fig. 3 eine graphische Darstellung, worin die Propidiumio- did-Aufnahme und die Überlebensrate (% reversibel permeabilisierte Zellen) in Abhängigkeit der Feld- stärke im isoosmolaren Medium gezeigt ist ; und Fig. 4 eine graphische Darstellung, worin die"pulse effi- ciency"als Maß für die Ausbeute in Abhängigkeit der Feldstärke im isoosmolaren Medium angegeben ist ; Es hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, dass die Überle- bensrate von reversibel permeabilisierten Zellen drastisch er- höht wird, wenn dem wäßrigen Arbeitsmedium Trehalose zugeführt wird. Es wird angenommen, dass die Trehalose eine membransta- bilisierende und membranheilende Funktion ausübt, wenn sich die Poren nach erfolgter Einschleusung des biologischen Mate- rials wieder schließen. Das hat zur Folge, dass die permeabi- lisierten Zellen überleben und somit nicht die Gefahr gegeben ist, dass durch den Verlust von Zellflüssigkeiten und -organellen die Zellfunktionen absterben.

Die Verwendung von Trehalose in Verfahren der hier beschriebe- nen Art ist bisher noch nicht bekannt gewesen. Die Literatur gibt lediglich Hinweise darauf, dass die Trehalose bei der Cryokonservierung von Säugetierzellen (Nature Biotechnology, Vol. 18, Februar 2000) und bei der Aufrechterhaltung intakter menschlicher Zellen ohne die Anwesenheit von Wasser (Nature Biotechnology, Vol 18, Februar 2000) einen Beitrag leistet.

Als Trehalose, die in den jeweiligen Arbeitspuffern gelöst wird, kann prinzipiell jede Trehalose verwendet werden. Die Trehalose ist ein Disaccharid und kommt in der Natur vor und wird auch in einem Fall synthetisch hergestellt. Die bekann- teste und am häufigsten in der Natur vorkommende Trehalose ist die a, a-Trehalose. Ebenfalls in der Natur vorkommende Trehalo- se ist die a, ß-Trehalose, die man in Honig nachgewiesen hat.

Die ß, ß-Trehalose ist nur synthetisch zugänglich. Vorzugsweise setzt man die a, a-Trehalose dem Arbeitspuffer bei der Übertra- gung des Materials zu.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich vorzugsweise für die Übertragung von Material unter Beteiligung mindestens ei- ner Zelle, die reversibel permeabilisiert wird oder unter Be- teiligung von mindestens zwei aneinander haftender Zellen, die permeabilisiert werden und praktisch Material untereinander austauschen. Hier ist es möglich, dass mindestens zwei Zellen miteinander verschmelzen, wobei es auch die Varianten gibt, daß mehrere Zellen, quasi unter Bildung eines Perlenstrangs, miteinander fusionieren.

Üblicherweise erfolgt die Übertragung von Material in die Zel- le durch lokale Öffnung bzw. Öffnungen der Membran der Zelle bzw. der Zellen. In diesem Fall spricht man von einer Permea- bilisierung der Membran. Es ist davon auszugehen, dass durch einen Teil der Öffnungen das Material übertragen wird und der andere Teil der Öffnungen ohne Materialdurchgang verbleibt.

Auch diese Öffnungen müssen sich nach Aufnahme des Materials wieder schließen, wobei sich gerade hier insbesondere die Tre- halose als membranheilendes Additiv als besonders vorteilhaft erwiesen hat.

Die Permeabilisierung der Membran kann in der Regel durch An- legen eines elektrischen Felds, durch Bestrahlung oder chemi- sche Behandlung erfolgen. Welche Methode hier gewählt wird, hängt im wesentlichen davon ab, welche Zellen transformiert werden sollen und welches Material übertragen werden soll.

Für die elektrische Permeabilisierung eignen sich Methoden, zu denen die Elektrotransfektion, Elektroporation und Elektro- fusion sowohl in makroskopischen Vorrichtungen als auch in Mikrosystemen/Mikrostrukturen gehören. Hier handelt es sich um etablierte Verfahren, mit denen bereits seit einigen Jahren erfolgreich in der Gentechnik gearbeitet wurde. Insbesondere bei der Elektroporation ist es oftmals erforderlich, bei hohen Feldstärken zu arbeiten. Herkömmlicherweise ergab sich hier aber das Problem, dass die Zellen dann abstarben, d. h. irre- versibel permeabilisiert worden zu sein. Dieses hat dann zu stark verminderten Ausbeuten geführt. Wenn man aber erfin- dungsgemäß dem Elektroporationspuffer Trehalose zufügt, ist es möglich, auch bei hohen Feldstärken reversibel permeabilisier- te lebende Zellen zu erhalten. Dieses macht das Verfahren weitaus wirtschaftlicher.

So ist auch eine Permeabilisierung durch UV-oder Laserbestrah- lung möglich. Bestrahlungen dieser Art sind dann vorteilhaft, wenn sich aufgrund der verwendeten Zellen und des zu übertra- genden Materials eine elektrische Behandlung nicht anbietet.

So ist eine chemische Behandlung zur Permeabilisierung nur dann empfehlenswert, wenn es nicht ratsam ist, eine Übertra- gung im elektrischen Feld oder durch Bestrahlung durchzufüh- ren. Sollte eine chemische Behandlung gewählt werden, so sind die Zellen für die Permeabilisierung mit Antibiotika, Deter- genzien, etc. zu behandeln.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann als Material jedes geeignete biologische Material übertragen werden. Dazu zählen : Xenomoleküle, DNA und RNA, Plasmide, Chromosomen, Chromosomen- teile und künstliche Chromosomen, Proteine und Glykoproteine, Zellen, Zellteile und Zellorganellen oder niedrigmolekulare Fremdstoffe.

Das biologische Material kann Trehalose bzw. Trehalose im Ge- misch mit Saccharose selbst sein. Auf diese Weise ist es mög- lich, Trehalose bzw. das Trehalose/Saccharose-Gemisch als in- trazelluläres Cryoprotektans oder Schutz vor Austrocknung ein- zuschleusen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist hinsichtlich der bei der Übertragung verwendeten Zellen keinen Beschränkungen unterle- gen. Es ist möglich, für die Übertragung von Material natürli- che Zellen oder membranumhüllte Vesikel zu verwenden. Als Bei- spiele für membranumhüllte Vesikel können natürliche oder künstliche Vesikel, Liposomen und Micellen genannt werden.

Als natürliche Zellen lassen sich erfindungsgemäß prokaryonti- sche und eukaryontische Zellen permeabilisieren und transfor- mieren. Als prokaryontische Zellen sind Bakterien, Blaualgen und Archaebakterien zu nennen. Die eukaryontischen Zellen kön- nen ihren Ursprung in Protozoen, Pflanzen (einschließlich Al- gen), Pilzen (einschließlich Hefen), Tieren oder Menschen ha- ben.

Bei der Elektroporation und Elektrofusion kann im isoosmolaren Medium und auch im hypoosmolaren Medium gearbeitet werden. Das hypoosmolare Medium weist bei tierischen Zellen eine Osmolari- tat von 75 bis 250 mOsm auf und ist daher unphysiologisch. Das isoosmolare Medium weist eine Osmolarität von etwa 300 mOsm auf und entspricht physiologischer Umgebung. Bei Pflanzenzel- len hingegen spricht man bei etwa 500 mOsm von einem isoosmo- laren Medium. Das hypoosmolare Medium bewegt sich bei etwa 400 bis 450 mOsm.

Es hat sich herausgestellt, daß gerade im hypoosmolaren Medium der Schutzeffekt der Trehalose deutlich wird.

Es hat sich gezeigt, daß die Konzentration der Trehalose im wäßrigen Medium bei beispielsweise elektrischer Behandlung im Bereich von 1 bis 200 mM liegen soll. Es ist festgestellt wor- den, dass Trehalose den Anteil überlebender Zellen nach Puls- applikation erhöht, wobei bei ca. 30 bis 50 mM ein Optimum in der Ausbeute auftritt, der sich bei weiterer Konzentrationser- höhung nicht verstärkt. Daher ist bei der Pulsapplikation ein Konzentrationsbereich von etwa 30 bis 50 mM bevorzugt.

Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße Verfahren in einer weiteren Ausführungsform auch dann zu einer erhöhten Ausbeute an reversibel permeabilisierten Zellen führt, wenn dem Arbeitspuffer ein Gemisch aus Trehalose und Saccharose zu- gesetzt wird. Das Verhältnis von Trehalose zu Saccharose liegt im Bereich 1 : 2 bis 1 : 10. Die Konzentration des Gemischs liegt im Bereich von 200 bis 300 mM.

Das vorliegende Verfahren ist hervorragend zum Einschleusen von biologischem Material in eine Zelle oder zwischen mindes- tens zwei Zellen geeignet. Daher ist es praktisch auf allen Gebieten der Biotechnologie, Gentechnik und Mikrosystemtechnik einsetzbar. Inbesondere läßt sich eine besondere Eignung in der Hybridomatechnik unter Anwendung beispielsweise der Elekt- rofusion erkennen. Auch lassen sich ohne weiteres mit dem er- findungsgemäßen Verfahren pflanzliche Protoplasten fusionie- ren.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat durch die Gegenwart von Trehalose im Arbeitsmedium eine Vielzahl von Vorteilen. Diese sind darauf zurückzuführen, dass die Trehalose auf die zu be- handelnden Zellen einen Schutzeffekt ausübt. Die Trehalose stabilisiert die Zellmembran und bewirkt beispielsweise nach Aufnahme des Fremdmaterials und Abschwächung der äußeren Kräf- te die schnelle Ausheilung der Poren. Insbesondere hat sich bei der Elektroporation herausgestellt, dass der Schutzeffekt der Trehalose bei hohen Feldstärken stark ausgeprägt ist, wäh- rend er von der Pulsdauer kaum beeinflußt ist. Es ist festge- stellt worden, dass die schützende Wirkung der Trehalose im hypotonen Pulsmedium stärker auftritt als im isotonen Pulsme- dium. Im schwach leitenden Medium ist die Wirkung der Trehalo- se etwas stärker ausgebildet als im höher leitenden Medium.

Diese vorteilhaften Schutzeigenschaften der Trehalose sind insbesondere dann von größtem Nutzen, wenn bei strikten Puls- bedingungen, wie geringer Leitfähigkeit, hypotonem Stress, ho- her Feldstärke, gearbeitet wird.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiele Beispiel 1 : Elektroporation von Zellen mit und ohne Trehalose im hypoosmo- laren Arbeitsmedium.

Als Pulsmedium wurde ein Phosphatpuffer mit 1,15 mM K2HP04/KH2PO4-Puffer, pH 7,2 verwendet. Als Leitsalz wurde KC1 in einer Konzentration von 10 mM (a = 1, 5-1,6 mS/cm) hinzu- gesetzt. Dann wurde Trehalose in entsprechenden Konzentratio- nen dem Pulsmedium hinzugefügt. Die Osmolarität wurde durch Zugabe von Inosit auf 100 mOsm eingestellt, um eine hypoosmo- lare Lösung zu erhalten.

Als Zellen wurden Jurkat-Zellen verwendet, welche Zellen einer humanen T-Lymphozyten-Linie sind.

Als zu übertragendes Material wurden 40 pg/ml Propidiumiodid, welches ein membranimpermeabler DNA-Farbstoff ist, hinzuge- setzt.

Die Pulsapplikation erfolgte nach zehnminütiger Inkubation vor Pulsapplikation im Pulsmedium bei Raumtemperatur (Zelldichte : 2-3 x 106 Zellen/ml). Die Pulsdauer betrug 20 ps.

Die Elektroporation erfolgte in einem Eppendorf-Multiporator.

Nach Pulsgabe ließ man 10 min bei Raumtemperatur die Poren schließen (Resealing).

Die Elektropermeabilisierung erfolgte bei folgenden Trehalose- konzentrationen : 0 mM und 40 mM (a,-Trehalose).

Es wird bei 4°C oder Raumtemperatur gepulst. Es kann einfach gepulst werden, während sich aber ein mehrfaches Pulsen, bis zu 3, als vorteilhaft erweisen kann.

Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt.

Figur 1 zeigt graphisch die Aufnahme von Propidiumiodid bzw. die Überlebensrate der elektropermeabilisierten Zellen in Ab- hängigkeit der Feldstärke. Die Poration ohne Trehalose ist mit Quadraten dargestellt. Der Ansatz mit 40 mM Trehalose wird in der Darstellung mit Dreiecken angeben. Die offenen Symbole zeigen die Überlebensrate (% Anteil der reversibel permeabili- sierten Zellen), während die gefüllten Symbole die Propidi- umiodid-Aufnahme in die Zelle darstellen.

Wie aus Figur 1 zu entnehmen ist, erleiden die Zellen in einem Pulsmedium ohne Trehalose bei Feldstärken ab 1,5 kV/cm irre- versibele Schädigungen und sterben durch Verlust der Zellfunk- tionen ab (offene Quadrate), wogegen in einem Pulsmedium im 40 mM Trehalose selbst bei sehr hohen Feldstärken bis 2,5 kV/cm nur ein relativ geringer Anteil von toten Zellen zu verzeich- nen sind (offene Dreicke). Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Zellen reversibel permeabilisiert wurden und lebensfähig geblieben sind. Die Propidiumiodid-Aufnahme wird nur in gerin- gem Maße durch Trehalose beeinflusst.

In Figur 2 wird die"pulse efficiency", welche das Produkt von Propidiumiodid-Aufnahme und Überlebensrate darstellt, als Maß für die Ausbeute der Eletroporation in Abhängigkeit der Feld- stärke untersucht. Hier ist festzustellen, dass diese Werte in Gegenwart von 40 mM Trehalose im Pulsmedium (Dreiecke) mit Er- höhung der Feldstärke stark ansteigen und deutlich über den Werten einer nicht mit Trehalose behandelten Kontrolle (Quad- rate) liegen. Diese deutliche Erhöhung der Ausbeute lässt sich ebenfalls auf eine stark verbesserte Überlebensrate in Gegen- wart von 40 mM Trehalose zurückführen.

Beispiel 2 : Elektroporation von Zellen mit und ohne Trehalose im isoos- molaren Arbeitsmedium.

Es werden im wesentlichen die gleichen Versuchsbedingungen wie im Beispiel 1 angewendet, mit der Ausnahme, dass die Osmolari- tat des Pulsmediums durch Zugabe von Inosit auf 290 mOsm auf isoosmolare Bedingungen eingestellt worden ist.

Es wurde wieder in das Pulsmedium a,-Trehalose in folgenden Konzentrationen eingegeben : 0 mM und 40 mM.

Die Ergebnisse sind aus den Figuren 3 und 4 zu entnehmen.

Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Überlebensrate und der Pro- pidiumiodid-Aufnahme gegenüber der Feldstärke. Die offenen Symbole stehen für die Überlebensrate, die gefüllten für die Propidiumiodid-Aufnahme.

Im isomolaren Pulsmedium ist die Überlebensrate bei den unbe- handelten Zellen (0 mM, offene Quadrate) um ein Vielfaches ge- ringer als bei mit 40mM Trehalose behandelten Zellen (offene Dreiecke), vor allem bei hohen Feldstärken. Die Propidiumio- did-Aufnahme variiert dagegen weniger stark. Es ist zu beach- ten, dass ein Absterben der Zellen ab einer Feldstärke von 3 kV/cm drastisch zu bemerken ist, wenn im Pulsmedium keine Tre- halose vorhanden ist.

Die"pulse efficiency"wird in Figur 4 in Abhängigkeit der Feldstärke für die vorliegenden Pulsmedien (0 bis 40 mM Treha- lose) gezeigt. Im Trehalose-haltigen Pulsmedium (Dreiecke) ist mit steigender Feldstärke eine stetige Erhöhung der, pulsa ef- ficiency"zu beobachten, während bei Fehlern der Trehalose (Quadrate) im Pulsmedium bei hohen Feldstärken eine drastische Reduzierung der Ausbeute zu erkennen ist. Auch hier zeigt die Trehalose wieder ihren Schutzeffekt bei strikten Pulsbedingun- gen.