背景技术 添加食品防腐剂是延长食品保藏期的重要手段 ，目前使用的防腐剂主要 是化学防腐剂，常见的有山梨酸 (钾）、 苯曱酸 (钠）、 丙酸钙等。 由于化学防 腐剂能在人体内残留，长期食用可能影响人体 健康，因此，防腐剂的天然化已 经成为防腐技术的趋势， 国内外对天然防腐剂主要集中在对细菌抑制作 用 上。

纳他霉素是一种天然、 广谱、 高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌 抑制剂， 它不仅能够抑制真菌， 还能防止真菌毒素的产生。 纳他霉素对 人体无害， 很难被人体消化道吸收， 而且微生物很难对其产生抗性， 同 时因为其溶解度很低等特点， 通常用于食品的表面防腐。 纳他霉素是目 前国际上唯一的抗真菌微生物防腐剂， 1 997年我国卫生部正式批准纳他 霉素作为食品防腐剂。 目前该产品已经在 5 0多个国家得到广泛使用， 广 泛应用于乳制品、 肉制品、 发酵酒、 饮料等食品的生产和保藏。

纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂， 其分子是一种具有活性的 环状四烯化合物， 含 3个以上的结晶水， 为白色 （或奶油色） ， 无味的结晶 粉末， 分子式 C ₃₃ H ₄₇ N0 ₁₃ , 分子量为 665. 7 3。 纳他霉素是两性物质， 分子当中 含有一个酸性基团和一个碱性基团， 其电离常数 pKa值为 8. 35和 4. 6 , 等电 点为 6. 5 , 熔点为 280 °C。其结构上存在两种构型， 烯醇式结构和酮式结构， 这就决定了它在许多溶剂中的低溶解性.它在� �性 pH下溶解度最低， 在溶剂 中的溶解性则随着 pH的升高或者降低而增加， 而在 pH低于 3或高于 9时溶解 度大幅增加，在大多数食品的 pH范围内非常稳定。 通常条件下它还是一种 水不溶性物质。 可由链霉菌经过发酵，提取，精制而得。

通过对链霉菌的培养， 发酵代谢后得到含有纳他霉素的发酵液。 国外以 及国内的专利文献公布的提取精制方法大都是 先过滤从发酵液中收集包含 纳他霉素和菌丝体以及未用完的水不溶性培养 基等物质的滤饼， 再通过加有 机溶剂在碱性或酸性下浸泡滤饼， 过滤得到含纳他霉素的滤液， 调节滤液的 pH至中性， 结晶得到粗品， 由于粗品中还含有大量杂质如蛋白质和脂肪等 ， 还要再进行一步重结晶才能得到合格的产品。

由于滤饼中包含水不溶性的培养基， 而这些培养基含有大量的蛋白质， 还有一些消泡用植物油， 这些物质的存在增加了滤液的粘度， 加大了过滤时 的阻力， 严重制约了过滤速度， 延长了生产周期， 加大了产品的损失。 当菌 体自溶后， 由于发酵液无法过滤甚至导致颗粒无收。 而且当溶剂浸泡滤饼后 进行过滤时， 这些水不溶性蛋白质和脂肪不但会影响过滤速 度， 而且还会有 一部分进入产品， 严重影响产品纯度和降低结晶液的过滤速度。 为了加快发 酵液的过滤速度， 通常都要再添加一些助滤剂， 比如硅藻土、 珍珠岩、 碳酸 钙等。 这些助滤剂虽然在一定程度上增加了滤速， 但最终都留在了滤饼中， 降低了滤饼中产品的含量， 也加大了后处理的负荷。

发明内容 本发明利用酶化学对发酵液进行酶解， 可很好的解决上述问题。 即加入 蛋白酶和脂肪酶将滤饼中水不溶性的的蛋白质 和脂肪水解成水溶性的小肽 氨基酸或甘油和脂肪酸， 这样就使发酵液的粘度得到大幅度的降低， 过滤能 够快速而稳定地进行， 使得菌体自溶的发酵液也得到过滤， 减少了损失， 同 时也避免了助滤剂的使用， 减少了滤饼量， 得到的滤饼杂质也相应减少， 可 以通过简单的一步结晶就能得到纯度 4艮高的产品， 缩短了生产周期， 提高了 生产效率和产品收率。 滤饼量的减少也大大降低了后期产品精制时有 机溶剂 的使用量， 产品结晶液由于蛋白质和脂肪油的除去也可以 得到快速的过滤。 而且酶解成本低， 反应条件温和， 不降低产品效价。

本发明是这样实现的， 一种纳他霉素发酵液的处理方法，其中， 所说的 方法由下列步骤组成：

( 1 )在纳他霉素发酵液中进行酶解； 蛋白酶酶解条件为： 蛋白酶重量 体积比为 0.002-0.01% (酶重量 /发酵液体积）， 温度 35-55°C, pH=3.0-8.5, 水解时间 2-24h, 反应结束灭酶； 脂肪酶酶解条件为： 脂肪酶重量体积比用 量为 0.002-0.01% (酶重量 /发酵液体积）， 温度 35-45°C, pH=5.5-10.5, 水 解时间 2-24h; 反应结束灭酶。

( 2)酶解完成后，调节 pH为 5.0-10.5,过滤，收集滤饼；

( 3 )滤饼用曱醇在碱性环境下浸泡，过滤，滤液� �节 pH为 5.0-10.5，放 置析晶；

( 4 )将结晶液进行固液分离得到湿产品，干燥后� �到纳他霉素产品。 本发明还可以这样实现的， 所述步骤（1 ) 所采用的蛋白酶或为酸性蛋 白酶，或为中性蛋白酶， 或为碱性蛋白酶， 或为上述蛋白酶中至少两种蛋白 酶的组合。

所述步骤 ( 1 ) 中性蛋白酶酶解条件为： 蛋白酶用量 0.002-0.01% (酶重 量 /发酵液体积）， 温度 35-55°C, pH=6.0-7.5, 水解时间 2-24h, 反应结束 灭酶。

所述步骤 ( 1 )碱性蛋白酶酶解条件为： 蛋白酶用量 0.002-0.01% (酶重 量 /发酵液体积）， 温度 35-55°C, pH=7.0-8.5, 水解时间 2-24h, 反应结束 灭酶。

所述步骤 ( 1 )酸性蛋白酶酶解条件为： 蛋白酶用量 0.002-0.01% (酶重 量 /发酵液体积）， 温度 35-55°C, pH=3.0-6.0, 水解时间 2-24h, 反应结束 灭酶。 所述步骤 （ 1 ) 脂肪酶酶解条件： 脂肪酶重量体积比用量为发酵液的 0. 002-0. 01% , 温度 35-45 °C , pH=6. 5-8 , 水解时间 2-8h; 反应结束灭酶。

本发明还可以这样实现的， 所述步骤（1 ) 所采用的蛋白酶或为酸性蛋 白酶，或为中性蛋白酶， 或为碱性蛋白酶， 或为上述蛋白酶中至少两种蛋白 酶的组合。

本发明还可以这样实现的， 所述步骤（1 ) 所采用的脂肪酶为植物油脂 水解用脂肪酶一种或几种的组合。

本发明还可以这样实现的， 所述步骤（1 ) 所用的蛋白酶和脂肪酶或同 时加入同时进行蛋白质和脂肪酶解， 或先加入蛋白酶进行蛋白质酶解再加入 脂肪酶进行脂肪酶解， 或先加入脂肪酶进行脂肪酶解再加入蛋白酶进 行蛋白 质酶解。 本发明还可以这样实现的， 步骤 ( 2 )和步骤 ( 3 )所说的 pH为 6-7 , 优选 6. 5。

本发明还可以这样实现的， 步骤（3 ) 所述曱醇用量按照湿滤饼：曱醇 =1 : 3-4的重量比例加入， 碱性环境 pH为 10-11 ;

本发明的较佳实施方式 下面通过具体的实施方案叙述本发明中纳他霉 素发酵液的处理方法。 法。 另外， 实施方案应理解为说明性的， 而非限制本发明的范围， 本发明的 实质和范围仅由权利要求书所限定。 对于本领域技术人员而言， 在不背离本 发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中 的培养条件、含量、酶解条件、 分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本 发明的保护范围。

本发明利用酶化学对发酵液进行酶解， 即在发酵液中加入蛋白酶和脂肪 酶将进入滤饼中那些水不溶性的蛋白质和脂肪 水解成水溶性的小肽和氨基 酸以及甘油和脂肪酸， 这样就使发酵液的粘度得到大幅度的降低， 使过滤能 够快速而稳定地进行。

本发明采用的蛋白酶或为酸性蛋白酶，或为中 性蛋白酶， 或为碱性蛋白 酶， 或为上述三类蛋白酶中或一类或两类或三类中 的或一种蛋白酶或几种蛋 白酶的组合。 也即本发明采用的蛋白酶采用或者碱性蛋白酶 ， 或者中性蛋白 酶， 或者酸性蛋白酶三类中任何一类中的一种或者 这三类中任何一类或者两 类或者三类中任何一种或者几种的组合。

蛋白酶酶解条件： 蛋白酶用量 0.002-0.01% (酶重量 /发酵液体积）， 温 度 35-55 , pH=3.0-8.5, 水解时间 2-6h, 反应结束灭酶。

脂肪酶酶解条件： 脂肪酶用量 0.002-0.01% (酶重量 /发酵液体积）， 温度 35-45 °C, pH=5.5-10.5, 水解时间 2-6h

实施例一：

取纳他霉素发酵液 20000L, 先进行蛋白酶酶解， 后进行脂肪酶水解； ( 1 )、 加入碱性蛋白酶 0.006% (w/v) , 控制 H=7.2-7.8, 40°C下水解 3h, 反应过程用碱液维持 pH=7.2-7.8, 反应结束后灭酶 10分钟；

( 2 ) 、 加入脂肪酶 0.006% (w/v) , 控制温度在 40°C左右水解 3h; 水解完 成后调节 pH至 6. 3-6.7; 反应结束后灭酶 10分钟；

( 3 )、 快速过滤发酵液， 得到滤饼。 按照湿滤饼：曱醇 =1: 4的比例加入曱 醇， 调节 pH至 10.2-10.7, 萃取 2h后过滤， 收集滤液；

( 4 ) 、 调节滤液 pH至 6. ⁴ _6.6, 放置结晶；

( 5 )、过滤结晶液，收集产品结晶，水洗后干燥,� ��成品。产品含量 97.5% (干 基计）， 收率 90.1%。

实施例二：

取纳他霉素发酵液 20000L, 等分成两份， 一份按常规方法处理， 一份按 本发明工艺处理。

a.不加酶酶解 调节发酵液 pH至 6.5左右， 加入 4% (w/v)硅藻土助滤剂，搅拌均勾后用 板框过滤.过滤时间 10h;

收集滤饼，按照湿滤饼： 曱醇 =1: 3的比例加入曱醇， 调节 pH至 10.5左 右， 萃取 2h后过滤， 收集滤液。 过滤时间 3.5h;

调节滤液 pH至 6.5左右， 放置结晶；

过滤结晶液， 收集粗品，产品含量 60.8% (干基计），前面两步收率 81.6%; 将粗品进行一次重结晶，过滤水洗干燥后得到 成品，含量 97.6% (干基计），收 率 94.4%,总收率 77.0%。

b.同时采用蛋白酶和脂肪酶酶解

( 1 ) 纳他霉素发酵液中同时加入碱性蛋白酶 0.006% (w/v) 和脂肪酶

0.006% (w/v) , 控制 pH=7.3-7.7, 40°C下水解 4h, 反应过程用碱液维持 pH=7.3-7.7左右， 反应结束后灭酶 10分钟。 调节发酵液 pH至 6.3-6.7,快 速过滤发酵液， 得到滤饼。 过滤时间 4h;

( 2) 、 收集滤饼，按照湿滤饼： 曱醇 =1: 3 的比例加入曱醇， 调节 pH 至 10.2-10.7, 萃取 2h后过滤， 收集滤液。 过滤时间 lh;

( 3)调节滤液 pH至 6. ⁴ _6.6, 放置结晶；

( 4 ) 、 过滤结晶液， 收集产品结晶， 水洗后干燥， 得成品。 产品含量 97.1% (干基计）， 总收率 89.7%。

实施例三：

( 1) 、 同时加入碱性蛋白酶 0.006% (w/v) 、 中性蛋白酶 0.004% (w/v)和 脂肪酶 0.006% (w/v) (植物油脂水解用脂肪酶) , 控制 pH=6.8-7.2, 45°C 下水解 4h, 反应过程用碱液维持 pH=6， 8-7.2, 反应结束后灭酶 10分钟。 调 节发酵液 pH至 6.3-6.7，快速过滤发酵液， 得到滤饼。 过滤时间 4h;

( 2) 、 收集滤饼，按照湿滤饼： 曱醇 =1: 3 的比例加入曱醇， 调节 pH 至 10.2-10.7, 萃取 2h后过滤， 收集滤液。 过滤时间 lh; ( 3) 、 调节滤液 pH至 6.3-6.7左右， 放置结晶；

( 4 ) 、 过滤结晶液， 收集产品结晶， 水洗后干燥， 得成品。 产品含量 97.6% (干基计) , 总收率 90.0%。

实施例四：

( 1) 、 同时加入碱性蛋白酶 0.003% (w/v) 、 中性蛋白酶 0.005%(w/v)和 脂肪酶 0.01%(w/v) (植物油脂水解用脂肪酶） ， 控制 pH=6.5-7. ² , 40°C下 水解 4h, 反应过程用碱液维持 pH=6.5-7.2, 反应结束后灭酶 10分钟。 调节 发酵液 pH至 6.3-6.7，快速过滤发酵液， 得到滤饼。 过滤时间 3h;

( 2) 、 收集滤饼，按照湿滤饼： 曱醇 =1: 4 的比例加入曱醇， 调节 pH 至 10.3-10.7, 萃取 2h后过滤， 收集滤液。 过滤时间 lh;

( 3) 、 调节滤液 pH至 6.4-6.6左右， 放置结晶；

( 4 ) 、 过滤结晶液， 收集产品结晶， 水洗后干燥， 得成品。 产品含量 97.8% (干基计) , 总收率 91.0%。 工业实用性 本发明可使发酵液的粘度得到大幅度的降低， 使过滤能够快速而稳定地 进行， 缩短了后处理周期缩短了 3-6小时， 使生产周期也大大缩短， 提高企 业生产效率。

本发明菌体自溶的发酵液也能够过滤， 减少了损失。 同时也避免了助滤 剂的使用， 减少了滤饼量， 得到的滤饼杂质也相应减少； 可以通过简单的一 步结晶就能得到纯度很高的产品； 减少了反复处理造成的产品损失， 采用发 明方法使产品总收率比对照提高了 16%以上。

本发明使滤饼量减少，后期产品精制时有机溶 剂曱醇的使用量降低了 50% 以上。 产品结晶液由于蛋白质和脂肪油的除去也可以 得到快速的过滤。

由于采用酶解方法使发酵液后处理时间缩短了 3-6小时， 有效避免了由 于发酵液存放时间过长而造成的菌体自溶问题 ， 从而避免了纳他霉素因菌体 自溶所造成的损失， 也间接提高了纳他霉素收率。

本发明成本低， 反应条件温和， 不降低产品效价。