GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 und eine entsprechende Vorrichtung gemäß Anspruch 12. Demnach ist vorgesehen, vorzugsweise einzelne, insbesondere biologische, Objekte einer in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population zu behandeln unter Verwendung mindestens eines Substrates und einerelektronischen, insbesondere digitalen mikrofluidischen, Schaltung oder Steuerung, wodurch digitale mikrofluidische Tröpfchenbewegungen mittels digitaler Mikrofluidik ermöglicht werden.

TECHNOLOGISCHER HINTERGRUND

Eine wesentliche Zielsetzung zum Behandeln von in Flüssigkeiten suspendierten Populationen sich voneinander unterscheidender, insbesondere biologischer Objek- te aus Ziel- und Restpartikeln ist das Sortieren einer solchen Population in solche Objekte, die erwünscht sind oder gesucht werden, um diese weiter zu verwenden (Zielpartikel) und solche, deren Weiterverwendung nicht im Fokus stehen (Restpartikel). Zu diesem Zweck werden seit fast 40 Jahren so genannte Fluss-Zytometer verwendet, die eine tröpfchenbasierte Sortierung mittels eines fadenförmigen und vertikal gerichteten, kontrollierten Flüssigkeitsstromes nach dem so genannten Jet- in-air-Prinzip vornehmen. Der nach unten gerichtete Flüssigkeitsfaden wird mittels geeigneter Schwingungserreger in eine Perlenschnur kleinster Flüssigkeitströpfchen zerlegt, nachdem der Flüssigkeitsfaden mit optischen Methoden daraufhin analysiert wurde, an welchen Stellen er ein interessierendes biologisches Objekt, wie eine Zelle enthält. Nachfolgend werden die Flüssigkeitströpfchen durch ein e- lektrisches Feld in die ein oder andere Richtung abgelenkt, dies nach der Maßgabe, ob ein Flüssigkeitströpfchen eine gesuchte Zelle enthält oder nicht enthält. Auf diese Weise können gesuchte Zellen von nicht gesuchten Zellen getrennt gesammelt werden. Dieses Verfahren setzt voraus, dass nur eine äußerst geringe Zahl von Zellen, vorzugsweise nur eine Zelle in einem Tröpfchen vorliegt. Demzufolge müssen alle in der Flüssigkeit vorhandenen Zellen die Analyseposition einzeln durchlaufen. Dieses auch als FACS (Fluorecence-Activated Cell Sorting) bezeichnete Verfahren gestattet es z.B., menschliche Stammzellen aus Blutplasma zu gewin- nen. Auf diese Weise konnten durch so genanntes Hochgeschwindigkeitssortieren in kommerziellen FACS- Geräten über 40.000 Zellen je Sekunde sortiert werden. Dabei fallen z.B. etwa 6.000 Stammzellen je Stunde an. Höheren Gewinnungsraten und Sortiergeschwindigkeiten sind bei dieser Methode physikalische Grenzen gesetzt, die - im Falle der Sortierung von Zellen - bei etwa 100.000 Zellen pro Se- künde vermutet werden. Außerdem lassen sich systembedingt massive Aerosol- Bildung und hydrodynamische Belastungen nicht vermeiden.

Zur Erzielung deutlich höherer Zellsortiergeschwindigkeiten wurde daher vorgeschlagen (James F. Leary, ULTRA HIGH-SPEED SORTING, International Society for Analytical Cytology, Cytometry Part A 67A, Seite 67-85), Ultrahochgeschwindig- keitszellsortierung durch Kaskadierung zu erreichen, d.h., dass von einem Reservoir ausgehend die Zellverbände entlang von sich immer wieder teilenden Pfaden bis hin zu einer Vielzahl von Analysepunkten transportiert werden und jeder Analyseposition nachgeschaltet ein Sortierschritt erfolgt. Durch die Kaskadierung, wie sie u.a. in der WO03/060486 A1 beschrieben wird, wird unter anderem eine hochgradige Parallelisierung von Sortierschritten möglich, wodurch Sortiergeschwindigkeiten von 1.000.000 Zellen pro Sekunde erreichbar sein sollen.

Eine alternative Zeilsortierungsmethode zur Durchflusszytometrie beschreibt die Veröffentlichung von Irena Barbulovic-Nad et al, DIGITAL MICROFLUIDICS FOR CELL-BASED ASSAYS, veröffentlicht durch The Royal Society of Chemistry in Lab Chip, 2008, 8, Seiten 519 - 526. Danach werden eine Vielzahl von Zellen enthaltende Flüssigkeitströpfchen über die Oberfläche oder in einer Deckschicht eines Mikrochips, die in 7x7 mm große Elektroden unterteilt ist, nach der Elektrowetting Methode oder nach der Dielektrophorese Methode oder einer anderen Methode zum Generieren und Manipulieren von Mikrotröpfchen in einem digitalen mikroflui- dischen Substrat, von einem Reservoir ausgehend, zu bestimmten Positionen hin transportiert und mit Reagenzien, wie auch Farbstoffen, die auf gleiche Weise von Elektrode zu Elektrode transportiert, analysiert und/oder zusammengeführt werden. Die Methode der digitalen Mikrofluidik wird in der Veröffentlichung ULTRA HIGHSPEED SORTING als zukünftige Möglichkeit der Zellsortierung vorgeschlagen.

DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, mittels eines gattungsgemäßen Verfahrens Ziel- und Restpartikel enthaltende Populationen von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten, sich von einander unterscheidenden, vorzugsweise einzelnen, insbesondere biologischen Objekten durch vergleichsweise wenige Prozessschritte zu behandeln. Dabei wird unter „Behandeln" im einfachsten Fall eine Sortierung in Ziel- und Restpartikel verstanden. Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 12 vorgeschlagen. Demnach ist hinsichtlich eines gattungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, zunächst Flüssigkeitströpfchen geeigneter Zusammensetzung aus Ziel- und Restpartikeln zu generieren. Jedes generierte Flüssigkeitströpfchen wird in einer ersten Analyseposition auf das Vorhandensein mindestens eines Ziel- oder Restpartikels untersucht. Flüssigkeitströpfchen ohne Zielpartikel werden nachfolgend über eine Restpartikelsenke von dem Substrat entfernt. Flüssigkeitströpfchen mit mindestens einem Zielpartikel werden mittels des Substrats einer zweiten Behandlungsstufe zugeführt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in weiteren Behandlungsstufen Proben bis zum Niveau einzelner Zellen/Partikel zu isolieren.

Zwar können Tröpfchenbewegungen in gewissem Umfang durch Schwerkraftein- fluss erreicht werden, doch ist vorzugsweise eine digitale mikrofluidische Tröpfchenbewegung (DMF) in der Weise vorgesehen, dass Potentiale zwischen Elektroden in einer Reihe, entlang der sich die Tröpfchen auf einer Oberfläche des Sub- strates oder in einer Schicht des Substrates bewegen können sollen, vorgesehen, wobei der Antrieb der Tröpfchen nach der Methode des Elektrowetting und in einem untergeordneten Verfahrensabschnitt auch nach der Methode der Dielektrophorese erfolgen kann. Beim Elektrowetting werden Kräfte durch nicht symmetrische Kontaktwinkel generiert. Bei der Dielektrophorese werden anziehende oder abstoßende Kräfte durch Polarisationseffekte in unregelmäßigen elektrischen Feldern hervorgerufen. Mittels DMF-Schaltkreisen ist es möglich, Flüssigkeitströpfchen zu bilden, zu transportieren, zu unterteilen und zu verbinden. Diese Hauptoperationen werden in der Veröffentlichung von Sung Kwon Cho et al „CREATING, TRANSPORTING, CUTTING, AND MERGING LIQUID DROPLETS BY ELECTROWETTING BASED ACTUATION FOR DIGITAL MICROFLUIDIC CIRCUITS" im Journal of Microe- lectrochemical Systems, Vol. 12, No. 1 , Februar 2003, Seiten 70 - 80, für das E- lektrowettingverfahren beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hier einbezogen wird.

Durch die Erfindung wird es möglich, auf eine große Vielzahl von Prozessschritten zu verzichten, weil Flüssigkeitströpfchen, die eine Population von biologischen Objekten enthalten, von denen aber keines als Ziel- respektive Restpartikel betrachtet wird, sofort über die Restpartikelsenke samt der Flüssigkeit des betroffenen Flüssigkeitströpfchen aus dem Prozess ausgesondert werden. Anders als bei der Durchflusszytometrie, bei der jedes in der Flüssigkeit vorhandene biologische Objekt, vorzugsweise vollständig, analysiert wird, also entsprechend viele Analyse- schritte erforderlich sind, wird durch die Erfindung eine ganz erhebliche Verminderung der Analyseschritte erreicht. Dieser Vorteil wird ebenso gegenüber der oben beschriebenen Kaskadierungsmethode erzielt. Nur die mit Zielpartikeln befrachteten Flüssigkeitströpfchen werden einer weiteren Behandlungsstufe zugeführt. Dabei können biologische sowie nicht biologische Objekte in einer Anzahl von 1 bis etwa 10 ³ in einem einzelnen Flüssigkeitströpfchen vorliegen. Gegebenenfalls lässt sich die Anzahl noch erhöhen.

Unter „biologischen Objekten", für die das erfindungsgemäße Verfahren zum Einsatz kommt, zählen ganze Zellverbände, einzelne hochentwickelte Zellen, Zellbe- standteile, Chromosomen und auch mikrobiologische Objekte, wie z.B. Viren. Die Erfindung ist aber nicht auf die Behandlung von biologischen Objekten beschränkt, sondern auch für nicht biologische Populationen von Ziel- und Restpartikeln anwendbar. Unter „Behandeln" von Populationen biologischer Objekte wird neben dem Trennen auch das Durchführen chemischer Reaktionen, das Färben, das Wa- sehen, das Ausbleichen, das Hybridisieren und andere Behandlungsprozeduren an biologischen Objekten verstanden. Unter „Population" wird eine Mehrzahl von einander sich unterscheidenden Objekten verstanden.

Es ist nun auf verschiedene Weise möglich, die Erfindung auszuführen. Gemäß einer ersten Ausführungsform werden die in einer Flüssigkeit suspendierten biologischen Objekte, wie z.B. gemischte Zellverbünde, in einem Vorratsbehältnis oder in einem Zwischenbehältnis so in Bewegung gehalten oder aufbewahrt, dass sie nicht sedimentieren. Das Behältnis weist an mindestens einer Seite eine Öffnung, vorzugsweise eine Mehrzahl von voneinander beabstandeten Öffnungen oder Ports auf, deren Größe und Form so gewählt ist, dass an diesen Stellen aus dem Vorrat einzelne Flüssigkeitströpfchen geeigneter Größe aus dem Gesamtvolumen abgezogen oder herausgelöst werden können, wie es insbesondere in der Druckschrift „CREATING, TRANSPORTING, CUTTING, AND MERGING LIQUID DROPLETS BY ELECTROWETTING BASED ACTUATION FOR DIGITAL MICROFLUIDIC CIRCUITS (a.a.O.)" beschrieben ist. Dementsprechend ist es bevorzugt, wenn sich ein DMF-Chip mit seinen Kanälen oder Bahnen für den Tröpfchentransport direkt an die jeweiligen Ports des Vorratsbehältnisses anschließt. Auf diese Weise kann eine Vielzahl paralleler Tröpfchenpfade für den Tröpfchentransport bis hin zu einer Analyseposition genutzt werden. Auch können mehrere Mikrochips auf die gleiche Weise an derselben Seite oder an weiteren Stellen eines Voratsbehältnisses „angedockt" werden, z. B. um die Parallelisierung noch zu vergrößern.

In der Analyseposition wird festgestellt, ob das jeweilige Flüssigkeitströpfchen mindestens ein Zielpartikel oder eine minimale Zielpartikelkonzentration enthält. Bejahendenfalls wird dieses Flüssigkeitströpfchen entlang einer der Tröpfchen- Bewegungsbahnen auf dem Substrat in eine Weitergabeposition an einem Pfaden- de (Übergabepunkt) navigiert, an dem das Tröpfchen an eine weitere Behandlungsstufe abgegeben wird. Hierbei kann es sich um einen Zwischenbehälter handeln. Tröpfchen, die keine oder zu wenige Zielpartikel enthalten, werden in einen anderen Bewegungspfad gelenkt als die Tröpfchen mit Zielpartikeln. An dem Ende des Pfades für nicht interessierende Tröpfchen wird das Tröpfchen an eine Tröpf- chensenke übergeben. Hierbei kann es sich um einen Tröpfchenauffangbehälter handeln.

Wegen der Parallelisierung der Sortiervorgänge auf jedem Mikrochip kommt es bei zweidimensionaler Anordnung der die Tröpfchenbewegung hervorrufenden Elekt- roden zu Kreuzungen von Wegstrecken. Um hier Kollisionen von Ziel- und Restpartikeln zu vermeiden oder zumindest weitgehend auszuschließen, werden geeignete Sortieralgorithmen verwendet, die die Elektroden steuern. Wenn, wie bevorzugt, die Anzahl von biologischen Objekten in einem Flüssigkeitströpfchen derart gewählt wird, dass die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins eines Zielpartikels in dem Tröpfchen sehr gering ist, können somit sehr viele Tröpfchen als Ganzes verworfen werden. Dies führt zum Einen zu einer Verringerung des Sortieraufwandes. Zum Anderen werden dadurch die Häufigkeiten potentieller Tröpfchenkollisionen an sich kreuzenden Bewegungspfaden gering gehalten und der Steuerungsaufwand für die Tröpfchenbewegung somit verringert.

In den Analysepositionen können beliebige Analysen durchgeführt werden, wie z.B. mittels Fotodetektoren, die markierte Proben optisch, z.B. mittels Lichtstreuung und/oder Fluoreszenzmessung erkennen und deren Nachweis auf dem Niveau einzelner Zellen/Partikel ermöglichen. Es können auch Widerstandsmessungen zur Partikelgrößenbestimmung, z.B. nach dem Coulter-Prinzip (der Coulter-Counter detektiert Änderungen in der elektrischen Leitfähigkeit einer durch eine Blende be- obachteten, biologische Partikel enthaltenden Flüssigkeit) vorgenommen werden. Die Sortierung kann auch durch magnetische Aktivierung erfolgen.

Die Architektur der DMF-Chips zur Behandlung der biologischen Objekte wird vorzugsweise modular ausgestaltet. Dies ermöglicht nicht nur einen hohen Grad an Parallelisierung der generierten Tröpfchen, sondern gestattet auch die Übergabe von Tröpfchen zwischen den Pfadenden benachbarter Module, so dass weitere Behandlungsschritte sich unmittelbar anschließen können. Einzelnen Modulen können unterschiedliche Aufgaben zugeordnet werden, etwa weil auf den vorangehenden Modulen gewisse Behandlungsschritte nicht oder nicht mehr Platz finden. Ebenso ist es möglich, Module zu verwenden, die dreidimensionale Bewegungspfade ermöglichen, so dass Flüssigkeitströpfchen in unterschiedlichen, insbesondere parallelen Ebenen behandelt und auch von einer Ebene in eine andere Ebene transportiert werden können.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Behandlung einer Ziel- und Restpartikel enthaltenden Population von in Flüssigkeitströpfchen suspendierten biologischen Objekten stufenweise derart vorgenommen, dass Flüssigkeitströpfchen mit nicht interessierenden Populationen nach der Detektion auf direktem Wege und ohne Kreuzung mit Bewegungspfaden für interessierende Flüssigkeits- tröpfchen der Restpartikelsenke zugeführt werden. Hierbei kann eine Restpartikelsenke für mehrere Tröpfchenports und entsprechend für mehrere Bewegungspfade auf dem Mikrochip verwendet werden. Vorzugsweise auf demselben Mikrochip fin- det danach eine Teilung der interessierenden Flüssigkeitströpfchen statt. Die Teiltröpfchen werden nachfolgend einzeln analysiert und nachfolgend in einer weiteren Restpartikelsenke gesammelt oder abgeführt, wenn sie nicht interessieren und der weiteren Behandlung zugeführt, wenn sie interessieren, also z.B. mindestens ein Zielpartikel enthalten. Die Tröpfchenteilung wird vorzugsweise auf demselben Mik- rochip durchgeführt, auf dem sich auch die erste Restpartikelsenke befindet. Grundsätzlich ist es aber auch möglich, die interessierenden Flüssigkeitströpfchen zunächst an einen weiteren Mikrochip zu übergeben und danach erst weiter zu behandeln.

Die Teiltröpfchen können an sich auch auf dem Mikrochip, auf dem die Tröpfchenteilung stattgefunden hat, weiterbehandelt werden, d.h. insbesondere in einer zweiten Analyseposition auf das Vorliegen von Zielpartikeln hin analysiert werden. Vorzugsweise findet dieser zweite Analyseschritt auf veränderten Tröpfchen- Bewegungspfaden statt, nämlich solchen, bei denen die Elektroden und ggf. deren Abstände der geringeren Tröpfchengröße entsprechend kleiner sind. Das kann grundsätzlich auf demselben Mikrochip stattfinden, auf dem eine Tröpfchenteilung bereits stattgefunden hat. Bevorzugt wird für die Weiterbehandlung allerdings ein anderes Mikrochipmodul verwendet, das kleinere Elektroden aufweist. Durch diese Verkleinerung der Elektrodengröße ist eine (überlagerte) Kaskadierung erreichbar, insbesondere eine Verdopplung der Bewegungspfade von einem Modul zum nächsten. Auf diese Weise kann eine Vereinzelung von Zielpartikeln schrittweise erfolgen.

Zudem können die Elektroden auch in gleicher Größe ausgeführt und zu kleineren und größeren Elektrodenflächen zusammengeschaltet werden. Die Form der resultierenden Flächen kann quadratisch, rechteckig oder auch rund sein. Auf diese Weise könnten die Elektrodenflächen auf dem Substrat an jeder Stelle an die jeweilige Tröpfchengröße angepasst werden.

Wenn die Tröpfchengröße aufgrund mehrfacher Tröpfchenteilung so gering wird, dass der Tröpfchentransport und/oder die in den Tröpfchen enthaltenden Zielparti- kel unter der geringen Flüssigkeitsmenge leiden, können nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung partikelfreie Flüssigkeitströpfchen mit einem partikelenthaltenden Flüssigkeitströpfchen vereint werden. Hierbei wird unter partikelfreiem Flüssigkeitströpfchen verstanden, dass in diesem Flüssigkeitströpfchen keine den Behandlungsvorgang oder das Behandlungsziel störenden Objekte vorliegen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Flüssigkeitströpfchen, insbesondere auf dem Mikrochip, gekühlt, erwärmt, oder begast werden, um optimale Bedingungen für die Zellen I mit dem Ziel zu schaffen, deren Verände- rung oder Absterben während des Sortierens möglichst weitgehend zu vermeiden.

Weiter ist es möglich, Ziel- oder Restpartikel enthaltende Flüssigkeitströpfchen entlang einer „Warteschleife" zu bewegen und/oder sie in eine vorangehende Stufe zurück zu führen. So können bei sehr kleinen Probenvolumina mit nur geringer An- zahl an Zielpartikeln Mehrfachuntersuchungen durchgeführt und insbesondere der Verlust solcher Partikel vermieden oder in engen Grenzen gehalten werden.

Weiterhin kann es von Vorteil sein, die Tröpfchengröße, die Zahl an biologischen Objekten je Tröpfchen und Analyseeinstellungen in einer Vorsortierungsstufe zu definieren. So ist es möglich, anhand der prozentualen Verteilung der in der Gesamtpopulation vorhandenen interessierenden Zellen optimale Werte für die Tröpfchengröße und die Zellzahl/Tröpfchen in für das System vorgegebenen Grenzen zu definieren. Z.B. wählt man hohe Zellzahl/Tröpfchen bei geringen prozentualen Anteilen an interessierenden Zellen und einer gleichzeitig großen Gesamtpopulation und geringe Zellzahl/Tröpfchen bei hoher Konzentration an interessierenden Zellen.

Ebenso kann anhand der prozentualen Verteilung bestimmt werden, ab welchem späteren Teilungsschritt Detail-Analysen erfolgen sollen, z.B. ab ca. 10 Zellen/Tröpfchen.

Ferner kann man, insbesondere in der Vorsortierstufe, Sortiermodi wie Reinheit, Verunreinigungen (z.B. nicht vitale Zellen oder Zellbruchstücke), Zuordnung der Zellpopulationen und der angestrebten Anzahl von Zellen zu Sammelgefäßen (Mischungen/Serien von gleichen oder ungleichen Zellzahlen) definieren. Je nach Startbeladung der einzelnen Tröpfchen würden diese nun in mehr oder weniger vielen Stufen analysiert, geteilt und vorsortiert. Tröpfchen ohne interessierende Zellen können früh aussortiert und dem Abfall zugeführt werden. Tröpfchen mit mindestens einer interessierenden Zelle können in Richtung Sammelgefäß navigiert werden. Sollte die Analyse, ob z.B. in einem Tröpfchen mindestens eine interessierende Zelle vorhanden ist, zweifelhaft sein, kann das System anhand der Voranalyse entscheiden, ob das Tröpfchen verworfen oder einem weiteren Analyse- und Teilungsvorgang zugeführt wird.

Während des Sortiervorgangs, falls z.B. wegen zu hoher Zellkonzentration zu oft zweifelhafte Analyse-Ergebnisse vorliegen, können bestimmte Sortierparameter vom System auch selbstlernend weiter optimiert werden. In diesem Fall sollte die Zellzahl bei der ersten Generierung der Tröpfchen niedriger gewählt werden. Sollte bei der Vorsortierung festgestellt werden, dass sich in einem Tröpfchen mehrere Zellen befinden und dass diese zu der gleichen Zielpopulation gehören, kann dieses Tröpfchen ohne weitere Analyse und Teilung dem Ziel-Sammelgefäß zugeführt werden.

Sollten Tröpfchen nach Teilungen zu klein werden für die vorgegebene Elektrodengröße, können diese Tröpfchen mit Tröpfchen ohne Zellen zusammengeführt werden. Wenn die Zellzahl/Tröpfchen in etwa auf Einzelzellniveau liegt, werden die Tröpfchen mit den ermittelten Zellen von Interesse in der Feinsortierstufe den Ziel-Sammelgefäßen zugeführt. Ebenso können Tröpfchen mit Zellen von Interesse direkt von der Feinsortierstufe, unter Umgehung der Sammelgefäße, zu speziellen Modulen navigiert werden.

Für besondere Anwendungen kann das System mit Zusatzmodulen erweitert werden, wie Warteschleifen, Färben, Waschen und Ausbleichen. Die Messung schwacher, spezifischer Fluoreszenz-Signale kann mittels Ausbleichung verbessert werden, indem das beständigere Autofluoreszenzsignal der Zellen ermittelt und von der anfangs ermittelten Summe aus Autofluoreszenz und spezifischer Fluoreszenz subtrahiert wird.

Weiterhin können Module verwendet werden, z.B. für Bildanalyse und darauf aufbauende manuelle Sortierentscheidungen, für Zellassays an Zellpopulationen, Einzelzellen oder Zellkomponenten, für Zeil-Fusionierung, für Polymerase- Kettenreaktion (PCR), für Genexpressions-Analyse (BioChip). Diese Module können sowohl bei den Vorsortierstufen als auch bei der Feinsortierung eingesetzt werden.

Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen, erfindungsgemäß zu verwendenden Bauteile unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, sowie aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Zeichnungen, in denen - beispielhaft - Ausführungsbeispiele von Sortiervorrichtungen dargestellt sind. Auch einzelne Merkmale der Ansprüche oder der Ausführungsformen können mit anderen Merkmalen anderer Ansprüche und Ausführungsformen kombiniert werden.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 die erste Stufe einer Sortiervorrichtung in schematischer Darstellung;

Fig. 2 eine weitere Ausführungsform einer Sortiervorrichtung;

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines DMF-Chips im Vertikalschnitt; Fig. 4 eine modulare Sortiervorrichtung;

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Gemäß dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 ist vorgesehen, zunächst Flüssigkeitströpfchen geeigneter Zusammensetzung aus Ziel- und Restpartikeln an Öffnungen oder Ports 3A bis 3D aus einem Behälter 2 herauszulösen, d.h. zu generieren. Jedes generierte Flüssigkeitströpfchen wird über ein DMF-Mikrochip 20 mittels Elektroden 22 in eine erste Analyseposition 3OA bewegt und dort auf das Vorhandensein mindestens eines Ziel- oder Restpartikels untersucht. Flüssigkeitströpfchen ohne Zielpartikel werden nachfolgend über eine Restpartikel- oder Tröpfchensenke 40 von dem Substrat entfernt. Flüssigkeitströpfchen mit mindestens einem Zielpartikel werden mittels des Substrats einer zweiten Behandlungsstufe zugeführt. Hier- zu kann ein Zwischenbehälter 4 vorgesehen sein

Zur Tröpfchenbewegungen ist vorzugsweise eine digitale mikrofluidische Tröpfchenbewegung (DMF) in der Weise vorgesehen, dass Potentiale zwischen Elektroden 22 einer Reihe (Tröpfchen-Bewegungspfad 22A) entlang einer Oberfläche des Substrates (Mikrochip 20, siehe Fig.2) oder in einer Schicht des Substrates (Tröpfchen-Bewegungs-Ebene 21 ) bewegen sollen, wobei der Antrieb der Tröpfchen unter anderem nach der Methode des Elektrowetting und/oder der Dielektrophorese erfolgen kann. Mittels an sich bekannter DMF-Schaltkreise ist dies möglich.

Nur die mit Zielpartikeln befrachteten Flüssigkeitströpfchen werden einer weiteren Behandlungsstufe zugeführt. Dabei können biologische sowie nicht biologische Objekte in einer Anzahl von 1 bis 10 ³ , ggf. auch darüber hinaus, in einem einzelnen Flüssigkeitströpfchen vorliegen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform werden die in einer Flüssigkeit suspendierten biologischen Objekte, wie z.B. gemischte Zellverbünde, in einem Vorratsbehältnis (Behälter 2) so in Bewegung gehalten oder aufbewahrt, dass sie nicht sedimentie- ren. Die voneinander beabstandeten Öffnungen oder Ports 3A ₁ ... sind in ihrer Größe und Form so gewählt ist, dass an diesen Stellen aus dem Vorrat einzelne Flüssigkeitströpfchen geeigneter Größe aus dem Gesamtvolumen abgezogen oder herausgelöst werden können. Dementsprechend ist der DMF-Mikrochip 20 mit seinen Kanälen oder Bahnen für den Tröpfchentransport (Tröpfchen-Bewegungspfade 22A) direkt an die jeweiligen Ports 3A ₁ ... des Vorratsbehältnisses angedockt.

In den Analysepositionen 3OA wird festgestellt, ob das jeweilige Flüssigkeitströpfchen mindestens ein Zielpartikel oder eine minimale Zielpartikelkonzentration ent- hält. Bejahendenfalls wird dieses Flüssigkeitströpfchen entlang eines der Tröpfchen-Bewegungspfades 22B auf dem Substrat in eine Weitergabeposition 50 an einem Pfadende 25 (Übergabepunkt) navigiert, an dem das Tröpfchen an eine weitere Behandlungsstufe abgegeben wird. Hierbei kann es sich um einen Zwischenbehälter 4 handeln. Tröpfchen, die keine oder zu wenige Zielpartikel enthalten, werden über andere Bewegungspfade 22C gelenkt als die Tröpfchen mit Zielpartikeln. An dem oder den Ende/n 24 dieses/dieser Pfade/s 22C für nicht interessierende Tröpfchen werden die Tröpfchen über mindestens eine Tröpfchensenke 40 an einen Tröpfchenauffangbehälter 41 übergeben.

Um Kollisionen von Ziel- und Restpartikeln zu vermeiden oder zumindest weitgehend auszuschließen, werden geeignete Sortieralgorithmen verwendet, die die E- lektroden 22 steuern.

Die Betriebsweise dieser beispielhaften Anordnung ist die, dass aus einem großen Reservoir (Behälter 2) markierte Zellen bzw. Mikropartikel zusammen mit nicht markierten Zellen bzw. Mikropartikeln in einer umgebenden Flüssigkeit abgeholt und auf beliebig vielen parallelen Wegstrecken zu den Analyseeinheiten (erste Analysepositionen 30A) gebracht werden, was durch einen elektrodynamischen Antrieb wie das Elektrowetting, geschieht. Hierzu sind entlang der vorgesehenen Tröpf- chen-Bewegungspfade 22A nacheinander Elektroden 22 auf einem nicht dargestellten DMF Mikrochip 20 angeordnet und so gesteuert, dass die Tröpfchen über ein wanderndes elektrisches Potential in die vorgegebene Richtung gezogen werden. Dieser Vorgang kann auf nach oben offenen Bahnen, aber auch entlang von Kanälen oder zwischen mit vertikalem Abstand von einander angeordneten Elektroden tragenden Flächen des DMF-Mikrochips geschehen. In dem in Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel sind Verzweigungen der Tröpfchenbewegungspfade 22A in Gestalt von Kreuzungen oder T-Verbindungen vorgesehen. Ein quer zu dem ersten Tröpfchenbewegungsfaden 22A verlaufender Bewegungspfad 22B schafft eine direkte Verbindung zu einem Zwischenbehälter 4 für interessierende Zellen, die an einer Tröpfchen-Weitergabeposition 50 am Pfadende 25 übergeben werden, während die dritten Tröpfchen-Verbindungspfade 22C eine Verbindung zu einem Tröpf- chen-Auffangbehälter 41 für nicht interessierende Zellen herstellen, die an Tröpfchensenken 40 an den Pfadenden 24 übergeben werden.

Die nach unten gerichteten Pfeile und Punkte deuten an, dass sich weitere Sortiermodule anschließen können. Die nach rechts weisenden Punkte nebst Pfeil deuten an, dass sich auf demselben Mikrochip weitere Ports und Tröpfchen- Bewegungspfade befinden können, oder sich weitere Sortiermodule dieser Stufe anschließen können, die ihre Zellen enthalten Tröpfchen aus demselben oder einem parallel geschaltetem Reservoir beziehen können, um die Parallelisierung und damit die Sortierleistung erhöhen.

Die Figur 2 zeigt beispielhaft eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung nach Figur 1 , welche alternativ verwendbar ist oder die in einem dem ersten Sortierschritt z.B. nach Figur 1 folgenden weiteren Sortierschritt - ggf. nach zwischengeschalteten Zwischensortiersch ritten - verwendet werden kann. Der Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel besteht darin, dass sich eine weitere Sortierstufe an das Pfadende 25 des Tröpfchenbewegungspfades 22B anschließen kann. Zu diesem Zweck ist an dem Pfadende eine weitere Analyseposition 3OB vorgesehen, die in dem dargestellten und insoweit bevorzugten Fall eine Differenzierung zwischen einer Mehrzahl interessierender Zellen vornehmen kann, die nachfolgend über Tröpfchen-Bewegungspfade 22D und 22E in Sammelbehälter Gr.1 - Gr.5 je nach Eigenschaft der Zelle oder deren Komponenten gesammelt werden. Auch diese Tröpfchenbewegungspfade und Analyseposition können auf dem strichpunktiert angedeutetem DMF Mikrochip vorgesehen sein.

Alternativ zu den Ausführungsformen nach Figur 1 und 2, kann auch der Tröpf- chenauffangbehälter 41 für nicht interessierende Objekte über einen Sammelpfad 22F (in Entsprechung des Sammelpfades 22B für interessierende Objekte) geführt werden. Dies ist beispielhaft als alternatives Detail zu Figur 1 dargestellt. Eine solche „BUS"-Leitung für gleichwertige Tröpfchen vermindert den Steuerungsaufwand.

Das Detektionsprinzip wird in Figur 3 beispielhaft verdeutlicht. Die mikrofluidische Tröpfchenbewegungspfade sind als Kanäle auf einem CMOS Chip (Siliziumsubstrat) eingebettet. Darin lassen sich die Elektroden unterbringen und elektrisch ansteuern. In dem dargestellten Beispiel sind Fotodetektoren auf Siliziumbasis mit einem strukturierten Farbfilter ebenfalls in dieser Schicht angebracht. Die Tröpfchen mit den Populationen an biologischen Objekten laufen zwischen Silizium und z.B. einem Glassubstrat als Deckel. Über den Glasdeckel kann dann das Anregungslicht mittels Glasfasern, etc. eingekoppelt werden. Die Elektroden lassen sich beispielsweise auch optisch transparent realisieren.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung nach Figur 4 wird die Behandlung einer Population von in Flüssigkeitströpfchen (F) suspendierten biologischen Objekten aus Ziel- und Restpartikeln stufenweise derart vorgenommen, dass Flüssigkeitströpfchen mit nicht interessierenden Populationen nach der Detektion bei 3OA auf direktem Wege und ohne Kreuzung mit Bewegungspfaden für interessie- rende Flüssigkeitströpfchen der Restpartikelsenke 40 zugeführt werden. Hierbei kann eine einzige Restpartikelsenke für mehrere Tröpfchenports 3 und entsprechend für mehrere Tröpfchen-Bewegungspfade 22A auf dem Mikrochip 2OA, 2OB, 2OC verwendet werden. Vorzugsweise auf demselben Mikrochip findet danach eine Teilung der interessierenden Flüssigkeitströpfchen bei 32A statt. Die Teiltröpfchen F ₁ , F ₂ werden nachfolgend einzeln bei 3OC analysiert und nachfolgend in einer weiteren Restpartikelsenke 40'; 50' gesammelt oder abgeführt, wenn sie nicht interessieren, der weiteren Behandlung zugeführt, wenn sie interessieren, also z.B. min- destens ein Zielpartikel enthalten. Die Tröpfchenteilung wird vorzugsweise auf demselben Mikrochip 2OA durchgeführt, auf dem sich auch die erste Restpartikelsenke 40, 50 befindet.

Der zweite Analyseschritt findet bei dem dargestellten und insofern bevorzugten Ausführungsbeispiel nach Fig. 4 auf veränderten Tröpfchen-Bewegungspfaden statt, nämlich solchen, bei denen die Elektroden 22' der geringeren Tröpfchengröße entsprechend kleiner sind. In dem Beispiel nach Fig. 4 sind die Flächen der Elektroden 22' des Mikrochips 2OB etwa % so groß wie die Flächen der Elektroden 22 des Mikrochips 2OA und etwa vier mal so groß wie die Flächen der Elektroden 22' des Mikrochips 2OC. Für die Weiterbehandlung wird ein weiteres Mikrochipmodul 2OB verwendet, dass die kleineren Elektroden 22' aufweist. Durch diese Verkleinerung der Elektrodengröße wird eine (überlagerte) Kaskadierung erreicht, in dem die Bewegungspfade von einem Modul zum nächsten jeweils etwa verdoppelt werden. Auf diese Weise kann eine Vereinzelung von Zielpartikeln schrittweise erfolgen.

Zudem können die Elektroden auch in gleicher Größe ausgeführt und zu kleineren und größeren Elektrodenflächen zusammengeschaltet werden. Die Form der resultierenden Flächen kann quadratisch, rechteckig oder auch rund sein. Auf diese Weise könnten die Elektrodenflächen auf dem Substrat an jeder Stelle an die jeweilige Tröpfchengrösse angepasst werden.

Wenn die Tröpfchengröße aufgrund mehrfacher Tröpfchenteilung so gering wird, dass der Tröpfchentransport und/oder die in den Tröpfchen enthaltenden Zielparti- kel unter der geringen Flüssigkeitsmenge leiden, können partikelfreie Flüssigkeitströpfchen FO mit einem partikelenthaltenden Flüssigkeitströpfchen F vereint werden.

Die Flüssigkeitströpfchen können, insbesondere auf den Mikrochip, gekühlt, er- wärmt oder begast werden, um optimale Bedingungen für die Zielpartikel zu schaffen. Weiter ist es möglich, Ziel- oder Restpartikel enthaltende Flüssigkeitströpfchen entlang einer „Warteschleife" zu bewegen oder sie in eine vorangehende Stufe zurück zuführen. Letzteres ist für die Feinsortierung auf Mikrochip 2OC für interessierende Tröpfchen mittels entsprechender Bewegungspfade 22G und 22H verwirklicht.

Die Architektur der DMF-Chips zur Behandlung der biologischen Objekte wird vorzugsweise modular ausgestaltet. Dies ermöglicht nicht nur einen hohen Grad an Parallelisierung der generierten Tröpfchen, sondern gestattet auch die Übergabe von Tröpfchen zwischen den Pfadenden benachbarter Module, so dass weitere Behandlungsschritte sich unmittelbar anschließen können. Einzelnen Modulen können unterschiedliche Aufgaben zugeordnet werden, etwa weil auf den vorangehenden Modulen gewisse Behandlungsschritte nicht oder nicht mehr Platz finden. Ebenso ist es möglich, Module zu verwenden, die dreidimensionale Bewegungspfade ermöglichen, so dass Flüssigkeitströpfchen in unterschiedlichen, insbesonde- re parallelen Ebenen behandelt und auch von einer Ebene in eine andere Ebene transportiert werden können.

BEZUGSZEICHENLISTE:

2 Behälter 3OA erste Analyseposition

3A, B, ... Ports 3OB zweite Analyseposition

Zwischenbehälter 3OC dritte Analyseposition

11 Tröpfchen-Quellen 32A Tröpfchen-Teilungsposition 0 DMF-Mikrochip 40 Tröpfchensenke OA DMF-Mikrochip 40' Tröpfchensenke OB DMF-Mikrochip 40" Tröpfchensenke OC DMF-Mikrochip 40'" Tröpfchensenke 1 Tröpfchen-Bewegungs-Ebene 41 Tröpfchen-Auffangbehälter 2 Elektroden 50 Tröpfchen-Weitergabeposition 2' Elektroden 50' Tröpfchen-Weitergabeposition 2" Elektroden 50" Tröpfchen-Weitergabeposition 2A Tröpfchen-Bewegungspfade 50'" Tröpfchen-Weitergabeposition 2B Tröpfchen-Bewegungspfade 60 Steuerungselektronik 2C Tröpfchen-Bewegungspfade 2D Tröpfchen-Bewegungspfade A Zielpartikel 2E Tröpfchen-Bewegungspfade B Restpartikel 2F Tröpfchen-Bewegungspfade F Flüssigkeitströfchen 2G Tröpfchen-Bewegungspfade F1 Teiltröpfchen 2H Tröpfchen-Bewegungspfade F2 Teiltröpfchen 3 erstes Pfadende FO partikelfreie Flüssigkeitströpf- 4 zweites Pfadende chen 5 drittes Pfadende