本发明属于生物技术、 干细胞、 肿瘤学领域， 涉及采用凝集素用于识别、 纯化干细胞的方法、 试剂盒 及其应用， 具体而言， 涉及采用特异识别糖蛋白和 /或糖脂糖链末端的凝集素结合物用于从啮齿� �物、人类 或其他哺乳动物来源的细胞群中识别、 纯化干细胞的方法、 试剂盒， 本发明所公开的方法、 试剂盒可有效 且精准的用于从所述细胞群中识别、 纯化成体干细胞、 肿瘤干细胞、 癌干细胞， 所述含干细胞的样品不带 任何外来标记。 本发明还涉及获得的干细胞及它们在诸如研究 或治疗中的广泛用途。

背景技术

"凝集素"这一术语最早在 1888年出现说， 人们发现其具有凝集红细胞的特性。 简单来说， 凝集素也 是一种蛋白质， 广泛从植物、 动物、 真菌、 细菌等中分离， 具有结合糖脂或糖肽末端特异性碳水化合物的 特性 ( Sharon N等， Science, 1972.177 (53 ) :949-59; Pusztai A, 植物凝集素， 1991. 剑桥： 剑桥大学出版社）， 且其唯一的特异性在于， 它们是一组结构上有区别的蛋白书质， 且可特异性结合细胞膜上的碳水化合物， 并 进一步通过细胞膜表面寡糖基之间的交联实现 对细胞的凝集 （Pusztai A, 植物凝集素， 1991. 剑桥： 剑桥大 学出版社； Sharon N, Trends Biochemistry Sci, 1993. 18(6):221-226)。

众所周知， 糖基化是在酶的作用下， 实现对蛋白质或脂质附加上糖类的过程。 此过程为共转移 (co-translational ) 与后转移修饰的步骤之一， 发生于内质网， 细胞表面蛋白发生糖基化的几率几乎超过 50%。 早在二十世纪的八十年代， 有研究者发现， 凝集素具有结合或杀死胚胎性的细胞癌和生殖 系肿瘤细 胞的能力，后来又发现，多潜能干细胞表面上 的抗原常常显示为糖蛋白或糖脂（Andrews PW等, Hybridoma, 1984.3(4):347-61； Pera MF等， Differentiation， 1988. 39(2): 139-49 ), 这提示蛋白质特异性糖基化可能是细胞 具有多潜能性的标志。

上述研究结果表明凝集素可能具有与多能性的 细胞相互作用的特征 （Draber P等， Somat Cell Mol Genet, 1984.10:435-443; Kosmehl H等， Neoplasma 1989.36:29-39)。 而且， 膜结合蛋白和对应配体的低聚糖 化修饰常常介导细胞外分子或信号启动的胞内 信号传导 （Haltiwanger RS. Curr Opin Struct Biol 2002.12(5):593-8; Xia L等， Blood, 2004.104(10):3091-6)。 人们发现， 在许多细胞相关的事件， 例如细胞分 化 (Moody AM 等， Cell, 2001. 107(4):501-12) 以及肿瘤 (Reis CA等， J Clin Pathol, 2010. 63(4):322-9 ) 发 生中， 均可观察到蛋白糖基化的动态变化。

在胚胎水平， 例如， 小鼠胚胎多个组织器官的上皮细胞膜上， 研究者发现其上有结合特异性凝集素的 位点 （Carter WG等， J. Biol. Chem, 1975. 250(7):2756-62； Noguchi M等， J. Embryol. Exp. Morphol, 1982. 72:39-52), 进一步观察发现， 不同类型的凝集素在识别胚胎不同组织上皮方 面具有差异性， 有趣的是， 当 用低剂量放射性射线照射小鼠胚胎后 （0.25、 0.50和 0.75Gy)， 细胞膜上结合 SBA、 PNA和 DBA三种凝 集素的表达量增加 （Nievergelt-Egido MC等， Radiat Environ Biophys, 1993. 32(2): 119-28 )， 而且在胚胎不同 区域， 三种凝集素的结合强度不同。 随后在胚胎期发育的胰腺上皮和管状细胞膜上 ， 其他研究者进一步发 现， 上述细胞膜上有可特异性结合凝集素的位点， 这表明识别细胞膜上特异性糖表位的凝集素可 能作为一 个指示细胞具有多能性的标志， 可用于表征胰腺前体细胞 （Kobayashi等， BBRC, 2002. 293(2):691-7)。 近 期研究发现， 路易斯寡糖 （Lewis X antigen) 在小鼠的胚胎干细胞、 多潜能细胞和胚胎癌性细胞的细胞膜 上均有表达， 而不在人类相应的胚胎干细胞、 内细胞团或胚胎癌性细胞上表达 （Muramatstu TA 等, Glycoconjugate Journal, 2004.21 :41-45)， 未来还需要进一步研究这一不一致性。

采用细胞生物学和生物化学方法， 来自多个研究者的实验研究发现， 人类胚胎干细胞与其蛋白的糖基 化密切相关（Xia L等， Blood, 2004. 104:3091-6； Satomaa T等， BMC Cell Biol, 2009. 10:42; Venable A等， BMC Dev Biol 2005; 5: 15 )。 细胞膜上的特异性糖原表位可作为一个新的、 特异性标志， 用于反映小鼠胚胎的早 期分化状态， 其表达早于目前所发现的胚胎特异性抗原， 如 SSEAl , CD9和 FA， 而且， 随着胚胎分化进程 的发展，其膜上特异性糖原表位的表达逐渐降 低并消失 (Nash Rodney等， 2006, stem cell.25(4):974-82) oWang 等采用培养的胚胎干细胞或诱导多能干细胞为 研究对象， 当用凝集素芯片分析细胞抽提物后发现， 特异性 的凝集素可用来识别和分离胚胎干细胞 （Wang YC等, Cell Research, 2011.1-13 )。。

在成体水平， 例如， 识别 D-半乳糖的刀豆凝集素（PNA)可用来对啮齿动物 的造血干细胞进行进一步 分群（Salner AL等， 1982, J Natl Cancer Inst. 6说8(4):639-41 ),甚至可用来从神经组织中识别和分离出 PNA阳 性的细胞群 （Rietze RL等， Nature, 2001. 412(6848):736-9)， 分选的细胞可能是干细胞。 最近的研究发现， CD133+的人造血干细胞和祖细胞的 N-糖基化模式与 N-glycan结构和基因表达密切相关 （Hemmoranta H 等， Exp Hematol, 2007.35(8): 1279-92)。 书

肿瘤 /癌与凝集素

肿瘤是机体细胞失去对其生长的正常调控而形 成的新生物， 是细胞自身调控和其所处的微环境相互作 用的结果， 其治疗仍是一个世界难题。 目前肿瘤研究领域的一个研究热点是癌干细胞 （Cancer Stem Cells, CSCs 早期由多伦多大学的分子生物学家 John Dick研究者提出 "癌干细胞"理论（John Dick等， Nature, 1994. 17： 645-648 )， 这一新理论表明， 癌症的发生及难于根治的在于其内癌干细胞 （CSCs ) 的存在， 随 后的多个癌症研究中的研究结果支持此理论（ Reya T等， Nature, 2001.414： 105-111 )， 源自其他组织的进 一步研究证实了癌干细胞是存在的， 它们在例如血液、 乳腺、 脑组织、 肺组织和肠组织中存在（Ai-Hajj M 等， PNAS, 2003.100:3938-3988 )； He等， Nat Genet, 2007.39: 189-198； Kim CF等， Cell, 2005.121 :823-835； Lapidot T 等， Nature , 1994.367:645-648； Ricci-Vitiani L 等， Nature , 2006； Singh SK 等， Nature , 2004.432:396-401； Yilmaz OH等， Nature, 2006.441 :475-482)。 "癌干细胞"的提出给肿瘤的治疗带来曙光， 因而， 如果能够识别癌干细胞将具有及其重要的临床 意义， 例如通过靶向癌干细胞从而治愈肿瘤等， 将产 生重大的应用价值和经济效益。 然而， 遗憾的是， 现在尚没有很有效的方法从肿瘤组织中识别、 分离出癌 干细胞，这也意味着在治疗中， 不可能准确而彻底地清除掉癌干细胞。这大大 阻碍了针对肿瘤的有效治疗。 研究发现， 肿瘤细胞表面和其所处的微环境中大量糖链修 饰改变以及凝集素受体功能异常在肿瘤发生发 展 和转移过程中发挥极其重要的作用。 其中， 糖链合成的调控以及糖链与凝集素的相互作用 参与了肿瘤生物 学行为的各个方面。 凝集素已广泛应用于肿瘤细胞表面糖连接物的 研究， 其在肿瘤的生物学行为研究、 诊 断、 治疗及其预后方面起着十分重要的作用。

成体干细胞：

成体干细胞是另外一种特殊干细胞群， 越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成 熟组织 （Moore KA, Science, 2006. 311 (5769)： 1880-1885 )， 而成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用 先决条件和最 关键条件之一是对干细胞的有效且精准筛选分 离。 当前， 研究者已鉴定到多个成体干细胞相关的分子表 面 标志， 例如 Thy-llow、 FLK2-Lineage-Sca-l+c-Kit+用于识别造血干细胞 （Hematopoietic stem cells, HSCs) (Christemsen JL等， PNAS, 2001.98: 14541-14546; Uchida N等， Experimental hematology, 1996.24： 649-659)， ISLl+、 Sca-1+或 c-kit+ (Laugwitz KL, 等， Nature. 2004. 433(7026):647-653; Okada S 等， Blood, 1991. 78(7): 1706-12; Matsuura K等， J Biol Chem, 2004. 279(12): 11384-91 )， a 6 brilOG7dim 用于识别表皮干细胞 (Li A等， PNAS, 1998. 95 (7)： 3902-7； Tani H等， PNAS, 2000.97 (20)： 10960-10965； Lavker RM等， PNAS, 2000.97 ( 25)： 13473-75 ), 虽然在成体干细胞特异分子标志方面取得了一 定进展， 但从成体中分离干细胞 仍是极具挑战性的任务， 一方面在于其数量较少且更难于定位、 筛选分离各种组织特异性干细胞， 另外一 方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进 行识别， 目前特异的细胞表面标记很难达到共识， 其有效性 需要进一步分析。

发明内容

本发明的目的在于公开一种识别、 纯化干细胞的方法、 试剂盒及其应用方法， 并进一步拓展其应用。 本发明人为实现上述目的， 进行了深入研说究， 结果本发明人惊喜的发现， 特异性的凝集素不仅可用于 识别啮齿动物、 人类或其他哺乳动物来源的正常组织或器官中 的特异性成体干细胞、 肿瘤干细胞、 癌干细 胞， 而且也可用于从来源于所述物种的细胞群中纯 化出所述干细胞。

本发明公开了一种采用凝集素用于识别、 纯化干细胞书的方法， 其包括：

( 1 ) 在使所述细胞群与细胞预处理试剂预先接触条 件下， 使样品接触一种凝集素， 后者含有： （a)至少 一种凝集素， 其可识别糖蛋白和 /或糖脂糖链末端特异位点， 该凝集素与 (b)至少一种结合物进行直 接或间接连接； 和

(2) 将与所述凝集素结合物结合的细胞群从所述样 品中分离， 获得富含干细胞的样品， 其中， 所述细 胞上存在与所述凝集素特异亲和性的受体表明 它们是干细胞。

其中， 可通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物 从所述细胞群上洗脱， 从而获得不含任何外来标 记的富含干细胞的样品。

其中， 细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或 裂解细胞群中的红细胞的试剂， 所述试剂可选择 为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、 明胶、 右旋糖酐、 聚乙烯吡咯烷酮、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉的任 一一种； 或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小 于 0.9%的生理盐水溶液的任一一种； 或选择泛影酸 钠-葡聚糖、 HITOPAQUE、 Ficoll 的任一一种进行细胞预处理， 其中， 所述试剂至少重复接触所述细胞群 一次。

其中， 所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化 学合成的植物凝集素、 动物凝集素或其衍生物的 一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为 0.001~40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于� �等于 120 分钟， 孵育温度为小于或等于 38°C。

其中， 所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧 光染料、 磁性微球或高分子量的生物大分子的任 一一种进行结合， 或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生 物或抗体片段的一种。

其中，所述与凝集素结合的高分子量的生物大 分子的分子量在一万道尔顿（Mw)至八十万道尔 顿 (Mw ) 之间， 其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血 清白蛋白、 羟乙基淀粉、 明胶、 甲基纤维素、 羧甲基 淀粉、 右旋糖酐、 聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。

其中， 所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、 人类或其他哺乳动物的成体组织、 肿瘤 /癌前组织、 肿 瘤 /癌性组织、 转移瘤 /癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种� �上组织的组合， 或选择来自所述组织 的原代、 传代细胞群的一种或两种以上的组合。

本发明还公开采用凝集素用于识别、 纯化干细胞的试剂盒及其应用方法， 其中， 所述凝集素还可用于 确定组织、 细胞群中干细胞存在与含量， 其在用于从所述细胞群中富集、 提纯干细胞的用途。

所述用于识别、 纯化干细胞的试剂盒， 其包括：

1 ) 细胞预处理试剂 A;

2) 识别、 纯化试剂 B ;

3 ) 以及任选的容器；

其中， 所述细胞预处理试剂 A可选择为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、 明胶、 右旋糖酐、 聚乙烯 吡咯烷酮、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉的任一说一种； 或可选择为氯化铵红细胞裂解液、 质量浓度小于 0.9% 的生理盐水溶液的任一一种； 所述细胞预处理试剂或可选择泛影酸钠-葡聚� �、 HITOPAQUE、 Ficoll 的任 一一种， 其中， 所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

书

其中， 识别、 纯化试剂 B为凝集素结合物， 包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素 、 动物凝集 素或其衍生物的一种或两种以上的组合， 其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先 与荧光染料、 磁性 微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行 结合， 或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生 物或抗 体片段的一种， 所述凝集素的浓度为 0.001~40mg/ml， 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 120分钟， 孵育温度为小于或等于 38°C。

其中， 所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、 人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变 、 肿瘤、 癌 前、 癌性、 癌转移组织， 或来自所述组织的原代、 传代细胞群的一种或两种以上的组合。

其中， 随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定 和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择 沉 淀法分离结合凝集素的所述细胞群， 进一步， 分离的所述干细胞， 其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受 体。

其中， 根据本发明方法、 试剂盒获得的纯化的干细胞， 可进一步通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素 结合物从所述细胞上洗脱， 从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。

其中， 所述识别、 纯化的干细胞包括全能干细胞、 多能干细胞、 专能干细胞、 成体干细胞、 肿瘤干细 胞、 癌干细胞， 进一步， 其与已知干细胞标志物接触。

其中， 本发明所述试剂盒还包括洗脱糖， 用于把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱， 从而使得所述 获得含干细胞的样品不带任何外来标记。

其中， 所述获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。 其中， 根据本发明所述的试剂盒应用方法， 其应用方法包括以下步骤：

( 1 ) 所述细胞样本与细胞预处理试剂 A接触： 如加入红细胞沉淀剂， 选择取上清； 如加入红细胞 裂解液， 选择离心后丢弃上清取细胞沉淀；

(2) 使经过步骤 （1 ) 的所述细胞群与所述识别、 纯化试剂 B 接触， 所述凝集素的浓度为 0.001~40mg/ml, 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 120分钟， 孵育温度为小于或等于 38°C；

( 3 ) 分离获得凝集素阳性的细胞群： 可选择采用荧光活化细胞分选、 磁珠分选法或静置沉淀法； (4) 加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤 （3 ) 获得的所述细胞上洗脱， 从而使得获得的干 细胞不带任何外来标记物， 进一步， 获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲 液以调整干细胞的浓度和体积。

所述分离的干细胞用于， 例如生物化学、 分子生物学或标志物水平的进一步分析， 进一步， 所述细胞 可以是同一表型或不同表型的集合， 其中所述识别的干细胞包含至少 1个， 所述纯化的干细胞包含至少为 \%, 优选包含至少 50%， 更优选包含至少 70%， 更优选包含至少 80%， 最优选包含至少 90%。

进一步， 所述分离的干细胞其细胞表面有可与凝集素结 合物中的凝集素结合的受体， 进一步所述细胞 与已知干细胞标志物接触， 例如 Sca-1、 Alb, c-Kit、 CD90、 Nkx2.5分子。

进一步， 根据本发明所述的方法， 可用于制备用于诊断样品中干细胞存在和 /或含量的诊断剂应用。

说

其中， 本发明所述试剂盒识别、 纯化的干细胞为成体干细胞、 肿瘤干细胞、 癌干细胞， 所述识别的干 细胞包含至少 1个， 纯化的干细胞的纯度至少为 1%。 本发明所述成体干细胞， 优选出生后的组织获得的 干细胞。 在诸如人类的哺乳动物中， 优选的， 从至少 1岁书大的个体中获得的成体干细胞， 优选发育期后的 个体， 例如成年。 在本发明的优选实施方案中， 所述干细胞是成体干细胞、 肿瘤干细胞和 /或癌干细胞。

其中， 检测或分离干细胞的方法包括采用荧光活化细 胞分选法 （FACS ) 用于鉴定和纯化结合凝集素 结合物的细胞。

其中， 根据本发明所述方法、 试剂盒获得的分离的干细胞， 进一步， 分离的干细胞， 其包含细胞膜上 的可与凝集素结合的受体。

据此， 本发明通过上述方法、 试剂盒实现从所述啮齿动物、 人类或其他哺乳动物来源的样品中识别、 纯化干细胞， 并进一步获得不带任何外来标记的含所述干细 胞的样品， 本发明所述分离的干细胞群在基础 与应用研究、 组织工程、 治疗、 修复受损或病变组织、 药物筛选等中的应用。

本发明所述试剂盒具有普遍适用性， 可用于准确且快速识别、 纯化啮齿动物、 人类或其他哺乳动物来 源的干细胞。 进一步， 所述试剂盒具有使用简捷、 可工业化生产、 特异性强、 实用有效， 应用前景广泛的 优点。

附图说明

图 1 识别、 纯化肺干细胞的结果图， 具体如实施例 1。 A图表示同型对照组的流式图 （n=2) ; B图表示分 离、 纯化肺干细胞的流式图， 从细胞群中所纯化的凝集素阳性活细胞数量约 为 4.5% (n=2) _; C图表示所述 肺干细胞的纯度。

图 2骨髓、 脐带血中识别、 纯化干细胞结果图， 具体如实施例 2。

A图表示采用 PE标记的蜗牛凝集素 （PE-HA) 从骨髓细胞群中识别、 纯化干细胞的结果， 阳性细胞 数量为 2.6% (n=2)， B图表示细胞纯度为 95.7% ; C图表示采用 PE标记的荆豆凝集素（PE-UEA)从脐带 血细胞群中识别、 纯化干细胞的结果， 阳性细胞数量为 3.5% (n=2)， D图表示细胞纯度为 96.8%。 图 3 识别、纯化肝癌干细胞的结果图，具体如实施 例 3。 A图表示同型对照组，对照组细胞数量为 0.13% (n=2) _; B图表示采用 TRITC标记的凝集素 SJ (T-SJ)作为分子标记从肝癌组织中提纯干细胞的 结果， 凝 集素阳性细胞数量为 5.6% (n=2) _; C图表示新分离的 T-SJ阳性肝癌干细胞群， 星号指 CD90+ (绿色） 细 胞， 其中细胞核用 DAPI染色， 图片的放大倍数为 100倍。

图 4采用本发明试剂盒从细胞群中识别、纯化肝� �细胞和肺干细胞的结果图， 具体如实施例 4。 A-C图表 示肝干细胞的纯化及显微镜观察结果， 其中， A图表示同型对照组， 对照组细胞数量为 0.05% (n=2) _; B 图表示采用明胶结合的凝集素 PT从肝脏细胞群中纯化干细胞并用 FITC-PT进行流式鉴定分析的结果， 凝 集素阳性细胞数量为 2.6% (n=2) ; C 图表示新分离的细胞群， 短箭头指 F-PT+/Alb+肝干细胞， 星号指 F-PT+/Alb-肝干细胞。 A'-C'图表示肺干细胞的纯化及显微镜观察结果� �� 其中， A'图表示同型对照组， 对照 组细胞数量为 0.19% ( n=2 ) _; B'图表示采用明胶结合的凝集素 RC 从肺脏细胞群中纯化干细胞并用 TRITC-RC进行流式鉴定分析的结果， 凝集素阳性细胞数量为 4.3% (n=2) _; C'图表示新分离的细胞群， 箭 头指 T-RC+ (红色） /c-Kit+ (绿色） 肺干细胞。 细胞核用 DAPI染色， 图片的放大倍数为 100倍。

图 5采用本发明试剂盒从细胞群中识别、纯化心� �细胞的结果图，具体如实施例 5。 A图表示同型对照组， 对照组细胞数量为 0.1% (n=2) _; B图表示采用 FITC标记的凝集素 SJ (F-SJ )作为分子标记从心脏细胞群 中纯化干细胞的结果， 凝集素阳性细胞数量为说 4.9% (n=2) _; C图表示新分离的 F-SJ阳性的细胞群， 其中 细胞核用 DAPI染色， 短箭头指 F-SJ阳性心脏干细胞， 长箭头指 F-SJ +/Nkx2.5+心脏干细胞， 图片的放大 倍数为 100倍。

书

具体实施方式

以下结合具体实施例以详细说明本发明的优点 ， 本领域的技术人员应当理解， 本发明的实施例目的是 为了清楚的说明本发明的优点， 并不是用于限制本发明， 任何基于本发明的修饰、 替换、 改变均落在本发 明的精神范畴和保护范围之内。

如本发明所述， 除非上下文另有明确指示， 否则没有限定对象的含义。

如本领域技术人员所理解的， 本发明文中"一种"指"至少一种"。 术语"包含"、 "包括"、 "含有"、 "选择" 是同义词， 是具有包容性的或者开放性的， 并且不排除额外的未详述的成员、 要素或方法步骤。 如本发明 所述， 术语"细胞群 "是指一个或一个以上的细胞的组合， 通常是指一组细胞， 除非另有说明， 否则该术语 是指由本发明所述分离的细胞组成或包含此处 分离的细胞的细胞群体。

如本发明所述， 术语 "组织"包括从啮齿动物、 人类或其他哺乳动物获得的正常组织或器官标 本、 肿 瘤 /癌前组织、 肿瘤 /癌组织、 转移瘤 /癌组织。 所述细胞群源自啮齿动物、 人类或其他哺乳动物正常组织或 器官标本、 肿瘤 /癌前组织、 肿瘤 /癌组织、 转移瘤 /癌组织， 源自上述物种中所制备的原代细胞群、 所述细 胞群的传代细胞或所建立的细胞系中获得， 其可由具有共同表型的细胞组成或包含至少部 分具有共同表型 的细胞组成， 当细胞在一个或多个显著特征上基本相似或一 致时， 可以认为细胞具有共同表型， 其特征包 括但不限于形态外观， 某细胞成分或产物 （RNA、 蛋白质或其它物质） 的表达的有无或水平、 某生化途径 的活力、 增殖能力和或动力学行为、 分化潜能和或对分化信号的响应或体外培养行 为。 因此这种显著特征 可以定为一个细胞群或其部分。

如本发明所述， 术语"干细胞 "是指能够长期自我更新 （即不分化而能够增殖） 的祖细胞， 处于静息或 增殖， 其中干细胞的后代或至少其一部分基本保持了 亲代干细胞未特化的或者相对较少特化的表型 、 分化 潜能、 以及增殖能力。 该术语包括能够基本上无限自我更新的干细胞 ， SP : 和亲代相比， 后代或其部分进 一步增殖的能力没有显著降低， 以及表现出有限的自我更新的干细胞， SP : 和母细胞相比， 后代或其部分 进一步增殖的能力显著降低。 基于其产生细胞的类型， 所述干细胞或祖细胞可以是多能的、 全能的、 专能 的、 或单能的一种或以上的组合。 术语"含干细胞的细胞群"在本发明中指含有至� ��一种干细胞或祖细胞， 或者包含部分祖细胞或干细胞的细胞群。 通常， 所述部分的干细胞或祖细胞可以具有共同表型 ， 也可具有 不同表型。

如本文所用的， 本发明文中术语"啮齿动物"指大鼠、 小鼠等； "哺乳动物"指人类、 牛、 马、 狗、 兔、 猴等。 如本文所用的， 术语"离体"包括离开动物或人类的组织或细胞� ��在体外保存或增殖， 例如保存在培 养容器中。术语"活检"包括采用本领域普遍了� ��的方法从动物或人类组织或器官中获得组织� ��本文中的"正 常组织或器官标本"指健康的、 未转化的、 非恶性、 非癌性或非致瘤的组织或器官标本。 任何病理学家、 本领域的技术人员能够确定组织是否是健康的 、 未转化的、 非恶性、 非癌性或非致瘤的。

本发明源于本发明人的深入研究， 本发明人惊喜的发现特异凝集素可用于从啮齿 动物、 人类或其他哺 乳动物正常组织或器官标本、 肿瘤 /癌前组织、 肿瘤 /癌组织、 转移瘤 /癌组织中识别、 纯化出成体干细胞、 说

肿瘤干细胞或癌干细胞， 进一步可用于从来源于上述组织的原代细胞群 、 传代细胞群、 建立的细胞系中识 别、 纯化出所述干细胞。

本发明的目的在于公开一种采用特异凝集素结 合物用书于识别、 纯化干细胞的方法， 其中包括， 采用特 定凝集素结合物用于从啮齿动物、人类或其他 哺乳动物来源的样品中识别、纯化成体干细胞 、肿瘤干细胞、 癌干细胞的方法， 其中， 所述样品源自啮齿动物、 人类或其他哺乳动物的离体、 活检或通过常规手段获得 的任意一种或两种以上组织中制备的原代细胞 群、 传代细胞群、 细胞系。

本发明的另一目的在于公开一种从含干细胞的 细胞群中识别和纯化干细胞的试剂盒及其应用 方法， 其 中， 所述细胞群源自啮齿动物、 人类或其他哺乳动物的任意一种或两种以上组 织中制备的原代细胞群、 传 代细胞群或建立的细胞系。

进一步， 所述试剂盒具有使用简捷、 特异性强、 实用有效、 可工业化生产、 应用前景广泛的优点。 本发明公开了一种采用凝集素用于识别、 纯化干细胞的方法， 其包括：

( 1 ) 在使所述细胞群与细胞预处理试剂预先接触条 件下， 使样品接触一种凝集素， 后者含有： （a)至少 一种凝集素， 其可识别糖蛋白和 /或糖脂糖链末端特异位点， 该凝集素与 (b)至少一种结合物进行直 接或间接连接； 和

(2) 将与所述凝集素结合物结合的细胞群从所述样 品中分离， 获得富含干细胞的样品， 其中， 所述细 胞上存在与所述凝集素特异亲和性的受体表明 它们是干细胞。

其中， 可通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物 从所述细胞群上洗脱， 从而获得不含任何外来标 记的富含干细胞的样品。

其中， 细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或 裂解细胞群中的红细胞的试剂， 所述试剂可选择 为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、 明胶、 右旋糖酐、 聚乙烯吡咯烷酮、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉的任 一一种； 或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小 于 0.9%的生理盐水溶液的任一一种； 或可选择泛影 酸钠-葡聚糖、 HITOPAQUE、 Ficoll 的任一一种进行细胞预处理， 其中， 所述试剂至少重复接触所述细胞 群一次。

其中， 所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化 学合成的植物凝集素、 动物凝集素或其衍生物的 一种或两种以上的组合， 所述凝集素的浓度为 0.001~40mg/ml， 进一步， 所述凝集素的浓度至少为 0.001mg/ml, 至少为 0.5mg/ml， 至少为 3mg/ml， 至少为 6mg/ml， 至少为 12mg/ml， 至少为 20mg/ml， 至 少为 25mg/ml， 至少为 30mg/ml， 不超过 40mg/ml。 其中， 所述凝集素结合物与所述细胞群接触的时间为 小于或等于 120分钟， 进一步， 接触时间至少为 l min、 至少为 10 min、 至少为 20 min、 至少为 30 min、 至少为 40min、 至少为 lhrs、 至少为 2hrs。

其中， 所述凝集素结合物与细胞群的孵育温度为小于 或等于 38°C。 进一步， 至少为 2°C、 至少为 8°C、 至少为 12°C、 至少为 16°C、 至少为 20°C、 至少为 24°C、 至少为 28°C、 至少为 32°C、 不超过 38°C。

其中， 所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧 光染料、 磁性微球或高分子量的生物大分子的任 一一种进行结合， 或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生 物或抗体片段的一种。

其中，所述与凝集素结合的高分子量的生物大 分子的分子量在一万道尔顿（Mw)至八十万道尔 顿（Mw) 之间， 其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血 清白蛋白、 羟乙基淀粉、 明胶、 甲基纤维素、 羧甲基 淀粉、 右旋糖酐、 聚乙烯吡咯烷酮的任一一种说。

其中， 所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、 人类或其他哺乳动物的成体组织、 肿瘤 /癌前组织、 肿 瘤 /癌性组织、 转移瘤 /癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种� �上组织的组合， 或选择来自所述组织 书

的原代、 传代细胞群的一种或两种以上的组合。

本发明还公开采用凝集素用于识别、 纯化干细胞的试剂盒及其应用方法， 其中， 所述凝集素还可用于 确定组织、 细胞群中干细胞存在与含量， 其在用于从所述细胞群中富集、 提纯干细胞的用途。

所述用于识别、 纯化干细胞的试剂盒， 其包括：

1 ) 细胞预处理试剂 A;

2) 识别、 纯化试剂 B;

3 ) 以及任选的容器；

其中， 所述细胞预处理试剂 A可选择为质量浓度为 0.1~20%的羟乙基淀粉、 明胶、 右旋糖酐、 聚乙烯 吡咯烷酮、 甲基纤维素、 羧甲基淀粉的任一一种； 或可选择为氯化铵红细胞裂解液、 质量浓度小于 0.9% 的生理盐水溶液的任一一种； 所述细胞预处理试剂或可选择为泛影酸钠-葡� �糖、 HITOPAQUE、 Ficoll 的 任一一种， 其中， 所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

其中， 识别、 纯化试剂 B为凝集素结合物， 包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素 、 动物凝集 素或其衍生物的一种或两种以上的组合， 其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先 与荧光染料、 磁性 微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行 结合， 或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生 物或抗 体片段的一种， 所述凝集素的浓度为 0.001~40mg/ml， 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 120分钟， 孵育温度为小于或等于 38°C。

其中， 所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、 人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变 、 肿瘤、 癌 前、 癌性、 癌转移组织， 或来自所述组织的原代、 传代细胞群的一种或两种以上的组合。

其中， 随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定 和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择 沉 淀法分离结合凝集素的所述细胞群， 进一步， 分离的所述干细胞， 其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受 体。

其中， 根据本发明方法获得的纯化的干细胞， 可进一步通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素 结合物从 所述细胞上洗脱， 从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。 其中， 本发明所述试剂盒还包括洗脱糖， 用于把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱， 从而使得所述 获得含干细胞的样品不带任何外来标记。

其中， 所述识别、 纯化的干细胞包括全能干细胞、 多能干细胞、 专能干细胞、 成体干细胞、 肿瘤干细 胞、 癌干细胞， 进一步， 其与已知干细胞标志物接触。

其中， 所述获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。 其中， 根据本发明所述的试剂盒应用方法， 其应用方法包括以下步骤：

( 1 ) 所述细胞样本与细胞预处理试剂 A接触： 如加入红细胞沉淀剂， 选择取上清； 如加入红细胞 裂解液， 选择离心后丢弃上清取细胞沉淀；

说

(2) 使经过步骤 （1 ) 的所述细胞群与所述识别、 纯化试剂 B 接触， 所述凝集素的浓度为 0.001~40mg/ml, 与所述细胞群接触的时间为小于或等于 120分钟， 孵育温度为小于或等于 38°C；

(3 ) 分离获得凝集素阳性的细胞群： 可选择采用书荧光活化细胞分选、 磁珠分选法或静置沉淀法；

(4) 加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤 （3 ) 获得的所述细胞上洗脱， 从而使得获得的干 细胞不带任何外来标记物， 进一步， 获得的干细胞还可加入生理盐水、 PBS缓冲液、 HBSS缓冲 液以调整干细胞的浓度和体积。

其中， 本发明所述识别、 纯化的干细胞为成体干细胞、 肿瘤干细胞、 癌干细胞， 进一步， 所述分离干 细胞其细胞表面有可与凝集素结合物中的凝集 素结合的受体， 进一步与已知干细胞标志物接触， 例如 Sca-K Alb、 c-Kit、 CD90、 Nkx2.5分子。

其中， 本发明还包括采用所述凝集素用于确定样品中 干细胞存在与含量。

其中， 本发明所述结合凝集素的结合物也可选择与允 许放射性成像、 正电子发射断层扫描、 核磁共振 成像或 X射线或计算机断层扫描的物质结合。

其中， 凝集素阳性细胞群的提纯（纯化）可采用流式 细胞仪（与荧光素结合的凝集素）、 磁珠筛选（包 被了凝集素的磁珠）、 吸附柱或其它已知的提纯手段获得， 例如， 免疫亲和提纯， 结合化合物与固体支持 物结合， 再比如， 淘选， 结合化合物与组织培养皿结合。

进一步， 如果用荧光素标记凝集素， 利用流式细胞仪的方法从细胞群中纯化目标细 胞是优选的， 更优 选荧光激活细胞分类仪 （FACS ) 分离所述细胞， 通过使用该装置， 可以自动分离、 回收目标细胞。

进一步， 根据本发明的方法、 试剂盒所识别的干细胞包含至少 1个， 进一步， 根据本发明的方法、 试 剂盒所提纯干细胞的纯度至少 99%、 至少 95%、 至少 90%、 至少 85%、 至少 80%、 至少 75%、 至少 70%、 至少 65%、 至少 60%、 至少 55%、 至少 50%、 至少 45%、 至少 40%、 至少 35%、 至少 30%、 至少 25%、 至少 20%、 至少 15%、 至少 10%、 至少 5%或至少 1%。

应当理解， 许多凝集素都是本领域已知的信息。 术语"凝集素 "是指共有结合糖脂或糖蛋白特异性的碳 水化合物基团特性的蛋白质组。 所述凝集素可以从天然来源纯化凝集素， 例如从植物、 动物、 真菌、 藻类 和细菌， 或者选择修饰的凝集素或其衍生物 （天然的或合成的）， 或者通过化学合成它。 凝集素衍生物包 括多 -亚单位凝集素中的一个或多个亚单位。在一� �优选的实施方案中， 凝集素可选择植物凝集素， 凝集素 可以商业上从许多商业供应商那里获得， 例如 Sigma公司。

进一步， 所述结合凝集素的结合物也可选择与允许放射 性成像、 正电子发射断层扫描、 核磁共振成像 或 X射线或计算机断层扫描的物质结合。 本发明还涉及凝集素结合物在用于从所述细胞 群中识别、 纯化干细胞的用途。

本发明的试剂盒的瓶中的凝集素组合物可以是 药学上可接受的溶液的形式， 例如与无菌盐水、 PBS缓 冲液或其它药学上可接受的无菌液体组合。 或者， 可以冻干或干燥的凝集素组合物， 在此类情况下， 试剂 盒还任选的包含装在容器中的药学上可接受的 溶液， 例如生理盐水、 PBS缓冲液等， 优选无菌的， 以溶解 所述冻干或干燥凝集素组合物。

本发明所述的样品包括， 例如能够通过将组织或器官标本机械剪切、 或破碎成更小的组织块从而从实 体器官中获得单细胞悬液。 任选的， 能够通过诸如化学制剂例如 EDTA和或通过使用， 胶原酶、 分散酶、 胰蛋白酶或胰酶制剂的消化特性将获得的组织 小块进一步分散为单个的细胞。 骨髓和或（脐带）血液、 尿 液、 脑脊液可被视为天然细胞悬液。

说

其中， 根据本发明所述的方法、 试剂盒可获得的分离的结合凝集素结合物的干 细胞， 当需要从凝集素 结合物分离干细胞时， 能够通过本领域技术人员所知道的多种方法来 进行分离， 例如， 通过加入洗脱糖， 或通过改变 _P H值或盐浓度来进行所述干细胞与凝集素� �书合物的分离。 本领域的技术人员应当理解， 所述 分离的干细胞及其子代也属于本发明的精神范 畴和保护范围。 分离的干细胞， 其包含细胞膜上的可与凝集 素结合的受体。 基于本发明所述的分离的干细胞， 可对其进行基因修饰， 例如， 使所述干细胞与核酸接触 以修饰基因组序列， 然后分离其中基因组序列已被修饰的干细胞， 之后应用于治疗等应用。 进一步， 任何 对基于本发明所获得的干细胞的修饰、 应用， 例如通过任何本发明所述的方法获得的干细胞 或干细胞的组 合物在制备用于治疗受损或患病组织的药物中 的用途， 这均属于本发明的精神范畴和保护范围。

进一步， 采用本发明所述识别纯化方法、 试剂盒所获得的干细胞群在基础与应用研究、 组织工程、 治 疗、 修复受损或病变组织、 药物筛选等中的应用。

实施例

实施例 1、 肺干细胞的识别及其纯化

材料： DAPI、 双花扁豆凝集素 DBA购自 Sigma, 胶原酶（Sigma)、 胎牛血清、 DMEM/F-12K培养基、 血球计数板、 氯化铵 （I X )。 洗涤缓冲液： PBS (pH值为 7.4±0.1 ) ； 封闭缓冲液： 在洗涤缓冲液 （PBS ) 中加入 3% BSA _; 抗原修复液： 柠檬酸缓冲液； 透膜缓冲液： TBS (0.1%Triton+PBS 其中， 凝集素的结 合物选择为 FITC标记。

a) 新鲜活检肺组织放入无菌培养皿中， 用 PBS缓冲液清洗 3次， 每次 3~5min， 随后， 用无菌眼科剪 剪切组织为小碎块，转入盛有胶原酶 /胰蛋白酶消化液的 50ml离心管中，在 37°C， lOOrpm消化 45mi _n ~60min， 随后加入 4°C预冷的含 10% 胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS)的 DMEM/F12K培养基终止反应，再用一次 性注射器将经消化的组织块吹打成单细胞悬液 ， 之后， 在 4°C， 以 200g 离心 3~5min， 弃上清后加入 4°C 预冷的含 2%FBS的 PBS， 轻轻混匀， 经 180目筛网过滤入另一个 50ml离心管中， 加入 NH ₄ C1裂解液后 混匀， 室温放置 3~5min， 在 4°C， 以 200g离心 3~5min， 弃上清后加入 1ml 4°C预冷含 2<¾FBS的 PBS混 匀， 用血球计数仪计数细胞数量， 细胞被等分为两份， 一份加入 F-DBA, 其中凝集素的浓度为 5mg/ml， 一份加入等体积过量的同型对照（图 l.A)，两份细胞均在 37°C避光孵育 30~60min， 之后， 在 4°C， 以 200g 离心 3~5min后， 丢弃上清， 加入 4°C预冷的含 2<¾FBS的 PBS重悬细胞， 流式细胞仪分选 F-DBA+细胞群 (图 l.B )， 纯化的干细胞纯度为 94% (图 l.C)。 在分析前， 添加碘化丙碇 （PI) 来排除分析中的死细胞。

结果： 采用本发明的方法能够识别肺组织中的干细胞 并进一步可对其进行纯化（图 1 )， 可进一步加入 N- 安 麵 F遞凝集 ¾ 鍾職鍾 麵， 从靈 籠可垂示 細隨口¾， # 进一步， 加入生理盐水调节所述样品中干细胞的浓度和 体积。

实施例 2、 骨髓、 脐带血干细胞的识别及其纯化

分别制备骨髓、 脐带血。

材料： 同实施例 1， 其中右旋糖酐（Sigma)、 HP、 UEA购自 Vector, 凝集素的结合物为牛血清白蛋白 方法：

a) : 加入 6~15%质量浓度的右旋糖酐于骨髓细胞悬液中， 接触细胞的时间为 30min从而沉淀红细胞， 随后吸取上清在 4°C， 以 230g 离心 3~5min， 弃上清后加入 4°C预冷的含 2<¾FBS的 PBS， 轻轻混匀， 经 200目筛网过滤入另一个离心管中用血球计数仪 计数细胞数量， 胎盘蓝染色细胞存活率 98%， 随加入 BSA 说

结合的凝集素 HP, 其中， 凝集素的浓度为 1.2 mg/ml， 在 35°C条件下接触 60min后， 吸取下层细胞沉淀， 分选的细胞群可进一步用洗脱糖 N-乙酰半乳糖胺把凝集素结合物从细胞膜上洗� ��下来， 在 4°C， 以 230g 离心 2~3min， 弃上清后加入 4°C预冷含 1<¾FBS的 PBS混匀。 随后， 在 4°C， 以 230g 离心 3~5min后， 丢 书

弃上清， 加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS重悬细胞， 从而获得不含任何外来标记的细胞群， 进一步可加 入 PBS缓冲液调节干细胞的浓度和体积。采用流式 细胞仪鉴定分析所述细胞群的数量及纯度， 结果表明阳 性细胞的百分比为 2.6% (图 2.A)， 识别纯化的干细胞纯度为 95.7 <¾ (图 2.B )。 在分析前， 添加碘化丙碇

(PD 来排除分析中的死细胞。

b)加入 6~15%质量浓度的右旋糖酐于脐带血细胞悬液中� �� 接触细胞的时间为 40min从而沉淀红细胞， 随后吸取上清在 4°C， 以 220g 离心 3~5min， 弃上清后加入 4°C预冷的含 2<¾FBS的 PBS， 轻轻混匀， 经 160目筛网过滤入另一个离心管中用血球计数仪 计数细胞数量， 胎盘蓝染色细胞存活率 98%， 离心丢弃上 清后加入 BSA结合的凝集素 UEA, 其中， 凝集素的浓度为 2.1mg/ml， 在 37°C条件下接触 45min后， 吸取 下层细胞沉淀，识别、纯化的细胞群可进一步 用洗脱糖海藻糖把凝集素结合物从细胞膜上洗 脱下来，在 4°C， 以 220g离心 2~3min， 弃上清后加入 4°C预冷含 1<¾FBS的 PBS混匀。 随后， 在 4°C， 以 220g 离心 3~5min 后， 丢弃上清， 加入 4°C预冷的含 1%FBS的 PBS重悬细胞， 从而获得不含任何外来标记的细胞群， 进一 步可加入生理盐水调节干细胞的浓度和体积。 采用流式细胞仪鉴定分析阳性细胞群的数量， 结果表明阳性 细胞数量为 3.5% (图 2.C)， 识别、 纯化的干细胞纯度为 96.8% (图 2.D)。 在分析前， 添加碘化丙碇 （PI) 来排除分析中的死细胞。

结果： 采用本发明所述方法能够从骨髓、 脐带血中识别、 纯化出干细胞 （图 2)。

实施例 3、 肝癌组织中肝癌干细胞的识别及其纯化

组织制备： 制备了来自成体动物的肝癌组织， 组织经 PBS缓冲液清洗， 清洗 3次， 每次 3~5min。 材料： 同实施例 1， 其中 TRITC标记的 SJ凝集素 （T-SJ) 购自 Sigma。

方法：

a) 无菌条件下获得新鲜肝癌组织转入无菌培养皿 中后， 用无菌眼科剪剪切组织为小碎块， 再转入盛有 胶原酶 /胰蛋白酶 /分散酶消化液的 50ml离心管中， 在 37°C， lOOrpm消化 45min~60min后， 加入 4°C预冷 的含 10% 胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS)的 DMEM/F12K培养基终止反应，再用一次性注射器将 经消化 的组织块吹打成单细胞悬液， 之后， 在 4°C， 以 180g 离心 3~5min， 弃上清后加入 4°C预冷的含 2<¾FBS的 PBS, 轻轻混匀， 经 200目筛网过滤入另一个 50ml离心管中， 加入 0.2%氯化钠裂解红细胞， 作用时间为 30second~l min,再加入 1.6%氯化钠恢复溶液至等渗，之后在 4°C，以 180g离心 3~5min，弃上清后加入 4°C 预冷含 2%FBS的 PBS混匀， 用血球计数仪计数细胞数量， 细胞被等分为两份， 一份加入 T-SJ, 凝集素浓 度为 0.03mg/ml， 一份加入等体积过量的同型对照， 两份细胞均在 4°C条件下避光孵育 lOOmin, 之后， 在 4°C， 以 180g离心 3~5min后， 丢弃上清， 加入 4°C预冷的含 2<¾FBS的 PBS重悬细胞， 流式细胞仪分选 T-SJ+细胞群， 纯化的干细胞纯度为 85%。 在分析前， 添加碘化丙碇 （PI) 来排除分析中的死细胞。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 30~40mim， 室温放置 40min~60min后， 再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、 室温冷却 （ 30min~60min )后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育， 孵育时间为 20~40min， 之 后加入 BSA封闭 （室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后， 用抗 CD90抗体与固定细胞进 行孵育， 4°C过夜孵育， 再用 PBS洗去未结合抗体， 之后加入 FITC-二抗及 DAPI, 室温孵育 30min~120min 后， 再用 PBS洗去未结合抗体及 DAPI, 室温干燥后封片。 激光共聚焦显微镜检测， 检测到阳性细胞的数 量为一个以上。 说

结果： 采用本发明的方法能够从肝癌组织中识别干细 胞并进一步可对其进行纯化 （图 3 )。

实施例 4、 识别、 纯化肝干细胞和肺干细胞的试剂盒及其应用方 法

所述试剂盒包括： 书

1 ) 细胞预处理试剂 A: 氯化铵 （I X ) ;

2 ) 识别、 纯化试剂 B： 明胶结合的 PT和 RC凝集素；

3 ) 容器： 用于盛放 1 )、 2) 两种溶液的圆形试剂瓶；

所述试剂盒还包括洗脱糖 N-乙酰葡糖胺、 半乳糖试剂。

其他实验材料： 同实施例 1。

应用方法：

a) 加入等体积的 N C1裂解液 (溶液 A)与细胞群混匀，室温放置 2~3min，在 4°C，以 200g离心 3~5min， 弃上清后加入 1ml 4°C预冷含 2%FBS的 PBS重悬细胞沉淀， 之后用血球计数仪计数细胞数量， 细胞被等 分为两份， 一份加入明胶结合的凝集素， 其中凝集素的浓度为 4.8mg/ml， 在 37°C条件下静置 30~45min， 之后， 取下层细胞沉淀， 识别、 纯化的细胞群可进一步用 N-乙酰葡糖胺、 半乳糖两种洗脱糖把凝集素结合 物从细胞膜上洗脱下来， 在 4°C， 以 220g离心 2~3min， 弃上清后加入 4°C预冷含 1<¾FBS的 PBS混匀。 随 后， 在 4°C， 以 220g 离心 3~5min后， 丢弃上清， 加入 4°C预冷的含 1<¾FBS的 PBS重悬细胞， 从而获得 不含任何外来标记的细胞群， 进一步可加入生理盐水调节干细胞的浓度和体 积。 采用流式细胞仪鉴定分析 阳性细胞群的数量， 结果表明阳性细胞数量分别为 2.6% (图 4.B )、 4.3% (图 4.B ' )， 纯化的肝干细胞和 肺干细胞纯度分别为 80%、 89% 在分析前， 添加碘化丙碇 （PI) 来排除分析中的死细胞。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 15~30mim， 室温放置 30min~60min后， 再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、 室温冷却 （ 30min~60min )后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育， 孵育时间为 20~40min， 之 后加入 BSA封闭 （室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后， 用抗 -Alb抗体、 抗 -c-Kit抗体 分别与固定含肝干细胞、 肺干细胞的载玻片进行孵育， 4°C孵育过夜后， 再用 PBS洗去未结合抗体， 含肝 干细胞的载玻片加入对应的凝集素、 TRITC-二抗及 DAPI， 含肺干细胞的载玻片加入对应的凝集素、 FITC- 二抗及 DAPI, 均在室温孵育 30min~120min后， 再用 PBS洗去未结合抗体及 DAPI, 室温干燥后封片。 激 光共聚焦显微镜检测， 检测到阳性细胞的数量为一个以上。

结果： 采用本发明试剂盒能够从混合细胞群中识别肝 干细胞和肺干细胞并进一步可对其进行纯化 （图 4λ 实施例 5、 识别、 纯化心脏干细胞的试剂盒及其应用方法

所述试剂盒包括：

1 ) 细胞预处理试剂 A: 0.2%氯化钠；

2) 识别、 纯化试剂 B: FITC-SJ凝集素；

3 ) 容器： 用于盛放 1 )、 2) 两种溶液的方形试剂瓶；

所述试剂盒还包括洗脱糖 N-乙酰葡糖胺试剂。

其他实验材料： 同实施例 1。

应用方法：

a) 加入 0.2%氯化钠 （溶液 A) 与细胞群说混匀， 室温放置 30second~lmin后加入 1.6%氯化钠恢复溶液 至等渗， 在 4°C， 以 200g离心 3~5min， 弃上清后加入 lml 4°C预冷含 2<¾FBS的 PBS重悬细胞沉淀， 之后 用血球计数仪计数细胞数量， 细胞被等分为两份， 一份加入凝集素， 其中， 凝集素的浓度为 7.6mg/ml， 一 份加入等体积的过量同型对照， 两份细胞在 16°C条件下均书避光孵育 45~60 min， 之后， 在 4°C， 以 200g 离 心 3~5 min后， 丢弃上清， 加入 4°C预冷的 PBS重悬细胞， 流式细胞仪分选凝集素阳性细胞群， 纯化的干 细胞纯度为 89%。 在分析前， 添加碘化丙碇 （PI) 来排除分析中的死细胞。 收集所述干细胞进一步加入洗 脱糖 N-乙酰葡糖胺把所述凝集素结合物从所述细胞� ��中洗脱，从而获得不带任何外来标记的细胞� ��品，其 中， 可进一步加入生理盐水以调节样品的体积和浓 度。

b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞 15~30mim， 室温放置 30min~60min后， 再依次经抗原修复（55°C~75°C， 30min~80min)、 室温冷却 （ 30min~60min )后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育， 孵育时间为 30~60min， 之 后 BSA封闭 （室温， 30min~60min)， PBS洗去剩余未结合 BSA之后， 用抗 Nkx2.5抗体与固定细胞进行 孵育， 4°C孵育过夜， 再用 PBS洗去未结合的抗体， 再加入 TRITC-二抗及 DAPI室温孵育 60min~120min 后， 再用 PBS洗去未结合抗体及 DAPI, 室温干燥后封片。 激光共聚焦显微镜检测， 检测到阳性细胞的数 量为一个以上。

结果： 采用本发明所述试剂盒能够从混合细胞群中识 别心脏干细胞并进一步可对其进行纯化 （图 5 )。 工业实用性

如上所述， 依照本发明的方法、 试剂盒， 可以用一种简单、 快速且经济的方法， 一方面准确且有 效地识别出成体干细胞， 另一方面可以高回收率地纯化成体干细胞， 而由此得到的含细胞液体无需随后繁 琐的细胞悬液制备过程， 可直接进行深低温保藏， 且所述含干细胞的样品可不带任何外来标记， 以便其用 于基础研究和医疗应用相关的产业， 如干细胞自我更新机理及相关技术研究、 干细胞用于治疗、 修复受损 或病变组织、 干细胞移植技术领域、 免疫治疗领域以及药物筛选等。