MÉTODO PARA AVALIAR HIDRATAÇÃO BIOATIVA DE UM INGREDIENTE OU MISTURA DE INGREDIENTES, COMPOSIÇÕES COSMÉTICAS PARA A MODULAÇÃO DE GENES RESPONSÁVEIS PELA HIDRATAÇÃO BIOATIVA DA PELE E MÉTODO PARA A MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES RESPONSÁVEIS PELA HIDRATAÇÃO BIOATIVA DA PELE CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção trata de um método para caracteriza- ção de hidratação bioativa (ou ativa ou dinâmica ou biológica) a partir do emprego de técnicas para avaliação de expressão gênica e proteica que permite identificar novos ingredientes ou combinação de ingredientes eficientes no estímulo dos cinco mecanismos endógenos da pele associados à dita hidratação.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A epiderme, camada mais externa da pele, está sempre se renovando e sua última camada, que faz contato com o meio exterior é chamada de estrato córneo. O EC compreende o estágio final de diferenciação celular epidérmica e é representado especificamente por células queratinizadas mortas e anucleadas embebidas em uma matriz lipídica atuando como uma barreira que separa o meio externo da ho- meostase interna.

[003] A barreira natural formada pelo EC depende criticamente de sua composição, representada por proteínas (75-80%), lipídeos (5- 15%) e demais constituintes (5-10%). A composição lipídica do EC humano pode variar quantitativamente entre indivíduos e partes do corpo, mas compreende principalmente ceramidas, ácidos graxos, colesterol, ésteres, triglicerídeos e fosfolipídios. Quando esses componentes não estão balanceados adequadamente, a capacidade da pele manter a água é reduzida e a pele torna-se mais suscetível à influên- cia dos fatores ambientais, ocasionando uma barreira prejudicada.

[004] Um papel importantíssimo na manutenção da integridade da barreira do EC é representado pela água. Um dos principais aspectos relaciona-se à sua capacidade de mediar a atividade de muitas en- zimas hidrolíticas da pele, incluindo aquelas responsáveis pela descamação adequada dos corneócitos, bem como as responsáveis pela formação do fator natural de hidratação (NMF - Natural Moisturizing Factor). Como um produto proteolítico das profilagrinas - molécula- chave na manutenção da barreira epidérmica -, o NMF é essencial- mente composto por aminoácidos e derivados, PCA (ácido pirrolidona carboxílico), minerais, ureia, açúcares e peptídeos. Esta mistura altamente higroscópica ajuda a manter a hidratação e, consequentemente, a função do EC.

[005] A epiderme também é responsável pela regeneração da pele. A cada 28 dias uma célula caminha desde a junção dermo- epidérmica até o estrato córneo, desprendendo-se então como uma célula morta no processo de descamação. Quando a pele se encontra desidratada, esta reconstituição e troca ficam alteradas dificultando a regeneração cutânea natural.

[006] Quando houver alterações na superfície do estrato córneo (por exemplo, por queimadura, escoriações ou rompimento) ou perda excessiva de lipídeos ou hidratantes naturais, a pele torna-se seca, áspera, sem elasticidade ou flexibilidade. O sol, os poluentes, a umi- dade relativa do ar também são fatores que interferem na hidratação da pele.

[007] Outra molécula importante para a hidratação da pele é o ácido hialurônico presente na derme e em espaços intercelulares epi- dermais. Essa molécula consegue se ligar até mil vezes o seu peso com moléculas de água. Na derme, juntamente com outras moléculas da matriz extracelular, é responsável por reter a água e manter a hi- dratação adequada do tecido.

[008] Além disso, canais proteicos de membrana chamados aquaporinas são responsáveis por facilitar o transporte de água e solutos, incluindo glicerol e ureia, entre as membranas biológicas. Essa condução da água ocorre através de um gradiente osmótico.

[009] É recomendável que as pessoas adultas usem hidratante em toda a pele pelo menos uma vez por dia. Esses produtos, em geral, incluem ingredientes que agem tipicamente por dois mecanismos bem conhecidos: oclusão e umectação.

[0010] A hidratação por oclusão é promovida por ingredientes que formam um filme lipofílico, que dificulta a perda de água, fazendo aumentar a retenção hídrica na camada córnea.

[001 1] A hidratação por umectação, por sua vez, é promovida por ingredientes que retêm água proveniente da composição cosmética, da atmosfera e da pele, na superfície da pele por meio de um filme hi- drofílico formado sobre a camada córnea, aumentando a retenção de água na superfície cutânea.

[0012] No entanto, em evolução aos mecanismos clássicos citados anteriormente, outros mecanismos de hidratação, chamados no estado da técnica de hidratação ativa, já têm sido propostos. Em geral, refe- rem-se ao uso de ingredientes que têm a capacidade de estimular a pele a produzir suas próprias substâncias de hidratação, ou seja, moléculas que são capazes de reter água em todas as camadas da pele.

[0013] Atualmente, a comprovação das propriedades hidratantes de preparações cosméticas para a pele é feita pelo emprego de métodos não invasivos utilizando instrumentos baseados em propriedades elétricas, tais como condutância e capacitância, bem como técnicas espectroscópicas, tais como NIR (near-infrared spectroscopy). No entanto, existem problemas associados à confiabilidade das medições de propriedades elétricas da pele (capacitância é a propriedade mais utili- zada para avaliação da hidratação da pele) quando esta recebe tratamentos com altas concentrações de ingredientes oclusivos, apoiares e não higroscópicos. Falsos negativos em medições do estado hídrico da pele podem ser observados dependendo da composição química da formulação em estudo. Por esse motivo em alguns casos recomen- da-se a combinação de várias técnicas instrumentais e até mesmo avaliações visuais com auxílio de escalas fotográficas para se demonstrar os benefícios de preparações cosméticas para a pele.

[0014] O ressecamento é uma das condições mais presentes e crónicas da pele, resultando em "rigidez" da pele e danos à pele na forma de fissuras e rachaduras. Dessa forma, a avaliação de propriedades mecânicas da pele (utilizando modelos mecânicos) pode ser útil para entender como danos à pele seca ocorrem (por exemplo, rachaduras).

[0015] Assim, o estado da técnica ainda necessita de novas técnicas que permitam identificar produtos hidratantes, por meios mais precisos e confiáveis.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0016] A presente invenção trata de um método para caracteriza- ção de hidratação bioativa a partir do emprego de técnicas para avaliação de expressão gênica e proteica que permite identificar novos ingredientes ou combinação de ingredientes eficientes no estímulo dos cinco mecanismos endógenos da pele associados com a dita hidratação.

[0017] De acordo com a presente invenção, por "hidratação bioativa", aqui também nomeada de hidratação biológica ou hidratação biodinâmica ou hidratação ativa, entende-se a capacidade de uma combinação balanceada de ingredientes de estimular mecanismos endógenos da pele a promoverem o equilíbrio entre o conteúdo hídrico e lipídico para uma hidratação e nutrição eficientes. [0018] Os mecanismos endógenos que determinam a hidratação bioativa de acordo com a presente invenção são simultaneamente:

[0019] (1 ) estímulo a moléculas que retêm água nas camadas mais profundas da pele (derme) como ácido hialurônico e outros com- ponentes da matriz extracelular;

[0020] (2) estímulo a moléculas que retêm água na superfície da pele como fatores de hidratação naturais, conhecidos como NMF, do inglês "Natural Moisturizing Factor" (sais minerais);

[0021] (3) estímulo à produção e metabolismo de lipídios na super- fície da pele;

[0022] (4) estímulo da remoção adequada e balanceada das células mortas da superfície da pele (descamação);

[0023] (5) estímulo a moléculas que transportam água e sais minerais para manter o balanço osmótico da pele (como por exemplo, aquaporinas).

[0024] O efeito nos cinco mecanismos endógenos acima é aferido por meio de técnicas para avaliação de expressão gênica e proteica, que são técnicas altamente precisas e seus resultados independem de fatores externos como ocorre em técnicas usualmente empregadas.

[0025] Assim, o método para caracterização de hidratação bioativa de acordo com a presente invenção consiste em avaliar a expressão de um ingrediente ou combinação de ingredientes (complexos) em um conjunto de genes associados aos cinco mecanismos endógenos da pele que promovem o equilíbrio entre o conteúdo hídrico e lipídico para uma hidratação e nutrição eficientes, que caracterizam a hidratação bioativa.

[0026] A depositante, surpreendentemente, identificou que um conjunto de genes específicos está diretamente associado aos cinco mecanismos endógenos que caracterizam uma hidratação bioativa conforme identificados na tabela 1 a seguir. Tabela 1. Coniunto de genes associados à hidratação bioativa

Símbolo Gene

18s Rna RNA, 18S ribosomal [reference gene]

ACACA Acetyl-CoA carboxylase 1

ACACB Acetyl-CoA carboxylase beta

AQP10 Aquaporin-10

AQP1 Aquaporin-1

AQP3 Aquaporin-3

AQP5 Aquaporin-5

ASAH1 Acid ceramidase

BGN Biglycan

CASP14 Caspase-14

CD44 CD44 molecule (Indian blood group)

CDH1 Cadherin-1

CDSN Corneodesmosin

CLDN1 Claudin-1

CLDN4 Claudin-4

CLDN7 Claudin-7

COL1A1 Collagen, type I, alpha 1

COL1A2 Collagen, type I, alpha 2

COL4A4 Collagen, type IV, alpha 4

COL7A1 Collagen, type VII, alpha 1

CRNN Cornulin

CST6 Cystatin 6

CTSB Cathepsin B

CTSD Cathepsin D

CTSE Cathepsin E

CTSL Cathepsin L

CTSV Cathepsin V

DCN Decorin

DSC1 Desmocollin 1

DSC2 Desmocollin 2

DSG1 Desmoglein 1 Símbolo Gene

DSG3 Desmoglein 3

DSG4 Desmoglein-4

DSP Desmoplakin

ELN Elastin

ELOVL3 ELOVL fatty acid elongase 3

EVPL Envoplakin

FASN Fatty acid synthase

FLG Filaggrin

FMOD Fibromodulin

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [reference gene]

GBA Glucosylceramidase beta

GJA1 Gap junction protein, alpha 1

GJB2 Gap junction protein, beta 2

GPC3 Glypican 3

HAL Histidine ammonia-lyase

GUSB Glucuronidase, beta [reference gene]

HAS1 Hyaluronan synthase 1

HAS2 Hyaluronan synthase 2

HAS3 Hyaluronan synthase 3

HMGCR 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase

HMGCS1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1

HMMR Hyaluronan mediated motility receptor

HYAL1 Hyaluronidase 1

HYAL2 Hyaluronidase 2

HPRT Hypoxanthine phosphoribosyltransferase [reference gene]

ITGA6 Integrin alpha-6

ITGB4 Integrin beta-4

IVL Involucrin

KLF4 Krueppel-like factor 4

KLK5 Kallikrein 5 Símbolo Gene

KLK7 Kallikrein 7

KRT1 Keratin 1

KRT10 Keratin 10

LAMA5 Laminin subunit alpha-5

LCE2B Late cornified envelope protein 2B

LOR Loricrin

LOX Lysyl oxidase

LUM Lumican

MATN2 Matrilin 2

MMP1 Matrix metallopeptidase 1

MMP12 Matrix metallopeptidase 12

MMP9 Matrix metallopeptidase 9

OCLN Occludin

PADI1 Peptidyl arginine deiminase, type I

PADI3 Protein-arginine deiminase type 3

PCNA Proliferating cell nuclear antigen

PKP1 Plakophilin 1

PLEC Plectin-1

PPL Periplakin

SDC1 Syndecan 1

SMPD1 Sphingomyelin phosphodiesterase/Acid sphingomyeli- nase

SOD2 Superoxide dismutase 2, mitochondrial

SPINK5 Serine peptidase inhibitor, Kazal type 5

SPTLC2 Serine palmitoyltransferase, long chain base subunit 2

SREBF2 Sterol regulatory element-binding protein 2

ST14 Suppression of tumorigenicity protein 14

TGM1 Transglutaminase-1

TGM3 Transglutaminase-3

TGM5 Transglutaminase-5

TIMP1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1

TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2 Símbolo Gene

TJP1 Tight junction protein 1

UGCG Ceramide glucosyltransferase

VCAN Versican

VCL Vinculin

[0027] Em realização particular, o conjunto de genes associados a cada mecanismo endógeno de acordo com a presente invenção é:

[0028] 1. Estímulo a moléculas que retêm água nas camadas mais profundas da pele (ácido hialuronico e outros componentes da matriz extracelular): BGN, CD44, COL1A1 , COL1A2, COL4A4, DCN, ELN, FMOD, GPC3, HAS1 , HAS2, HAS3, HMMR, HYAL1 , HYAL2, LOX, LUM, MATN2, MMP12, MMP1 , MMP9, SDC1 , TIMP1 , TIMP2, VCAN;

[0029] 2. Estímulo a moléculas que retêm água na superfície (processamento da filagrina e síntese de NMF): CASP14, FLG, HAL, PA- DM , PADI3, ST14, TGM1 , TGM3, TGM5;

[0030] 3. Estímulo à produção de moléculas lipídicas na superfície da pele: ACACA, ACACB, ASAH1 , ELOVL3, FASN, GBA, HMGCR, HMGCS1 , SMPD1 , SPTLC2, SREBF2, UGCG;

[0031] 4. Estímulo da remoção adequada e balanceada das célu- las mortas da superfície da pele (descamação): CRNN, CST6, CTSB, CTSD, CTSE, CTSL, CTSV, DSC1 , DSG1 , DSG3, KLF4, KLK5, KLK7, SPINK5; e

[0032] 5. Estímulo a moléculas que transportam água e sais minerais para manter o balanço osmótico da pele: AQP10, AQP1 , AQP3, AQP5, CLDN1 , CLDN4, CLDN7, GJA1 , GJB2, TJP1.

[0033] Em outra realização, a presente invenção também contempla, de maneira abrangente, composições cosméticas para a modulação de genes responsáveis pela hidratação bioativa da pele, seja do corpo ou do rosto, que compreende pelo menos um ingrediente ou combinação de ingredientes que atuam de forma simultânea nos cinco mecanismos endógenos de acordo com a presente invenção e pelo menos um veículo cosmeticamente aceitável.

[0034] Os excipientes cosmeticamente aceitáveis de acordo com a presente invenção são aqueles conhecidos do técnico no assunto para composição de bases cosméticas em variadas formas, por exemplo, emulsões, cremes, géis, séruns, e outros conhecidos do técnico no assunto. Por exemplo, sem qualquer limitação, os excipientes cosmeticamente aceitáveis podem ser selecionados dentre aqueles citados no "International Cosmetic Ingredient Dictionary & Handbook", 16th Edition.

[0035] Os exemplos a seguir, sem impor qualquer limitação, as realizações particulares da presente invenção, bem como demonstram a eficácia do complexo de acordo com a presente invenção em hidratação bioativa.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Exemplo 2. Análise da eficácia em hidratação bioativa de um ingrediente potencial

[0036] Foi utilizada análise de expressão gênica e proteica para verificar a modulação dos genes envolvidos no estímulo dos mecanismos endógenos da pele, que promovem o equilíbrio entre o conteúdo hídrico e lipídico para uma hidratação e nutrição eficientes, ou seja, hidratação bioativa.

[0037] Foi realizado um estudo de expressão gênica em larga escala, seguido da confirmação da expressão proteica para comprovação do benefício.

[0038] A amostra foi testada em explantes de pele humana obtidos após cirurgias plásticas (blefaroplastia) e avaliada eficácia na modulação de um total de 92 genes relacionados a mecanismos biológicos determinados como relevantes para a hidratação da pele, bem como para alguns benefícios adicionais como integridade da barreira cutâ- nea, antioxidante, adesão e coesão entre as células, renovação celular e anti-aging (elasticidade, firmeza, preenchimento e coesão dermo- epiderme).

[0039] Neste experimento, os fragmentos de pele provenientes de 3 doadores diferentes foram divididos em duas porções e inseridos, em triplicata de cada doador, imediatamente em meio de cultura. Os explantes foram submetidos ao tratamento com 2mg/cm ² da amostra aplicada topicamente, sem qualquer diluição, e mantidos por 24 horas (porção 1 ) e 72 horas (porção 2) em atmosfera úmida a 37°C em presença de 5% de CO2. Além disso, uma condição de controle foi reali- zada pela manutenção dos explantes, em triplicata de cada doador, em meio de cultura somente. Uma análise de viabilidade prévia foi realizada para garantir a integridade dos tecidos durante todo o protocolo do estudo.

[0040] A porção (1 ) foi coletada e submetida à extração de RNA total. A partir do RNA, foi confeccionado o cDNA e este (50ng) foi submetido à etapa de RT-PCR ("Polymerase-Chain Reaction") em tempo real para avaliação da expressão de 96 genes. O perfil de expressão gênica e seleção dos genes diferencialmente expressos foram realizados com o auxílio do Expression Suite Software v.1.0.3 (Life Technologies). Os valores de ACt para os genes de referência e os genes alvo foram calculados pela subtração dos valores dos grupos experimentais. Posteriormente, o ACt do grupo experimental foi subtraído do grupo de controle (explante de pele sem tratamento) para a obtenção do AACt. Por fim, a quantificação relativa dos genes alvo foi determinada pela equação: RQ = 2 ^A -AACt. Foram selecionados apenas os genes que apresentaram um threshold de 1 ,3, ou seja, 30% de aumento ou redução em relação ao controle. A significância estatística foi avaliada pelo teste-t acompanhado do método de Benjamini- Hochberg (FDR - false discovery rate), sendo que p-value < 0,05 foi considerado significante. [0041] Para a detecção por imunofluorescência, as amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% (pH 7,4) por 24 horas e criopro- tegidas em solução de sacarose a 30% por 48 horas. Em seguida, cortes seriados de 10 m foram coletados diretamente em lâminas silani- zadas com o auxílio de Criostato (Leica - CN1850). Ao término da Coleta dos cortes, os mesmos foram submetidos a lavagens com PB a 0,1 M e incubados overnight com anticorpos referentes aos marcadores de interesse selecionados. Em seguida, as lâminas foram analisadas em Microscópio de Fluorescência (Leica - DM 1000) com auxílio do Software LAS (Leica Application Suite). O parâmetro avaliado foi intensidade de fluorescência emitida pela marcação com anticorpo específico. Para análise estatística foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Em todos os grupos estudados, foram considerados estatisticamente significativos aqueles cujos valores de P foram inferiores a 0,05.

[0042] Para a detecção por Elisa, foram utilizados kits disponíveis comercialmente (R&D Systems, USA). O anticorpo monoclonal de captura contra o marcador de interesse foi adicionado em uma placa de 96 poços que, em seguida, foi incubada por 12 horas à temperatura ambiente. As amostras foram adicionadas e a placa foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. O anticorpo de detecção contra o marcador de interesse foi então incubado por mais 2 horas (TA). Adicio- nou-se uma solução de estreptavidina-peroxidase e incubou-se por 1 hora (TA). Finalmente, a solução de substrato (H2O2 e TMB - tetrame- tilbenzidina) foi adicionada à placa e uma coloração azul se desenvolveu dentro de um período de 20 minutos. A reação de coloração foi interrompida adicionando-se H2SO4 a 2N e a leitura foi realizada em leitor de microplacas a 450nm. Os níveis da proteína foram expressos em pg/mL ou g/mL e calculados a partir dos valores de referência ob- tidos com uma curva padrão construída com concentrações conheci- das da proteína. Para análise estatística foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Em todos os grupos estudados, foram considerados estatisticamente significativos aqueles cujos valores de P foram inferiores a 0,05.

[0043] Os genes que tiveram sua expressão avaliada pelo estudo foram: ACACA, ACACB, AQP10, AQP1 , AQP3, AQP5, ASAM , BGN, CASP14, CD44, CDH1 , CDSN, CLDN1 , CLDN4, CLDN7, COL1A1 , COL1A2, COL4A4, COL7A1 , CRNN, CST6, CTSB, CTSD, CTSE, CTSL, CTSV, DCN, DSC1 , DSC2, DSG1 , DSG3, DSG4, DSP, ELN, ELOVL3, EVPL, FASN, FLG, FMOD, GBA, GJA1 , GJB2, GPC3, HAL, HAS1 , HAS2, HAS3, HMGCR, HMGCS1 , HMMR, HYAL1 , HYAL2, ITGA6, ITGB4, IVL, KLF4, KLK5, KLK7, KRT1 , KRT10, LAMA5, LCE2B, LOR, LOX, LUM, MATN2, MMP1 , MMP12, MMP9, OCLN, PADI1 , PADI3, PCNA, PKP1 , PLEC, PPL, SDC1 , SMPD1 , SOD2, SPINK5, SPTLC2, SREBF2, ST14, TGM1 , TGM3, TGM5, TIMP1 , TIMP2, TJP1 , UGCG, VCAN, VCL.

[0044] A figura 1 mostra os resultados de expressão gênica obtidos a partir de um potencial ingrediente ativo em comparação a outros ingredientes de mercado.

[0045] Como pode ser observado, apenas um ingrediente foi capaz de atuar de forma simultânea nos cinco mecanismos endógenos que determinam a ocorrência de hidratação bioativa.

[0046] O homem da técnica saberá prontamente avaliar, por meio dos ensinamentos contidos no texto e nos exemplos apresentados, vantagens da invenção e propor variações e alternativas equivalentes de realização, sem fugir do escopo da invenção, conforme definido nas reivindicações anexas