以下、本発明についてより詳細に説明す� ��。

[シアン化合物高分解活性菌]
 本発明の土壌浄化方法で使用されるアース� ��バクター(Arthrobacter)属に属する微生物とし� �は、例えば、土壌中からフェリシアン化カ� �ウムを唯一の炭素源およびエネルギー源と� �る培地を用いて分離されたアースロバクタ� �・エスピー(Arthrobacter sp.)No.5菌株が挙げられ る。

 アースロバクター・エスピー(Arthrobacter s p.)No.5菌株の形態観察および生理的性状は、� �下の通りである。

 形態:多形性桿菌、
 グラム染色性:陽性、
 胞子:形成せず、
 運動性:なし、
 酸素に対する態度:好気性、
 オキシダーゼ:陰性、
 カタラーゼ:陽性、
 OF(Oxidation Fermentation)テスト:試験用培地に生 育せず、
 集落の色調:特徴的集落色素を生成せず。

 また、本菌株の同定は、ポリメラーゼ連鎖� ��応(PCR;Polymerase Chain Reaction)法により増幅し� ��16SrRNA領域のDNAについて、ABI PRISM 310 Genetic  Analyzer[Applied Biosystems]を用いて塩基配列を� �析し、得られた配列を国際塩基配列データ� �ース(DDBJ/EMBL/GenBank )に登録されている配列� �よびMicroSeq Analysis Software [Applied Biosystems]� �データベースと比較し、さらに、近縁種と� �系統樹をMicroSeq Analysis Software を用いて近� �結合法(NJ法)により作成して行った。
 その結果、本菌株は塩基配列の不一致率が0 .88%でアースロバクター・オキシダンス(Arthrob acter oxydans)およびアースロバクター・ポリク ロマジェンス(Arthrobacter polychromogenes)に最近� �であると確認された。

 本菌株はアースロバクター・エスピー(Arthro bacter sp.)No.5菌株と命名し、2007年10月18日付で 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄 託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番 地1 中央第6(郵便番号305-8566))に受託番号:FERM� �P-21400号として国内寄託され、その後、2008年 9月16日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに「受領番号:FERM ABP-1 1019」で国際寄託された。

[微生物の培養]
 本発明で使用する微生物の培養は公知の方� ��であれば特に限定はない。
 微生物を培養するための培地(培養培地)の� �素源としては、例えばグルコースやシュー� �ロース、フルクトース、廃糖蜜等の糖類等� �、単独、あるいはこれらの組み合わせによ� �、通常0.1w/v%~30w/v%、望ましくは1w/v%~10w/v%程度 の濃度で用いることができる。

 培養培地の窒素源としては、例えばペプ� ��ン、肉エキス、酵母エキス、アンモニア、� ��酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン� ��アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナ� ��リウム、硝酸カリウムまたは尿素等を単独� ��あるいはこれらの組み合わせにより、通常0 .1w/v%~30w/v%、望ましくは1w/v%~10w/v%程度の濃度� �用いることができる。

 さらに必要に応じて、リン酸1水素カリウ ム、リン酸2水素カリウム等のリン酸塩、硫� �マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウ� �、塩化マンガンなどの金属塩、ビタミン類� �アミノ酸、核酸等の供給源として、例えば� �オチン、チアミン等を菌の生育改善のため� �添加できる。

 培養は、通常通気撹拌または好気的条件下� ��20℃~40℃、好ましくは25℃~35℃の温度で行う ことができる。またpHは5~10、好ましくは7~8の 範囲がよく、酸またはアルカリを添加するこ とにより容易に調整することができる。
 培養工程に用いる槽は、培養中の菌体と培� ��培地成分を通気しながら分散混合できる機� ��を有する発酵槽であればよく、特に限定は� ��い。

[シアン化合物含有土壌とシアン定量]
 本発明で浄化の対象となる土壌はシアン化� ��物を含有するものであり、例えば鉄シアノ� ��体、銅シアノ錯体、ニッケルシアノ錯体、� ��アン化カリウム、シアン化ナトリウムなど� ��無機シアン化物や、ニトリル基を含む有機� ��アン化合物などが挙げられる。

 シアノ錯体を含有する場合、土中に元来存� ��する鉄などの金属により難溶出性の沈殿を� ��成し、土中での形態は可溶性と難溶出性の� ��アン化合物が混在することなる。
 本発明では難溶出性部分まで含めたシアン� ��合物の浄化を行うため、土壌中のシアン定� ��は、日本国における土壌汚染対策法(土対法 )公定法である土壌溶出全シアン濃度(すなわ� ��、溶出全CN。平成15年環境省告示第18号「土� ��溶出量調査に係る測定方法」による。単位m g/L、土対法指定基準<0.1)、土壌含有遊離シ� ��ン濃度(すなわち、含有遊離CN。平成15年環� �省告示第19号「土壌溶出量調査に係る測定方 法」による。単位mg/kg、土対法指定基準遊離� ��50)に加え、底質調査方法である土壌含有全� ��アン濃度(すなわち、含有全CN。昭和63年環� �管第127号底質調査法による。単位mg/kg)につ� �ても実施し、更には土壌中の難溶出性の全� �アン濃度(すなわち、難溶出CN。単位mg/kg)を� �有全CN-溶出全CN×9の計算式で求めて評価に活 用する。なお、難溶出性全シアン濃度の計算 式は、乾燥土壌当たりの質量(mg/kg)として求� �るものであり、そのため土壌10%の水懸濁液� �ろ液部分の濃度を示す値である溶出全CNは、 90%液部分のCNが懸濁した10%土壌部分に含まれ� ��いたものとして、計算式では9を掛けて土壌 換算にして単位を揃えている。

[本発明が目指す土壌の浄化]
 本発明が目指す土壌の浄化は、含有全CNが� �出して溶出全CNが検出されるリスクを排除で きるレベルであり、数値的には含有全CN<1mg /kgである。その根拠は溶出全CNの測定対象が� ��壌濃度10%の水溶出液のろ液であり、その検� ��限界が0.1mg/Lであることから、含有全CN<1mg /kgであれば溶出全CNが検出限界未満にできる� ��算となるからである。

 対象となる土壌のシアン含有濃度は特に� ��定されないが、一般的なバイオレメディエ� ��ションでの濃度である含有全CN1mg/kg~100mg/kg� �行うことができる。

[土壌処理方法]
 発明による土壌処理法は、土壌への微生物� ��栄養源、生分解性キレート剤などの添加に� ��り行われるが、土壌への添加方法や実施ス� ��ールは特に限定されず、土壌浄化における� ��知の方法で行うことができる。

 添加する微生物の形態は、培養液そのまま� ��も、培養液の水希釈液でも構わない。
 添加する栄養源および生分解性キレート剤� ��どは、水溶液、粉末のいずれでも構わない� ��、土壌への成分の浸透、拡散を考えた場合� ��溶液として添加することが好ましい。
 液状で添加する場合は、添加したままでも� ��増加した水分を抜き出しても、どちらでも� ��わない。

 処理温度は、成り行きで行うが、ラボス� ��ールで浄化性能を定量的に確認する場合に� ��、恒温槽等に土壌サンプルを入れて5℃~50℃ 、好ましくは15℃~35℃の温度に制御して行う� ��とができる。

[土壌中のシアン化合物の分解]
 土壌中のシアン化合物の分解は、シアン分� ��活性菌を有する微生物を添加することによ� ��行うことができる。利用する微生物はシア� ��分解活性を有する微生物であれば限定され� ��いが、アースロバクター(Arthrobacter)属に属� �る微生物を用いることが好ましく、アース� �バクター・エスピー(Arthrobacter sp.)No.5菌株を 用いることがより好ましい。

 添加する微生物の濃度は、シアン分解活性� ��発現できれば限定されないが、土壌への拡� ��、浸透と分解活性との両立を考慮すると、1 0 ⁶ 個/g~10 ⁹ 個/gが好ましく、特に10 ⁷ 個/g~10 ⁸ 個/gがより好ましい。

 添加した微生物の菌数とシアン分解活性� ��維持するために、栄養源を添加してもよい� ��添加する栄養源は微生物の菌数とシアン分� ��活性を維持できれば特に限定されないが、� ��素源としては、例えばグルコースやシュー� ��ロース、フルクトース、廃糖蜜等の糖類等� ��、単独、あるいはこれらの組み合わせによ� ��、通常土壌に対して0.001w/w%~2.0w/w%、望まし� �は0.01w/w%~0.05w/w%程度の濃度で用いることがで きる。

 窒素源としては、例えばペプトン、肉エ� ��ス、酵母エキス、アンモニア、硫酸アンモ� ��ウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ� ��ム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、� ��酸カリウムまたは尿素等を単独、あるいは� ��れらの組み合わせにより、通常土壌に対し� ��0.001w/w%~2.0w/w%、望ましくは0.01w/w%~0.05w/w%程度 の濃度で用いることができる。

 さらに必要に応じて、リン酸1水素カリウ ム、リン酸2水素カリウム等のリン酸塩、硫� �マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウ� �、塩化マンガンなどの金属塩、ビタミン類� �アミノ酸、核酸等の供給源として例えばビ� �チン、チアミン等を添加できる。

 栄養源の添加のタイミングは、特に限定� ��れないが、微生物を添加する前の単独添加� ��微生物と一緒の添加、微生物を添加した後� ��単独添加のいずれでも構わない。またその� ��加回数も限定されない。

[難溶出性シアン化合物の可溶化]
 難溶出性シアン化合物の可溶化は、生分解� ��キレート剤の添加により行うことができる� ��ここで使用するキレート剤は生分解性であ� ��ば特に限定されるものではなく、例えば、� ��エン酸、グルコン酸、酒石酸、シュウ酸、� ��ハク酸、カルボキシメチルタルトロン酸、� ��ルボキシメチルオキシコハク酸、アスパラ� ��ン酸二酢酸、L-グルタミン酸二酢酸、およ� �これらの酸の塩などを単独、あるいはこれ� �の組み合わせにより、通常土壌に対して0.001 w/w%~2.0w/w%、望ましくは0.01w/w%~0.05w/w%程度の濃� ��で用いることができる。添加する特に好ま� ��いキレート剤の成分はクエン酸とその塩で� ��る。生分解性キレート剤の添加のタイミン� ��は、特に限定されないが、微生物を添加す� ��前に単独で添加しても、微生物と一緒に添� ��しても、微生物を添加した後に単独に添加� ��ても、いずれでも構わない。また、その添� ��回数も限定されず、土壌にシアン分解菌が� ��在している場合には、例えば菌の添加と組� ��合わせず使用しても構わない。しかしなが� ��最も好ましいのは、アースロバクター・エ� ��ピー(Arthrobacter sp.)No.5菌株とクエン酸ナト� �ウムを併用する条件である。

 また、使用するキレート剤は遊離型でも塩� ��でもよく、特に限定されないが、土壌内のp Hを中性域に保つために遊離型と塩型を共用� �るという方法をも用いることができる。
なお、キレート剤を生分解性に限定する理由 は土壌への残留蓄積を回避し環境への影響を 極小化するためである。

 本発明の土壌浄化方法において難溶出性� ��アン化合物の可溶化が実現するのは、例え� ��可溶性のフェリシアン化カリウムから、土� ��中の2価鉄イオンにより変化した難溶出性の フェロシアン化鉄に対して、難溶出化の原因 となる鉄イオンがキレート剤に取り込まれる 結果によるものと考えられる。