PROCEDES DE DEFIBRILLATION DE SUBSTRATS CELLULOSIQUES ET DE FABRICATION DE CELLULOSES UTILISANT UNE NOUVELLE FAMILLE DE LYTIC POLYSACCHARIDE MONOOXYGENASES (LPMO) FONGIQUES

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne de manière générale le domaine des celluloses, notamment de nanocelluloses, et plus particulièrement des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défïbrillation de substrats cellulosiques.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

La cellulose est un des polymères naturels les plus importants, une matière première quasi inépuisable, et une source importante de matériaux durables à l'échelle industrielle.

A ce jour, différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de « nanocelluloses ».

Les propriétés de ces nanocelluloses, notamment leurs propriétés mécaniques, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels.

Les nanocelluloses sont ainsi utilisées par exemple en tant qu'additif dispersant ou stabilisant dans les industries papetière, pharmaceutique, cosmétique ou agroalimentaire. Elles entrent également dans la composition de peintures et de vernis.

Les nanocelluloses sont également employées dans de nombreux dispositifs nécessitant un contrôle de la porosité nanométrique, en raison de leur surface spécifique élevée.

Enfin, de nombreux matériaux nanocomposites à base de nanocelluloses sont actuellement développés. En effet, les propriétés mécaniques remarquables des nanocelluloses, leur dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile, leur confèrent des propriétés barrières au gaz excellentes. Ces caractéristiques suscitent notamment un intérêt important pour la fabrication d'emballages barrières.

Sur la base de leurs dimensions, fonctions et méthodes de préparation, qui elles-mêmes dépendent principalement de la source cellulosique et des conditions de traitement, les nanocelluloses peuvent être classées principalement dans deux familles : les fibrilles de cellulose et les nanocristaux de cellulose.

Les nanocristaux de cellulose (dits encore « nanocelluloses cristallines » ou NCCs pour « nanocrystalline cellulose ») sont en général obtenus par une hydrolyse avec un acide fort dans des conditions strictement contrôlées de température, de durée et d'agitation. Un tel traitement permet d'attaquer les régions amorphes des fibres tout en laissant les régions cristallines, plus résistantes, intactes. La suspension obtenue est ensuite lavée par des centrifugations et des dialyses successives dans l'eau distillée. Les NCCs les plus classiquement obtenus ont une longueur de quelques dizaines de nanomètres à environ 1 μιη (notamment de 40 nm à 1 μιη et de préférence de 40 nm à 500 nm), et un diamètre allant de 5 à 70 nm, de préférence inférieur à 15 nm (typiquement de 5 à 10 nm).

Les fibrilles de cellulose, couramment désignées microfibrilles de cellulose (dites encore « cellulose microfibrillée » ou MFC pour « microfibrillated cellulose ») ou nano fibrilles de cellulose (NFC pour « nanofïbrillated cellulose ») sont typiquement isolées à partir de matériaux cellulosiques issus de la bio masse, par des procédés mécaniques permettant de délaminer les fibres de cellulose et de libérer les fibrilles de cellulose.

Bien que connues depuis les années 50, les nanocelluloses font l'objet d'une littérature intense depuis une dizaine d'années.

Par exemple, le document US 4 483 743 décrit un procédé de fabrication de cellulose microfibrillée, qui implique le passage d'une suspension liquide de cellulose au travers d'un homogénéiseur type Gaulin à haute pression. Des passages répétés de la suspension de cellulose permettent d'obtenir des microfibrilles ayant typiquement une largeur allant de 25 à 100 nm et une longueur bien plus importante.

De manière générale, les procédés mécaniques d'obtention de fibrilles de cellulose ont l'inconvénient de consommer d'importantes quantités d'énergie. A titre d'exemple, il a été évalué que l'utilisation d'un homogénéiseur entraîne une consommation d'énergie de l'ordre de 70000 kWh/t. Cette consommation énergétique importante, et en corollaire les coûts élevés de la production de nanocelluloses, restent donc un frein considérable à leur développement industriel.

Différentes stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d'énergie requise pour leur délamination mécanique.

Une première stratégie de prétraitement, décrite par exemple dans la demande WO 2007/091942, consiste à prétraiter les fibres de cellulose par des cellulases de manière à déstructurer la fibre avant l'application du traitement mécanique par homogénéisation.

Cependant, ce prétraitement enzymatique est extrêmement versatile en fonction de l'état de la fibre et notamment en fonction de l'histoire thermochimique préalable de la fibre.

De plus, la qualité des nanocelluloses obtenues (en particulier l'état de dispersion et notamment la taille latérale des nanofibrilles qui conditionne les propriétés d'usage et les rendements énergétiques sont très variables.

Une seconde stratégie de prétraitement s'appuie sur une étape chimique d'oxydation des fibres de cellulose (par exemple Saito et al., Biomacromolecules, Vol. 8, No. 8, 2007, pp. 2485-2491).

Typiquement, les fibres sont oxydées avec un oxydant tel que hypochlorite de sodium catalysé par le radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-l-oxyl (« TEMPO ») avant de subir le traitement mécanique précité.

Le traitement oxydatif convertit la fonction alcool primaire en position C ₆ de l'unité de glucose de la cellulose en une fonction carboxylate, ce qui conduit à l'introduction de charges à la surface des fibres de cellulose. Ces charges créent des répulsions électrostatiques qui facilitent la délamination et qui augmentent son efficacité.

Toutefois, l'élimination des produits de réaction conduit à de grandes quantités d'effluents fortement pollués. En outre, des résidus de réactifs persistent au sein du produit final et continuent à réagir, altérant in fine les propriétés des fibres de celluloses produites par ces procédés.

Ainsi, malgré les nouvelles stratégies de prétraitement développées, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les propriétés sont variables.

Plus récemment, WO 2016/193617 enseigne des procédés de fabrication de nanocelluloses, comprenant une étape de traitement enzymatique du dit substrats par une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs), aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de celluloses.

Pour des raisons évidentes, la mise à disposition de nouveaux procédés optimisés pour obtenir des nanocelluloses, relève d'une préoccupation constante. Les voies d'optimisation visent notamment à réduire la consommation énergétique, privilégier une procédure simplifiée et reproductible, et de toxicité réduite voire nulle.

La présente invention vise précisément à proposer un procédé répondant au moins en partie à ces attentes.

RESUME DE L'INVENTION

Selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:

a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact le dit substrat, en présence d'un donneur d'électron, avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;

caractérisé en ce que ladite enzyme est une polysaccharide-oxydase possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon un autre objet, l'invention concerne l'utilisation d'un substrat cellulosique obtenu selon le procédé précédent à titre de matière première cellulosique pour préparer des fibres de cellulose, en particulier de la nanocellulose, notamment de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose via un procédé de défibrillation, notamment mécanique.

Plus précisément, selon un autre objet, l'invention concerne un procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :

a) disposer d'un substrat cellulosique obtenu selon le procédé tel que défini précédemment et

b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin d'extraire lesdites fibres de cellulose du dit subtrat. Selon encore un autre de ses objets, l'invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :

a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact ledit substrat cellulosique avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lyriques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron;

c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,

caractérisé en ce que ladite enzyme est une polysaccharide-oxydase possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon encore un autre de ses objets, l'invention concerne des fibres de celluloses issues d'un procédé d'extraction, et/ou d'un procédé de fabrication, tels que définis ci-dessus.

Les fibres de cellulose qui sont tout particulièrement considérées par l'invention sont des nanofibres de cellulose, ou nanocelluloses.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1: Arbre phylogénétique de la famille AAxx démontrant que les membres de la famille AAxx clusterisent fortement ensemble et sont très distants des séquences relatives aux familles AA9, AA10, AA11 et AA13 respectivement.

Figure 2: diagramme en ligne du site actif des LPMOs de type PcAAxx

Figure 3A-3B: séquence consensus basée sur un alignement de 283 séquences appartenant au module catalytique des familles AAxx révélant une première histidine conservée dans la famille

Figure 4: Morphologie de fibres cellulosiques de bouleau (A et B) et résineux (C et D) sous l'action des polysaccharides monooxygenases. Images de microscopie optique des fibres témoin (A et C) et des fibres soumises au traitement par une LPMO de type PcAAxxA correpondant à un polypeptide de séquence SEQ ID N°l (B et D)

Figure 5 : Etat de défibrillation des fibres cellulosiques sous l'action d'une polysaccharide monooxygenase (PcAAxxA/ SEQ ID N°l). Images de TEM (A et C) et d'AFM (B et D).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

L'invention a pour objet de répondre à ces besoins.

Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un procédé de fabrication de nanocelluloses s'appuyant sur une étape de prétraitement de fibres de cellulose avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides, couramment désignés « LPMOs » pour « Lytic Polysaccharide MonoOxygenases ».

Les inventeurs sont ainsi d'avis que l'utilisation de LPMOs permet de proposer un procédé innovant pour la fabrication de fibres de celluloses, dont les nanocelluloses. En effet, les LPMOs sont des enzymes dont la fonction oxydative a récemment été mise en évidence (Vaaje-Kolstad, 2010 ; Quinlan et al. 2011; Westereng et al. 2011 ; Horn et al, 2012 ; Bey et al, 2013). Ces enzymes qui améliorent la dégradation de la lignocellulose (Harris et al., 2010) sont retrouvées dans la dernière génération de cocktails enzymatiques industriels (e.g. Cellic CTec3). Ce sont des enzymes cuivre-dépendantes qui catalysent le clivage oxydatif de la cellulose. Ces enzymes anciennement classées dans la famille GH61 (« Glycoside Hydrolase ») de CAZy (www.cazy.org) ont été reclassées dans la famille AA9 (« Auxiliary Activity » enzymes).

Les travaux menés lors d'essais préliminaires ont eu pour objectif d'apporter la preuve de concept de la fabrication de nanocellulose suite à l'action de LPMO fongiques.

De manière surprenante, il a désormais été démontré sur une fibre papetière qu'une enzyme appartenant à une nouvelle famille produite en système hétérologue chez la levure Pichia pastoris pouvait être avantageusement mise en oeuvre dans des procédés de dé-fïbrillation de fibres cellulosiques, ainsi que dans des procédés de fabrication de fibres de celluloses, notamment de nanocelluloses.

Cette nouvelle famille d'enzymes capable d'oxyder les polysaccharides est aussi référencée ici en tant que famille de protéines « AAxx ». Les inventeurs ont caractérisé structurellement la protéine de référence PcAAxxB (Genbank #KY769370) de P. coccineus, en résolvant la structure cristallographique de son module catalytique à une résolution de 3 Â. Ils ont ainsi fourni un modèle structurel pour l'identification de tous les membres pertinents appartenant à cette famille de protéines AAxx, en complément de l'analyse par alignement de séquence de plus de 300 protéines possédant des similarités significatives à PcAAxxB.

La présente invention tire donc partie des propriétés enzymatiques particulières d'une nouvelle classe d'enzyme à activité polysaccharide oxydase, caractérisée en ce que : la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 30% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e ^-3 ou moins

En particulier, les inventeurs ont identifié une structure cristallographique du polypeptide de séquence SEQ ID NO 2.

Les enzymes à activité polysaccharide oxydase selon l'invention sont caractérisées par la présence d'un site actif conservé fixant le cuivre, aussi référencé ici comme un site actif fixant le cuivre de type "histidine brace", formée par deux résidus Histidine et une Tyrosine, un des deux résidus histidine étant l'histidine N-terminale après le clivage du peptide signal.

Plus spécifiquement, les inventeurs ont montré ici que la pluralité des protéines appartenant à cette nouvelle famille AAxx peut être différenciée d'autres mono- oxygénases lytique des polysaccharides en ce que cette nouvelle famille AAxx ne possède pas, de manière obligatoire, de module fixant les carbohydrates (CBM).

Plus précisément, les inventeurs ont démontré qu'une enzyme oxydant les polysaccharides telle que celles identifiées dans la présente demande peut agir en synergie avec d'autres enzymes oxydant les polysaccharides déjà connues telle que les mono- oxygénases lytiques des polysaccharides (généralement appelées LPMO) afin d'améliorer l'hydrolyse de ces polysaccharides.

Les données expérimentales décrites ici montrent que les enzymes oxydant les polysaccharides identifiés par les inventeurs peuvent cibler des unités de sucres distinctes constituant un polysaccharide (par exemple la cellulose, hémicellulose ou lignocellulose), ou encore peuvent cibler des groupes chimiques d'unité de sucre distinctes de celles ciblées par les LPMO déjà connues, telle que AA9 (aussi appelée GH61), AA10, AAl l et AA13.

Ainsi, les inventeurs ont découvert de façon inattendue que les enzymes oxydant les polysaccharides considérées selon l'invention peuvent agir en synergie avec des cellulases afin de dégrader des matériaux contenant des polysaccharides, tels que des matériaux contenant de la cellulose et semblables à la lignocellulose.

Il a aussi été constaté que les enzymes oxydant les polysaccharides identifiés ici peuvent aussi agir en synergie avec des LPMO afin de dégrader des matériaux contenant des polysaccharides, tels que des matériaux contenant de la cellulose et semblables à la lignocellulose.

En conséquence, les enzymes oxydant les polysaccharides, de la présente invention, peuvent être considérées soit séparément, soit en combinaison avec d'autres enzymes capables d'oxyder ou de dégrader les polysaccharides, ainsi que les mélanges de celles-ci. Ainsi, les inventeurs ont identifié une nouvelle classe d'enzymes oxydant les polysaccharides qui peut être utilisée dans une variété de processus pour dégrader des matériaux contenant des polysaccharides, et plus particulièrement dans une large variété de processus pour dégrader les matériaux lignocellulosiques.

Ces propriétés sont donc avantageuses pour la préparation de supports cellulosiques pour la fabrication de fibres de cellulose.

Sans vouloir être limité par un quelconque mécanisme d'action, les inventeurs sont d'avis que les propriétés polysaccharide-oxydases de ces nouvelles LPMOs peuvent faciliter la fabrication de fibres de cellulose depuis un substrat cellulosique comme suit:

- le clivage des chaînes (hémi)cellulosiques peut provoquer des fragilités au sein des fibres facilitant la délamination mécanique indispensable à la nanofibrillation sur le même schéma que les endoglucanases utilisées actuellement ; et d'autre part

- la formation de produits d'oxydation permettrait d'introduire des fonctions chimiques chargées sur la surface des fibres en induisant des répulsions électrostatiques.

De plus, sans forcément être lié par la théorie, les inventeurs sont d'avis que les enzymes AAxx de l'invention sont capables d'agir préférentiellement sur les xylanes liés à la cellulose et plus spécifiquement sur les xylanes ayant une rigidité et une conformation similaire à celles des chaînes cellulosiques sous-jacentes. Ces modifications structurales combinées ont pour conséquence la facilitation de la séparation des fibres jusqu'à dispersion nanométrique et la formation de fibres de cellulose, en particulier de nanofïbriUes de cellulose, possédant des caractéristiques et fonctionnalités nouvelles et avantageuses.

L'invention concerne donc (i) un procédé original de préparation d'un substrat cellulosique; (ii) l'utilisation du substrat cellulosique ainsi obtenu à titre de matière première pour former des fibres de cellulose, notamment des nanocelluloses (iii) un procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique ; et (iv) un procédé de fabrication de fibres de cellulose.

Un procédé de fabrication de fibres de cellulose tel que défini ici peut ainsi consister en la mise en oeuvre combinée d'un procédé de préparation d'un substrat cellulosique, puis d'un procédé de défibrillation sur le dit substrat préparé.

Les domaines d'application des fibres de cellulose, en particulier de nanocelluloses, obtenues par les dits procédés sont extrêmement variés. De façon générique les nanocelluloses visent des applications dans 3 grands domaines :

- Systèmes dispersés hydratés: Les nanocristaux sont habituellement stabilisés en suspensions colloïdales par des répulsions électrostatiques induites par la présence de charges de surface. Ils peuvent servir de stabilisant de phases hydrophobes et donc entrer dans la composition de peintures, vernis, cosmétique, etc. Ils peuvent également permettre de disperser des agents fonctionnels tels que des opacifiants pour des applications (dioxyde de titane par exemple en papèterie), ou des renforçants (argiles)

- Matériaux poreux (mousses, aérogels, membranes, .. etc) : La très grande surface spécifique des nanocelluloses permet d'accéder un contrôle de la porosité des matériaux au niveau nanométrique après séchage. Ce contrôle donne accès à différents types d'applications où la porosité ou une grande surface spécifique sont des caractéristiques clefs: membrane de fïltration, support de catalyse, superisolants thermiques.

- Nanocomposites : Les nanocelluloses ont des propriétés mécaniques tout à fait remarquables. D'autre part la dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile leur confère des propriétés barrière au gaz. Ces caractéristiques ouvrent la voie à leur utilisation notamment dans le domaine des emballages. Définitions générales

De manière générale, et tout au long du présent texte, les termes de type "comprendre" ou "inclure", ainsi que leurs variations, sont susceptibles d'inclure d'autres éléments que ceux explicitement mentionnés. Ces termes peuvent, le cas échéant, être replacés par "consister en". Les articles "un" et "une" incluent également "plus d'un" ou "plus d'une", ce qui inclut "une pluralité", ou encore "deux ou plus".

La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses, en particulier de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose, à partir d'un substrat cellulosique.

Par « cellulose », on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et constitué d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU pour « Anhydro glucose unit ») reliées entre elles par des liaisons glycosidiques β-(1-4). Le motif de répétition est un dimère de glucose également appelé dimère de cellobiose.

Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).

Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des chaînes formées de dimères de cellobiose forme une nano fibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de nanofibriUes élémentaires forme une nano fibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm). L'agencement de plusieurs de ces nanofibriUes forme ensuite ce qui est généralement appelé une fibre de cellulose.

Le terme « fibre de cellulose » désigne l'ensemble des formes de cellulose susceptibles d'être obtenues à l'issue d'un procédé de défibrillation, ou délamination d'un substrat cellulosique ; ce qui inclut les formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre, ainsi que les formes de cellulose ayant une dimension supérieure.

Le terme « nanocelluloses » désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon l'invention, deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.

Les termes « fibrilles de cellulose », « nanofibrilles (de cellulose) », « nanofibres (de cellulose) », « cellulose nanofibrillée », « microfibrilles (de cellulose) », « cellulose microfibrillée », « microfibrillated cellulose », « cellulose nanofibrils » sont synonymes.

Chaque nano fibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.

L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).

Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à environ 1 μιη, de préférence allant de 40 nm à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm.

Les termes « nanocristaux de cellulose », « cellulose nanocristalline », « cellulose whiskers », « microcristaux » ou « cellulose nanocrystal » sont synonymes. Dans la suite de la présente demande, le terme « nanocristaux de cellulose » (NCCs) sera utilisé de manière générique.

Comme utilisé ici, un matériel contenant des polysaccharides englobe une substance ou une composition comprenant des polysaccharides.

Le terme « polysaccharide » est utilisé dans son sens conventionnel et désigne des carbohydrates polymériques composés de longues chaînes de monosaccharides maintenus ensemble par des liaisons glycosidiques. Lors de leur hydrolyse, les polysaccharides libèrent les monosaccharides ou oligosaccharides les constituant.

Le terme « matériel contenant de la lignocellulose » utilisé ici fait référence à un matériel consistant initialement de cellulose, hémicellulose et lignine. Ce terme est synonyme de « matériel lignocellulosique ». Un tel matériel est souvent référencé comme « biomasse ».

Selon cette définition, un matériel contenant de la lignocellulose est un exemple de substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, au sens de l'invention. Comme utilisé dans la présente demande, une « enzyme oxydant les polysaccharides » englobe les polypeptides avec les propriétés suivantes :

- le dit polypeptide produit du peroxyde d'hydrogène en présence d'oxygène et d'un composé donneur d'électrons, tel que les ascorbates,

- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l'absence ou en présence d'un composé donneur d'électrons, la dégradation d'un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causée par des cellulases et/ou des xylanases,

- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l'absence ou en présence d'un composé donneur d'électrons, la dégradation d'un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causé par des cellulases, en présence d'une ou plus LPMO, tel que les LPMO sectrionnées dans un group comprenant AA9, AA10, AA1 1 et AA13.

Une « enzyme oxydant des polysaccharides » selon l'invention a été démontrée comme particulièrement efficace pour oxyder les xylanes, et notamment les xylanes absorbés sur de la cellulose. Le terme « composé donneur d'électron » est utilisé ici dans son sens habituel pour un homme du métier. Ainsi, un composé donneur d'électron est une entité chimique capable de donner des électrons à un autre composé. Un composé donneur d'électron est un agent réducteur grâce à sa capacité à donner des électrons et est lui-même oxydé quand il donne des électrons à une autre entité chimique. Un composé donneur d'électrons comme spécifié plus haut pour les propriétés d'oxydation des polysaccharides, englobe, de manière non exhaustive, des ascorbates et des cellobiose déshydrogénases (CDH).

En l'absence d'un réducteur, tel que l'ascorbate, l'agent réducteur peut de façon avantageuse être fourni par la biomasse (la lignine) qui peut agir en tant que donneur d'électron.

Comme utilisé dans la demande, une « méthode BLAST-P » (appelée aussi Protein Basic Local Alignement Search Tool method) est une méthode d'analyse bien connue pour l'homme du métier. La méthode BLAST-P a notamment été décrite dans Altschul et al. (1990, J Mol Biol, Vol. 215 (n°3) :403-410), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. Vol. 25:3389-3402) et Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol. 272:5101-5109). La méthode BLAST-P peut être réalisée en utilisant l'outil de NCBI disponible en ligne (adresse internet : http://blast.ncbi.nlm.nih.gOv/B last.cgi?PAGE= Proteins).

Quand la méthode BLAST-P est utilisée dans la présente demande, elle est utilisée de préférence selon les paramètres suivants : : (i) Expected threshold : 10; (ii) Word Size : 6; (iii) Max Matches in a Query range : 0; (iv) Matrix : BLOSSUM62; (v) Gap costs : Existence 11, Extension 1; (vi) Compositional Adjustments : Conditional compositional score matrix adjustment, (vii) No fïlter; (viii) No mask.

Comme cela est bien connu, le score d'un alignement, S, est calculé comme la somme des scores de substitution et de gap. Les scores de substitution sont donnés dans une table (voir PAM, BLOSUM ci-dessous). Les scores de gap sont généralement calculés comme la somme des G, la pénalité d'ouverture d'un gap et L, la pénalité d'extension d'un gap. Pour un gap d'une longueur n, le coût d'un gap serait de G+Ln. Le choix des coûts des gaps, G et L sont empiriques, mais il est habituel de choisir une valeur élevée pour G (10-15) et une faible valeur pour L (1-2).

Un alignement optimal signifie l'alignement de deux séquences avec le score le plus haut possible.

L'identité en acides aminés représente la mesure dans laquelle deux séquences en acides aminés ont les mêmes résidus aux mêmes positions dans un alignement, et est souvent exprimée en pourcentage.

Les matrices BLOSUM (Blocks Substitution Matrix) sont des matrices de score de substitution dans lesquelles les scores pour chaque position sont dérivées de l'observation de la fréquence de substitution des blocks dans des alignement locaux pour des protéines apparentées. Chaque matrice est dessinée pour une distance d'évolution particulière. Dans la matrice BLOSUM62, par exemple, l'alignement à partir duquel les scores ont été dérivés a été créé à partir de séquences ne partageant pas plus de 62% d'identité. Les séquences qui possèdent plus de 62% d'identité sont représentées par une séquence unique dans l'alignement afin de ne pas surreprésenter des membres proches d'une même famille.

Comme utilisé ici, une E-valeur (aussi appelé Expect Value) est un paramètre calculé quand la méthode BLAST-P est utilisée, le dit paramètre représentant le nombre d'alignements différents avec des scores équivalents ou avec meilleur que S dont l'apparition est attendue lors d'une recherche dans la base de données par hasard. Ainsi, plus la E valeur sera basse, et plus le score et l'alignement seront significatifs.

Dans le cadre de la présente invention, le « pourcentage d'identité » entre deux polypeptides signifie que le pourcentage d'acides aminés identiques entre les deux séquences polypeptidiques à comparer, obtenu après un alignement optimal, ce pourcentage étant entièrement statistique et les différences entre les deux séquences polypeptidiques étant distribués aléatoirement sur leur longueur. La comparaison de deux séquences polypeptidiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison doit pouvoir être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d'alignement ». L'alignement optimal des séquences pour leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-P.

Dans son principe, le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale au sein desquelles les séquences d'acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou délétions par rapport à la séquence de référence de l'alignement optimal entre les deux séquences polypeptidiques. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant du nombre de positions dans lesquelles un acide aminé est identique entre les deux séquences, de préférence entre deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences.

Comme il est entendu dans la présente demande, des séquences polypeptidiques ayant au moins 20% d'identité en acides aminés avec une séquence de référence comprennent celles qui ont au moins 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% d'identité en acides aminés avec ladite séquence de référence.

De manière similaire, le «pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques représente le pourcentage de résidus nucléotidique identiques entre les deux séquences d'acides nucléiques à comparer, obtenus après un alignement optimal, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant distribuées de façon aléatoire sur la longueur des séquences. La comparaison de deux séquences d'acides nucléiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison pouvant être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d'alignement ». L'alignement optimal des séquences en vue de leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-N.

En principe, le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale dans lesquelles les séquences d'acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence de l'alignement optimal entre les deux séquences Le pourcentage d'identité est calculé selon le nombre de positions auxquels les résidus nucléotidiques sont identiques entre les deux séquences, de préférence entre les deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences.

Comme il est entendu ici, les séquences nucléotidiques ayant au moins 20% d'identité avec la séquence de référence incluent celles ayant au moins least 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%o et 99% d'identité en nucléotides avec la séquence de référence.

Comme indiqué ici, une E valeur de 10 e ^"3 ou moins englobe les E-valeur de 1 e ^"3 ou moins, 1 e ^"4 ou moins, 1 e ^"5 ou moins, 1 e ^"6 ou moins, 1 e ^"7 ou moins, 1 e ^"8 ou moins, 1 e ^"9 ou moins, 1 e ^"10 ou moins, 1 e ^"20 ou moins, 1 e ^"30 ou moins, 1 e ^"40 ou moins, 1 e ^"50 ou moins, 1 e ^"60 ou moins, 1 e ^"70 ou moins, 1 e ^"80 ou moins, 1 e ^"90 ou moins et 1 e ^"100 ou moins.

Le terme "traitement chimique" fait référence à tous les prétraitements chimiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine. Des exemples de ces prétraitements chimiques adéquats incluent, par exemple des acides dilués, de la chaux, des bases, des solvants organiques, de l'ammoniaque, du dioxyde de soufre, du dioxyde de carbone. De plus l'oxydation humide et l'hydrothermolyse à pH contrôlé sont aussi considérées comme des prétraitements chimiques. Les méthodes de prétraitements utilisant de l'ammoniaque sont notamment décrites dans les demandes PCT WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, et WO 2006/110901.

D'autres exemples de prétraitement adéquat sont décrits par Schell et al, 2003, Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108: 69-85, et Mosier et al, 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, et U.S. Publication No. 2002/0164730.

Le terme « prétraitement mécanique » fait référence à tous les traitements mécaniques (ou physiques) qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, de l'hémicellulose et/ou de la lignine à partir d'un matériel contenant de la lignocellulose. Par exemple, les prétraitements mécaniques incluent différents types de broyage, irradiation, explosion à la vapeur et l'hydrothermolyse.

Le prétraitement mécanique inclut la fragmentation d'un solide (comminution ou réduction mécanique de la taille). La fragmentation d'un solide inclut les techniques de broyages en milieu sec, de broyage en milieu humide et de broyage par balles vibrantes. Le prétraitement mécanique peut aussi inclure des fortes pressions et/ou des températures élevées (explosion à la vapeur). Dans certaines représentations de l'étape de prétraitement, la dite étape peut combiner un prétraitement mécanique et chimique.

Comme il a été utilisé dans la présente invention, le terme « prétraitement biologique » fait référence à tous les traitements biologiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine à partir d'un matériel contenant de la lignocellulose. Les prétraitements biologiques peuvent impliquer l'application de microorganismes capables de solubiliser la lignine (voir, par exemple, Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, dans le Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, éd., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh et Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: une revue, dans Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Séries 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, Cao, Du, et Tsao, 1999, Ethanol production from renewable resources, dans Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, éd., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241 ; Olsson et Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; et Vallander et Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng J Biotechnol. 42: 63-95).

Procédés selon l'invention

Selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes:

a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact le dit substrat, en présence d'un donneur d'électrons, avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose, afin de défïbriller le dit substrat cellulosique ;

caractérisé en ce que ladite enzyme possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon un autre objet, l'invention concerne l'utilisation d'un substrat cellulosique préparé selon le procédé précédent, à titre de matière première cellulosique pour préparer des fibres de cellulose, en particulier de la nanocellulose, notamment de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose via un procédé de défïbrillation, notamment mécanique.

Selon un second objet, l'invention concerne un procédé d'extraction de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :

a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose mis en contact avec un donneur d'électrons et une enzyme à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron, caractérisé en ce que la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase étant caractérisée en ce qu'elle possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e ^"3 ou moins ; et

b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin d'extraire lesdites fibres de cellulose du dit subtrat.

Selon un troisième objet, l'invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :

a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact ledit substrat cellulosique avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lyriques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron;

c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,

caractérisé en ce que ladite enzyme à activité polysaccharide-oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ

ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e ^"3 ou moins.

Ladite enzyme à activité polysaccharide-oxydase est mélangée avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre ladite au moins une enzyme et les fibres de cellulose.

L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres. Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en œuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).

De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en œuvre à une température allant de 30 à 50 °C, notamment de 30 à 45 °C.

Le pH des conditions réactionnelles de l'enzyme au contact du substrat cellulosique est généralement compris entre 3 et 7, ce qui inclut entre 4 et 7, et notamment entre 4 et 6.

Selon l'invention ladite au moins une enzyme LPMO peut être ajoutée au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 : 1000 à 1 :50, notamment de 1 :500 à 1 :50 ou de 1 : 100 à 1 :50 ou encore de 1 : 1000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 : 100.

De préférence, ladite au moins une enzyme LPMO est utilisée à une concentration allant de 0,001 à 10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.

Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).

La ou les LPMOs mises en œuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.

Dans ce cas, les Exemples démontrent que les fibres sont entièrement déstructurées.

De manière non-exclusive, des tests de clivage de la cellulose par une enzyme LPMO selon l'invention peuvent être menés selon le protocole suivant :

Par exemple un test de clivage peut être réalisé dans un volume de 300 μΐ de liquide contenant 4,4 μΜ d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 : 19-25) dans 50 mM d'un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 μΜ de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.

La réaction enzymatique peut être mise en œuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50°C et 580 rpm (rotation par minute).

Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration comprise entre 1 et 5 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 : 100, 1 :500 et 1 : 1000) et d'ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 °C.

Après 16 h d'incubation, l'échantillon est porté à 100°C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4°C afin de séparer la fraction solution de la fraction insoluble restante.

Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que les fibres de cellulose obtenues à l'issue du procédé sont des nanofîbrilles de cellulose.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques ; et de préférence l'ascorbate.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite, les pâtes au sulfate, les pâtes à la soude, les pâtes kraft.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des traitements mécaniques suivants :

- un traitement d'homogénéisation,

- un traitement de micro fluidisation,

- un traitement d'abrasion, et/ou

- un traitement de cryobroyage.

Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que, suite à ladite étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de posttraitement choisie parmi : un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de groupements chimiques portés par les dites fibres de cellulose. Selon un autre objet, l'invention concerne des fibres de celluloses issues d'un procédé de défïbrillation et/ou d'un procédé de fabrication de fibres de cellulose tels que définis ci-dessus.

Les dites fibres de celluloses peuvent être caractérisées en ce que lesdites fibres de cellulose, de préférence de nanocellulose, comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C ₄ , voire également C ₆ .

Selon un mode de réalisation préféré, les fibres de celluloses sont des nano fibrilles de cellulose. Etape(s) de traitement(s) mécanique(s)

Le substrat cellulosique mis en contact avec la dite enzyme est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l'obtention des nanocelluloses.

La délamination (dite encore « fibrillation » ou « défibrillation ») consiste à séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose au sein du substrat cellulosique, notamment pour la fabrication de nanocelluloses.

Comme démontré, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l'étape de traitement mécanique.

Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie. Par ailleurs, l'utilisation de LPMOs selon l'invention permet d'introduire dans les fibres de cellulose des groupements chargés induisant des répulsions électrostatiques, sans contamination avec des réactifs de traitement, comme lors de l'utilisation de réactifs TEMPO.

Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l'homme du métier et peuvent être mis en œuvre dans le(s) procédé(s) de l'invention.

De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.

On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à 744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose micro fibrillée (par exemple des nanofïbrilles de cellulose).

Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d'homogénéisation, de micro fluidisation, d'abrasion, ou de cryobroyage.

Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).

Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité, typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à vitesse élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l'orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80°C durant le traitement d'homogénéisation, de l'eau de refroidissement est généralement utilisée.

Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en œuvre à l'aide d'un dispositif de type micro fluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d'une fine chambre typiquement en forme de « z » (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 μιη) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à 10 ⁷ .s ^_1 ) permet d'obtenir des nanofïbrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fîbrillation.

Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al, 2007

Applied Physics A89(2) :461-66) est basé sur l'utilisation d'un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage. Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute (rpm). Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.

Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al, Bio macro molécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à partir d'une suspension de fibres de bois.

Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al, 1997,

Journal of Applied Polymer Science, 64(6) : 1185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote liquide. Les cristaux de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l'agriculture.

Etape (s) de post-traitement du substrat cellulosique

Dans certains modes de réalisation, le procédé de défïbrillation et/ou de fabrication de fibres de cellulose comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en œuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.

Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fïbrillation des celluloses (notamment des nanocelluloses) obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.

Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les micro fibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses. Substrat cellulosique

Le substrat cellulosique peut être obtenu selon l'invention à partir de toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) comprenant des fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).

Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.

Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de types Gluconacetobacter).

On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.

Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).

Le substrat cellulosique se présente avantageusement sous la forme d'une suspension de fibres de cellulose dans un milieu liquide (de préférence un milieu aqueux), ou d'une pâte de cellulose.

Les pâtes de cellulose peuvent être conditionnées à l'état « sec », soit typiquement dans un état de siccité supérieur ou égal à 80%, notamment supérieur ou égal à 90%). La pâte de cellulose peut ensuite être redispersée dans un milieu aqueux par un traitement mécanique.

De préférence, le substrat cellulosique contient au moins 90%>, notamment au moins 95% et de préférence 100% de fibres de celluloses.

De préférence, le substrat cellulosique est adapté à la fabrication de papier ou d'un produit cellulosique. Le substrat cellulosique est ainsi de préférence choisi parmi les pâtes papetières (ou pâte à papier), et en particulier les pâtes papetières chimiques.

De manière générale, la pâte de cellulose et notamment la pâte papetière peut contenir, en association avec les fibres de cellulose, de l'hémicellulose et de la lignine. De préférence, la pâte de cellulose contient moins de 10% et notamment moins de 5% de lignine et/ou d'hémicellulose.

De préférence, les pâtes papetières chimiques contiennent quasiment exclusivement, voire exclusivement des fibres de cellulose.

La pâte papetière peut être choisie parmi l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite (écrues ou blanchies), les pâtes au sulfate (écrues ou blanchies), les pâtes à la soude (écrues ou blanchies) et les pâtes kraft.

Il est également possible d'utiliser des pâtes à dissoudre ayant une faible proportion d'hémicellulose, de préférence inférieure à 10% et notamment inférieure ou égale à 5%.

De préférence, les pâtes papetières utilisées dans un procédé de l'invention sont des pâtes de bois, notamment des pâtes papetières chimiques de bois.

Selon un mode de réalisation, le substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.

Un matériel contenant de la lignocellulose, tel que défini ci-après, est un exemple de substrat cellulosique particulièrement considéré selon l'invention.

Dans un mode de réalisation préféré, le matériel contenant de la lignocellulose contient au moins 30%> wt. %, de préférence au moins 50 wt. %, encore plus préférentiellement, au moins 70% wt. %, et encore plus préférentiellement au moins 90%) wt. % de lignocellulose. Il est noté que le matériel contenant la lignocellulose peut aussi contenir d'autres composants tels que du matériel proteique, amidon, sucres, tels que des sucres pouvant fermenter et /ou des sucres ne pouvant fermenter.

Un matériel contenant de la lignocellulose peut être tout matériel contenant de la lignocellulose. Dans une représentation préférée le matériel contenant de la lignocellulose contient au moins 30% wt. %, de préférence au moins 50 wt. %, encore plus préférentiellement, au moins 70% wt. %, et encore plus préférentiellement au moins 90% wt. % de lignocellulose. Il est important de comprendre que le matériel contenant la lignocellulose peut aussi contenir d'autres composants tels que du matériel protéique, amidon, sucres, tels que des sucres pouvant fermenter et /ou des sucres ne pouvant fermenter.

Le matériel contenant la lignocellulose est généralement présent, par exemple, dans les tiges, les feuilles, le son, les enveloppes et les rachis des plantes ou feuilles, branches, et le bois des arbres. De manière non-limitative, le matériel contenant la lignocellulose peut aussi être du matériel herbacé, des restes de l'agriculture et de la sylviculture, des déchets municipaux solides, des déchets papier, et des restes de broyage de pulpe et de papier. Il faut comprendre ici que le matériel contenant la lignocellulose peut se trouver sous la forme de matériel de la paroi cellulaire de la plante contenant de la lignine, cellulose, et hémicellulose dans une matrice mixte.

Selon certains modes de réalisation particuliers, le matériel contenant de la lignocellulose est une biomasse lignocellulosique choisie dans le group consistant en : l'herbe, le switchgrass, la spartine, l'ivraie, la baldingère faux-roseau, le miscanthus, les résidus de transformation du sucre, la bagasse de canne à sucre, les déchets agricoles, la paille de riz, la balle de riz, la paille d'orge, l'épi de maïs, la paille de céréales, la paille de blé, la paille de canola, la paille d'avoine, la coque d'avoine, la canne de maïs, la farine de soja, la farine de maïs, les déchets forestiers, la fibre de pâte de bois recyclée, la boue de papier, la sciure de bois, le bois dur, le bois résineux, l'agave et ses combinaisons. Dans un mode de réalisation préféré, le matériel contenant de la lignocellulose est choisi dans un groupe comprenant : la farine de maïs, la fibre de maïs, la paille de riz, le bois de pin, les copeaux de bois, le peuplier, la bagasse, le papier et les déchets de traitement de la pâte.

De préférence, le matériel contenant la lignocellulose est une biomasse lignocellulosique à base de bois. D'autres exemples de matériel contenant de la lignocellulose incluent du bois dur comme le peuplier et le bouleau, le bois tendre, la paille des céréales telle que la paille de blé, le millet vivace, les déchets municipaux solides, les déchets industriels organiques, les papiers de bureau et un mélange de ces derniers.

Selon des modes de réalisation exemplifîés, le matériel contenant de la lignocellulose est sélectionné à partir de pin, de peuplier et de paille de blé. Enzyme de type LPMO selon l'invention (famille AAxx)

Une enzyme selon l'invention est définie en tant qu'enzyme à activité polysaccharide-oxydase, ladite enzyme possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E- value) de 10 e ^~3 ou moins.

Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 30% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 60%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO 1, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO 2, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins. Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e ^"3 ou moins.

Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase est codée par un acide nucléique ayant au moins 90% d'identité de séquence avec un acide nucléique choisi dans le groupe consistant en SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6.

A titre illustratif, lorsqu'une enzyme à activité polysaccharide-oxydase de séquence SEQ ID NO. 2 est comparée au polypeptide de référence SEQ ID NO. 1 selon la méthode de comparaison BLAST-P, (i) la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase de SEQ ID NO. 2 possède une identité de séquences en acides aminés de 66% par référence au polypeptide de séquence SEQ ID NO.l et (ii) la méthode de comparaison BLAST-P résulte en une E-value de 4 e ^-133 .

Egalement à titre illustratif, lorsqu'une enzyme à activité polysaccharide- oxydase de séquence SEQ ID NO. 3 est comparée au polypeptide de référence SEQ ID NO. 1 selon la méthode de comparaison BLAST-P, (i) la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase de SEQ ID NO. 2 possède une identité de séquences en acides aminés de 34% par référence au polypeptide de séquence SEQ ID NO.l et (ii) la méthode de comparaison BLAST-P résulte en une E-value de 2 e ^"40 .

Selon des modes de réalisation préférés, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase est choisie dans le groupe comprenant des polypeptides ayant l'une des références GenBank suivantes: ALO60293.1; CCA68158.1; CCA68159.1; CCA68161.1; CCA71530.1; CCA72554.1; CCA72555.1; CCO30796.1; CCT73728.1; CDM26384.1; CD076981.1; CD076983.1; CDO76990.1; CDR41535.1; CDZ98469.1; CDZ98532.1; CDZ98792.1; CDZ98793.1; CEJ62913.1; CEJ80690.1; CEL55274.1; CEL55761.1; CEN61973.1; CEQ41736.1; CRL20539.1; CUA74138.1; CUA75968.1; EEB87294.1; EEB88604.1; EEB93106.1; EGU12035.1; EGU79270.1; EJU02917.1; EJU04796.1; EJU04797.1; EKC98083.1; EKD01731.1; EKD04876.1; EKG10038.1; ELU37011.1; ELU44209.1; EMD31282.1; EMD34047.1; EMT65805.1; ENH74989.1; EPT05587.1; EPT05590.1; EPT05591.1; EUC56978.1; EUC64931.1; EWG51104.1; EWY85510.1; EXK29887.1; EXU99300.1; GA089447.1; GAQ 10202.1; GAT49547.1;

GAT49548.1; GAT52486.1; GAT61130.1; GAT61131.1; KDE05902.1; KDE09071.1;

KDN48575.1; KDN50638.1; KDQ07356.1; KDQ08649.1; KDQ08700.1; KDQ08703.1;

KDQ11515.1; KDQ12702.1; KDQ15932.1; KDQ19064.1; KDQ25667.1; KDQ34148.1; KDQ59091.1; KDQ59092.1; KDR69809.1; KDR78641.1; KDR82083.1; KEP48245.1;

KEY82804.1; KFG85718.1; KFH41721.1; KFY94807.1; KFZ00858.1; KFZ20368.1;

KGB74552.1; KID86720.1; KII89650.1; KII89670.1; KIJ14235.1; KIJ14422.1;

KIJ36788.1; KIJ36789.1; KIJ36910.1; KIJ36911.1; KIJ59037.1; KIJ62866.1; KIJ66712.1;

KIJ93961.1; KIKO 1335.1; KIKO 1364.1; KIK03019.1; KIK24220.1; KIK24223.1; KIK45012.1; KIK47453.1; KIK58046.1; KIK60325.1; KIK64405.1; KIK64418.1;

KIK64426.1; KIK64427.1; KIK64461.1; KIK94802.1; KIL59842.1; KIL67972.1;

KIL68458.1; KIL88744.1; KIM29500.1; KIM34148.1; KIM35038.1; KIM39331.1;

KIM49751.1; KIM57407.1; KIM60439.1; KIM60441.1; KIM60443.1; KIM60444.1;

KIM84967.1; KIM93034.1; KIM95301.1; KIM95307.1; KIN08100.1; KIN97734.1; KIN97736.1; KIN97737.1; KIO31600.1; KIP08019.1; KIP08026.1; KIP10435.1;

KIR25380.1; KIR50229.1; KIR55806.1; KIR67208.1; KIW62805.1; KIY36322.1;

KIY46248.1; KIY46262.1; KIY46497.1; KIY46927.1; KIY47293.1; KIY51548.1;

KIY64670.1; KIY68736.1; KIY71843.1; KJA14486.1; KJA19114.1; KJA20550.1;

KJA20613.1; KJK82496.1; K 098459.1; KKP01653.1; KLT38889.1; KLT39034.1; KLT43002.1; KLT43602.1; KLT43893.1; KLT46239.1; KMK54965.1; K Z77897.1;

K Z78922.1; KPA38710.1; KPI34779.1; KPM37038.1; KPV71930.1; KPV77521.1;

KPV77742.1; KTB29212.1; KTB33212.1; KUE98996.1; KUE99426.1; KWU44348.1;

KWU44477.1; KXH42132.1; KXH43636.1; KXH51881.1; KXN82218.1; KXN84873.1;

KXN89494.1; KXN90938.1; KXN93349.1; KYQ38716.1; KYQ40395.1; KYQ41811.1 ; KZL64940.1; KZO90689.1; KZO90691.1; KZP14545.1; KZP23879.1; KZS91941.1;

KZT07581.1; KZT07590.1; KZT20429.1; KZT29895.1; KZT40257.1; KZT57664.1;

KZT57666.1; KZT73200.1; KZT73202.1; KZV68182.1; KZV68185.1; KZV69208.1;

KZV72373.1; KZV79310.1; KZV79844.1; KZV82398.1; KZV83782.1; KZV85461.1;

KZV85472.1; KZV86197.1; KZV88440.1; KZV88442.1; KZV88448.1; KZV96582.1; KZV97371.1; KZV97738.1; KZV97742.1; KZV98356.1; KZV99282.1; KZW00468.1;

KZW00469.1; OAA59408.1; OAA71978.1; OAG11613.1; OAG40496.1; OAL02191.1;

OAL28870.1; OAL45637.1; OAP54840.1; OAQ60454.1; OAQ77899.1; OAQ86421.1; OAQ94383.1; OAQ97907.1; OAX34821.1; XP 001263997.1; XP 001796117.1;

XP 001829371.2; XP 001835502.2; XP 001835509.1; XP 001836582.1;

XP _001840021.2; XP 001877230.1; XP 001878077.1; XP 001885228.1;

XP 001905249.1; XP 003035108.1; XP 003035505.1; XP 003036605.1;

XP 003042172.1; XP 003191958.1; XP 006458724.1; XP 006459911.1;

XP 006963793.1; XP 007001773.1; XP 007003269.1; XP 007262604.1;

XP 007299807.1; XP 007301417.1; XP 007306950.1; XP 007318869.1;

XP 007318871.1; XP 007319142.1; XP 007327029.1; XP 007329615.1;

XP 007337360.1; XP 007343208.1; XP 007346002.1; XP 007349200.1;

XP 007349275.1; XP 007351346.1; XP 007351348.1; XP 007351349.1;

XP 007351518.1; XP 007352398.1; XP 007353707.1; XP 007359130.1;

XP 007362490.1; XP 007362492.1; XP 007362499.1; XP 007362779.1;

XP 007388801.1; XP 007388810.1; XP 007393138.1; XP 007393767.1;

XP 007581903.1; XP 007600909.1; XP 007746185.1; XP 007765609.1;

XP 007768205.1; XP 007792087.1; XP 007792157.1; XP 007826256.1;

XP 007849383.1; XP 007867180.1; XP 007867564.1; XP 008039133.1;

XP 008039347.1; XP 008039803.1; XP 008039807.1; XP 008718658.1;

XP 008731148.1; XP 009256644.1; XP 009545121.1; XP 009545122.1;

XP 011321625.1; XP 012046198.1; XP 012181508.1; XP 012183613.1;

XP 013257070.1; XP 013271081.1; XP 013277879.1; XP 013332110.1;

XP 013943298.1; XP 013944931.1; XP 013954691.1; XP 013960458.1;

XP 014176455.1; XP 014180074.1; XP 014180075.1; XP 014181917.1;

XP 014543483.1; XP 014573268.1; XP 016242373.1; XP 016271225.1;

XP 016275235.1; XP 016275300.1; XP 016610141.1; XP 016620042.1; XP_016630521.1; XP_567250.1; XP_753127.1 et XP_778151.1.

Selon des modes de réalisation préférés, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase consiste en une protéine recombinante. Selon certains de ces modes de réalisation préférés, la dite protéine recombinante est produite dans une levure qui a été génétiquement transformée pour produire la dite enzyme recombinante à activité polysaccharide-oxydase.

Selon certains modes de réalisation préférés, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase ayant une séquence en acides aminés comprenant, voire consistant en, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3, et/ou au moins l'une des enzymes identifiées par leur numéro GenBank ci-dessus.

Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase est codée par un acide nucléique ayant une séquence en acides nucléiques choisie dans un groupe comprenant SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6.

Selon certains modes de réalisation préférés, plusieurs enzymes à activité polysaccharide-oxydase peuvent être mises en oeuvre au sein d'un même procédé. En particulier, le support cellulosique considéré peut être mis (ou avoir été mis) en contact avec une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention, et tout particulièrement une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase comprenant une séquence en acides aminés comprenant, voire consistant en, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3, et/ou au moins l'une des enzymes identifiées par leur numéro GenBank ci-dessus.

Selon certains modes de réalisation préférés, plusieurs enzymes à activité polysaccharide-oxydase peuvent être mises en oeuvre au sein d'un même procédé. En particulier, le support cellulosique considéré peut être mis (ou avoir été mis) en contact avec une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention, et tout particulièrement une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase codées par un acide nucléique choisi dans un groupe parmi SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, et SEQ ID NO. 6, et/ou au moins l'une des enzymes identifiées par leur numéro GenBank ci-dessus.

Selon certains de ces modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase, ou la dite pluralité d'enzymes, est mise en oeuvre dans une composition à activité polysaccharide-oxydase.

Ainsi, selon ces modes de réalisation, la dite pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase comprend entre 2 et 10 enzymes à activité polysaccharide-oxydase distinctes, ce qui inclut 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, enzymes à activité polysaccharide-oxydase distinctes.

Selon certains modes de réalisation encore plus particuliers, une composition à activité polysaccharide-oxydase est susceptible de comprendre une ou plusieurs autres enzymes activité polysaccharide-oxydase choisies parmi les LPMOs, ce qui inclut les enzymes choisies dans un groupe comprenant: AA9, AA10, AA11 et AA13 LPMOs Méthodes pour identifier les polypeptides appartenant à la famille AAxx

Les inventeurs décrivent ici la structure cristallographique du module catalytique PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370) appartenant à une enzyme à activité polysaccharide-oxydase. Sont également divulguées près de 300 enzymes à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention, lesquelles appartiennent à la même famille enzymatique, incluant les polypeptides de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID

N°2 et SEQ ID N°3.

Pour référence, la séquence SEQ ID N°3, correspond au polypeptide SEQ ID

N°9 après clivage du peptide signal; et la séquence SEQ ID N°8 correspond au peptide signal clivé.

Ainsi, en combinant ces données structural et les séquences consensus dérivables de cette sélection d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase, il est possible de déterminer n'importe quel variant ayant l'activité polysaccharide-oxydase considérée.

De manière non-limitative, des méthodes bio-informatiques existent pour identifier de nouveaux variants faisant partie de la dite nouvelle famille de LPMO, en mettant en oeuvre d'une part une modélisation in silico basée sur la diste structure cristallographique, et d'autre part les dits alignements de séquence. Des exemples de tels programmes aptes à réaliser de tels modèles tridimensionels (homology & comparative modeling) incluent:

- MODELLER© V.9.18 (see B. Webb, A. Sali. Comparative Protein Structure

Modeling Using Modeller. Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., 5.6.1-5.6.32, 2014) ;

- I-TASSER V.5.1 (See J Yang, R Yan, A Roy, D Xu, J Poisson, Y Zhang. The I-TASSER Suite: Protein structure and function prédiction. Nature Methods, 12: 7-8 (2015)) and

- SWISS-MODEL homology-modelling server (see Biasini M, Bienert S, Waterhouse A, Arnold K, Studer G, Schmidt T, Kiefer F, Cassarino TG, Bertoni M, Bordoli L, Schwede T (2014). SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information (Nucleic Acids Research 2014 (1 July 2014) 42 (Wl): W252-W258).

Ainsi, selon un mode de réalisation, il est possible d'identifier des enzymes à activité polysaccharide oxydases, selon une méthode comprenant les étapes suivantes: al) identifier un ou plusieurs polypeptides susceptibles d'avoir une activité polysaccharide-oxydase;

a2) identifier des coordonnées expérimentales d'une chaîne principale d'un polypeptide de référence, incluant ou non les positions des chaînes latérales, la dite chaîne principale et/ou les dites chaînes latérales étant comprises dans un polypeptide de séquence SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 7, ou un de leurs fragments à activité polysaccharide- oxydase;

a3) identifier un alignement de séquence d'un ou plusieurs des dits polypeptides candidats avec un polypeptide de référence possédant une identité de séquence de 20 % ou plus avec SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3 ou SEQ ID NO 7 selon la méthode de comparaison BLAST-P, caractérisés en ce que les dits un ou plus polypeptides candidats possèdent une E-value de 10 e ^-3 ou moins;

b) déterminer à partir de al), a2), et a3), les coordonnées théoriques des dits un ou plusieurs polypeptides candidats;

c) déterminer la déviation RMSD (root-mean-square déviation) desdites coordonnées théoriques avec les coordonnées expérimentales du dit polypeptide référence;

étant entendu qu'un RMSD augmenté des dites coordonnées théoriques par rapport aux coordonnées expérimentales au delà d'un seuil de référence, indique une plus faible probabilité d'avoir une activité polysaccharide-oxydase;

étant entendu qu'un RMSD diminué des dites coordonnées théoriques par rapport aux coordonnées expérimentales au delà d'un seuil de référence, indique une plus forte probabilité d'avoir une activité polysaccharide-oxydase;

d) optionnellement, choisir les un ou plus polypeptides candidats dont les coordonnées théoriques définissent un site d'interaction au cuivre de type "histidine brace active site", formé par deux résidus Histidine et une tyrosine, l'un des deux résidus Histidine étant une Histidine N-terminale. EXEMPLES

MATERIEL & METHODES A.1. clonage et production des gènes

La séquence de nucléotides a été synthétisée par optimisation de codons à partir de P. pastoris (GenScript, Piscataway, USA, et ensuie insérée avec la séquence signal native dans un vecteur pPICZaA (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) en utilisant les sites de restriction BstBl and Xbal, en phase avec la séquence (His) ₆ tag en C-terminal. La souche P. pastoris X33 et le vecteur pPICZaA sont des composants du système Easy Select Expression System (Invitrogen), et tous les milieux et protocoles sont décrits dans e manuel du fabricant (Invitrogen).

La transformation des colonies compétentes P. pastoris X33 a été réalisée par électroporation à partir d'un plasmide recombinant pPICZaA linéarisé par Pmel tel que décrit dans Bennati-Granier et al (Biotechnol. Bio fuels 8, 90 (2015)).

Les transformants résistants à la Zeocine ont été ensuite testés (criblés) en fonction de leur production de protéine. Les meilleurs transformants ont été cultivés dans 2 litres de BMGYcontenant 1 ml.l ^-1 de sels minéraux Pichia (PTM4) comme suit: (2 g.l ^-1 CuS0 ₄ .5H ₂ 0, 3 g.l ^-1 MnS0 ₄ .H ₂ 0, 0.2 g.l ^-1 Na ₂ Mo0 ₄ .2H ₂ 0, 0.02 g.l ^-1 H3BO3, 0.5 g.l ^-1 CaS0 ₄ .2H ₂ 0, 0.5 g.l ^-1 CaCl ₂ , 12.5 g.l ^-1 ZnS0 ₄ .7H ₂ 0, 22 g.l ^-1 FeS0 ₄ .7H ₂ 0, biotin 0.2 g.l ^-1 , H ₂ S0 ₄ 1 ml.l ^-1 ); sous agitation à 30°C (200 rpm) jusqu'à une OD ₆ oo comprise entre 2 et 6.

Les cellules sont ensuite transférées dans 400 mL de BMMY contenant 1 ml.l ^-1 de sels PTM4 à 20 °C sous agitation (200 rpm) pendant 3 jours, supplémentés avec 3 % (v/v) de méthanol chaque jour.

La purification a été réalisée comme déjà décrit dans Bennati-Granier et al (2015) et la protéine concentrée est dialysée dans un tampon sodium acétate, pH 5.2 et stockée à 4°C. A.2. Production des LPMO de type AAxx par P. coccineus

Le transformant produisant la plus grande quantité de protéine a été sélectionné pour la culture en bioréacteur. Celle-ci est réalisée dans des fermenteurs de type New Brunswick BioFlo 115 contenant 1,3L (Eppendorf, Hamburg, Germany) selon le protocole de fermentation de P. pastoris (Invitrogen) contenant quelques modifications. P. pastoris est cultivé en milieu solide YPD agar (20 g.L-1 peptone, 10 g.L-1 yeast extract, 20 g.L-1 glucose, 20 g.L-1 agar). lOOmL de milieu BMGY contenu dans une flasque de 500mL sont inoculés à partir d'une colonie isolée de P. pastoris et incubé à 30°C dans un incubateur rotatif sous agitation (200 rpm) pendant 16 à 18h jusqu'à l'obtention d'une DO 600 comprise entre 4 et 6. Un inoculum de 10% (v/v) provenant de cette préculture servira à ensemencer le bioréacteur. La première étape de la culture en batch se fait dans 400 mL de milieu minimum contenant 40 g.L-1 glycerol; 26.7 mL.L-1 H 3 P04 ; 14.9 g.L-1 MgS04 .7H20; 0.93 g.L-1 CaS04 .2H20; 7.7 g.L-1 KC1; 4.13 g.L-1 KOH; 4.35 mL.L-1 PTM 1 sait solution (6 g.L-1 CuS04 .5H 2 O, 0.08 g.L-1 Nal, 3 g.L-lMnS04 .H 2 O, 0.2 g.L-1 Na2Mo04 .2H20, 0.02 g.L-1 H3BO 3 , 0.5 g.L-1 CoC12 , 20 g.L-1 ZnCl 2 .7H20, 0.2 g.L-lbiotin, 5 mL.L-1 H2SO 4 , 65 g.L-1 FeS04 .7H 2 O). Cette étape est réalisée à 30°C, sous agitation à 400 rpm et à pH maintenu à 5 par ajout d'hydroxyde d'ammonium (28% v/v). L'oxygénation du milieu est contrôlée à 20% par un enrichissement en oxygène par cascade (0-50%>) selon débit gazeux de 0.5 v.v.m. 200 mL de Pluriol 8100 (BASF, Ludwigshafen, Germany) sont ajoutés à la culture en tant qu'agent antimoussant. Après 20 à 24h de culture, la seconde phase débute par l'ajout simultané de 50 g de sorbitol et de 0.5%) de méthanol (v /v) au bioréacteur afin que les levures basculent sur le métabolisme du méthanol (environ 5h). Pendant cette phase, l'agitation est augmentée jusqu'à 500 rpm et le pH est progressivement augmenté jusqu'à pH6 par ajout d'hydroxyde d'ammonium (28%o v/v). La phase d'induction (phase 3) débute par l'ajout d'une solution de méthanol contenant 12 mL.L-1 de sels PTM1 (contenant du cuivre) selon un mode « fed-batch ». Le débit initial est de 1.47 mL.h-1 et est augmenté après environ 14h d'incubation à 2.94mL.h-l . La phase d'induction est réalisée à 20°C et la concentration d'oxygène dissous est maintenu à 20%> par agitation (800rpm), débit gaz (0.2-1 v.v.m.) et la cascade d'oxigéne (0-50%>). La phase d'induction est poursuivie pendant 144h.

A3. Purification des LPMOs de type AAxx de P. pastoris

Les surnageants de la culture sont récupérés après centrifugation à 2700 g pendant 5 min à 4 °C et sont passés à travers des filtres de 0.45 μιτι (Millipore, Molsheim, France) afin d'enlever les cellules restantes. Pour les enzymes présentant un tag 6xhis, le pH est ajusté à 7.8 et les surnageants sont filtrés une seconde fois à travers des filtres de 0.2 μηι avant d'être déposé dans une colonne His Trap HP de 5 mL (GE healthcare, Bue, France) connecté au système Akta Xpress (GE healthcare). La colonne est équilibrée dans un tampon contenant 50 mM de Tris HC1 pH 7.8 et 150 mM de NaCl (buffer A) avant la charge. Après le dépôt des surnageants, la colonne est lavée avec 5 volumes de colonnes (CV) de buffer A contenant lOmM d'imidazole. L'élution est ensuite réalisée par le passage de 5 CV de buffer A contenant 150 mM d'imidazole. Les fractions contenant la protéine purifiée sont assemblées et concentrées en utilisant un concentrateur vivaspin 3kDa (Sartorius, Palaiseau, France) avant d'être chargé dans une colonne HiLoad 16/600 Superdex 75 Prep Grade (GE Helthcare) pour séparation dans 50 mM de tampon acétate à pH 5.2. L'analyse de la fïltration par gel a montré que les protéines PcAAxx sont monomériques en solution même après addition de cuivre. Pour les enzymes ne contenant de tag 6xhis, les sels contenus dans le milieu de culture sont dilués 10 fois dans 20 mM de Tris-HCl pH 8 et les protéines sont ensuite concentrées en utilisant une cassette Pellicon-2 avec un eut off de lOkDa (Millipore) jusqu'à obtenir un volume d'environ 200 mL qui sera chargé dans une colonne High Prep DEAE de 20 mL (GE Healthcare). Les protéines sont ensuite éluées de la colonne selon un gradient linéaire de 1M de NaCl (0 à 700mM dans 200mL). Les fractions sont ensuite analysées par SDS-PAGE pour vérifier la présence de la protéine recombinante et les fractions contenant la protéine sont rassemblées dans un même échantillon et concentrées. Les protéines concentrées sont enfin incubées pendant une nuit dans une solution contenant leur équivalent molaire de cuivre avant une autre étape de séparation utilisant une colonne HiLoad 16/600 Superdex 75 Prep Grade dans 50 mM de tampon acétate à pH 5.2. Enfin les fractions contenant les protéines purifiées sont rassemblées dans un même échantillon et concentrées avec une colonne de concentration vivaspin 3kDa (Sartorius).

A.4. Cristallisation des protéines PcAAxxB purifiées

Les protéines purifiées PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370) sont concentrées avec un concentrateur Vivaspin lOkDa en polyethersulfone (Sartorius). La concentration des protéines est déterminée en mesurant ΓΑ280 nm de la solution avec un Nanodrop ND-2000 (Wilmington, Delaware, USA). Toutes les expériences de cristallisation ont été réalisées à 20 °C par la technique de gouttes assises (diffusion par vapeur) en plaque de cristallisation à 96 puits (Swissci) avec un robot de cristallisation mosquito® Crystal (TTP labtech). Les réservoirs contiennent 40 μΐ, de solution de criblage commerciale et les gouttes de cristallisation sont préparées en mélangeant 100 nL de solution réservoir avec 100, 200 et 300 nL de solution contenant la protéine à cristalliser. Un premier résultat a été obtenu au bout d'une semaine à partir d'une des conditions préparée avec la solution screen AmSO 4 (Qiagen) contenant 2.4 M (NH4) 2 S04 et 0.1M d'acide citrique pH4. Afin d'obtenir des cristaux capable de générer un signal de diffraction, cette condition de cristallisation a été optimisée en mélangeant la solution protéique à 28 mg.mL-1 avec une solution de précipitation composée de 2.4 M (NH4)2 S 04 et de 0.1 M d'acide citrique à pH 4.4 selon un ratio en volume de 3: 1. Les cristaux de PcAAxxB sont générés en une semaine à la dimension de 0.15x0.15x0.05 mm. Les cristaux appartiennent au groupe d'espace P41212 et possèdent des axes de 204x204x 110 Â et 2 molécules par unité asymétrique. A.5. Collecte des données, détermination de la structure et affinement

A des fins de cryoprotection, les cristaux de PcAAxx sont incubés pendant 5 min dans une solution de 2.4M Li2SO4 pour remplacer les 2.4M de (NH4)2 S04 de la solution mère avant un refroidissement instantané dans de l'azote liquide. Comme les premières tentatives de scan de fluorescence par rayon X sur les crystaux natifs n'a pas révélés la présence significative d'atome de cuivre au sein des cristaux, un cristal dérivé est obtenu par introduction d'un atome lourd en incubant les cristaux dans la solution réservoir supplémentée avec 55 mM du complexe gadoteridol- gadolinium (Gd) avant le refroidissement. Les données de la diffraction initiale ont été collectées avec une ligne de lumière beamline ID23-1, tandis que les données MAD ont été collectées avec une ligne de lumière beamline ID30B au laboratoire European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France. Les données ont ensuite été indexées et intégrées dans le groupe d'espace P41212 un utilisant XDS. Le traitement des données nécessaire a été réalisé avec la suite de programme CCP4. La détermination de la sous structure de GD3+ et le phasage subséquent combiné à l'aplanissement du solvant (solvent flattening) a été réalisé avec SHELXC/D/E, et en utilisant les données S AD collectées sur le bord du Gd qui ont permis d'obtenir un coefficient de corrélation de 71.8%. A partir des phases expérimentales, un modèle initial contenant 526 résidus (sur 584) a été automatiquement construit avec Buccaneer et ensuite manuellement complété avec Coot (44). Ce modèle initial a été utilisé pour raffinement corps rigide (rigid body) suivi de raffinement restreint contre les données natives avec le programme Refrnac. Un jeu aléatoire de 5% de réflexions a été mis en oeuvre pour permettre la validation du modèle. La qualité du modèle a été déterminée avec les modules internes de Coot et en utilisant le serveur Molprobity. Les données collectées et les statistiques d'affïnement sont résumées ci- dessous :

Tableau 1 : Statistiques d'affïnement

A.6. Analyse bioinformatique des LPMOs AAxx

Les séquences des AAxx de P. coccineus (Genbank ID KY769369 and KY769370) ont été comparées à la base de données de séquences non redondantes de NCBI avec BlastP (29) en février 2016. Les analyses par blast à partir de AAxx n'ont pas permis de retrouver AA9s, AAlOs, AAl ls, ou AA13s avec des scores significatifs, et inversement. MUSCLE a été utilisé pour réaliser les alignements multiples. Afin d'éviter les interférences dues à la présence ou à l'absence de résidus additionnels, les peptides signaux et les extensions C-terminal ont été retirées. Les analyses bio informatiques ont été réalisées à partir de 286 génomes fongiques préalablement séquencés et partagés par des collaborateurs du JGI. Les clusters protéiques sont disponibles grâce au JGI (https ://goo . gl/Z Aa2NX) pour chacune des variétés de champignons. 100 alignements de protéines provenant de clusters de protéines sélectionnés ont préalablement été nettoyés et fusionnés afin de générer un arbre phylogénétique. Ces clusters sont présents en une copie », autant que possible, en une copie dans toutes les variétés de champignons pour améliorer le score∑l/n (n représente le nombre de copie dans le génome). Les séquences provenant des clusters ont été alignées avec Mafft et nettoyées avec Gblocks, et l'arbre phylogénétique a été généré par concaténation des alignements avec Fasttree. L'arbre est visualisé avec Dendroscope et Bio::phylo.

Voir figure 1 pour l'arbre phylogénétique et les figures 3A et 3B correspondant à la séquence consensus du module catalytique. A.7. protocole de charge du cuivre

Les enzymes AAxx ont été chargées en cuivre à partir de sels de cuivre (sulfate ou acétate) pendant ou après la purification. Les protéines ont été incubées avec 10 équivalent molaire de sels de cuivre entre 2h et une nuit à 4°C. L'excès de cuivre a ensuite été retiré par diafiltration avec des centricons de 3kDa ou par chromatographie par filtration sur gel. La présence de cuivre peut être déterminée par spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS), comme décrit ci-dessous.

A.8. Analyse ICP-MS

Avant l'analyse, les échantillons sont minéralisés dans un mélange contenant 2/3 d'acide nitrique (Sigma-Aldrich, 65 % Purissime) et 1/3 d'acide hydrochlorique (Fluka, 37%, Trace Select) à 120°C. Les résidus sont dilués dans de l'eau ultrapure (2 mL) avant l'analyse par ICP-MS. L'instrument permettant l'analyse ICP-MS est un ICAP Q (ThermoElectron, Les Ullis, France), équipé d'une chambre de collision. La courbe de calibration est obtenue par la dilution d'une solution certifiée multi-éléments (Sigma- Aldrich). Les concentrations en cuivre sont déterminées avec le programme Plasmalab (Thermo-Electron), à une masse d'intérêt de m/z=63.

A.9. Tests de défibrillation

Des dispersions aqueuses de fibres de cellulose Kraft sont ajustées à pH 5.2 dans un tampon acétate (50 mM), dans un volume réactionnel final de 5 mL. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°l (LPMO AAxx) est ajouté aux fibres à une concentration finale de 20 mg.g ^"1 en présence d'acide ascorbique à 1 mM. L'incubation enzymatique est réalisée à 40°C sous agitation légère pendant 48 heures. Les échantillons sont ensuite dispersés par un homogénéiseur Polytron PT2100 Kinematica AG, Allemagne) pendant 3 minutes, puis soumis à ultrasonication avec un sonicateur de type QSonica Q700 (20 kHz, QSonica LLC, Newtown, USA) à une puissance d'ultrasons de 350 W pendant 3 minutes comme décrit précédemment {Villares et al, Sci Rep. 2017 Jan 10; 7:40262. doi: 10.1038/srep40262) . L'échantillon de référence est soumis au même traitement, en l'absence d'enzyme. Les fibres de cellulose (référence et traité par PcAAxx) sont déposées sur une lamelle de verre et observées par microscope polarisant BX51 (Olympus France S.A.S.) avec un objectif 4x. Les images sont prises avec une caméra de type U-CMAD3 (Olympus Japon).

Les images en microscopie optique ainsi qu'en microscopie de force atomique (AFM) et microscopie électronique à transmission (TEM) ont été prises après le dépôt des fibres à une concentration 0.1 g/L sur des substrats solides, après séchage par courant d'azote.

RESULTATS

Exemple 1: structure cristallographique du module catalytique de PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370) à 3.0 À

La structure cristallographique du module catalytique de PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370), affiné à une résolution de 3.0 Â, révèle un noyau ("core") structuré et un site catalytique formé selon un mode de coordination canonique de type "histidine brace", exposé à la surface.

PcAAxxB (#KY769370) a été produit en grandes quantités chez Pichia pastoris et purifié jusqu'à homogénéité.

La structure de PcAAxxB a été résolue par la technique MAD (multiple- wave length anomalous dispersion) à partir du signal du gadolinium, puis affinée à 3.0 Â de résolution. Le noyau de la protéine se structure en un large sandwich β antiparallèle, un repliement qui est globalement similaire à celui déjà identifié pour d'autres familles.

Le site actif de PcAAxxB est constitué par Hisl, His99 et Tyrl76, qui forment un mode de coordination canonique de type "histidine brace" (voir figure 2). Par contraste avec les surfaces planes d'interaction avec le ligand qui sont ordinairement observables chez les LPMOs de type AA9, la surface de PcAAxxB a une forme ridée ("rippled shape") présentant un clamp formé par deux boucles proéminentes, visible à partir du format pdb (Protein Data Bank). Cinq N-glycanes sont attachés à la structure cristallographique de PcAAxxB, à travers les résidus Asparagine suivants: Asnl3, Asn76, Asnl33, Asnl83 et Asn217.

La structure cristallographique indique en outre la présence de 10 résidus Cystéine impliqués dans cinq ponts disulfure, aux positions suivantes: Cys67 & Cys90; Cysl09 & Cysl36; Cysl53 & Cysl58; Cysl60 & Cysl82; Cys202 & Cys218.

La structure cristallisée inclut deux molécules par unité asymétrique. Les coordonnées de la chaîne A sont ici présentées au format pdb. La chaîne B, qui fait également partie de l'unité asymétrique, n'est pas représentée ici.

Lorsqu'elle est visualisée par le logiciel PyMOL© Viewer 1.7.4.5 Edu (Schrodinger, LLC), la structure est caractérisée par 6 feuillets β formant un coeur de type sandwich-β antiparallèle, dont les limites (par référence à la séquence SEQ ID N°2) sont définies comme suit:

- du résidu Phe53 à Glu64;

- du résidu Cysl09 à Alal 14;

- du résidu Thrl28 à Asnl33;

- du résidu Phel41 à Vall46;

- du résidu Cysl58 à Trpl64;

- du résidu Metl77 à Thrl85.

La séquence SEQ ID N°7 correspond au fragment minimal de séquence SEQ ID N°2 comprenant les trois acides aminés impliqués dans la triade catalytique fixant le cuivre, incluant le résidu Histidine en position N-terminale, et comprenant en outre le sandwich-β antiparallèle, jusqu'au résidu Thrl85.

Les résidus suivants compris dans la séquence SEQ ID N°2 peuvent être en outre positionnés par rapport à une séquence consensus dérivée de la figure 3, comme suit: Tableau 1A: Séquence Consensus et position sur SEQ ID N°2

Tableau 1B: Séquence Consensus et position sur SEQ ID N°2 (Résidus Cystéine)

Exemple 2: Défibrillation de supports cellulosiques issus de bouleau et résineux sous l'action des mono-oxvgénases lytiques de polysaccharides (LPMO)

Les fibres sont mises en contact d'une enzyme à activité polysaccharide oxydase selon l'invention, de séquence SEQ ID N°l, et d'ascorbate puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures. En absence d'enzyme les fibres restent intactes et aucune modification n'est constatée.

Après 48 heures de traitement en présence de l'enzyme, un début de défibrillation est constaté après la dispersion mécanique des fibres.

Les dispersions ont été ensuite analysées par microscopie optique, microscopie électronique en transmission (TEM) et microscopie à force atomique (AFM). Les images montrent des structures de dimensions nano métriques. Les fibres sont entièrement déstructurées laissant apparaître les zones cristallines de la fibre (figures 4 et 5).

Exemple 3 : Production de peroxide d'oxygène par les polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO.3

Afin de déterminer la fonction des polypeptides de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3, leur capacité à produire du peroxide d'hydrogène ( H ₂ 0 ₂ ) a été évaluée, en présence d'oxygène et d'un donneur d'électrons (ascorbate). Une production significative d' H ₂ 0 ₂ a été détectée. Cette production est similaire en amplitude à celle observée pour les LPMOs d'autres familles décrites dans la littérature, telles que les LPMOs AA9 de P. anserina (Bennati-Granier et al., 2015, Biotechnol. Bio fuels 8, 90). Exemple 4 : Activité de dégradation de polysaccharides de polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO.3, dans un test de dégradation séquencielle de lignocellulose

La dégradation de biomasse ligocellulosique par des polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et d'un cocktail de cellulase de T.reesei a été testé par réactions séquentielles. Des supports cellulosiques de type "peuplier" ont d'abord été incubés avec 2.2 μΜ (équivalent à 70 μg) de polypeptide de séquence SEQ ID NO. 1 ou 2.2 μΜ (équivalent à 70 μg) de polypeptide de séquence SEQ ID NO.2 pendant 48 heures; suite auxquelles 10 μg de cocktail de cellulases T. reesei TR3012 ont été rajoutés. Les réactions ont été incubées pendant 24 heures.

L'analyse des sucres solubles libérés a été faite selon plusieurs méthodologies (DNS assay, RTU assay et HPAEC), lesquelles ont montré une amélioration de la libération de glucose et de cello-oligosaccharides. L'addition de quantités supplémentaires de polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO.2 a résulté en une augmentation proportionnelle de la libération de glucose.

Exemple 5 : Activité de dégradation de polysaccharides de polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, et SEQ ID NO. 2 dans un test de dégradation séquencielle de lignocellulose, en présence de LPMO de type AA9

La dégradation de biomasse ligocellulosique par des polypeptides de séquences

SEQ ID NO. 1, en combinaison avec des LPMOs de type AA9, a été testé par réactions séquentielles.

Des supports cellulosiques de type "peuplier" ont d'abord été incubés avec (i) un milieu de contrôle, (ii) 2.2 μΜ (équivalent to 35 μg) de polypeptide SEQ ID NO. 1 , (iii) 2.2. μΜ de LPMO de type AA9 et (iv) 1.1 μΜ de polypeptide SEQ ID NO. 1 et 1.1. μΜ de LPMO de type AA9, pendant 48 heures; suite auxquelles 10 μg de cocktail de cellulases T. reesei TR3012 ont été rajoutés. Les réactions ont été incubées pendant 24 heures.

L'analyse des sucres solubles libérés a été faite selon plusieurs méthodologies (DNS assay, RTU assay et HPAEC), lesquelles ont montré une amélioration de la libération de glucose et de cello-oligosaccharides.