Parmi les méthodes actuellement disponibles pour étudier des interactions entre protéines, le système double-hybride, et plus récemment celui du triple-hybride, s'avèrent tre des méthodes particulièrement performantes.

Le système double-hybride est basé sur la reconstitution d'un activateur transcriptionnel dans la levure (Fields S. et Song O., 1989 ; Chien C.-T. et al., 1991). Une première protéine est clonée en fusion avec le domaine de liaison à l'ADN, alors qu'une deuxième protéine est clonée en fusion avec le domaine d'activation de la transcription. Lorsque les deux protéines d'intért interagissent entre elles, un activateur transcriptionnel est formé permettant la transcription de gènes rapporteurs.

Un système triple-hybride, reprenant le principe du double-hybride, en insérant dans les vecteurs utilisés une séquence d'ADN codant un troisième partenaire, a été développé par Zhang et Lautar (Zhang J. et al., 1996).

Toutefois, les systèmes double-hybride et triple-hybride actuellement disponibles, présentent, comme inconvénient majeur, la nécessité de faire un test d'interaction avec un témoin négatif, ce qui correspond à effectuer les deux expériences distinctes suivantes : -une première expérience où les cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs contenant la séquence d'ADN codant la protéine testée, et les séquences d'ADN codant le ou les partenaires potentiels de cette protéine testée, et -une deuxième expérience servant de témoin négatif, dans laquelle les cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs ne contenant pas la séquence d'ADN codant la protéine testée, mais seulement celles codant le ou les partenaires potentiels de cette protéine testée.

Ces deux expériences sont distinctes car les cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs différents en fonction de l'expérience effectuée.

Outre le fait que cette nécessité d'effectuer ces deux expériences distinctes ne permet pas de contrôler rapidement l'influence de la protéine testée sur le ou les autres partenaires, il arrive fréquemment que l'absence de

croissance de ces témoins négatifs, résulte de mutations ou de recombinaisons éventuelles dans un des vecteurs, ce qui conduit à des résultats erronés.

Un des buts de la présente invention, est précisément de fournir de nouvelles méthodes d'étude d'interactions entre protéines, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de deux expériences distinctes, ces méthodes étant par conséquent plus simples à mettre en oeuvre, plus rapides et plus fiables que les méthodes actuellement proposées.

L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un promoteur conditionnel pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection d'une (ou plusieurs) protéine (s) (ou polypeptides) interagissant directement ou indirectement avec au moins deux autres protéines (ou polypeptides) dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.

Par protéine interagissant directement avec au moins deux autres protéines dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, on entend : -toute protéine s'associant à au moins deux autres protéines pour former avec ces dernières un complexe protéique constitué d'au moins trois protéines, ou -toute protéine catalysant la formation d'un complexe protéique entre au moins deux protéines (sans pour autant s'associer à ces dernières pour former un complexe protéique), notamment par un mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires du complexe protéique.

Par protéine interagissant directement avec au moins deux autres protéines dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique, on entend : -toute protéine inhibant la formation du complexe protéique constitué d'au moins ces deux autres protéines susmentionnées, notamment par un mécanisme de compétition avec l'un des partenaires du complexe protéique, ou -toute protéine catalysant l'inhibition de la formation du complexe protéique constitué d'au moins ces deux autres protéines, notamment par un mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires dudit complexe protéique.

Parmi les promoteurs conditionnels susceptibles d'tre utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer : -le promoteur Met25 (Kerjan P. et al., 1986), réglable en fonction de la concentration en méthionine, ou -les promoteurs GAL1 ou GAL10 (Johnston and Davis, 1984), régulables en fonction de la concentration en galactose.

L'invention a également pour objet toute méthode de détection d'une protéine telle que définie ci-dessus interagissant avec au moins deux protéines déterminées, dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique, caractérisée en ce qu'elle comprend : -une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec un ou plusieurs vecteurs, de manière à ce que le génome de ces cellules hôtes contienne la séquence d'ADN codant la protéine testée susceptible d'tre détectée, ainsi que les séquences d'ADN codant au moins deux protéines déterminées, la transcription de l'une au moins des séquences d'ADN étant placée sous le contrôle d'un promoteur conditionnel, -la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel, avec les effets de l'activation de ce promoteur conditionnel, sur l'éventuelle transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, les résultats de cette comparaison étant corrélables à la détection d'une interaction, ou au contraire d'une absence d'interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées.

De préférence, la méthode décrite ci-dessus de détection d'une protéine interagissant directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées, comprend : -une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec un ou plusieurs vecteurs, de manière à ce que le génome de ces cellules hôtes contienne : . d'une part la séquence d'ADN codant ladite protéine testée susceptible d'interagir avec au moins deux protéines déterminées, la transcription de cette séquence d'ADN étant placée sous le contrôle d'un promoteur conditionnel, . et, d'autre part, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées, -la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel, avec les effets de l'activation de ce promoteur conditionnel, sur l'éventuelle transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, les résultats de cette comparaison étant corrélables à la détection d'une interaction, ou au contraire d'une absence d'interaction entre ladite protéine testée et lesdites protéines déterminées.

Par transformation de cellules hôtes avec un vecteur, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute méthode permettant d'ajouter dans le génome desdites cellules, le contenu de séquences d'ADN d'un vecteur, notamment de type plasmide ; les cellules hôtes résultantes sont désignées dans

ce qui précède et ce qui suit par 1'expression"cellules hôtes transformées". Par génome d'une cellule, on entend 1'ensemble de l'ADN contenu dans une cellule, à savoir l'ADN des chromosomes, des mitochondries et des épisomes.

Ainsi, la méthode de l'invention présente l'avantage de ne pas comprendre deux expériences distinctes telles que décrites ci-dessus, dont une expérience servant de témoin négatif par culture parallèle de cellules hôtes transformées avec des vecteurs ne contenant pas de séquence d'ADN codant la protéine testée, aux fins de comparaison avec l'étape de culture des cellules hôtes transformées avec des vecteurs contenant 1'ensemble des séquences d'ADN codant les protéines susceptibles d'interagir entre elles.

En effet, les cellules hôtes mises en culture dans la méthode de la présente invention, soit à titre de témoin négatif (ou de témoin interne), soit pour mettre en évidence une interaction entre les protéines, sont transformées par les mmes vecteurs, évitant ainsi de conduire à des résultats erronés, comme indiqué ci-dessus dans le cadre des méthodes actuellement proposées dans ce domaine.

Ainsi, un des aspects particulièrement avantageux des méthodes de l'invention, est que le contrôle est interne à l'expérience, ce qui rend ces méthodes particulièrement adaptées au criblage d'une banque d'ADNc, ou d'une banque synthétique dégénérée d'oligonucléotides, susceptibles de contenir une (ou plusieurs) séquence (s) d'ADN codant une (ou plusieurs) protéine (s) interagissant avec au moins deux autres protéines déterminées.

L'invention a plus particulièrement pour objet, toute méthode telle que décrite ci-dessus, dans laquelle : -deux des protéines codées par les séquences d'ADN contenues dans le (ou les) vecteur (s) utilisé (s) pour la transformation desdites cellules hôtes, sont en fusion, pour l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN, et pour l'autre, avec un domaine d'activation de la transcription, la transcription des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle de promoteurs constitutifs, -l'autre de ces protéines, ou l'une au moins des autres protéines codées par la ou les séquences d'ADN contenues dans le ou les vecteurs susmentionnés, est codée par une séquence d'ADN dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.

Avantageusement, les deux protéines déterminées, ou au moins deux desdites protéines déterminées, codées par les séquences d'ADN contenues dans le (ou les) vecteur (s) utilisé (s) pour la transformation desdites cellules hôtes, sont en fusion, pour l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN,

et pour l'autre, avec un domaine d'activation de la transcription, la transcription des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle de promoteurs constitutifs.

Parmi les domaines de fixation à l'ADN susceptibles d'tre utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer : -LexA (décrit notamment dans Vojtek A. et al., 1993), ou -GAL4 DBD (décrit notamment dans Fields S. and Song O., 1989, et Chien C.-T. et al., 1991, susmentionnés), -ERE (Estrogen Response Element) (décrit notamment dans Klein- Hitpass L. et al., 1986, et dans le Douarin B. et al., 1995).

Parmi les domaines d'activation de la transcription susceptibles d'tre utilisés dans de cadre de la présente invention, on peut citer : -l'activateur transcriptionnel de VP16 (décrit notamment dans Vojtek A. et al. susmentionné), ou -GAL4 AD (décrit notamment dans Fields S. and Song O., 1989, et Chien C.-T. et al., 1991, susmentionnés).

La méthode susmentionnée de l'invention peut tre effectuée à l'aide d'un vecteur contenant l'ensemble des séquences d'ADN codant pour les protéines en question, ou de préférence à l'aide de plusieurs vecteurs construits de telle manière que : -l'un d'entre eux contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur constitutif, tandis qu'un autre vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation, et dont la transcription est également sous le contrôle d'un promoteur constitutif, -l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient une séquence d'ADN codant une protéine susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel, -le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou plusieurs autres vecteurs, contiennent une ou plusieurs séquences d'ADN codant une protéine susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel (avantageusement différent du promoteur conditionnel précédent), ou d'un promoteur constitutif.

Avantageusement, la méthode susmentionnée de l'invention est effectuée à l'aide de plusieurs vecteurs tels que : -l'un d'entre eux contient une séquence d'ADN codant une des protéines déterminées en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, et dont la

transcription est sous le contrôle d'un promoteur constitutif, tandis qu'un autre vecteur contient une séquence d'ADN codant une autre protéine déterminée en fusion avec le domaine d'activation, et dont la transcription est également sous le contrôle d'un promoteur constitutif, -l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient la séquence d'ADN codant la protéine testée susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel, -le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou plusieurs autres vecteurs, contiennent une ou plusieurs séquences d'ADN codant une autre protéine déterminée susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel différent du promoteur conditionnel précédent, ou sous le contrôle d'un promoteur constitutif.

A titre d'illustration, la détection d'une interaction entre une protéine testée et deux protéines déterminées peut tre effectuée à l'aide de deux vecteurs tels que : -l'un d'entre eux contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, -l'autre vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation, -l'un des deux vecteurs susmentionnés contient la séquence d'ADN codant pour la protéine testée susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.

La méthode susmentionnée de l'invention, pour la détection d'une interaction entre une protéine testée et deux protéines déterminées, peut également tre effectuée à l'aide de trois vecteurs tels que : -le premier vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, -le deuxième vecteur contient la séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation, -le troisième vecteur contient la séquence d'ADN codant pour la protéine testée susceptible d'interagir avec les précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.

Avantageusement, les vecteurs susmentionnés contiennent également une séquence d'ADN correspondant à un gène de sélection, tel qu'un gène codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé particulier pour lequel la souche de cellules hôtes transformées est auxotrophe.

Les cellules hôtes transformées par les vecteurs susmentionnés dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, sont avantageusement telles que leur génome comprend un ou plusieurs gènes rapporteurs dont la transcription est placée, pour chacun d'entre eux, sous le contrôle d'un opérateur reconnu par le domaine de fixation à l'ADN codé par l'un des vecteurs susmentionnés, la transcription de ces gènes rapporteurs ayant lieu lorsqu'il y a formation, le cas échéant sous l'influence directe ou indirecte de la protéine testée, d'un complexe protéique entre les protéines déterminées produites dans les cellules hôtes transformées mises en culture.

Parmi les gènes rapporteurs susceptibles d'tre contenus dans le génome des cellules hôtes, on peut citer, à titre d'exemple : -tout gène codant une enzyme susceptible de réagir avec un substrat déterminé dans des conditions permettant de détecter, voire de mesurer, le résultat de cette réaction enzymatique dans le milieu de culture des cellules transformées, notamment une enzyme réagissant avec un substrat dans le cadre d'une réaction colorée, par exemple le gène LacZ permettant de détecter, voire de mesurer, une activité p-galactosidase ; une telle activité p-galactosidase peut par exemple se traduire par une coloration bleue en utilisant le 5-bromo-4- chloro-3-indolyl ß-D-galactoside (ou Xgal) à titre de substrat, ou encore par une coloration jaune en utilisant l'O-nitrophényl-ß-galactoside (ONPG) à titre de substrat, -tout gène codant une enzyme responsable du métabolisme d'un composé particulier, notamment d'un acide aminé, pour lequel la souche de cellules hôtes transformées est auxotrophe.

Avantageusement, les cellules hôtes utilisées sont auxotrophes pour les acides aminés dont le métabolisme est sous la dépendance des enzymes codées par les gènes de sélection contenus dans les vecteurs susmentionnés et, le cas échéant, pour l'acide aminé dont le métabolisme est sous la dépendance de l'enzyme codée par un gène rapporteur contenu dans le génome desdites cellules hôtes.

A titre d'exemple, la souche de cellules hôtes utilisée est une souche de levures, notamment la souche de levure L40, dont le génome contient à titre de gènes rapporteurs le gène HIS3 (codant pour une enzyme du métabolisme de l'histidine) et le gène LacZ codant la ß-galactosidase, la transcription de ces gènes rapporteurs étant sous le contrôle d'un opérateur reconnu par le domaine de fixation à l'ADN LexA.

Avantageusement, dans le cadre de la détection d'une protéine telle que définie ci-dessus, susceptible d'interagir directement ou indirectement avec au

moins deux protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées sont choisies parmi celles codant des protéines ne formant pas ou peu de complexes protéiques entre elles.

Dans ce cas, il n'y a pas de transcription, voire une faible transcription, lu ou des gènes rapporteurs des cellules hôtes transformées par le ou les vecteurs définis ci-dessus, lorsque ces cellules sont mises en culture en réprimant ledit promoteur conditionnel sous le contrôle duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée, ou une des protéines déterminées.

La transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, voire une transcription accrue de ce ou ces gènes rapporteurs par rapport à la transcription de ces mmes gènes en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à la détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et lesdites protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique.

Avantageusement, dans le cadre de la détection d'une protéine telle que définie ci-dessus, susceptible d'interagir directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées sont choisies parmi celles codant des protéines formant un complexe protéique entre elles.

Dans ce cas, il y a transcription du ou des gènes rapporteurs des cellules hôtes transformées par le ou les vecteurs définis ci-dessus, lorsque ces cellules sont mises en culture en réprimant ledit promoteur conditionnel sous le contrôle duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée.

L'absence de transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, voire une transcription plus faible de ce ou ces gènes par rapport à la transcription de ces mmes gènes en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à la détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et lesdites protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.

Selon un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre des méthodes décrites ci-dessus de l'invention :

-le promoteur conditionnel est le promoteur Met25 réglable en fonction de la concentration de méthionine dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées, ledit promoteur étant activé en l'absence de méthionine dans le milieu de culture, et réprimé en présence de méthionine, et -les gènes rapporteurs contenus dans le génome des cellules hôtes transformées sont : . un gène codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé particulier, pour lequel la souche desdites cellules hôtes est auxotrophe par mutation dans ledit gène, un gène codant une enzyme responsable de la coloration de milieu de culture lorsqu'elle réagit avec son substrat, tel que le gène LacZ codant la galactosidase.

Ainsi la détection, voire la mesure, de la croissance des colonies de la souche de cellules hôtes transformées dans un milieu de culture sélectif M1 qui, d'une part ne contient pas l'acide aminé dont le métabolisme est sous la dépendance de l'enzyme codée par le gène rapporteur contenu dans le génome desdites cellules hôtes et, d'autre part, ne contient pas de méthionine, est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, dans la mesure où la croissance de ces colonies dans un milieu de culture sélectif M2 correspondant au milieu Ml précédent dans lequel de la méthionine est rajoutée, est nulle ou inférieure à celle mesurée en l'absence de méthionine.

De mme, la détection, voire la mesure, d'une coloration dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées, notamment d'une coloration bleue dans un milieu contenant le substrat XGal, mais ne contenant pas de méthionine, est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, dans la mesure où cette coloration, dans le milieu de culture précédent dans lequel de la méthionine est rajoutée, est nulle ou inférieure à celle mesurée en absence de méthionine.

En revanche, l'absence de croissance des colonies de la souche de cellules hôtes transformées dans le milieu de culture MI susmentionné, ou la détection d'une plus faible croissance de ces colonies dans le milieu MI par rapport à la croissance détectée pour ces colonies dans le milieu M2 susmentionné, est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.

De mme, l'absence de coloration dans le milieu de culture des cellules hôtes transformées contenant le substrat spécifique de la coloration (notamment XGal) mais ne contenant pas de méthionine, où la détection d'une plus faible coloration dans ce milieu de culture par rapport au milieu de culture contenant de la méthionine, est corrélable à la détection d'un interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.

La présente invention a plus particulièrement pour objet l'application des méthodes décrites ci-dessus au criblage d'une banque d'ADNc, ou d'une banque synthétique dégénérée d'oligonucléotides, lesdites banques étant susceptibles de contenir une (ou plusieurs) séquence (s) d'ADN codant une (ou plusieurs) protéine (s) telle (s) que décrite (s) ci-dessus, interagissant directement ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition d'un complexe protéique.

A titre d'illustration, la détection d'une protéine interagissant directement ou indirectement avec deux protéines déterminées A et B, dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition de la formation d'un complexe protéique, est avantageusement effectuée selon la méthode suivante qui comprend : -la transformation de cellules hôtes avec : un vecteur contenant : 'une séquence d'ADN de fusion entre une séquence d'ADN codant une protéine déterminée A, et une séquence d'ADN codant : un domaine d'activation de la transcription à l'ADN, et * un gène de sélection codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA1, et un vecteur contenant : * une séquence d'ADN de fusion entre une séquence d'ADN codant une protéine déterminée B différente de la précédente protéine A et une séquence d'ADN codant un domaine de fixation à l'ADN, et k un gène de sélection codant une enzyme responsable du métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA2, AA2 étant différent de AA1, l'un des deux vecteurs susmentionnés contenant une séquence d'ADN codant la protéine testée, la transcription de cette séquence d'ADN étant sous le contrôle du promoteur conditionnel Met25, lesdites cellules hôtes étant telles que leur génome comprend, un gène rapporteur, notamment le gène LacZ, ainsi qu'un gène codant une enzyme du

métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA3, AA3 étant différent de AA1 et AA2, et telles qu'elles sont auxotrophes pour les acides aminés AAI, AA2 et AA3.

-la sélection des cellules hôtes transformées par les deux vecteurs susmentionnés par mise en culture de ces dernières dans un milieu sélectif MO comprenant AA3, mais ne contenant pas AA1 et AA2, -la culture des cellules hôtes transformées sélectionnées lors de l'étape précédente, en activant ledit promoteur conditionnel dans un milieu de culture sélectif MI ne contenant pas AA1, AA2 et AA3, et ne contenant pas de méthionine, -une étape de culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture sélectif M2 en réprimant ledit promoteur conditionnel, M2 correspondant au milieu MI auquel de la méthionine est rajoutée, cette étape de culture étant effectuée antérieurement, ou postérieurement, ou parallèlement à l'étape de culture précédente, -la détection éventuelle d'une interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées, de la manière indiquée ci-dessus.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux des méthodes de l'invention, la séquence d'ADN codant la protéine testée, ou l'une des séquences d'ADN codant une protéine déterminée, est fusionnée, dans le ou les vecteurs susmentionnés, à une séquence d'ADN codant un peptide susceptible d'tre reconnu spécifiquement par un anticorps, notamment une séquence d'ADN codant la tag Hémagglutinine (tag HA) susceptible d'tre reconnue par l'anticorps anti-HA (décrit notamment dans Hanke et al., 1992).

Ainsi, la formation d'un complexe protéique dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, peut encore tre vérifiée par immunoprécipitation dudit complexe à partir d'un extrait total des cellules hôtes mises en culture et d'un anticorps tel que décrit ci-dessus. Cette immunoprécipitation permet de séparer et de purifier le complexe protéique à partir du milieu de culture desdites cellules, et, le cas échéant, de vérifier la structure et/ou l'activité biologique de ce complexe, notamment pour en déduire la nature de l'interaction entre la protéine testée et les protéines déterminées dans le cadre la formation de ce complexe (à savoir : interaction directe ou indirecte telle que décrite ci-dessus).

Bien entendu, la présente invention ne se limite pas à l'étude de l'interaction entre trois protéines entre elles, et la méthode décrite ci-dessus dans le cadre de l'étude d'interactions entre trois protéines, peut tre adaptée à l'étude de l'interaction entre quatre ou cinq protéines (voire plus encore).

Dans ce cas, chaque séquence d'ADN codant une protéine supplémentaire à tester, est introduite dans un des deux vecteurs utilisés dans la méthode décrite ci-dessus, voire dans d'autres vecteurs supplémentaires, et est avantageusement sous le contrôle d'un promoteur conditionnel de préférence différent du ou des autres promoteurs conditionnels déjà utilisés pour contrôler la transcription de séquences d'ADN codant d'autres protéines au sein des vecteurs susmentionnés.

L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent de l'étude d'interactions entre plusieurs protéines.

I-Etude de l'interaction entre les trois protéines Cdk7, Cycline H et MAT1.

Ces trois protéines sont des protéines du complexe multiprotéique TFIIH essentiel pour la transcription et la réparation de l'ADN (Svejstrup et al., 1996). Celui-ci peut se résoudre en deux sous-complexes : le"core"comportant 6 sous-unités et le complexe kinase formé des trois protéines, Cdk7, Cycline H et MAT1. Ce dernier complexe existe également sous forme libre in vivo. Des expériences préalables de double-hybride et d'immunoprécipitation à partir d'extraits de cellules coinfectées avec des virus ayant intégré l'ADNc correspondant, ont montré que les protéines Cdk7 et Cycline H interagissent entre elles. Il n'a pas été possible avec le système double-hybride, de détecter des complexes de type Cdk7/MAT 1 ou Cycline H/MAT 1.

A) Matériels et Méthodes La souche de levure L40, auxotrophe pour l'histidine, la leucine, le tryptophane et l'adénine ainsi que les plasmides pLex9-3H dérivés du vecteur pBTM116 (Vojtek et al., 1993), et pVP16 ont été utilisés.

En plus du marqueur de sélection TRP1 (gène codant pour une enzyme du métabolisme du tryptophane) et de LexA (contenant un domaine de liaison à l'ADN) clone en aval du promoteur constitutif de l'alcool déshydrogènase (ADH), pLex9-3H comporte une cassette d'expression constituée du promoteur inductible Met25, un tag Hémagglutinine (tag HA), un signal de localisation nucléaire (NLS), les sites de clonage Notl et Srfl permettant d'intégrer l'ADN codant pour un polypeptide d'intért et le terminateur de transcription de la Phosphoglycérate kinase, tPGK (Figure 1).

La plasmide pVP16 contient un marqueur de sélection LEU2 (gène codant pour une enzyme du métabolisme de la leucine) et l'activateur transcriptionnel de VP16 cloné en aval du promoteur de I'ADH.

Les ADNc codant pour Cdk7, Cycline H et MAT1 ont respectivement été clones en fusion avec LexA dans le plasmide pLex9-3H, sous la dépendance du promoteur Met25 dans pLex9-3H et en fusion avec VP16 dans le plasmide pVP16 (Figure 2). a) Construction des plasmides Les ADNc codant pour chacune des trois protéines ont été amplifiés par PCR à partir de constructions décrites dans Adamczewski J. P. et al., 1996, avec des oligonucléotides spécifiques à chacun d'entre eux, avant d'tre insérés dans les vecteurs adéquats.

La PCR permettant le clonage de Cdk7 en fusion avec LexA, dans le site EcoRI de pLex9-3H a été faite avec les oligonucléotides 5'AGTCGTGAATTCATGGCTCTGGACCTGAAG3'pour la partie 5'de I'ADNc et 5'GATCGTGAATTCTTAAAAAATTAGTTTCTTGGGCAA3' pour l'extrémité 3', la protéine de fusion résultante étant LexA-Cdk7. La PCR permettant le clonage de cycline H en fusion avec le tag HA, dans le site NotI de pLex9-3H en aval du promoteur pMet25, a été faite avec les oligonucléotides 5'GATCGTGCGGCCGCAATGTACCACAACAGT3'pour la partie 5'de I'ADNc et 5'GATCGTGCGGCCGCTTAGAGAGATTCTACCAG pour l'extrémité 3', la protéine de fusion résultante étant TagHA-Cycline H. Enfin, la PCR permettant le clonage de MAT1 en fusion avec VP16, dans le site EcoRI de pVP16, a été faite avec les oligonucléotides 5'GATCAGGAATTCCCATGGAGGATCAGGGTT3'pour la partie 5'de I'ADNc et 5'GATCAGGAATTCTTAACTGGGCTGCCAGAA3'pour l'extrémité 3', la protéine de fusion résultante étant VP16-MAT1. b) Transformation de la levure et sélection des transformants La souche L40 [MATa, trpl, his3, leu2, ade2, LYS2 : : (LexAop) 4- HIS3, URA3 : : (LexAop) g-LacZ] contient les gènes rapporteurs HIS3 (codant pour une enzyme du métabolisme de l'histidine) et LacZ en fusion avec un opérateur reconnu par LexA. Les cellules sont mises en culture pendant 16 heures dans du milieu complet (milieu YPD) et transformées par Cdk7-pLex9- 3H-CyclineH par la méthode à l'Acétate de Lithium (Schiestl R. H. et al., 1993). pLex9-3H contenant le gène TRP1, la sélection des transformants se fait sur milieu minimum HLA (contenant 0.06 g/1 d'histidine, 0.12 g/I de leucine et

0.12 g/ ! d'adénine, en plus des 1.44 g/1 de"yeast nitrogen base without amino acids"et des 20 g/1 d'agarose, mais sans tryptophane). Un des clones transformés est alors remis en culture dans 20 ml de HLA pendant une nuit, puis transformé à son tour par MATlpVP16 de la mme façon que précédemment. Puisque pVP16 comporte le gène LEU2, la sélection des doubles transformants se fera sur milieu minimum HA (contenant de l'adénine et de l'histidine mais pas de tryptophane ni de leucine). c) Expression des protéines L'expression des protéines est contrôlée par immunoblots réalisés à partir des extraits de levures ayant poussé sur milieu HA, milieu sélectif pour la présence des plasmides. La répression induite par la présence de méthionine est également examinée (Rose M. D., 1990). d) Test d'interaction entre les trois partenaires Deux types de contrôles sont disponibles : le test de croissance et le test d'activité de la p-galactosidase.

Pour le test de croissance, trois clones différents, isolés à partir de cultures établies sur milieu HA, sont mis en suspension dans 50 tel d'eau stérile et dilués en cascade de 10 jusqu'à 10-4. Pour chacun des clones, une goutte de chaque dilution est déposée sur milieu sélectif pour l'interaction à trois (A, ne contenant que l'adénine) ainsi que sur un milieu inhibant l'expression de la cycline H (AM, contenant l'adénine et méthionine lmM).

L'activité p-galactosidase est évaluée sur des cellules ayant poussées une nuit dans le milieu adéquat (on mesurera la densité optique à 600nm [DO600]) puis resuspendues dans un tampon phosphate (d'après Miller J., 1972) auquel sont ajoutées trois gouttes de chloroforme et 2 gouttes de détergent SDS 0,1% pour incubation de 5 minutes à 28°C ; la réactivation est initiée par 200, u1 d'O-nitrophényl-ß-galacatoside (ONPG) 4mg/ml puis arrtée dès l'apparition d'une couleur jaune pâle par 500, 1 de bicarbonate Na2C03 1 mM. La DO420 est alors mesurée. L'activité p-galactosidase (en mol-1. min-l) est calculée par la formule : (DO420)/ [DO60o) x vol. de culture (ml) x temps de réaction (min)]. (Rose M. D., 1990).

B) Résultats Dans un milieu dépourvu de méthionine (permettant l'expression non seulement de cdk7 et MAT1 mais également de la cycline H), on observe la croissance de colonies pour des dilutions allant de 10-1 à 10-4, alors que sur un

milieu riche en méthionine (répression de la cycline H), on observe des colonies uniquement pour les deux premières dilutions (figure 3). De plus, la mesure de l'activité P-galactosidase de la souche ayant poussé sur le milieu sans méthionine est de 115 ml-l. min-l alors que celle de la mme souche ayant poussée en présence de méthionine, a une activité de 18 ml-l. min-l, soit une inhibition de l'activité -Gal de plus de 6 fois (figure 4).

Ces résultats démontrent que le troisième polypeptide cycline H, catalyse (stabilise) la formation du couple d'activation Lex-cdk7/VP16-MAT1, ce qui pourrait tre dû à la formation d'un complexe à trois entre Cdk7, Cycline H et MAT1.

La faible activité P-galactosidase visualisée lorsque la cycline H est réprimée, suggère une association faible entre MAT1 et Cdk7 ; ce qui ne peut tre exclu d'après des expériences d'immunoprécipitation faites sur des extraits de cellules d'insectes, où une association faible Cdk7/MATl a été visualisée.

Afin de vérifier la spécificité de l'interaction, Cdk7/cycline H/MAT1, nous avons intégré dans le vecteur pVP16, les autres sous unités du complexe TFIIH. Ainsi, cinq sous unités du core de TFIIH ont été testées pour une association avec Cdk7 en présence de cyline H. Aucune interaction n'a pu tre visualisée que ce soit par le test de croissance ou le test p-galactosidase comme illustré (figure 4). L'expression de Cdk7 et de Cycline H (Cdk7-pLex9-3H- Cycline H), d'une part et de VP16 seul (ne contenant pas de protéine fusionnée) d'autre part, donne une réponse équivalent au bruit de fond, que ce soit pour le test de croissance ou celui de l'activité -galactosidase (figure 4).

Les résultats des tests d'interaction d'une part et la présence des trois protéines mise en évidence par western blot d'autre part, suggèrent fortement l'existence d'un complexe ternaire contenant les protéines Cdk7, cycline H et MAT1. Afin de visualiser un tel complexe ternaire, un extrait total de levure ayant poussé sur milieu A a été immunoprécipité par l'intermédiaire du peptide de fusion tag HA de la cycline H. Ainsi, l'anticorps anti-HA retient non seulement la cycline H, mais aussi Cdk7 et MAT1. De plus, le complexe ainsi purifié possède le mme type d'activité CTD kinase que le complexe isolé différemment.

II-Inhibition de l'interaction entre les protéines Ras et Raf Ras et Raf sont deux protéines oncogènes qui interagissent entre elles avec pour conséquence une implication potentielle dans la transduction de signaux contrôlant les phénomènes de croissance et de différenciation cellulaire.

L'inhibition de contact de ces deux protéines peut tre étudiée soit par criblage de banque d'oligopeptides soit en impliquant un troisième partenaire identique à l'un des deux autres polypeptides formant l'activateur transcriptionnel, mais ne contenant pas de séquence de fusion. Afin de contrôler la spécificité de l'interaction Ras/Raf, le troisième partenaire sera sous le contrôle du promoteur inductible Met25.

A) Matériels et méthodes : Une cassette contenant le promoteur Met25, un épitope HA et un fragment d'ADN codant une séquence de localisation nucléaire, un site NotI, soit un site Bgl2, soit un site Srfl, un codon Stop et le terminateur PGK, a été insérée au niveau du site unique PvuII des plasmides pGBT9 (Bartel et al., 1993), pGBT10 (Chardin et al., 1993), pHP5, pBTM116 (Vojtek et al., 1993) and pVJL10 (Julien-Flores et al., 1995), en donnant les plasmides pGBT9-3H, pGBT10-3H, pGBTll-3H, pLex9-3H et pLexlO-3H, respectivement.

L'expression du promoteur Met25 est réprimée en présence de 1 mM Méthionine.

Les plasmides dérivés de pGBT9-3H ont été construits de la manière suivante : Le cadre de lecture (ORF) de H-Ras (V12) (Fragment EcoRI-Sall de pBTM116-Ras (Vojtek et al., 1993)) a été clone en phase avec le domaine de liaison à l'ADN de GAL4, le plasmide résultant étant [pGBT-Ras/Met-0]. Le plasmide [pGBT-Ras/Met-Rafl a été obtenu en ajoutant de part et d'autre du fragment EcoRI-BamHI de cRaf-1 provenant du plasmide pGAD-Raf (Van Aelst et al., 1993) une séquence de liaison contenant le site de clonage NotI, et en clonant ensuite le fragment résultant dans le site NotI de la cassette d'expression Met25 de [pGBT-Ras/Met-0].

B) Résultats : Les cellules cotransformées avec [pGBT-Ras/Met-Raf] et pGAD-Raf sont LacZ+ (transcription du gène de la-galactosidase) en présence de méthionine, c'est-à-dire dans des conditions de répression du promoteur Met25.

Les mmes cellules sont LacZ-en absence de méthionine, à savoir dans des conditions de dérépression du promoteur Met25. Cette observation peut s'expliquer par le fait que la protéine sauvage Raf exprimée à partir du promoteur Met25 entre en compétition pour l'interaction avec celle exprimée à

partir de [pGBT9-Ras/Met-Raf], inhibant ainsi l'interaction entre les protéines de fusion GAL4DBD-Ras et GAL4AD-Raf.

Des contrôles préalables ont montré que la présence du promoteur inductible Met25 n'affecte pas l'interaction entre les deux produits provenant des séquences de fusion, que celui-ci soit actif ou réprimé.

Les plasmides décrits ci-dessus peuvent tre utilisés pour identifier des peptides inhibant une interaction entre des protéines, par exemple en exprimant une banque synthétique dégénérée d'oligonucléotides sous le contrôle du promoteur Met25.

L'inhibition de l'interaction peut tre détectée par un test LacZ dans des conditions de dérépression du promoteur Met25 ; le phénotype LacZ+ pourrait tre restauré en présence de méthionine, prouvant que l'inhibition est due à l'expression du promoteur Met25 mais pas à d'autres événements tels qu'une mutation.

Tableau 1 : Nom sous promoteur ADH, ous promoteur Met25, fusionné au GAL-DBD fusionné au HA-NLS pGBT935 pGBT935-Ras, Met25-0 c-H-Ras pGBT935-Ras, Met25-Raf c-H-Ras c-Raf-1 Légende du Tableau 1 : Dans pGBT935, l'insertion de l'ADNc codant la protéine Ras (c-h-Ras ; Vojtek, 1993) en phase avec la région codante du domaine de fixation à l'ADN GAL4 (GAL-DBD) conduit au plasmide [pGBT935, Met25-0] ; l'ADNc codant pour la protéine Raf (c-Raf-1 ; Van Aelst, 1993) clone en phase avec la région codante du site de localisation nucléaire lié à l'épitope HA (HA-NLS) dans le plasmide [pGBT935, Met25-0] conduit au plasmide [pGBT935, Met25-Raf3. Le plasmide pGAD-Raf permet l'expression d'une protéine c-Raf-1 fusionnée au domaine d'activation GAL4 (AD-Raf).

Légendes des figures : Figure 1 : Le vecteur pLex9-3H dérivé du vecteur pBTM116. La partie pBTM116 contient, en plus des séquences nécessaires à sa réplication dans E. coli, le marqueur de sélection TRP1 et l'activateur transcriptionnel LexA clone en aval du promoteur (P) et en amont du terminateur (T) de l'ADH. pLex9-3H possède également une cassette d'expression contenant le promoteur réglable Met25, un tag HA, une séquence de localisation nucléaire (NLS), et un terminateur tPGK.

Les sites d'insertion de l'ADNc d'intért sont indiqués.

Figure 2 : L'ADNc codant Cdk7 est clone en fusion avec LexA, celui de la cycline H est en fusion avec le tag HA, en aval du promoteur réglable Met25, dans le plasmide pLex9-3H alors que l'ADNc et MAT1 est clone en fusion avec VP16 dans le plasmide pVP16. Ce dernier contient le marqueur de sélection LEU2 et le domaine d'activation de VP16 en aval du promoteur constitutif ADH.

Figure 3 : A : test de croissance de trois clones de levures transformées par les plasmides Cdk7-pLex9-3H-Cycline H et MAT1-pVP16 sur un milieu dépourvu (Met- : méthionine dérépression) et riche (Met+ 1 mM : méthionine répression) en méthionine. Les différentes dilutions sont indiquées au centre de la figure.

B : activité P-galactosidase des extraits de levures transformées par les vecteurs Cdk7-pLex9-3H-Cycline H d'une part et les vecteurs exprimant la protéine VP16 fusionnée à XPB, XPD, p62, p44, p34 ou MAT1 ou VP16 seul (VP16) d'autre part, ayant poussé en présence (+) ou en absence (-) de méthionine. Les unités P-gal sont indiquées en ml~l. min-1.

Figure 4 : Les cellules de la souche de levure HF7c cotransformées avec des couples de plasmides sont sélectionnées dans un milieu ne contenant pas de tryptophane et de leucine (Rose, 1990) ; les colonies sont réparties dans un milieu ne contenant pas de tryptophane, ni de leucine, et contenant ou ne contenant pas de méthionine. Après 24 heures à 30°C, les boites ont été répliquées pour tester l'hypotrophie à l'histidine (résultats non montrés) et pour l'expression de LacZ (Chardin, 1993), en présence ou en absence de méthionine.

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