LEMAITRE, Nathalie (37 rue des Marais, Viroflay, Viroflay, F-78220, FR)
BOIS, Frédéric (800 route de Sabres, Luxey, Luxey, F-40430, FR)
AIR LIQUIDE SANTE INTERNATIONAL (75 quai d'Orsay, Paris, Paris, F-75007, FR)
SCHREIBER, Valérie (5 rue du Hameau, Meudon, Meudon, F-92190, FR)
LEMAITRE, Nathalie (37 rue des Marais, Viroflay, Viroflay, F-78220, FR)
BOIS, Frédéric (800 route de Sabres, Luxey, Luxey, F-40430, FR)
REVENDICATIONS
1. Trousse pour PCR comprenant :
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 1 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 70 0 C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 2 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 7O 0 C.
2. Trousse pour PCR comprenant : a) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 1 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 7O 0 C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 70 0 C; ou bien b) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 70 0 C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 2 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 7O 0 C.
3. Trousse pour PCR selon la revendication 1 comprenant en outre une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55°C et 85°C.
4. Trousse pour PCR comprenant :
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 4 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 7O 0 C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 5 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 7O 0 C.
5. Trousse pour PCR comprenant : a) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 4 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 70 0 C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 70 0 C ; ou bien b) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 70 0 C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 5 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 70 0 C.
6. Trousse pour PCR selon la revendication 4 comprenant en outre une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 6 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N 0 6 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55°C et 85°C.
7. Trousse pour PCR comprenant un couple d'amorces tel que défini à la revendication 1 et un couple d'amorces tel que défini à la revendication 4.
8. Trousse pour PCR selon la revendication 7 comprenant en outre une sonde telle que définie à la revendication 3 et une sonde telle que définie à la revendication 6.
9. Trousse pour PCR comprenant une trousse selon la revendication 2 et une trousse selon la revendication 5.
10. Trousse selon l'une quelconque des revendications 3, 6 ou 8 comprenant une sonde présentant un fluorochrome émetteur fixé à son extrémité 5' et un fluorochrome suppresseur fixé à son extrémité 3'.
11. Trousse selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant une ou plusieurs amorces ou sondes présentant un ou plusieurs nucléotides rigidifiés par une liaison cyclique 2'-O, 4'-C-méthylène.
12. Méthode de détection de bactéries dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 1.
13. Méthode de détection de bactéries dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 2.
14. Méthode de détection de bactéries selon la revendication 12 dans laquelle il s'agit d'une PCR en temps réel utilisant une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N 0 3 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55 0 C et 85°C.
15. Méthode de détection de levures et/ou de moisissures dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 4.
16. Méthode de détection de levures et/ou de moisissures dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 5.
17. Méthode de détection de levures et/ou de moisissures selon la revendication 15 dans laquelle il s'agit d'une PCR en temps réel utilisant une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 6 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55 0 C et 85°C.
18. Méthode de détection de bactéries, de levures et/ou de moisissure dans un échantillon comprenant deux étapes : a) la détection de bactéries selon la méthode de l'une quelconque des revendications 12 à 14 ; et b) la détection de levures et/ou de moisissures selon la méthode de l'une quelconque des revendications 15 à 17. |
METHODES DE DETECTION DE MICROORGANISMES PAR PCR
L'invention porte sur des méthodes de détection de microorganismes (bactéries, levures et moisissures) par PCR. La qualité microbiologique de l'environnement, celle des aliments, des produits pharmaceutiques, des gaz, et de l'air en particulier, devient un sujet de préoccupation. Il existe par exemple de nombreux appareils commerciaux qui permettent de contrôler la qualité microbiologique de l'air ambiant selon différents principes tels l'impaction sur milieu gélose, la filtration, le bullage... Toutes ces méthodes comprennent une étape d'isolement, une étape de culture sur un milieu approprié puis une étape de comptage des microorganismes. A cause de cette étape de culture, le temps d'analyse est long. De plus, la sensibilité de la méthode dépend du milieu de culture utilisé, le milieu de culture n'étant pas nécessairement approprié pour tous les microorganismes présents dans l'échantillon prélevé.
De nombreuses méthodes de détection de microorganismes existent. La PCR (la réaction de polymérisation en chaîne ou en anglais Polymerase Chain Reaction) est une technique qui est couramment utilisée pour détecter la présence de certains microorganismes dans un échantillon. Toutes les méthodes de PCR actuelles sont très spécifiques et permettent seulement la détection de certains microorganismes présents dans un échantillon. On peut citer à titre d'exemple la demande de brevet d'invention publiée sous le numéro FR 2 811 321 qui décrit une méthode de détection d'espèces eubactériennes présentes dans le sang à l'aide d'un procédé pour amplifier une zone polymorphique de PARN ribosomal 16S. La demande de brevet publiée sous le numéro EP 1 672 081 décrit une méthode pour détecter la présence d ' 'Alicyclobacillus spp. dans un échantillon qui met en œuvre des amorces spécifiques pour amplifier une région du gène codant pour ARN ribosomal 16S caractéristique d'Alicyclobacillus spp.
Un des objectifs de la présente invention est de fournir une méthode de détection des microorganismes qui soit rapide, sensible et universelle, c'est-à-dire capable de détecter et de quantifier la flore microbienne totale présente en très faible quantité.
Pour ce faire, les inventeurs ont mis au point deux types de couples d'amorces pour PCR. Le premier type de couples d'amorces permet d'amplifier chez quasiment tous les procaryotes une région du gène codant PARN ribosomal 16S. Le deuxième type de couples d'amorces permet d'amplifier chez quasiment toutes les levures et moisissures une région du gène codant PARN ribosomal 18S. A l'aide de
ces deux types de couples d'amorces, il est possible d'amplifier une région du gène codant TARN ribosomal de quasiment tous les microorganismes.
Les inventeurs ont également mis au point deux types de sondes. Les sondes du premier type sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 16S de quasiment tous les procary otes. Les sondes du deuxième type sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 18S de quasiment toutes les levures et moisissures.
Par microorganismes, on entend les bactéries, les levures et les moisissures.
Par nucléotide, on entend l'acide désoxyribonucléique et/ou l'acide ribonucléique, mais également des nucléotides non naturels composés de 3 parties: un groupement phosphate ou un équivalent, un sucre ou un équivalent et une base azotée. A titre d'exemple de nucléotides non naturels, on peut citer les monomères
LNA ou PNA (Peptide Nucleic Acids) (cf. Singh et al. J Org Chem. 1998 Sep
4;63(18):6078-6079; Yong You et al. Nucleic Acids Research, 2006, vol.34, n°8 « Design of LNA probes that improve mismatch discrimination » et A-Z of quantitative PCR - Stephen A. Bustin -IUL, California).
Un premier mode de réalisation de la présente invention est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 1 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 1 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 7O 0 C.
Un deuxième mode de réalisation de la présente invention est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 2 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N 0 2 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 7O 0 C.
Un troisième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ
ID N° 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion
(Tm) comprise entre 50 0 C et 70 0 C.
Un quatrième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N 0 3 ou pris dans une séquence variante
de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 7O 0 C.
Un cinquième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 4 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 4 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 70 0 C.
Un sixième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 5 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N 0 5 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 7O 0 C.
Un septième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N 0 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 50 0 C et 70 0 C.
Un huitième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O 0 C et 70 0 C.
Le tableau suivant présente les séquences 1 à 6 (R est A ou G):
Typiquement lesdits oligonuclétides des huit premiers modes de réalisation présentent une température de fusion comprise entre 55°C et 65 0 C, préférentiellement comprise entre 57°C et 62°C.
Un neuvième mode de réalisation est une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55°C et 85°C.
Un dixième mode de réalisation est une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55 0 C et 85°C.
Les sondes selon le neuvième mode de réalisation sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 16S de quasiment tous les procaryotes. Les sondes selon le dixième mode de réalisation sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 18S de quasiment toutes les levures et moisissures.
Typiquement lesdits oligonucléotides des neuvième et dixième modes de réalisation présentent une température de fusion comprise entre 63°C et 75 0 C, préférentiellement comprise entre 66°C et 72°C. Typiquement les oligonucléotides des dix premiers modes de réalisation comprendront au moins 15 nucléotides successifs pris respectivement dans une des séquences de SEQ ID N 0 1 à 6 ou dans une séquence complémentaire d'une des séquences de SEQ ID N° 1 à 6, de préférence au moins 17 nucléotides successifs et tout particulièrement les oligonucléotides comprendront respectivement la totalité d'une des séquences de SEQ ID N° 1 à 6 ou d'une séquence complémentaire d'une des séquences de SEQ ID N 0 1 à 6.
Typiquement une séquence variante d'une des séquences de SEQ ID N 0 1 à 6 ou d'une séquence complémentaire d'une des séquences de SEQ ID N 0 1 à 6, comprendra une ou deux mutations. Pour déterminer la température de fusion d'un oligonucléotide, l'homme du métier utilisera l'une des techniques suivantes :
Si les oligonucléotides ne contiennent que des acides désoxyribonucléiques et/ou ribonucléiques, la température de fusion pourra être déterminée en utilisant le logiciel de calcul: Primer Express Software 2.0 de Applied Biosystems selon la méthode de calcul du plus proche voisin (cf. Santa Lucia, J. (1998) Proc. Nat. Acad.
ScL USA 95, 1460-1465).
Si les oligonueléotides ne contiennent pas que des acides désoxyribonucléiques et/ou ribonucléiques, la température de fusion pourra être déterminée en utilisant le logiciel de calcul: Beacon Designer 6.0 (c) (Premier Biosoft International, 3786 Corina Way, PaIo Alto, CA 94303-4504, USA). Ce dernier logiciel est basé sur l'algorithme développé par IDT (Integrated DNA Technologies).
Pour toutes les méthodes de calcul, les calculs sont effectués pour une concentration en sel de 50 mM.
Alternativement, et quelle que soit la nature de l'oligonucléotide, la température de fusion des oligonueléotides pourra être déterminée selon la méthode physique traditionnelle telle que décrite par Wickstrom et al. Biopolymers 1974, 13, 2367. En résumé, la méthode comprend les étapes suivantes, mélange équimolaire de l'oligonucléotide avec sa séquence complémentaire dans une solution comprenant une concentration en sel de 50 mM. La solution est chauffée jusqu'à 90 0 C pendant 15 minutes, puis refroidie lentement jusqu'à température ambiante. La température de la solution est ensuite augmentée graduellement (de 0,5 0 C par mesure), l'absorption UV à 260 nm est déterminée après chaque équilibration de la température. La température de fusion de l'oligonucléotide sera déterminée à partir de la courbe de fusion obtenue (absorption à 260 nm en fonction de la température). La température de fusion correspond à la température pour laquelle l'augmentation de l'absorbance correspond à la moitié de l'augmentation maximale de l'absorbance.
Si ces différentes méthodes de détermination de la température de fusion conduisent à des résultats sensiblement différents, l'oligonucléotide sera considéré comme présentant un Tm compris dans une gamme de températures telle que définie dans les différents modes de réalisation de l'invention, dès lors qu'au moins l'un des résultats obtenus tombe dans ladite gamme de températures.
Afin d'obtenir des oligonueléotides présentant les températures de fusion souhaitées, l'homme du métier pourra utiliser un ou plusieurs nucléotides autres que les acides désoxyribonucléiques et ribonucléiques. En particulier il pourra utiliser la technologie LNA et les oligonueléotides pourront comprendre un ou plusieurs monomères LNA (cf. Singh et al. J Org Chem. 1998 Sep 4;63(18):6078-6079 et Yong You et al. Nucleic Acids Research, 2006, vol.34, n°8 « Design of LNA probes that improve mismatch discrimination »). Les monomères LNA sont modifiées au niveau du ribose par l'établissement d'une liaison cyclique 2'-O, 4'-C-methylène. Il existe également d'autres techniques pour modifier la température de fusion d'un oligonucléotide. On peut citer comme exemple : L'utilisation des PNA (Peptide Nucleic Acids) qui permettent d'augmenter le Tm de 0.5 à 2°C par nucléotide
modifié ajouté (cf. A-Z of quantitative PCR - Stephen A. Bustin -IUL, California). Citons également les sondes Minor Groove Binding (MGB) sur lesquelles est fixée en 3' une macro molécule qui s'intègre dans le petit sillon de l'ADN et stabilise ainsi la structure (réf. Bio futur N°219 février 2002 « La PCR en temps réel »). Pour ce type de sondes l'augmentation maximale de Tm possible est d'environ 10 0 C (cf. A-Z of quantitative PCR - Stephen A. Bustin -IUL, California).
Typiquement une sonde selon l'invention pourra être adaptée à la PCR en temps réel, à la technologie Taqman en particulier. La PCR en temps réel et la technologie Taqman sont des techniques couramment utilisées, on peut citer pour revue Poitras et Houde, Reviews in Biology and Biotechnology, Dec. 2002, 2(2) : 2-
11. Avantageusement, une sonde selon l'invention présentera un fluorochrome émetteur fixé à son extrémité 5 ' et un fluorochrome suppresseur fixé à son extrémité
3'. Des exemples de fluorochromes émetteurs et suppresseurs sont : FAM, HEX,
TET, TAMRA, JOE, YAKIMA YELLOW, CY3, CY5, ROX, QSY-7, Dabcyl, BHQ- 1 , BHQ-2, Eclipse® Dark Quencher.
Préférentiellement le fluorochrome émetteur est FAM ou YAKIMA YELLOW et le fluorochrome accepteur est Eclipse® Dark Quencher.
Typiquement les amorces et/ou les sondes selon l'invention pourront comprendre au plus 60, 50, 40 ou 30 nucléotides.
Couples d'amorces permettant de détecter les bactéries ;
Un couple d'amorces comprenant une amorce selon le premier mode de réalisation et une amorce selon le deuxième mode de réalisation permet d'amplifier chez quasiment tous les procaryotes une région du gène codant l'ARN ribosomal 16S. Il en est de même pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le premier mode de réalisation et une amorce selon le quatrième mode de réalisation et pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le troisième mode de réalisation et une amorce selon le deuxième mode de réalisation.
Couples d'amorces permettant de détecter les levures et/ou les moisissures : Un couple d'amorces comprenant une amorce selon le cinquième mode de réalisation et une amorce selon le sixième mode de réalisation permet d'amplifier chez quasiment toutes les levures et moisissures une région du gène codant l'ARN ribosomal 18S. Il en est de même pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le cinquième mode de réalisation et une amorce selon le huitième mode de réalisation et pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le septième mode de réalisation et une amorce selon le sixième mode de réalisation.
A l'aide de ces deux types de couples d'amorces, il est possible d'amplifier une région du gène codant l'ARN ribosomal de quasiment tous les microorganismes.
Un mode de réalisation de l'invention est une méthode de détection de bactéries dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant un couple d'amorces décrit ci-dessus permettant de détecter les bactéries.
Un autre mode de réalisation de l'invention est une méthode de détection de levures et/ou de moisissures dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant un couple d'amorces décrit ci-dessus permettant de détecter les levures et/ou les moisissures. Pour mettre en œuvre les méthodes de détection selon l'invention, l'homme du métier pourra utiliser les techniques classiques de la PCR. La révélation pourra être effectuée sur gel agarose ou d'acrylamide ou encore par un système d'électrophorèse capillaire.
L'homme du métier pourra également utiliser les techniques de PCR en temps réel. L'homme du métier pourra utiliser une sonde. Avantageusement la sonde présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12°C, préférentiellement de 8 à 10 0 C à la plus basse des températures de fusion des amorces. Alternativement, l'homme du métier pourra utiliser les techniques de PCR en temps réel ne faisant pas intervenir de sonde. Il pourra par exemple utiliser la technologie basée sur le SYBR Green I.
La PCR en temps réel permet une quantification des microorganismes présents dans un échantillon.
Encore un mode de réalisation de l'invention est une méthode de détection de bactéries, de levures et/ou de moisissures dans un échantillon comprenant deux étapes : a) la détection de bactéries selon la méthode telle que décrite précédemment; et b) la détection de levures et/ou de moisissures selon la méthode telle que décrite précédemment. Les deux étapes de détection peuvent être simultanées ou successives.
Typiquement l'échantillon prélevé pourra être divisé en deux fractions, une fraction servant à la détection des bactéries et la seconde fraction à la détection des levures et moisissures. Alternativement le même échantillon pourra servir à la détection des bactéries et des levures et moisissures, dans ce cas l'homme du métier prendra soin de choisir pour les sondes des fluorochromes compatibles entre eux, c'est-à-dire n'interférant pas entre eux.
Typiquement l'échantillon dans lequel est effectuée une méthode de détection selon l'invention pourra être obtenu à partir de prélèvements effectués dans l'air, dans un gaz, dans les liquides (par exemple dans l'eau, sur des surfaces).
Typiquement, une méthode de détection selon l'invention peut trouver une application dans les domaines suivants : l'hygiène, l'alimentaire, la pharmacie, la cosmétique, la peinture, le contrôle des procédés de désinfection, le contrôle qualité, le monitoring de procédés industriels et de production.
A titre d'exemple, l'échantillon dans lequel est effectuée une méthode de détection selon l'invention pourra être obtenu par prélèvement dans un gaz ou un mélange de gaz, en particulier dans l'air. Pour prélever les microorganismes présents dans le gaz ou le mélange de gaz, on pourra, par exemple, utiliser un procédé de séparation par impaction, avantageusement le procédé décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 03 099418.
Pour mettre en œuvre les méthodes ci-dessus, les inventeurs ont mis au point des trousses (kits) à cette fin.
C'est pourquoi un autre mode de réalisation de l'invention est une trousse pour PCR comprenant une amorce selon le premier mode de réalisation et une amorce selon le deuxième mode de réalisation.
Typiquement la trousse comprendra en outre une sonde selon le neuvième mode de réalisation. Avantageusement la sonde présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12°C, préférentiellement de 8 à 10 0 C à la plus basse des températures de fusion des amorces.
Un autre mode de réalisation de l'invention est une trousse pour PCR comprenant une amorce selon le cinquième mode de réalisation et une amorce selon le sixième mode de réalisation.
Typiquement la trousse comprendra en outre une sonde selon le dixième mode de réalisation. Avantageusement la sonde présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12°C, préférentiellement de 8 à 10 0 C à la plus basse des températures de fusion des amorces. Encore un autre mode de réalisation de l'invention est une trousse pour PCR comprenant quatre amorces, à savoir une amorce selon chacun des modes de réalisation 1, 2, 5 et 6.
Typiquement la trousse comprendra en outre deux sondes, à savoir une selon chacun des neuvième et dixième modes de réalisation. Avantageusement la sonde selon le neuvième mode de réalisation présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12 0 C, préférentiellement de 8 à 10 0 C à la plus basse des températures de fusion des amorces selon le premier et le deuxième modes de
réalisation et la sonde selon le dixième mode de réalisation présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12 0 C, préférentiellement de 8 à 1O 0 C à la plus basse des températures de fusion des amorces selon le cinquième et le sixième modes de réalisation. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention.
Sauf si cela est indiqué autrement, pour réaliser les expériences de microbiologie et de biologie moléculaire, les techniques classiques ont été utilisées. Les références suivantes donnent une description de ces techniques :
• « La PCR en temps réel : principes et applications » (E. Poitras et A. Houde, Reviews in Biology and Biotechnology, Vol.2, N°2, Déc.2002, pp.2-11)
• « Quantification des acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel » (C, Tse et J. Capeau, Ann. Biol. Clin., Vol.61, N°3, mai-juin 2003, pp.279- 293)
• Bio futur N°219 février 2002 « La PCR en temps réel » • « Molecular Biology Techniques Manual : PCR Primer Design and reaction optimisation» (Third Edition, 2001, Vernon E. Coyne et al, University of Cape Town, South Africa)
Amorces et sondes utilisées: Les amorces suivantes ont été synthétisées par synthèse chimique et utilisées pour la méthode de détection des bactéries : Bact-Forw : 5'-CTGGTAGTCCACGCCGTAAA-3' (SEQ ID N 0 I) Bact-Rev : 5'-CGTTGCTTCGAATTAAACCACA-S' (SEQ ID N°2)
La sonde suivante a été utilisée pour la détection des bactéries : Bact-Probe : 5'-GAATTGACGGGGRCCCGCACAA-S ' (SEQ ID N°3)
Cette sonde porte en 5' le fluorochrome 6-FAM et en 3' le fluorochrome BHQ-I. Les amorces suivantes ont été utilisées pour la méthode de détection des levures et des moisissures :
YM-Forw: 5'-AAACTATGCCGACTAGRGAT-S' (SEQ ID N°7) YM-Rev: 5'-GTGGTGCCCTTCCGTCAATT-3' (SEQ ID N°5)
La sonde suivante a été utilisée pour la détection des bactéries des levures et des moisissures : YM-Probe : 5'-CGCAAGGCTGAAACTTAAAG-3' (SEQ ID N°8) Cette sonde porte en 5' le fluorochrome 6-FAM et en 3' le fluorochrome BHQ- 1. Dans les séquences ci-dessus, lorsque la base est soulignée (par exemple A), cela indique qu'il s'agit d'un monomère LNA.
Les oligonucléotides comprenant la base R correspondent à un mélange de deux populations d'oligonucléotides : pour environ 50% des oligonucléotides, R correspond à A et pour le reste des nucléotides, R correspond à G.
PCR en temps réel
Les conditions suivantes ont été utilisées pour effectuer les PCR en temps réel :
* * * Pour Ia détection des bactéries :
> Composition du PCR mix
> Le profil en température de la PCR :
Traitement UNG (étape optionnelle) 50,0 0 C pendant 2 minutes
Activation ADN polymérase: 95,0 0 C pendant 10 minutes cycles: PCR (45X) étape 1: 95,0 0 C pendant 10 secondes étape 2: 60,0 0 C pendant 30 secondes
*> Pour Ia détection des levures et des moisissures :
> • Composition du PCR mix
> Le profil en température de la PCR :
Traitement UNG (étape optionnelle) 50,0 0 C pendant 2 minutes
Activation ADN polymérase: 95,0 0 C pendant 10 minutes cycles: PCR (45X) étape 1 : 95,0 0 C pendant 10 secondes étape 2: 60,0 0 C pendant 30 secondes
Les expériences ont été réalisées sur un appareil IQ cycler de BioRad en suivant les recommandations du constructeur. Une attention toute particulière a été portée aux réactifs utilisés afin de réduire le plus possible toute contamination par de l'ADN de microorganismes (bactéries, levures et moisissures). Extraction de l'ADN
Pour extraire l'ADN des microorganismes, le réactif DNAzol® (SIGMA) ainsi que broyeur-homogénéiseur 24 tube Precellys® de Bertin Technologies ont été utilisés.
Spécificités des amorces et des sondes
La spécificité des amorces et des sondes a été testée en utilisant les souches de bactéries suivantes : Bacillus cereus, spores de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Sphingomonas sanguinis, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus weihenstephanensis, Arthrobacter sp., Sphingomonas phyllosphaerae,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtïlis, Bacillus macroides, ainsi que les levures et moisissures suivantes : Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Candida albicans, Cryptococcus adeliensis, Pénicillium sp., Cladosporium sp..
Les deux méthodes de détection sont complémentaires. Toutes les bactéries testées ont été détectées par la méthode de détection des bactéries, aucune des levures/moisissures testées n'a été détectée. Toutes les levures/moisissures testées ont été détectées par la méthode de détection des levures/moisissures, aucune des bactéries testées n'a été détectée.
Sensibilité des méthodes de détection
Pour déterminer la limite de détection de la méthode de détection des bactéries, les souches suivantes ont été testées : Bacillus weihenstephanensis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et spores de Bacillus cereus. Pour toutes les bactéries testées, la limite de détection est 1 UFC (Unité
Formant Colonie).
Pour déterminer la limite de détection de la méthode de détection des levures et/ou moisissures, les souches suivantes ont été testées : Aspergillus niger, Candida albicans. Pour toutes les levures/moisissures testées, la limite de détection est 1 UFC (Unité Formant Colonie).