Mutationen stellen durch chemische oder physikalische Einflüsse verursachte Veränderungen des genetischen Materials einer Zelle oder eines Organismus dar. So führen z. B. erkennbare Mutationen zu Änderungen in Struktur-oder Regulatorgenen und zeigen sich entweder durch das Fehlen oder durch Veränderungen von Enzymen, Strukturproteinen, Stoffwechselreaktionen oder Stoffwechselleistungen.

Auswirkungen auf morphologische Merkmale können z. B. Änderungen in der Pigmentierung, Körperstruktur oder Reaktionen auf Umweltveränderungen sein. Daher spielt besonders in der Forschung und der medizinischen Diagnostik eine sensitive und spezifische Analyse von Mutationen eine wichtige Rolle.

Die genaueste Methode zur Mutationsanalyse stellt die DNA-Sequenzierung dar. Mit diesem Verfahren kann eine DNA von einigen hundert Nukleotiden innerhalb weniger Stunden sequenziert werden. Allerdings handelt es sich bei diesem Verfahren um ein technisch sehr aufwendiges Verfahren mit einer relativ geringen Sensitivität. Daher findet die DNA-Sequenzierung zur Detektion von Mutationen nur in sehr wenigen Fällen Anwendung.

Ein technisch wesentlich weniger aufwendiges Verfahren, das sich zudem zur Analyse einer großen Probenanzahl eignet, stellt die sequenzspezifische Hybridisierung, z. B. auf DNA-Chips dar. Solche Hybridisierungsverfahren ermöglichen eine sensitive und spezifische Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren, sind jedoch nur in den Fällen anwendbar, in denen die potentiellen Mutationen der Nukleinsäure vor der Analyse genau bekannt sind. Dadurch sind Hybridisierungsverfahren nur sehr begrenzt einsetzbar und dienen lediglich zur Identifizierung oder Kontrolle einer erwarteten Mutation in einer Nukleinsäure.

Ein weiteres Verfahren zur Mutationsdetektion in Nukleinsäuren mit relativ geringem technischen Aufwand und hoher Sensitivität, stellt der"Single Strand Conformation Polymorphism" (SSCP) dar. Dieses Verfahren basiert auf einer detektierbaren Konformationsänderung in Genen und ist daher lediglich auf sehr wenige Gene und sehr kurze Genabschnitte anwendbar.

Eine Mutationsdetektion einer beliebig ausgewählten Nukleinsäure lässt sich daher in der Regel mit diesem Verfahren nicht durchführen.

Das PTT ("Protein Truncation Test")-Verfahren ist ein weiteres Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren. Dieses Verfahren stellt aufgrund seiner großen Anwendbarkeit eines der gebräuchlichsten Verfahren zur Mutationsdetektion in Nukleinsäuren dar und ermöglicht eine Mutationsdetektion auf Proteinebene anhand der Translationsprodukte der untersuchten Nukleinsäure. Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende, isolierte genomische DNA oder cDNA zunächst in vitro transkribiert und translatiert. Bei der Translation werden radioaktiv markierte Aminosäuren (z. B. 35S Methionin) eingesetzt, um die translatierten Proteine nach Auftrennung durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese durch Autoradiographie zu detektieren. Dieses Verfahren ermöglicht eine sensitive und spezifische Analyse von Mutationen anhand der Molekulargewichtsverteilung der translatierten Proteine, verfügt jedoch über zahlreiche Nachteile. Da die Mutationsdetektion des PTT-Verfahrens

durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Autoradiographie der translatierten Proteine erfolgt, können mit Hilfe dieses Verfahrens nur Mutationen erfasst werden, die zu einem Translationsstop und damit zu einem im Vergleich zum Wildtyp-Protein deutlich kleineren Protein führen. Leseraster-Verschiebungsmutationen, die nicht zu einem Translationsstop führen und Leseraster-Verschiebungsmutationen oder Stop-Mutationen, die zu einem Translationsstop im Bereich des 3'-Endes der untersuchten Nukleinsäure führen, können mit dem PTT-Verfahren nicht detektiert werden, da der Molekulargewichtsunterschied zwischen mutiertem Protein und Wildtyp-Protein zu gering ist, um durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese nachgewiesen zu werden. Ein weiterer Nachteil des herkömmlichen PTT-Verfahrens ist, dass aufgrund der notwendigen Verfahrensschritte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie keine vollständige Automatisierung des Verfahrens möglich ist. Durch den notwendigen Einsatz radioaktiver Aminosäuren kann das PTT-Verfahren nicht in jedem herkömmlichen Standardlabor durchgeführt werden und ist zudem sehr teuer in der Durchführung. Ein weiteres Problem, das sich bei dem PTT-Verfahren stellt, ist, dass vor der in vitro-Transkription und Translation keine Anreicherung der zu untersuchenden Nukleinsäure erfolgt. Daher können nur Proben untersucht werden, die eine große Kopienanzahl der zu untersuchenden Nukleinsäure enthalten, wie z. B. Tumore. Dadurch verfügt das PTT-Verfahren vor allem in der medizinischen Diagnostik über einen sehr geringen Anwendungsbereich.

Zusammenfassend ist in der Literatur bisher kein geeignetes Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren beschrieben, das gleichzeitig eine Analyse jeder Art von DNA und RNA sowie eine sensitive und spezifische Detektion praktisch aller möglichen relevanten Mutationen zulässt, nicht radioaktiv, technisch einfach und automatisierbar ist und sich für den Einsatz in Hochdurchsatz-Systemen einsetzen lässt.

Der vorliegenden Erfindung lag daher das Ziel zugrunde, Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren bereitzusteilen, welche die genannten Nachteile entsprechend dem Stand der Technik nicht aufweisen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren, umfassend die Schritte : (a) Amplifizieren der gesuchten Nukleinsäure, um ein doppelsträngiges Amplifikationsprodukt zu erhalten, unter Verwendung von Primer- Kombinationen, die so ausgewählt werden, dass das Amplifikationsprodukt eine Nukleotidsequenz aufweist, die (i) translatierbar ist und (ii) eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und den Translationsprodukten einer mutierten Nukleinsäure erlaubt, (b) in vitro Transkribieren und Translatieren der Amplifikationsprodukte und (c) Nachweisen der translatierten Proteine.

Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Primer-Kombinationen, die so <BR> <BR> <BR> <BR> ausgewähltwerden, dassdasamplifikationsprodukteine Nukleotidsequenz aufweist, die translatierbar ist und eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten, einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlaubt, wird erstmals ein Verfahren zur Mutationsdetektion bereitgestellt, das eine nicht-radioaktive, hoch sensitive und spezifische Detektion von Sequenzmutationen in Nukleinsäuren erlaubt, die zu einem Verlust oder zu einer Veränderung der Aminosäurenzusammensetzung eines Proteinabschnitts führen (siehe Figur 1). Auf Grund des geringen technischen Aufwands des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Verfähren in jedem herkömmlichen Standardlabor eingesetzt werden, um jede Art von DNA oder RNA auf das Vorhandensein von Mutationen zu testen, ohne Kenntnis der zu erwartenden Mutationen.

Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert auf der Amplifikation der zu untersuchenden Nukleinsäure, um ein transkribierbares und translatierbares Amplifikationsprodukt zu erhalten, das eine Detektion von Mutationen in der Nukleinsäure erlaubt. Für die Amplifikation der zu untersuchenden Nukleinsäure werden traditionelle Verfahren, wie PCR oder RT-PCR, herangezogen, wobei nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Primer-Kombinationen verwendet werden, die eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlauben.

Die neuartigen Primer-Kombinationen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassend in 5'-3'Richtung einen spezifischen Vorwärts-Primer mit (a) einer Promotorsequenz für die Transkription, (b) einem Translationsstart-Motiv, das eine Translation im Leserahmen der Wildtyp-Nukleinsäure ermöglicht, (c) mindestens einem Sequenzabschnitt der, für ein nachweisbares erstes Peptid codiert und (d) einem Sequenzabschnitt, der ausreichend identisch ist mit der Sequenz am 5'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben und in 3' » 5'Richtung einen spezifischen Rückwärts-Primer mit (a) einem Sequenzabschnitt, der ausreichend komplementär ist zur Sequenz am 3'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben, (b) mindestens einem Sequenzabschnitt, der für mindestens ein nachweisbares zweites Peptid, weiches vom ersten Peptid verschieden ist, codiert und im Leserahmen der gesuchten Wildtyp- Nukleinsäure liegt, (c) Sequenzabschnitten, die für jeweils mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, welche vom ersten und zweiten Peptid verschieden sind, codieren und in den beiden Leserahmen liegen, die

durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp- Nukleinsäure entstehen und (d) drei Stop-Motiven, eines für jeden möglichen Leserahmen, wobei die Reihenfolge der Sequenzabschnitte (b) und (c) des Rückwärts- Primers vertauscht sein kann.

Ein bevorzugtes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass die beiden spezifischen Primer der erfindungsgemäßen Primer-Kombination Sequenzabschnitte aufweisen, die für mindestens ein nachweisbares erstes Peptid, mindestens ein nachweisbares zweites Peptid und mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid codieren. Diese Sequenzabschnitte können frei gewählt werden, besitzen jedoch vorzugsweise eine Länge im Bereich von 6-100 Nukleotiden, bevorzugt 9-60 Nukleotiden und besonders bevorzugt 9-45 Nukleotiden und codieren für nachweisbare Peptide, die entweder direkt, z. B. über direkte spezifische, hochaffine Wechselwirkung mit Bindepartnern wie vom Typ Ligand-Rezeptor, Antigen-Antikörper und/oder indirekt, z. B. über eine Aminosäureseitenketten-Markierung, nachweisbar sind. Die Erfindung sieht jedoch vorzugsweise vor, dass diese Sequenzabschnitte aus den in SEQ. ID NO. : 1-20 gezeigten Nukleinsäuresequenzen ausgewählt werden.

Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen ; neuartigen Primer- Kombinationen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das eine nicht-radioaktive Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren auf Proteinebene ermöglicht. Gleichzeitig erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine Unterscheidung zwischen einer Stop-Mutation oder einer Leseraster-Verschiebungsmutation, die zu einem Stop-Signal führt und einer Leseraster-Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Stop- Signal führt.

Codieren in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Sequenzabschnitte (c) des Vorwärts-Primers und die

Sequenzabschnitte (b) und (c) des Rückwärts-Primers der erfindungsgemäßen Primer-Kombination für immunologisch nachweisbare Peptide, dann erfolgt der Nachweis der Peptide vorzugsweise über die entsprechenden spezifischen Antikörper. So ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine hoch sensitive und hoch spezifische Mutationsdetektion. Enthält der spezifische Vorwärts-Primer zusätzlich Sequenzabschnitte (c), die für zwei unterschiedliche nachweisbare erste Peptide codieren, so kann Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens- der Nachweis der translatierten Proteine und somit die Mutationsdetektion- mittels differenziellem ELISA erfolgen.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, werden Primer-Kombinationen verwendet, bei denen der spezifische Rückwärts-Primer Sequenzabschnitte (c) enthält, die für ein gleiches nachweisbares drittes und viertes Peptid codieren. In diesem Fall erfolgt die Detektion von Leseraster-Verschiebungsmutationen, die in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure entstehen und nicht zu einem Translationsstop führen, über das gleiche nachweisbare Peptid. Allerdings kann so der Leserahmen der mutierten Nukleinsäure nicht mehr eindeutig identifiziert werden. Soll der Leserahmen der mutierten Nukleinsäure hingegen genauer bestimmt werden, so enthält der Rückwärts-Primer Sequenzabschnitte (c), die für unterschiedliche dritte und vierte Peptide codieren.

Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren umfasst die in vitro Transkription und Translation der Amplifikationsprodukte aus Schritt (a). Vorzugweise erfolgt die in vitro Transkription und Translation der Amplifikationsprodukte durch Zugabe von Zeillysat. Als Zeillysate werden vorzugsweise kommerzielle oder selbst hergestellte Lysate aus transkriptions-und translationsaktiven Säugerzellen, wie z. B. Retikulozyten aus Kaninchen, Pflanzenzellen, wie

z. B. Weizenkeim und/oder Bakterienzellen, wie z. B. E : coli, verwendet. In Abhängigkeit von dem Vorhandensein einer Mutation in der gesuchten Nukleinsäure der zu analysierenden Probe, können in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens im allgemeinen drei verschiedene Mischungen von Translationsprodukten entstehen (Figur 1) : (I) Enthält die gesuchte Nukleinsäure keine Mutationen, entsteht bei der Translation ausschließlich das Wildtyp-Protein, das am N-Terminus an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid und am C-Terminus an mindestens ein nachweisbares zweites Peptid fusioniert ist.

(II) Enthält die gesuchte Nukleinsäure eine Stop-Mutation. oder eine Leseraster-Verschiebungsmutation, die zu einem Translationsstop führt, entsteht bei der Translation mutiertes Protein, dessen Aminosäuregesamtlänge im Vergleich zum Wildtyp-Protein verkürzt ist und das am N-Terminus an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid fusioniert ist, während an den C-Terminus kein nachweisbares Peptid fusioniert ist. Wenn in der Probe auch nicht- mutierte gesuchte Nukleinsäure vorkommt, dann entsteht zusätzlich Wildtyp-Protein (I).

(tit) Enthält die gesuchte Nukleinsäure eine Leseraster- Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Transiationsstop führt, entsteht bei der Translation mutiertes Protein, das am N-Terminus an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid und am C-Terminus an mindestens ein nachweisbares drittes oder viertes Peptid fusioniert ist. Wenn in der Probe auch nicht-mutierte gesuchte Nukleinsäure vorkommt, dann entsteht zusätzlich Wildtyp-Protein (I).

Die neuartige Primer-Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht eine selektive und spezifische Mutationsdetektion, wobei das Translationsprodukt der gesuchten Nukleinsäure (nicht-mutiertes unverkürztes Wildtyp-Protein, mutiertes verkürztes Wildtyp-Protein aufgrund einer Leseraster-Verschiebungsmutation oder einer Punktmutation, die zu einem Translationsstop führt oder/und mutiertes

unverkürztes Wildtyp-Protein aufgrund einer Leseraster- Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Translationsstop führt) anhand der verschiedenen nachweisbaren ersten, zweiten, dritten und vierten Peptide identifiziert werden kann. Wird nur das Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure detektiert, das N-terminal an ein nachweisbares erstes Peptid und C-terminal an ein nachweisbares zweites Peptid fusioniert ist, liegt in der gesuchten Nukleinsäure keine Sequenzmutation vor. Ist das Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure hingegen N-terminal an mindestens ein nachweisbares erstes Peptid und C-terminal an mindestens ein nachweisbares drittes oder viertes Peptid fusioniert, enthält die untersuchte Nukleinsäure eine Leseraster-Verschiebungsmutation, die nicht zu einem Translationsstop führt. Verfügt das Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure nur über mindestens ein N-terminal fusioniertes nachweisbares erstes Peptid, jedoch über kein C-terminal fusioniertes Peptid, so weist die untersuchte Nukleinsäure eine Stop-Mutation oder eine Leseraster-Verschiebungsmutation, die zu einem Translationsstop führt, oder den (monoallelischen) Verlust der gesamten Sequenz auf.

So ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelungen, ein Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren bereitzustellen, das alle Sequenzmodulationen erfasst, die eine Leseraster-Verschiebung beinhalten und zum Verlust und zum vorzeitigen Stop der Translation eines Proteinabschnitts führen. Zusätzlich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren jede Art von DNA und/oder RNA, die durch herkömmliche PCR und/oder RT-PCR amplifizierbar ist, einer Mutationsdetektion zu unterziehen. Aufgrund der nicht-radioaktiven Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren anhand der Anwesenheit der verschiedenen nachweisbaren ersten, zweiten, dritten und vierten Peptide im Translationsprodukt der untersuchten Nukleinsäure, ist das erfindungsgemäße Verfahren in jedem herkömmlichen Standardlabor einsetzbar.

In Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Nachweis der translatierten Proteine, vorzugsweise umfassend die folgenden Schritte : (i) ein zumindest teilweises Entfernen von nicht-mutiertem Wildtyp- Protein, (ii) eine Immobilisierung der translatierten Proteine und (iii) eine Proteindetektion, die qualitativ, vorzugsweise jedoch auch quantitativ durchgeführt werden kann.

Vorzugsweise erfolgt die Immobilisierung der translatierten Proteine (ii) über ein nachweisbares erstes Peptid. Dabei können die Translationsprodukte der gesuchten Nukleinsäure beispielsweise an einer festen Matrix immobilisiert werden, die einen spezifischen Bindepartner für das erste Peptid enthält. Die nachfolgende Proteindetektion (iii) der immobilisierten Proteine, die gleichzeitig die Mutationsanalyse beinhaltet, umfasst vorzugweise die folgenden Schritte : a) Detektion der Gesamtmenge der Proteine durch Bestimmung eines weiteren nachweisbaren ersten Peptids oder durch einen Antikörper gegen das Protein, b) Detektion der Menge an nicht-mutiertem Wildtyp-Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren zweiten Peptids und/oder c) Detektion der Menge an mutiertem Protein durch Bestimmung eines nachweisbaren dritten und/oder vierten Peptids.

Das Vorhandensein einer nachweisbaren Mutation erfolgt vorzugsweise rechnerisch durch Differenz Gesamtprotein minus Wildtyp-Protein (siehe Figur 1).

Das. erfindungsgemäße Verfahren sieht zwei bevorzugte Ausführungsformen für den Nachweis der translatierten Proteine (c) vor : In einer ersten Ausführungsform erfolgt Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels differenziellem ELISA, vorzugsweise dann, wenn es sich

bei den nachweisbaren Peptiden um immunologisch nachweisbare Peptide handelt und wenn die Sequenzabschnitte (c) des spezifischen Vorwärts- Primers der erfindungsgemäßen Primer-Kombinationen für mindestens zwei unterschiedliche nachweisbare erste Peptide codieren.

In diesem Fall erfolgt die Entfernung des nicht-mutierten Wildtyp-Proteins (i) vorzugsweise durch Präzipitation mit Matrices oder immobilisierten Antikörpern, die an das immunologisch nachweisbare zweite Peptid binden.

Für die Präzipitation des nicht-mutierten Wildtyp-Proteins mit Matrices werden vorzugweise unlösliche Matrices verwendet, wie z. B. Cellulose oder Agarose, an denen entsprechende Antikörper und/oder andere Proteine, wie z. B. Avidin, immobilisiert sind, die entweder kovalent oder nichtkovalent, jedoch hoch affin das immunologisch nachweisbare zweite Peptid des Wildtyp-Proteins binden. Vorzugsweise werden Matrices in Form magnetischer oder nicht-magnetischer Beads verwendet, auf denen Antikörper gegen das immunologisch nachweisbare zweite Peptid immobilisiert sind. Dafür eignen sich kommerziell erhältliche Protein-A und/oder Protein-G-Matrices. Diese bestehen aus einer unlöslichen Kohlenhydrat-Matrix aus Cellulose oder Agarose, an die kovalent die bakteriellen Proteine, Protein A oder Protein G, gebunden sind, die wiederum nicht kovalent aber mit sehr hoher Affinität an fast alle Klassen von Antikörpern binden. Wird der entsprechende Antikörper an die Protein- A-oder Protein-G-Matrices gebunden, so erfolgt die Präzipitation des nicht- mutierten Wildtyp-Proteins über die Wechselwirkung zwischen Antikörper und immunologisch nachweisbarem zweiten Peptid. Ist das nachweisbare zweite Peptid des nicht-mutierten'Wildtyp-Proteins Biotin markiert, so erfolgt die Präzipitation vorzugsweise mit Matrices wie Cellulose oder Agar. ose, an die das Protein Avidin gebunden ist Handelt es sich bei dem nachweisbaren zweiten Peptid hingegen um ein (His) 6-Tag, so kann das nicht-mutierte Wildtyp-Protein über eine Ni-NTA-Agarose-Matrix entfernt werden. So ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine Anreicherung

des mutierten Proteins und damit selbst eine Mutationsdetektion in Proben, die nur sehr geringe Mengen an mutierter DNA oder RNA enthalten.

Die Immobilisierung dertranslatierten Proteine (ii) erfolgt vorzugsweise über Antikörper gegen das erste nachweisbare erste Peptid auf einer Mikrotiter- Platte, oder über Bindepartner für das erste nachweisbare erste Peptid auf einer entsprechend modifizierten Platte (z. B. Ni2+-beschichtete Platte, Avidin-beschichtete Platte), wobei die zu analysierende Probe der Translationsprodukte in mindestens drei und vorzugsweise mindestens vier Aliquote aufgeteilt wird, die auf verschiedene Depots der Platte verteilt werden.

Die nachfolgende Proteindetektion (iii), die gleichzeitig die Mutationsanalyse beinhaltet, umfasst in diesem Fall die folgenden Schritte : a) Detektion der Gesamtmenge der immobilisierten Proteine mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein weiteres immunologisch nachweisbares erstes Peptid (in einem ersten Depot der Mikrotiterplatte) oder durch einen Antikörper gegen das Protein, b) Detektion der Menge an immobilisiertem nicht-mutiertem Wildtyp- Protein mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein nachweisbares zweites Peptid (in einem zweiten Depot der Mikrotiterplatte) und/oder c) Detektion der Menge an immobilisiertem mutiertem Protein mit monoklonalen Antikörpern gegen ein immunologisch nachweisbares drittes und viertes Peptid (in einem dritten und/oder vierten Depot der Mikrotiterplatte), wobei der Nachweis der Mutation durch Quantifizierung der detektierten Proteinmengen und Berechnung (differenzieller ELISA) erfolgt.

Alternativ können für die Proteindetektion (iii) Nachweisreagenzien, z. B.

Antikörper verwendet werden, die unterschiedliche Markierungen tragen,

wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emmissionsmaxima.

Dies führt zu einer wesentlichen Vereinfachung des Nachweises der translatierten Proteine, da die zu untersuchende Probe der Translationsprodukte nun nicht mehr in Aliquote aufgeteilt werden muss, sondern eine Analyse der verschiedenen immunologisch nachweisbaren Peptide in nur einem Ansatz, z. B. einem Depot der Platte, ermöglicht wird.

In einer zweiten Ausführungsform erfolgt Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels chromatographischer bzw. elektrophoretischer Auftrennung, z. B. nach Größe und nachfolgender Detektion, vorzugsweise dann, wenn es sich bei den nachweisbaren Peptiden um immunologisch nachweisbare Peptide oder direkt nachweisbare Peptide (über Avidin-Matrix oder Ni-NTA-Matrix) handelt.

In diesem Fall erfolgt die Entfernung des nicht-mutierten Wildtyp-Proteins (i) vorzugsweise durch Affinitätschromatographie. Dieser affinitätschromatographische Reinigungsschritt führt zu einer Anreicherung der mutierten Proteine. So ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren selbst eine Mutationsdetektion in Proben, die nur sehr geringe Mengen an mutierter DNA oder RNA enthalten.

Die analytische Trennung und Immobilisierung der translatierten Proteine (ii) erfolgt vorzugsweise mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließendem Western-Blotting, d. h. Transfer auf eine Membran.

Die auf der Membran immobilisierten Proteine werden durch Nachweisreagenzien, z. B. Antikörper gegen die verschiedenen immunologisch nachweisbaren Peptide detektiert, wobei die Proteindetektion (iii) folgende Schritte umfasst : a) Detektion der Gesamtmenge der Proteine mit einem Antikörper gegen ein immunologisch nachweisbares erstes Peptid oder mit einem Antikörper gegen das Protein,

b) Detektion der Menge an nicht-mutiertem Wildtyp-Protein mit einem Antikörper gegen ein immunologisch nachweisbares zweites Peptid und/oder c) Detektion der Menge an mutiertem Protein mit Antikörpern gegen ein immunologisch nachweisbares drittes und viertes Peptid.

Erfolgt die Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens über den Nachweis der translatierten Proteine, wird eine hoch sensitive und spezifische Mutationsdetektion ermöglicht. So werden ausschließlich Proteine erfasst, die als Ergebnis der in vitro Translation mit dem richtigen Start-Codon und im gewünschten Leserahmen entstanden sind.

Unspezifische Nebenprodukte werden hingegen nicht detektiert. Des weiteren liegt die Nachweisgrenze der Detektion in Größenordnungen, die selbst eine Detektion von Mutationen in Proben zulässt, die nur sehr geringe Mengen an mutierter DNA oder RNA enthalten.

Wird der Nachweis der translatierten Proteine des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels ELISA durchgeführt, so kann das gesamte Verfahren problemlos automatisiert werden und an ein Hochdurchsatz-System angepasst werden. Somit wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals ein Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren bereitgestellt, das eine schnelle, hoch sensitive, hoch spezifische und automatisierbare Mutationsdetektion in jeder Art von DNA und/oder RNA ermöglicht.

Erfolgt der Nachweis der translatierten Proteine durch chromatographische bzw. elektrophoretische Auftrennung und anschließender Detektion, so gibt ein weiterer Parameter, nämlich die Größe der translatierten Proteine, Aufschluss über die zu detektierenden Mutationen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird vor Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt die Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure durch Hybridisierung an eine zur gesuchten Sequenz komplementäre Sequenz, die immobilisiert sein kann. Dieser Schritt ist für die eigentliche Mutationsdetektion nicht notwendig, erhöht jedoch zusätzlich die Sensitivität des nachfolgenden erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Anreicherung der gesuchten Nukleotidsequenz ist vor allem dann günstig, wenn die gesuchte Nukleinsäure zwar in ausreichender Kopienzahl jedoch nur in sehr geringer Konzentration in der Probe vorliegt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch seine breite Anwendbarkeit, seine hohe Sensitivität, seine hohe Spezifität und durch die Möglichkeit der Automatisierbarkeit in weiten Bereichen der medizinischen Diagnostik einsetzbar. Beispielsweise kann das Verfahren zur Tumordiagnose (Tumorfrühdiagnose, Verlaufsdiagnose) und Tumorcharakterisierung (Tumor-Typisierung) eingesetzt werden, da praktisch alle Mutationen eines Tumor-Suppressor-Gens in der DNA aus Tumorzellen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden können. So können beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie Stuhl oder Urin eines Patienten auf tumorspezifische Mutationen in DNA mit dem Ziel der nicht-invasiven Diagnose von Darm-bzw. Blasentumoren untersucht werden. Als Analyseobjekt eignet sich hierbei z. B. das Tumor-Suppressor-Gen APC, das in mehr als 80% aller Darmtumoren mutiert ist, wobei mehr als 90% aller APC-Mutationen zu einem vorzeitigen Translationsstop führen.

Vorzugsweise erfolgt in diesem Fall die Detektion der Proteingesamtmenge (Schritt (a) der Proteindetektion (i)) über einen speziell entwickelten Antikörper gegen das APC-Gen. Neben dem Tumor-Suppressor-Gen APC eignen sich auch andere Tumor-Suppressor-Gene wie p53, DCC, msh1, GTBP, mlh1, mlh2, DPC4, RB, WT1, WT2, NF1, NF2, BRCA1 und BRCA2 als Analyseobjekte zur Früh-oder Verlaufsdiagnose von Tumoren in Lunge, Pankreas, Rachenraum, Bauchraum, Brust und Gehirn, zur Tumor-

Typisierung in chirurgisch entfernten Tumoren aus Lunge, Darm und Blase und zum Nachweis von vererbten Mutationen und damit von Erbkrankheiten in Keim-, Embryo-oder Blutzellen.

Die Tabellen 1 bis 3 zeigen verschiedene Tumorarten und die dazugehörigen Tumor-Suppressor-Gene, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert bzw. typisiert werden können, sowie die nach dem entsprechenden Analyseobjektzu untersuchenden Körperflüssigkeiten eines Patienten.

Tabelle 1 : Beispiele für die molekulargenetische Analyse in der Krebsfrühdiagnose Tumoren in DNA/RNA aus Analyseobjekt (Tumor-Suppressor-Gen) Lunge Sputum p53, Rb Blase Urin p53 Darm Stuhl APC, p53, DCC, msh1, GTBP, mlh1, mlh2 Pankreas Stuhl DPC4 Rachenraum Speichel p53 Gehirn Rückenmark p53 Tabelle 2 : Beispiele für die Verlaufsdiagnose mit molekulargenetischen Methoden

Tumoren in DNA/RNA aus Analyseobjekt Aussage Bauchraum Waschflüssigkeit APC, p53 Vollständigkeit der chirurgischen Entferung Brust Drüsensekret/Milch BRCA1/BRCA2 Rezidiv-Diagnose Gehirn Rückenmark p53 Rezidiv-Diagnose alle soliden Blut/Lymphflüssigkeit Gene, die als Rezidiv-/ Tumoren mutiert gefun-Metastasen- den wurden Diagnose Tabelle 3 : Beispiele für die Tumor-Typisierung mit molekulargenetischen Methoden DNA aus Tumoren aus Analyseobjekt Aussage Lunge p53 Prognose, Therapie Darm p53 Prognose Blase p53 Prognose, Ursache Eine weitere Anwendungsmöglichkeit liegt in der Analyse von Mutationen der Keimbahn. Dabei ist es von Vorteil, intakte mRNA aus embryonalen Zellen oder Blutzellen zur Mutationsdetektion heranzuziehen. Diese Strategie hat den Vorteil, dass die Ränder des analysierenden Fragments nicht von Exon-Intron-Übergängen begrenzt werden und in einem Durchgang längere Sequenzabschnitte analysiert werden können. Im Idealfall kann die gesamte Sequenz der transkribierten mRNA, also das betreffende Gen in voller Länge, analysiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nachweiskit, der die dem erfingungsgemäßen Verfahren zugrunde liegenden Primer-Kombinationen enthält und z. B. zum Einsatz in der Diagnose von Tumoren, insbesondere Darmtumoren und Blasentumoren, geeignet ist.

Der erfindungsgemäße Nachweiskit zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren umfasst : (a) mindestens einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten Vorwärts-Primer in 5'-3'Richtung, der folgende Elemente umfasst : (i) eine Promotorsequenz für die Tanskription, (ii) ein Translationsstart-Motiv, das eine Translation im Leserahmen der Wiltyp-Nukleinsäure ermöglicht, (iii) mindestens einen Sequenzabschnitt, der für ein nachweisbares erstes Peptid codiert und (iv) einen Sequenzabschnitt, der ausreichend identisch ist mit der Sequenz am 5'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben, (b) mindestens einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten Rückwärts-Primer in 3'-5'Richtung, der folgende Elemente umfasst : (i) einen Sequenzabschnitt, der ausreichend komplementär ist zur Sequenz am 3'-Ende der gesuchten Nukleinsäure, um eine spezifische Anlagerung und Amplifikation zu erlauben, (ii) mindestens einen Sequenzabschnitt, der für mindestens ein nachweisbares zweites Peptid, welches vom ersten Peptid verschieden ist, codiert und im Leserahmen der gesuchten Wiltyp-Nukleinsäure liegt, (iii) Sequenzabschnitte, die für jeweils mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, welche vom ersten und zweiten Peptid verschieden sind, codieren und in den beiden Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des Leserahmens der gesuchten Wildtyp-Nukleinsäure entstehen und

(iv) drei Stop-Motive, eines für jeden möglichen Leserahmen, (c) gegebenenfalls Desoxyribonukleotide, (d) gegebenenfalls ein zur Extension der Primer geeignetes Enzym, (e) gegebenenfalls einen für die Amplifikationsreaktion geeigneten Puffer, gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe, (f) gegebenenfalls Zelilysat mit hoher Transkriptions-und Translationsaktivität, (g) gegebenenfalls Nachweisreagenzien für die verschiedenen nachweisbaren Peptide, (h) gegebenenfalls Reagenzien zur Proteinanreicherung und (i) gegebenenfalls Reagenzien zur Anreicherung der gesuchten Nukleinsäure, wobei die Reihenfolge der Sequenzabschnitte (ii) und (iii) des Rückwärts- Primers vertauscht sein kann.

Der erfindungsgemäße Nachweiskit zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren basiert vorzugsweise auf der Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens. Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Nachweiskits stellen die beiden neuartigen Vorwärts- Primer und Rückwärts-Primer dar, die Sequenzabschnitte aufweisen, die für mindestens ein nachweisbares erstes Peptid, mindestens ein nachweisbares zweites Peptid und mindestens ein nachweisbares drittes und viertes Peptid, wie zuvor beschrieben, codieren.

Das für die Extension geeignete Enzym ist bevorzugt eine thermostabile.

DNA-Polymerase, die eine 5'-3-'Polymerase aufweist. Das Enzym kann außerdem eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität ("Proof-Reading") enthalten.

Vorzugsweise besitzt der Vorwärts-Primer einen identischen Sequenzabschnitt (iv) und der Rückwärts-Primer einen komplementären Sequenzabschnitt (i), die mit genomischer DNA eines Tumor-Suppressor- Gens aus Tumorzellen, insbesondere APC-DNA, hybridisieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Nachweiskits enthält der Vorwärts-Primer Sequenzabschnitte (iii), die für zwei unterschiedliche nachweisbare erste Peptide codieren und der Rückwärts-Primer Sequenzabschnitte (ii), die für ein gleiches drittes und viertes nachweisbares Peptid codieren. Handelt es sich bei den nachweisbaren Peptiden um immunologisch nachweisbare Peptide, erfolgt der Nachweis der translatierten Proteine (c) und somit die Mutationsdetektion vorzugsweise durch ENLISA.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Multi-Tag-Vektor als Klonierungsvektor und/oder Expressionsvektor, der auf dem Prinzip der erfindungsgemäßen Primer-Kombinationen beruht.

Der Multi-Tag-Vektor besitzt eine Multi-Tag-Sequenz, die folgende Sequenzabschnitte in 5'-3'Richtung umfasst : (a) gegebenenfalls eine Expressions-Kontrollsequenz umfassend einen Promotor und ein Translations-Startmotiv (b) mindestens ein Sequenzabschnitt, z. B. ein bis drei Sequenzabschnitte, der für jeweils ein unterschiedliches nachweisbares erstes Peptid codiert, wobei der oder die Sequenzabschnitte im Leserahmen des Startcodons einer in die multiple Klonierungsstelle klonierten Nukleinsäure liegen, (c) eine multiple Klonierungsstelle (MCS) zur Klonierung einer Nukleinsäure, (d) ein bis drei Sequenzabschnitte, die für unterschiedliche nachweisbare zweite Peptide, die von den nachweisbaren ersten Peptiden verschieden sind, codieren, wobei die Sequenzabschnitte in gleichen oder unterschiedlichen Leserahmen bezüglich einer in die MCS klonierten Nukleinsäure liegen, wobei sie z. B. (i) alle im erwarteten Leserahmen der klonierten Nukleinsäure liegen oder (ii) der erste Sequenzabschnitt im erwarteten Leserahmen der klonierten Nukleinsäure liegt und der zweite und dritte Sequenzabschnitt in den

Leserahmen liegen, die durch Verschiebung des erwarteten Leserahmens der klonierten Nukleinsäure entstehen und (e) drei Stop-Codons, eines für jeden möglichen Leserahmen.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Multi-Tag-Vektors stellen die Sequenzabschnitte (b) und (d) dar, die für unterschiedliche nachweisbare erste und unterschiedliche nachweisbare zweite Peptide codieren. Die nachweisbaren ersten Peptide sind dabei voneinander verschieden. Die nachweisbaren zweiten Peptide sind verschieden von den ersten Peptiden und untereinander verschieden. Die Sequenzabschnitte sind frei wählbar, weisen jedoch eine Länge im Bereich von 6-90 Nukleotiden, vorzugsweise 9-60 Nukleotiden und besonders bevorzugt 9-45 Nukleotiden auf und codieren für nachweisbare Peptide, die entweder direkt und/oder indirekt, z. B. über Aminosäureseitenketten-Markierung nachweisbar sind. Zusätzlich befindet sich zwischen den einzelnen Sequenzabschnitten der Multi-Tag-Sequenz mindestens jeweils eine Restriktionsschnittstelle für Restriktionsendonukleasen. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) enthält vorzugsweise mindestens eine Restriktionsschnittstelle für Restriktionsendonukleasen zur Klonierung einer Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzt die Multi-Tag-Sequenz des Multi-Tag-Vektors je eine der in SEQ. ID NO. 21 und SEQ. ID NO. 22 angegebenen Sequenzen.

Zusätzlich erhält der Multi-Tag-Vektor gegebenenfalls weitere für eine prokaryontische und/oder eukaryontische Replikation und Expression benötigte übliche Elemente, wie z. B. ori, Selektionsmarker (beschrieben u. a. in Sambrook et. al).

Der erfindungsgemäße Multi-Tag-Vektor ist als Klonierungs-und/oder <BR> <BR> <BR> <BR> Expressionsvektor für prokaryontische und/oder eukaryontische Wirtszellen einsetzbar. Er kann z. B. verwendet werden, um den Leserahmen einer klonierten Nukleinsäure zu bestimmen und/oder zu verifizieren. Dazu wird

eine zu untersuchende Nukleinsäure zunächst. in die multiple Klonierungsstelle des Multi-Tag-Vektors einkloniert. Das so entstandene Expressionsplasmid wird dann für eine spätere Expression in eukaryontische und/oder prokaryontische Zellen transformiert. Nach erfolgter Expression kann der Leserahmen der klonierten Nukleinsäure über die Anwesenheit der verschiedenen C-terminalen nachweisbaren zweiten Peptide des exprimierten Translationsproduktes bestimmt werden. Die nachweisbaren Peptide können dabei direkt oder indirekt, wie zuvor beschrieben, nachgewiesen werden. Vorzugsweise erfolgt ein direkter Nachweis der Peptide über spezifische Antikörper gegen die verschiedenen nachweisbaren Peptide.

Desweiteren kann der Multi-Tag-Vektor eingesetzt werden, um die Eignung der verschiedenen nachweisbaren ersten und zweiten Peptide für die Analyse und/oder Reinigung eines Proteins, das durch die klonierte Nukleinsäure codiert wird, in einem Schritt zu testen. Dazu wird die zu klonierende Nukleinsäure in die multiple Kionierungsstelle des Multi-Tag- Vektors einkloniert und das so entstandene Expressionsplasmid für die Expression in eukaryontische und/oder prokaryontische Zellen transformiert. Das Translationsprodukt ist N-terminal und C-terminal an verschiedene nachweisbare erste und zweite Peptide fusioniert. Diese Peptide können nun in der betreffenden Anwendung getestet werden. Da die einzelnen Sequenzabschnitte der Multi-Tag-Sequenz durch Restriktionsschnittstellen begrenzt werden, kann das Gen nach durchgeführter Analyse zusammen mit dem geeigneten nachweisbaren Peptid aus dem Multi-Tag-Vektor herausgeschnitten und in einen anderen Vektor für die eigentliche Anwendung ligiert werden.

Die nachfolgenden Beispiele und Figuren sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1 : Methode zur Detektion von Mutationen Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens soll die Detektion von Mutationen in DNA aus einer Stuhlprobe eines möglichen Darmtumorpatienten erfolgen.

Beispiel la : Dral-Restriktion von 100,rul Stuhl-DNA Eine Dral-Restriktionsspaltung wurde mit 100, ul DNA einer Stuhlprobe eines möglichen Darmtumorpatienten nach bekannten Verfahrenstechniken und unter herkömmlichen Restriktionsbedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) durchgeführt.

Beispiel 1b : APC-DNA-Anreicherung 10 pu Streptavidin-Dynabeads wurden zweimal mit je 40 µl 1 x B&W-Puffer (5 mM Tris-HCI pH 7,5 ; 0,5 mM EDTA ; 1 M NaCI) gewaschen und anschließend in 100 µl 2 x B&W-Puffer resuspendiert. 100 ul der Dral- restringierten Stuhl-DNA (Beispiel 1a) wurden mit 10 pmol APC1b-Biotin- Primer (Sequenz : 5'-TTAAAATATGCCACAGATATTCCTTCATCACAGAAA CAGT-3', Annealing mit APC-Gen im Bereich von nt 3559 bis nt 3598 ; 10 pmol/µl) vermischt. Die DNA wurde im PCR-Gerät für 5 min bei 95°C denaturiert. Danach erfolgte ein Annealingschritt für 10 min bei 56°C mit anschließender Abkühlung für 10 min bei 4°C. Die DNA wurde mit den Dynabeads vermischt und der Ansatz wurde über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Roller inkubiert. Anschließend wurden die Dynabeads mit einem Magneten separiert und der Überstand entfernt. Die Dynabeads wurden zweimal mit je 200 pu 1 x B&W-Puffer und einmal mit je 500 ul destilliertem Wasser gewaschen. Die APC-DNA-gebundenen Dynabeads wurden komplett in einer nachfolgenden 50, ul PCR-Reaktion eingesetzt.

Beispiel 1c : PCR-Amplifikation Die in Beispiel 1 b hergestellten Dynabeads mit gebundener APC-DNA wurden mit 5,0, ul PCR-Puffer (10x), 5,0, u1 BSA (1 µg/µl), 1,0, ul dNTP (10 mM jeweils), 2,0, ul 5'-Primer (Sequenz : 5'-GGATCCTAATACGACTCACTA TAGGAACAGACCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATG TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCCCTTCATCACAGAAACAGTC-3', der 5'-Primer enthält den für die Transkription notwendigen Promotor, zwei Kopien des HA-Tags mit je einem Start-Codon und einen Bereich, der identisch mit der Sequenz nt 3580 bis nt 3600 des APC-Gens ist ; 10 pmol/, ul), 2,0, ul 3'-Primer (Sequenz : 5'-CTACGGTGCTGTCCAGGCCC AGCAGGGGGTTGGGGATGGGCTTGCCCGGTGCTGTCCAGGCCCAGCAG GGGGTTGGGGATGGGCTTGCCCCTTGCCGTCGATAAGCCTGGGGTCCA CCTGGTCCTCTGACTTTGTTGGCATGGCAG-3', der 3'-Primer enthält einen Bereich, der komplementär zur Sequenz nt 4759 bis nt 4779 des APC- Gens ist, den Protein C-Tag und zweimal den V5-Tag jeweils in den zum Leserahmen des APC-Gens alternativen Rahmen sowie ein Stop-Codon ; 10 pmol/, ul) und 0,5, ul HotStarTaq-Polymerase (5 U/jul) vermischt und das Gemisch auf ein Gesamtvolumen von 50 NI mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Der so hergestellte PCR-Ansatz wurde in einem PCR-Gerät folgendem PCR-Programm unterzogen : (i) ein Denaturierungszyklus : 95°C, 15 min (ii) vierzig PCR-Zyklen : (a) Denaturierung 95°C, 30 sec (b) Annealing 56°C, 1 min (c) Elongation 72°C, 1 min, 30 sec.

Das so erhaltene PCR-Produkt wurde nach bekannten Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) aufgereinigt.

Beispiel 1d : In vitro Transkription und Translation 20, ul des TNT T7 PCR Quick Master Mix (Fa. Clontech) wurden mit 0,5, ul Methionin (1 mM), 2,0, ul destilliertem Wasser und 2,5 ul PCR-Produkt vermischt. Die Mischung wurde für 90 min bei 30°C inkubiert.

Beispiel 1e : APC-Protein-Anreicherung Geeignete Beads, wie z. B. Ni-NTA-magnetische Beads, Protein G-Agarose mit gebundenen Antikörpern, etc. wurden mit einem geeigneten Puffer (abhängig von den verwendeten Beads, z. B. PBS) gewaschen.

Anschließend wurden die Beads in 20, ul eines geeigneten Puffers (abhängig von den verwendeten Beads, z. B. PBS) aufgenommen und mit 20 ul der TNT-Reaktionsmischung aus Beispiel 1d vermischt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C auf einem Roller inkubiert. Die Beads wurden separiert, mittels Magnet oder Zentrifuge, und der Überstand entfernt. Nun wurden die Beads zweimal mit je 200, ul Puffer gewaschen und in 20, ul 1 x SDS-Beladelösung resuspendiert.

Beispiel 1f : SDS-PAGE Auf ein 12% iges SDS-Polyacrylamidgel (Acrylamid : Bisacryamid 37,5 : 1) wurden 1-5 nul der TNT-Reaktionsmischung aus Beispiel 1 d oder 1-5, ut Eluat aus Beispiel 1 e aufgetragen und eine herkömmliche SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt (siehe z. B. Sambrook et al., supra).

Beispiel 1g: Westernblot Nach beendeter SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde ein Semidry- Western-Blot unter Verwendung einer PVDF-Membran nach herkömmlichen

Verfahren durchgeführt (siehe Sambrook et al., supra). Danach wurde die PVDF-Membran entfernt und für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungslösung (PBS, 0,1 % Tween, 5% Magermilchpulver) inkubiert.

Anschließend wurde die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur in Antikörperlösung (anti-HA-Peroxidase 1 : 5000, anti-ProtC 1 : 400, anti-V5 1 : 10000) inkubiert und dreimal für je 10 min bei Raumtemperatur mit Waschlösung (PBS, 0,1 % Tween) gewaschen. Nun wurde die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einer zweiten Antikörperlösung (anti-Maus- HRP) behandelt und dreimal für je 10 min bei Raumtemperatur mit Waschlösung (PBS, 0,1% Tween) gewaschen. Die Detektion erfolgte mit ECL-Plus-Reagenz.

Figuren : Figur 1 zeigt einen Überblick über das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren. Ausgehend von gereinigter DNA oder RNA werden die Nukleinsäurekopien, die analysiert werden sollen, durch Hybridisierung an immobilisierte komplementäre Sequenzen gefischt. Bei Verwendung von RNA wird anschließend eine reverse Transkription durchgeführt. Dann wird die Nukleinsäuresequenz in einer konventionellen PCR amplifiziert, wobei erfindungsgemäße Primer- Kombinationen verwendet werden, die spezifische Vorwärts-Primer und spezifische Rückwärts-Primer umfassen, die eine Unterscheidung zwischen Translationsprodukten einer Wildtyp-Nukleinsäure und einer mutierten Nukleinsäure erlauben. In der anschließenden in vitro Transkription und Translation können drei Kombinationen (I bis III) von Proteinen entstehen.

Zur Erhöhung der Detektionssensitivität kann ein Teil des Wildtyp-Proteins abgetrennt werden. Zur anschließenden Detektion der Mutation gibt es zwei Möglichkeiten, der differentielle ELISA (links) oder die SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit anschließendem Western-Blotting (rechts).

Figur 2A zeigt schematisch die Technik der Anreicherung der interessierenden Genkopien (hier : APC-Gene) durch Hybridisierung. Zur aus Stuhl gereinigten DNA werden Oligonukleotide der Sequenz des APC-Gens gegeben, die eine Biotin-Markierung tragen. Nach Hybridisierung mit den APC-Genkopien werden die Oligonukleotide aus der Lösung mit Hilfe Streptavidin-gekoppelter magnetischer Beads gefischt. Nach einem Wasch- Schritt können die angereicherten APC-Genkopien als Template in einer PCR-Reaktion eingesetzt werden.

Figur 2B zeigt ein Agarose-Gel, das die Anreicherung einer gesuchten DNA- Sequenz aus menschlichem Stuhl durch Hybridisierung an eine zur gesuchten Sequenz komplementäre, immobilisierte synthetische Sequenz veranschaulicht. Das Agarose-Gel zeigt das Ergebnis von PCR Reaktionen ausgehend von einer DNA-Probe, wobei als Template in einer direkten PCR Amplifikation das APC-Gen diente (Spur 2 und 3). Nach Anreicherung der gesuchten Sequenz durch Hybridisierung an einen spezifischen komplementären Primer lässt sich das Gen zwar aus dem Pellet amplifizieren (Spur 6 und 7), nicht jedoch aus dem Überstand (Spur 6S und 7S). Umgekehrt lässt sich das Gen ohne spezifischen komplementären Primer nicht aus dem Pellet (Spur 4 und 5), jedoch aus dem Überstand amplifizieren (Spur 4S und 5S). Auf Spur M wurde ein DNA-Marker, auf Spur 1 eine negative Kontrolle ohne DNA aufgetragen.

Figur 3A zeigt einen Western-Blot, in dem-ausgehend von Kontroll-DNA oder auch menschlicher genomischer DNA aus Stuhl-die verschiedenen in vitro transkribierten und translatierten Proteine nachweisbar sind. Die Proteine wurden detektiert mit Antikörpern gegen die verschiedenen nachweisbaren Peptide. Auf Spur A. dest wurde eine negative Kontrolle aufgetragen. Ausgehend von Plasmid-DNA, zeigt das Ergebnis des Western-Blots das nicht mutierte APC Protein in voller Länge (wt, APC wt), das Protein mit einer Leseraster-Verschiebungsmutation, die nicht zu einer

Verkürzung führt (frameshift) und das Protein mit einer Mutation, die zu einem frühen Stop der Translation führt (stop, APC A).

Figur 3B zeigt einen Western-Blot mit dem Ergebnis der DNA-Analyse mit der entwickelten Methode. Spur 1 bis 3 : Plasmid-DNA als positive Kontrollproben. Erkennbar sind die unterschiedlichen Größen der Fragmente des normalen Wildtyp-Gens und der zwei verschiedenen mutierten Sequenzen, die zu Stop-Mutationen führen (stop1, stop2). Spur 4 : Tumor- DNA zeigt die normale Sequenz (wt) und das verkürzte Fragment (mut).

Spur 5 bis 8 : DNA aus zwei verschiedenen Stuhlproben (S1, S2) zeigt in beiden Fällen das mutierte zusätzlich zum normalen Fragment. Die Analysen wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt. Spur 9 : Negativ- Kontrolle ohne DNA.

Figur 4 zeigt eine beispielhafte Abbildung eines Multi-Tag-Vektors. Die Zahlen stehen für Restriktionsschnittstellen. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) trägt 6 Schnittstellen. Die Schnittstellen sind durch waagrechte Linien über der Sequenz gekennzeichnet. Die Sequenzabschnitte, die für nachweisbare erste und zweite Peptide codieren, die Start-und Stop- Codons sind unterstrichen. A. Die Multi-Tag-Sequenz besitzt die in SEQ. ID NO. 21 angegebene Sequenz. Alle Sequenzabschnitte, die für nachweisbare erste und zweite Peptide codieren, liegen in dem vom Start- Codon definierten Leserahmen. B. Die Multi-Tag-Sequenz besitzt die in SEQ. ID NO. 22 angegebene Sequenz. Nur die Sequenzabschnitte vor der MCS, die für nachweisbare erste Peptide codieren, liegen in dem vom Start-Codon definierten Leserahmen (x). Hinter der MCS liegen die Sequenzabschnitte für nachweisbare zweite Peptide in alternativen, zu dem vom Start-Codon unterschiedlichen Leserahmen (x+1, x+2).

Figur 5 zeigt einige Beispiele für mögliche Peptide mit Aminosäuresequenz sowie entsprechendem Nachweisreagenz (mAK : monoklonaler Antikörper, pAK : polyklonaler Antikörper), die an das zu analysierende Protein N-oder C-terminal fusioniert werden können. Die dazu notwendigen Nukleinsäuresequenzen sind in SEQ. ID NO: 1 - 20 angegeben.