Verfahren zur Elektromanipulation von Zellen zur Veränderung der Membranpermeabilität dieser Zellen unter Verwendung von lipophilen Ionen als Mediumzusatz

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Zellen mit elektrischen Feldern zur Veränderung der Membranpermeabilität dieser Zellen unter Verwendung von lipophilen Ionen als Mediumzusatz. Spezieller betrifft die Erfindung Verfahren zur Elektroporation und Elektrofusion von Zellen unter Verwendung von lipophilen Ionen als Mediumzusatz. Durch diesen Zusatz von lipophilen Ionen wird die Effizienz und vor allem auch die Reproduzierbarkeit deutlich erhöht sowie die ansonsten relativ hohe Variationsbreite der Elektroporations- bzw. Elektrofusionsverfahren verkleinert.

Stand der Technik

Elektrotransfektion und Elektrofusion von Zellen werden routinemäßig in vielen Bereichen der Biotechnologie und Biomedizin für die Manipulation des Genoms und des Zytosols eingesetzt. Beide Methoden basieren auf der Anwendung von elektrischen Feldpulsen hoher Intensität und sehr kurzer Dauer, die zu einem reversiblen elektrischen Membrandurchbruch (sog. Elektroporation) führen. Ein breites Spektrum von Molekülen, einschließlich Hormone, Proteine, RNA und DNA, kann in lebende Zellen mittels Elektroporation eingeschleust werden. Bei dielektrophoretisch kontaktierten Zellen führt der Membrandurchbruch in der Kontaktzone zur Verschmelzung der Zellen, was für die Herstellung von Hybridzellen (Elektrofusion) benutzt werden kann.

Für die Elektroporation/fusion von Säugerzellen verwendet man in der Regel Feldstärken von wenigen kV/cm und Pulsdauer von einigen 10 μs (bis ms). Das angelegte Feld führt zu einer exponentiellen Membranaufladung, die durch die induzierte Transmembranspannung V _% angegeben werden kann:

Fg(O = 1.5 α E ₀ cos 0(l-exp(-t/τ _m )) (1),

wobei a der Zellradius ist, θ der Polarwinkel zur Richtung des angelegten Feldes E ₀ und τ _m die Zeitkonstante der Membranaufladung. Der Membrandurchbruch findet statt, wenn V _g den

kritischen Wert V _c =l Volt überschreitet.

Die Zeitkonstante τ _m der Membranaufladung wird mit Hilfe der folgenden Gleichung errechnet:

_{Tm = aC} (± ₊ -L) (2) ^m ~{σ, 2σ. ||

wobei C _m [μF/cm ² ] die flächenspezifische Membrankapazität ist und σ; und σ _e für die spezifischen Leitfähigkeiten [mS/cm] des Zytosols und des äußeren Porations- bzw. Fusionsmediums stehen.

Setzt man für den Zellradius einen typischen Wert von 7 μm in die Gleichung 1 ein, kann die minimale kritische Feldstärke für den Durchbruch in den zu den Elektroden zugewandten Membranbereichen (θ = 0) berechnet werden (unter der Bedingung, dass die Pulsdauer viel länger als die Relaxationszeit der Membran ist t » τ _m ): £ _kr i _t = ^" VV(1.5 ^χ a)« 1 kV/cm. Für größere Zellen werden entsprechend der Gl. 1 wesentlich kleinere Feldstärken benötigt. Die Zeitkonstante τ _m bei Säugerzellen liegt im Bereich von 0.1-1 μs (Gl. 2: C _m =l μF/cm ² , σ; « 5mS/cm, σ _e = 0.1-10 mS/cm, s.u.). Daher sind die verwendeten Pulsdauern von 10-100 μs viel länger als τ _m , so dass Gl. 1 vereinfacht werden kann: V _g = 1.5 a EQ COS θ.

Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Effizienz von Elektrotransfektions- und -Elektrofusionsverfahren durch die Verwendung von schwach-leitenden, hypotonen Medien während der Pulsapplikation deutlich gesteigert werden kann [Zimmermann & Neil, 1996; Sukhorukov et al. 1998]. Solche Medien enthalten als Hauptosmotikum verschiedene Zucker und Zuckerderivate. Unter anderem Zucker werden monomere Kohlenhydrate, wie Glukose, Sorbit, Inosit oder Mannit, sowie Disaccharide, einschließlich Saccharose oder Trehalose, allgemein benutzt [Zimmermann & Neil, 1996].

Die Reduktion des osmotischen Druckes und der Leitfähigkeit dient mehreren Zwecken bei der Elektroporation und -fusion:

1) Das hypotone Anschwellen von Zellen fördert den Membrandurchbruch, weil die induzierte Membranspannung linear vom Zellradius abhängt (s.o. Gl. 1).

2) Das Verringern der äußeren Leitfähigkeit verbessert stark die Elektroinjektion aufgrund der transienten Elektrodeformationskraft F _D EF auf die Zellmembran:

F ^r DEF ^X _∞ E - ⁰ O ² / t ^σ ' ^{2 ~} _ ^σ e \)2

Wenn σj = σ _e , bleibt die Deformationskraft aus: FD = 0. Unter der Bedingung σj < σ _e wird auf die Zellmembran eine Elongationskraft F _D in Feldrichtung ausgeübt, deren Ausmaß mit sinkender σ _e zunimmt (Gl. 3). Gleichzeitig führt die Senkung der σ _e zu einer starken Zunahme der Mengen an elektroinjizierten Molekülen [Sukhorukov et al., 1998].

3/4) Bei der Elektrofusion sind niedrig leitende Medien obligatorisch. Analog zur Deformationskraft nehmen sowohl die elektrische Polarisation der Zelle bzw. der induzierte Zelldipol μc (Gl. 4) als auch die positive dielectrophoretische Kraft im MHz-Bereich (1-10 MHz) (Gl. 5) mit sinkender σ _e zu [Jones, 1995]:

μ _c = 4π ε _e ε ₀ a ^{3 gj} ° ^e E ₀ ( _4)> σ, + zσ„ e

F _DEP = ² ^ ε _e ε ₀ a ³ ° ^{ ° ^e VE ₀ ² ₍₅₎ σ _; + zσ _e wobei ε _e εo=8O><8.85 10 ^"12 F/m die Permittivität des wässrigen Außenmediums ist. Der Term VE ₀ ² spiegelt die Inhomogenität des Feldes wider. Die Verminderung der σ _e führt außerdem zu einer Erhöhung der Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, was die gegenseitige Anziehung der Fusionspartner begünstigt.

5) Zusätzlich zu den oben beschriebenen physikalischen Effekten erleichtert das hypotone Anschwellen die Elektrofusion durch die Auflösung des Zytoskeletts, das Glätten der Zellmembranen (Retraktion der Mikrovilli) und die Erhöhung der Mobilität der Membranbestandteile.

Trotz breiter Anwendung von Elektrotransfektions/Elektroporations- und Elektrofusions- verfahren gibt es bei den derzeit angewandten Verfahren jedoch immer noch eine Reihe ungelöster Probleme, wie z.B.:

(1) niedrige Transfektions- und Fusionsraten bei besonders „Feld-resistenten" Zelltypen,

(2) hohe Sterblichkeitsraten von Zellen nach der Elektroporation/fusion,

(3) starke „batch-to-batch" Schwankungen der Transfektions- und Fusionsraten sowie

(4) sehr oft schwankende Reproduzierbarkeit in der Elektroinjektions- bzw. Fusionsausbeute.

Aufgabe der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung von neuen verbesserten Elektromanipulationsverfahren für Zellen mit gesteigerter Effizienz und Reproduzierbarkeit. Eine damit in Zusammenhang stehende weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von Mitteln zur Verbesserung herkömmlicher Elektromanipulationsverfahren, insbesondere Elektroporations- und Elektrofusionsverfahren.

Eingehende Untersuchungen der Erfinder führten zu dem überraschenden Ergebnis, dass durch einen Zusatz von lipophilen Ionen zu dem Behandlungsmedium, insbesondere einem hypotonen Behandlungsmedium, die Effizienz und Reproduzierbarkeit von Elektromanipulationsverfahren für Zellen, wie z.B. Elektroporations- und Elektrofusionsverfahren, stark verbessert und insbesondere die Ausbeute und Lebensfähigkeit der elektromanipulierten Zellen deutlich erhöht werden kann.

Dementsprechend werden die oben angesprochenen Aufgaben erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung von Zellen mit elektrischen Feldern nach Anspruch 1, bei dem das Behandlungsmedium lipophile Ionen enthält, sowie die Verwendung dieser lipophilen Ionen nach Anspruch 23. Spezielle und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Beschreibung der Erfindung

Ausgangspunkt für die vorliegende Erfindung waren experimentelle Befunde, dass viele Zellen, speziell Säugerzellen, insbesondere unter hypotonen Bedingungen wie sie typischerweise während einer Elektroporation/Elektrofusion vorliegen, zu einer komplexen Volumenregulation in der Lage sind.

Jüngere Untersuchungen [Reuss et al., 2004] haben gezeigt, dass nach dem raschen anfänglichen Anschwellen der Zellen in hypotonem Zuckermedien, in Abhängigkeit von dem verwendeten Zuckern, sowohl eine langsamere sekundäre Volumenzunahme als auch Schrumpfung der Zellen auftreten kann. Beides kann zum schnellen Ausfluss des Elektrolyts durch sog. Volumen-sensitive Kanäle aus dem Zytosol fuhren.

In hypotonen Porations- und Fusionsmedien, die mit einem Oligosaccharid (z.B. Trehalose, Saccharose oder Raffinose) substituiert sind, findet eine regulatorische Volumenabnahme (sog. „regulatory volume decrease" = RVD) bei allen bisher untersuchten humanen und Säugerzellen statt. Dies bedeutet, dass Zellen nach einer kurzen Schwellungsphase (1-3 min) in hypotonem Medium ihr ursprüngliches Volumen (trotz anhaltendem hypotonen Stress) innerhalb von 15-20 min einregulieren können.

Elektrophysiologische Studien anderer Autoren lassen es wahrscheinlich erscheinen, dass die anfängliche Zellschwellung die Volumen-sensitiven Chlorid-Kanäle aktiviert, was zum Chlorid-Ausstrom aus der Zelle und einer Depolarisation der Zellmembran führt. Die Membrandepolarisation bewirkt eine Aktivierung der spannungsabhängigen K ⁺ -Kanäle und einen K ⁺ -Ausstrom. Der Netto-KCl-Ausstrom zusammen mit dem osmotisch-bedingten Wasserausstrom dürfte zu einer Wiederherstellung des normalen (d.h. isotonischen) Zellvolumens führen [Fürst et al., 2002; Lang, 1998].

Im Gegensatz zu Oligosacchariden findet in hypotonen Lösungen monomerer Zuckerderivate (z.B. Sorbit, Inosit oder Glukose) keine RVD statt [Reuss et al., 2004]. Bei manchen Zellarten beobachtet man sogar eine sekundäre langsamere Schwellung der Zellen. Der Unterschied zwischen Oligo- und Monosacchariden könnte durch die Größenselektivität der Volumensensitiven Kanäle („volume-sensitive Channels" =VSC) erklärt werden. Solche Kanäle sind ubiquitär in den Membranen der Säugerzellen vorhanden [Kirk, 1997; Strange, 1994].

Jedoch führt der hypotone Stress auch in Medien ohne RVD, z.B. in Inosit- oder Sorbitsubstituierten Medien, zu erheblichen Elektrolytverlusten und Senkung der zytosolischen Leitfähigkeit (wie z.B. durch Elektrorotationsspektren (Fig. 7A) belegt).

Die Ionenverluste aus dem Zytosol senken die Leitfähigkeit σ; des Zytosols, wodurch die Porations- und Fusions-relevante Deformationskraft (Gl. 3), Zellpolarisation μc (Gl. 4) und dielektrophoretische Kraft (Gl. 5) stark erniedrigt werden. Außerdem hat der Ionenausfluss aus dem Zytosol erhebliche Vitalitätsverluste bei Zellen zur Folge.

Diese Effekte können die positiven Wirkungen von hypotonen Medien bei der Elektro- poration/Elektrofusion ganz oder teilweise zunichte machen.

Bis jetzt wurden in der Literatur die komplexe Volumenantwort von Zellen, speziell Säugerzellen, in hypotonen Zuckermedien und die damit verbundenen Ionenflüsse jedoch noch nicht hinsichtlich ihrer Relevanz für die Elektroporation und -fusion diskutiert.

Die vorliegende Erfindung beruht nun u. a. auf dem überraschenden experimentellen Befund, dass der Zusatz von lipophilen Ionen, insbesondere Anionen, zu dem Behandlungsmedium unter anderem diese Volumenregulation unterbinden und damit auch die Effizienz von Elektroporations- bzw. Elektrofusionsverfahren deutlich steigern kann.

Die Adsorption bzw. der Einbau lipophiler Anionen in die Zellmembran führt möglicherweise zu einer Inhibierung der an der Volumenregulation beteiligten Ionenkanäle. Alternativ kann es sein, daß die lipophilen Ionen auf direkte oder indirekte Weise die Offenwahrscheinlichkeit der Kanäle bzw. deren sonstige Transporteigenschaften regulieren. Aus beiden Modellvorstellungen kann abgeleitet werden, daß bei Einsatz von lipophilen Ionen die Ionenverluste aus dem Zytosol während des hypotonen Stresses stark verringert werden. Zum einen wird dadurch das Zellvolumen stabilisiert, zum anderen werden der Ionengehalt und die Leitfähigkeit des Zytosols auf hohen Niveaus gehalten.

Ohne sich auf eine Theorie hinsichtlich des Wirkungsmechanismus festlegen zu wollen, wird gegenwärtig davon ausgegangen, dass diese Inhibierung bestimmter Ionenkanäle eine Folge der änderung, insbesondere Erhöhung, der Membrankapazität der Zelle, in Abhängigkeit von deren Membranspannung, durch die Adsorption und/oder den Einbau der lipophilen Ionen in die Membran ist.

Umfangreiche Untersuchungen der Erfinder haben ergeben, dass die durch lipophile Ionen induzierte änderung der Membrankapazität in Abhängigkeit von der Membranspannung in der Regel einer bestimmten Beziehung folgt und vorzugsweise das Verhalten einer symmetrischen oder asymmetrischen Glockenkurve mit einer Spannung V _max , bei der die Kapazitätserhöhung C(V _max ) maximal ist, aufweist.

Die Parameter der Glockenkurve hängen dabei von der chemischen Natur der lipophilen Ionen und von der Beschaffenheit der Membran (bzw. Zelltyp) ab. Anhand der Spannungsabhängigkeit der Glockenkurve eines lipophilen Ions können Rückschlüsse auf die Verteilung der lipophilen Ionen in der Membran gezogen werden.

Eine Gleichverteilung der lipophilen Ionen auf beiden Seiten der Membran sollte bei der Membranspannung vorliegen, bei der die maximale Kapazitätserhöhung festgestellt wird. Hingegen liegt die extremste Ungleichverteilung der lipophilen Ionen (entweder komplett auf zytosolischer oder extrazellulärer Membranseite) vor, wenn keine Kapazitätserhöhung durch die lipophilen Ionen gemessen werden kann. Eine ungleichmäßige Verteilung der lipophilen Ionen sollte zu einer starken Erniedrigung des Oberflächenpotentials (bis δV ~ -400 mV) an einer Seite der Membran führen. Dies wird in der Regel zu einer drastischen Veränderung des Potentialverlaufs über die Membran führen. Dieser „Membran-Asymrnetrie"-Effekt kann Elektromanipulationen von behandelten Zellen auf verschiedene Weise erleichtern:

1) die drastische Erniedrigung des Oberflächenpotentials führt zu einem so steilen Potentialverlauf über die Membran, daß lokale Durchbrüche erzeugt werden bzw. lokale Durchbrüche durch überlagerte externe Felder erleichtert werden (Elektroporation, Elektrofusion).

2) der veränderte Potentialverlauf führt zur Beeinflussung von spannungsabhängigen Transportsystemen in der Membran (Volumenregulation).

3) Neben der „Membran-Asymmetrie" wird eine „Hemisphären-Asymmetrie" der Zelle als ganzes auftreten. Diese erleichtert den elektrischen Durchbruch auf zwei Arten. Auf der einen Seite der Zelle ist das Potential zum Durchbruch bereits nahezu erreicht und die extern applizierte Durchbruchsspannung kann geringer als normal gewählt werden. Auf der anderen Seite der Zelle ist der anliegende Potentialgradient „ungünstig" für die extern angelegte Durchbruchsspannung. Diese Zellseite ist also durch die lipophilen Ionen „geschützt". Alternativ kann man dies im Rahmen der

externen Feldamplitude bzw. in der Länge/Kürze des applizierten Feldpulses nutzen. Beide Hemisphären werden unterschiedliche Aufladungszeiten aufweisen. Dies hat zur Folge, daß dieser „asymmetrische" Durchbruch für die Zelle schonender ist als der normale Durchbruch.

Dieser Befund ermöglicht die Auswahl besonders geeigneter lipophiler Ionen durch Bestimmung ihrer Auswirkungen auf die änderung der Membrankapazität unter vorgegebenen Bedingungen. Ein solches Auswahlverfahren wird typischerweise die folgenden Schritte umfassen:

- Messung der elektrischen Membrankapazität der biologischen Zelle in Abhängigkeit von einer bestimmten Membranspannung, wobei die Spannungsabhängigkeit der durch lipophile Ionen induzierten Membrankapazität mit mehreren verschiedenen lipophilen Ionen im Behandlungsmedium gemessen wird, und

- Feststellung und Auswahl der lipophilen Ionen, für welche die durch lipophile Ionen induzierte Membrankapazität der Zelle ein vorbestimmtes Auswahlkriterium erfüllt. Dieses Auswahlkriterium kann beispielsweise die Form oder Position der Glockenkurve bei bestimmten Membranspannungen sein.

Je nach den gewünschten Ergebnissen und Anwendungen können z.B. diejenigen lipophilen Ionen ausgewählt werden, für welche die Membrankapazität bei der natürlichen Membranspannung der Zelle ein Minimum aufweist (d.h. an der hypo- bzw. hyperpolarisierten Flanke der Glockenkurve liegt), oder diejenigen, für welche die Membrankapazität bei der natürlichen Membranspannung der Zelle ein Maximum aufweist.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden diejenigen lipophilen Ionen ausgewählt, für welche die Membrankapazität bei der natürlichen Membranspannung der Zelle einen nur wenig bzw. keinen erhöhten Wert aufweist, d.h. jene lipophilen Ionen, deren charakteristische Glockenkurve derartig aussieht, daß sie bei der natürlichen Membranspannung eine abfallende Flanke aufweist. In diesem Fall werden die lipophilen Ionen bei der natürlichen Membranspannung voraussichtlich ungleichmäßig über die Membran verteilt sein und den obigen nutzbaren Asymmetrieffekt verursachen. Dies betrifft z.B. hyperpolarisierte Zellen, die einem extrem schwachleitenden Fusionsmedium ausgesetzt sind.

Lipophile Ionen, für welche die Membrankapazität bei der natürlichen Membranspannung der Zelle ein Maximum aufweist, könnten für Anwendungen genutzt werden, bei denen eine hohe Membrankapazität bzw. eine Gleichverteilung der lipophilen Ionen von Nutzen ist. Ein Beispiel hierfür sind Zellen mit inhomogenem Membranaufbau, die auf diese Weise eine homogenere Membranaufladung erhalten, wie z.B. die meisten Säugerzellen, bei denen sich das negativ geladene Phosphatidylserin hauptsächlich auf der zytosolischen Seite der Plasmamembran befindet.

Nachdem die natürliche Membranspannung (d.h. ohne angelegtes Feld) von Ionengradienten permeabler Ionen zwischen dem äußeren Badmedium (Behandlungsmedium) und dem Inneren der Zelle abhängt, kann diese durch Zusatz von Salzen zu dem Behandlungsmedium eingestellt werden. Geeignete lösliche Salze können bespielsweise Natrium-, Kalium- oder Bariumionen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.

Nachdem die änderung der Membrankapazität einerseits durch Wahl der lipophilen Ionen und andererseits durch Veränderung der natürlichen Membranspannung beeinflusst werden kann, bedeutet dies, dass eine gewünschte Verteilung von lipophilen Ionen entweder bei unveränderter Membranspannung durch die Wahl eines lipophilen Ions mit der gewünschten Form (z.B. Flanke oder Maximum) der Glockenkurve bei dieser Spannung oder bei einem bestimmten Ion durch entsprechende Verschiebung der natürlichen Membranspannung bis zu der Spannung, die dem entsprechenden Glockenkurvenabschnitt entspricht, erhalten werden kann.

Ein weiterer Vorteil bei der Einstellung von Zellen auf ein bestimmtes Membranpotential (z.B. durch Verwendung zellzyklus-synchronisierter Zellen, Einstellung des Membranpotentials durch geeignete Salzbedingungen) liegt in der besseren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

Wie bereits erwähnt, kann die durch lipophile Ionen induzierte änderung der Membrankapazität zur vollständigen oder teilweisen Ausschaltung der Volumenregulation von Zellen in hypotonen Medien genutzt werden. Wie oben erörtert, führt dies zu deutlich verringerten Elektrolytverlusten und damit zu einer Verbesserung der Rahmenbedingungen für Elektromanipulationsverfahren wie Elektroporation oder Elektrofusion. Ionenverluste aus

dem Zytosol senken die Leitfähigkeit σ _\ des Zytosols, wodurch die Porations- und Fusionsrelevante Deformationskraft (Gl. 3), Zellpolarisation μc (Gl. 4) und dielektrophoretische Kraft (Gl. 5) stark erniedrigt werden. Außerdem hat der Ionenausfluss aus dem Zytosol erhebliche Vitalitätsverluste bei Zellen zur Folge.

Durch die Ausschaltung dieser negativen Effekte kann die Effizienz und Reproduzierbarkeit von Elektromanipulationsverfahren erheblich gesteigert werden.

Wie aus den obigen Ausführungen ersichtlich, kann die Gegenwart von lipophilen Ionen bzw. die dadurch induzierte änderung der Membrankapazität jedoch auch unter nicht-hypotonen, z.B. isotonen, Bedingungen zu einer Membranaufladung führen, die den bei Elektromanipulationsverfahren gewünschten bzw. erforderlichen Membrandurchbruch wesentlich erleichtert. Somit ermöglicht die erfindungsgemäße Verwendung von lipophilen Ionen auch eine leichtere und effizientere Durchführung von Elektromanipulationsverfahren wie Elektroporation oder Elektrofusion in nicht-hypotonen Medien. Die Vermeidung von hypotonem Stress für die Zellen wäre von großem Vorteil und wirkt sich jedenfalls auf die überlebensraten der manipulierten Zellen günstig aus.

Geeignete Zellen für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. die erfindungsgemäße Verwendung von lipophilen Ionen sind grundsätzlich alle Zellen natürlichen oder synthetischen Ursprungs. Synthetische Zellen können beispielsweise künstliche membranumhüllte Vesikel, Liposomen oder Micellen sein. Natürliche Zellen umfassen prokaryotische Zellen, z.B. Bakterien oder Hefen, oder eukaryotische Zellen, z.B. tierische oder pflanzliche Zellen. Bevorzugte tierische Zellen sind Säugerzellen, insbesondere humane Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zellen um lebende Zellen.

Die erfindungsgemäß verwendeten lipophilen Ionen können Kationen, Anionen oder ein Gemisch aus Kationen und Anionen sein.

Kationen sind speziell für die Verwendung bei Pflanzenzellen bevorzugt, während Anionen bei tierischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, besonders bevorzugt sind.

Die erfindungsgemäß verwendeten Kationen können aus einer Spezies bestehen oder mehrere verschiedene Kationen umfassen. Typischerweise werden die verwendeten lipophilen Kationen wenigstens eine Substanz aus der Gruppe von Kationen enthalten, die Kationen von lipophilen Metallkomplexen, lipophilen organometallischen Verbindungen und lipophilen organischen Verbindungen mit mindestens einer positiv geladenen funktionellen Gruppe umfasst. Spezielle Beispiele sind Rheniumhexacarbonyl (Re(CO) ₆ ) ^"1" , Tetraphenyl- phosphonium- oder Tetraphenylarseniumverbindungen. Weitere geeignete Verbindungen sind für den Fachmann unschwer durch Routineversuche zu ermitteln.

Die erfindungsgemäß verwendeten Anionen können aus einer Spezies bestehen oder mehrere verschiedene Anionen umfassen. Typischerweise werden die verwendeten lipophilen Anionen wenigstens eine Substanz aus der Gruppe von Anionen enthalten, die Anionen von lipophilen Metallkomplexen, lipophilen organometallischen Verbindungen und lipophilen organischen Verbindungen mit mindestens einer deprotonierbaren funktionellen Gruppe umfasst.

Spezielle, nicht beschränkende Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare lipophile Ionen, insbesondere lipophile Metallkomplexe, sind die folgenden:

O

Vorzugsweise enthalten die lipophilen Anionen wenigstens eine Substanz aus der Gruppe von Anionen, die Anionen lipophiler Wolfram-Komplexe (LTC), insbesondere lipophiler Wolframcarbonyl-Komplexe, Dipikrylamin (DPA) und Derivate davon, Anionen lipophiler organischer Verbindungen, die mindestens eine Carboxylat-, Sulfonat-, Sulfat-, Thiosulfat-

oder Thiocyanatgruppe enthalten, insbesondere Arachidonsäure, oder Anionen eines gegebenenfalls substituierten Tetraphenylborats oder Phenyldicarbaundecandecaborans (PCB) oder eines Tetracyanoborats oder Tetratrifluormethylborats umfasst.

Besonders bevorzugt sind die lipophilen Anionen aus der Gruppe der folgenden Anionen

^~ r

ausgewählt, wobei: (1) = [C ₁₂ H ₄ N ₇ O ₁₂ ] ^" , 2,2',4,4',6,6 ^I -Hexanitrodiphenylamid (Dipikrylamin = DPA); (2) = das Anion von Et ₄ N[W(CO) ₅ (SCNOC ₆ H ₄ )], Tetraethylammoniumbenzoxazolidin-2- thion-1-yl-pentacarbonylwolframat, MW 604 (abgekürzt WO). (3) das Anion von Et _t N[W ₂ (CO)10(μ-S ₂ CH)], Tetraethylammoniumdecacarbonyl-μ-dithioformiato-diwolframat , MW 725 (hier im folgenden als LTC ("Lipophilic Tungsten Complex") oder WW abgekürzt); (4) Das Anion von Na[B(C ₆ Hs) ₄ ], Natriumtetraphenylborat, MW 342.

Durch die Verwendung mehrerer lipophiler Ionen unterschiedlicher Natur in gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen zur gleichen Zeit oder in zeitlicher Abfolge kann eine „überlappung" der individuellen Eigenschaften der lipophilen Ionen erreicht werden. Dies kann für verschiedene Zwecke, z.B. zur Gewährleistung robusterer, d.h. reproduzierbarer und weniger störungsanfälliger Verfahrensabläufe von Vorteil sein.

Die erfindungsgemäß verwendbaren lipophilen Ionen sind im Stand der Technik wohlbekannte Verbindungen und im Handel erhältlich oder nach bekannten Routineverfahren herstellbar.

Grundsätzlich sind alle Ionen geeignet, die befähigt sind, die Membrankapazität derartig zu erhöhen, dass die Erhöhung der Kapazität eine symmetrische bzw. asymmetrische Glockenkurve in Abhängigkeit von der Trans-Membranspannung aufweist. Exemplarisch ist dies für einige Ionen (Wolfram-Verbindungen, DPA, etc. ) gezeigt.

Nachdem eine Hauptanwendung der vorliegenden Erfindung die Elektromanipulation lebender Zellen sein wird, sollten die lipophilen Ionen in diesem Fall für lebende Zellen physiologisch verträglich sein. Für einige Anwendungen ist es besonders bevorzugt, dass die verwendeten lipophilen Ionen durch UV-Licht abbaubar sind und für lebende Zellen physiologisch verträgliche Abbauprodukte ergeben. Beide Bedingungen sind z.B. bei dem lipophilen anionischen Wolframkomplex der obigen Formel 3 in idealer Weise erfüllt. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass unschwer ähnliche Verbindungen mit ähnlicher Wirksamkeit, Verträglichkeit und ähnlichem Abbauverhalten hergestellt werden können.

Erfindungsgemäß werden die lipophilen Ionen typischerweise in einem Verfahren zur Behandlung von Zellen mit elektrischen Feldern zur Veränderung der Membranpermeabilität dieser Zellen eingesetzt, welches mindestens die folgenden Schritte umfasst:

- Bereitstellung von mindestens einer Zelle (1) in einem Behandlungsmedium (2), und

- Beaufschlagung der Zelle (1) mit mindestens einem elektrischen Spannungspuls, gekennzeichnet durch den Schritt:

- Zusatz von lipophilen Ionen zu dem Behandlungsmedium (2).

Ein solches Verfahren umfasst allgemein die verschiedenen bekannten oder denkbaren Elektromanipulationsverfahren zur Veränderung der Membranpermeabilität von Zellen, bei denen die Zellen einem elektrischen Spannungspuls ausgesetzt werden, und insbesondere Verfahren zur Elektrotransfektion/Elektroporation oder Elektrofusion.

Die lipophilen Ionen werden dem Behandlungsmedium (2) in der Regel in einer Konzentration im Bereich von 1 nM bis 100 μM, vorzugsweise 0,1 μM bis 60 μM, besonders bevorzugt 1 μM bis 50 μM, zugesetzt.

In einer speziellen Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dem Behandlungsmedium (2) auch eine osmotisch wirksame Substanz zur Erzeugung eines hypotonen Stresses für die mindestens eine biologische Zelle (1) zugesetzt. Solche Substanzen umfassen alle für diesen Zweck bekannte Substanzen, vorzugsweise Mono- und/oder Disaccharide, z.B. Saccharose, Trehalose, Glukose, Mannit, Inosit, Sorbit etc.

Vorzugsweise erfolgt die Beaufschlagung der biologischen Zelle (1) mit dem elektrischen Spannungspuls mit einer Verzögerungszeit nach dem Zusatz der osmotisch wirksamen Substanz, wobei die Verzögerungszeit vorzugsweise im Bereich von 15 s bis 10 min gewählt ist.

Untersuchungen der Erfinder haben ergeben, dass bei Elektrotransfektions/porations- und Elektrofusionsverfahren die Dauer des hypotonen Stresses vor der Feldpulsapplikation einen erheblichen Einfluss auf die Effizienz dieser Verfahren hat.

Basierend auf biophysikalischen und volumetrischen Experimenten, konnte die Dauer der hypotonen Behandlung in den Elektromanipulationprotokollen erheblich optimiert werden. In diesen Experimenten wurden hypotone Porations- und Fusionsmedien verwendet, deren Zusammensetzung in den Tabellen 1 und 2 angegeben ist. Für das Waschen der Zellen wurden auch entsprechende isotone Medien eingesetzt.

a) Elektrofusion:

Wesentlich höhere Ausbeuten von lebenden Hybridzellen konnten durch eine Optimierung des Timings der Pulsapplikation erreicht werden. Die Hybridausbeuten hingen stark von der Dauer des hypotonen Stresses vor der Pulsapplikation ab. Eine kurze hypotone Behandlung von 2 min, die dem Ende der schnellen Anschwellphase entsprach, ergab die besten Ergebnisse. Längere Inkubationszeiten (z.B. 20 bzw. 40 min) verringerten die Fusionsausbeuten (Daten nicht gezeigt).

b) Elektrotransfektion mit dem GFP-Plasmid:

Analog zur Elektrofusion ergab eine kurze hypotone Behandlung (d.h. 2 min vor der Pulsapplikation) in der Regel wesentlich höhere Ausbeuten an GFP-transfizierten Zellen als eine längere Inkubation von 10 min (Tabelle 4). Im Allgemeinen korrelierten die Inkubationszeit-abhängigen Transfektionsausbeuten (TY) sehr gut mit den transienten Veränderungen der Zellgröße (s. Gl. 1) bei verschiedenen Zelltypen.

Längere Inkubation führte stets zu einer Abnahme der Zellproliferation (PF, z.B. von 47 auf 33% bei HEK-Zellen in Inosit 150), was auf eine verminderte Lebensfähigkeit der Zellen (aufgrund des Elektrolytverlusts) hindeutet.

Diese starke Abhängigkeit der Elektroporations/transfektions- bzw- Elektrofusionseffizienz von der Dauer des hypotonen Stresses kann zu einer weiteren Verbesserung der oben beschriebenen Elektromanipulationsverfahren unter Verwendung von lipophilen Ionen durch Optimierung der Zeitspannen für den hypotonen Stress genutzt werden. Es ist anzumerken, dass durch diese zeitliche Optimierung in einigen Fällen auch ohne Einsatz von lipophilen Ionen bereits sehr hohe Effizienzen erzielt wurden, die mit lipophilen Ionen nur noch geringfügig gesteigert werden konnten. Die Verwendung von lipophilen Ionen bringt jedoch in jedem Fall den zusätzlichen Vorteil eines robusteren Protokolls, d. h. eines Protokolls, das nicht auf die präzise Einstellung optimaler Zeitwerte zur Erzielung hoher Effizienzen angewiesen ist. Dies stellt gerade bei der gewerblichen Anwendung dieser Verfahren einen großen praktischen Vorteil dar.

Vorzugsweise erfolgt der Zusatz der lipophilen Ionen zu dem Behandlungsmedium (2) in einer ausreichenden Konzentration und für eine ausreichende Zeitspanne vor dem Spannungspuls, dass eine Dotierung der Membranen der zu behandelnden Zellen mit diesen lipophilen Ionen erfolgt. Der Begriff „Dotierung" umfasst in diesem Zusammenhang die Adsorption der Ionen an der Membran und/oder den Einbau der Ionen in die Membran. Geeignete Konzentrationen und Zeitspannen (gewöhnlich in der Größenordnung von Minuten) können in Kenntnis der vorliegenden Offenbarung vom Fachmann unschwer in Routineversuchen ermittelt werden.

Figurenbeschreibung

Fig. 1 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens

Fig. 2 Schematische Darstellung einer Versuchsanordnung zur Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Verfahrens

Fig. 3 Schematische Darstellung des Verfahrens zur Auswahl geeigneter lipophiler Ionen

Fig. 4 Darstellung von „Glockenkurven", welche die Kapazitätsänderung der Zellmembran von Oozyten in Abhängigkeit von der an die Membran angelegten Spannung für drei verschiedene lipophile Anionen zeigen.

A: DPA (Verbindung 1)

Die unteren beiden Kurven stellen die Ergebnisse der Kontrollmessungen in Abwesenheit des lipophilen Ions DPA am Anfang (Quadrate ) bzw. am Ende (Dreieck mit der Spitze nach unten) der Messreihe dar. Die oberste Kurve (ausgefüllte Kreise) zeigt die Ergebnisse in Anwesenheit von extrazellulären 50 μM DPA und die darunterliegende Kurve (Dreieck mit der Spitze nach oben) in Anwesenheit von extrazellulären 50 μM DPA und 2,8 mM BaCl ₂ .

B: WO (Verbindung 2)

Die unteren beiden Kurven stellen die Ergebnisse der Kontrollmessungen in Abwesenheit des lipophilen Ions WO am Anfang (Quadrate ) bzw. am Ende (Dreieck mit der Spitze nach unten) der Messreihe dar. Die oberste Kurve (Dreieck mit der Spitze nach oben) zeigt die Ergebnisse in Anwesenheit von extrazellulären 10 μM WO und 2,8 mM BaCl ₂ und die darunterliegende Kurve (ausgefüllte Kreise) in Anwesenheit von extrazellulären 10 μM WO.

C: WW (Verbindung 3; LTC) Die unteren beiden Kurven stellen die Ergebnisse der Kontrollmessungen in Abwesenheit des lipophilen Ions WW am Anfang (Quadrate ) bzw. am Ende (Dreieck mit der Spitze nach unten) der Messreihe dar. Die oberste Kurve (ausgefüllte Kreise) zeigt die Ergebnisse in Anwesenheit von extrazellulären 10 μM WW und die darunterliegende Kurve (Dreieck mit der Spitze nach oben) in Anwesenheit von extrazellulären 10 μM WW und 2,8 mM BaCl ₂ .

Fig. 5 Zeitverläufe der relativen Volumina von aktivierten B -Lymphozyten (A) und Jurkat- Zellen (B und C) in stark hypotonen Fusionsmedien (75 bzw. 100 mOsm), die entweder Sorbit oder Trehalose als Hauptosmotikum enthielten. In hypotonem Trehalosemedium

(ausgefüllte Kreise) zeigten beide Zelltypen eine RVD nach dem ersten raschen Anschwellen. Im Gegensatz dazu eliminierte hypotones Sorbit die RVD in Jurkat-Zellen (Daten nicht gezeigt) oder induzierte sogar ein sekundäres Anschwellen) (A, leere Kreise). Der Wolframkomplex LTC inhibierte die RVD in B-Lymphozyten partiell oder vollständig in Jurkat-Zellen (Quadrate in A bzw. B). Arachidonsäure hob die RVD in Jurkat Zellen auf (C, Quadrate).

Fig.6 Vollständige oder teilweise Inhibierung der RVD in Säugerzellen durch verschiedene strukturell nicht verwandte lipophile Anionen (Verbindungen (1) (DPA), (2) (WO) und (4) TPB) (A-C). Im Gegensatz dazu beeinflusste das lipophile Kation Tetraphenylphosphonium (TPP, 10- 50 μM) die RVD nicht (C, Quadrate).

Fig. 7 Typische Rotationsspektren von H7- und Jurkat-Zellen (A bzw. B).

A: H7-Zellen wurden 15-20 min in isotonen oder hypotonen Sorbitmedien (ausgefüllte bzw. leere Kreise) derselben Leitfähigkeit von 120 μS/cm inkubiert. Im Vergleich zu isotonen Bedingungen führte hypotoner Stress zu einer deutlichenVerschiebung des zytosolischen Peaks f _c2 zu einer niedrigeren Frequenz, was eine signifikante Verringerung der zytosolischen Leitfähigkeit σ, anzeigt.

B: Lm Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (offene Kreise) verursachte 10 μM LTC einen zusätzliche Antifeld-Peak (furc) und verschob auch die f _c2 zu einer höheren Frequenz. Der letztere Effekt ist auf verringerten Elektrolytverlust aus dem Zytosol zurückzuführen.

Fig. 8 Wirkung von LTC auf die Elektroinjektion von Propidiumiodid Abhängigkeit der elektrisch induzierten PI-Aufnahme von der applizierten Feldstärke Eu bei einer Pulsdauer von 40 μs. Die Datenpunkte sind die mittleren PI-Aufnahmewerte, die aus drei unabhängigen Durchflusszytometriebestimmungen ermittelt wurden. Innerhalb des untersuchten Bereichs der Feldstärke war die PI-Aufnahme in Zellen, die mit 10 μM LTC ^" behandelt worden waren (ausgefüllte Kreise), größer als bei der Kontrolle (leere Kreise).

Tabelle 1. Zusammensetzung von Wasch- und Pulslösungen, die zur Elektrotransfektion verwendet wurden

Isotone Waschlösung Hypotone für die Poration Pulslösung IWS-P HPS

Inosit oder Trehalose 24O mM 50 oder 10O mM

KCl 25 mM 25 mM

KH ₂ PO ₄ 0.3 mM 0.3 mM

K ₂ HPO ₄ 0.85 mM 0.85 mM pH-Wert 7.4 7.4

Leitfähigkeit bei 22-24°C ~3.5 mS/cm -3.5 mS/cm

Osmolalität -290 mOsm -100 oder 150 mOsm

Tabelle 2. Zusammensetzung von Medien, die in dem verbesserten Elektrofusionsprotokoll verwendet wurden

Isotone Waschlösung Hypotone für die Fusion Fusionslösung IWS-F HFS-75/HFS-100

Ca-Acetat 0.1 mM 0.1 mM

Mg-Acetat 0.5 mM 0.5 mM

Rinderserumalbumin 1 mg/ml 1 mg/ml

Sorbit 29O mM 75 oder 10O mM pH-Wert 7.0 7.0

Leitfähigkeit bei 22-24°C -120 μS/cm -120 μS/cm

Osmolalität -290 mOsm -75 or lOO mOsm

Tabelle 3. Elektrische Eigenschaften von H7- and Jurkat-Zellen gemäß ROT-Spektren, die in isotonen und hypotonen Medien unterschiedlicher Zuckerzusammensetzung gemessen wurden

H7-Zellen

Sorbit 270 5.5±0.2 88±4 1.0±0.1

Sorbit 75 1.3±0.1 2.2±0.2 58±4 0.5±0.1

Jurkat-Zellen

Sorbit 300 1 11.0±l.( 1.3±0.1 12

Sorbit 100 1 .8±0. 1 2.5±0.1 140±5 0.7±0.1 8

Sorbit 100 10 1 .8±0. 1 5.3±0.3 88±5 0.7±0.1 7

Trehalose 300 1 8.5±0.7 HOttlO 1.3±0.1 9

Trehalose 100 1 4.1±0.2 120±20 l.l±0.1 8

Trehalose 100 10 1 .5±0. 1 5.7±0.2 110±12 0.7±0.1 12

^a Die mittleren C _m -, σ,- and ε,-Werte (±SA) wurden durch Anpassung des Einschalenmodells an die ROT-Spektren der in Fig. 6 gezeigten Zellen (nicht mit LTC ^" behandelt) erhalten. Hinsichtlich weiterer Details siehe Legende zu Fig. 6. ^b Die v- Werte wurden durch Volumenmessungen erhalten und repräsentieren das relative Zellvolumen, gemessen 20-25 min nach dem hypotonen Schock.

Tabelle 4. Wirkungen der Dauer des hypotonen Stresses und von LTC auf die Transfektionsausbeute (TA), GFP-Genexpression (GE) und den Proliferationsfaktor (PF) von HEK- and L929-Zellen

Dauer des

Zucker und Relatives hypotonen LTC Osmolalität Zellvolumen TA ^b GE ^b PF ^c TE ^d Stresses μM % a.u. mOsm % % r, min ^a v(7) ^a

HEK-Zellen

Inosit 150 2 1.5±0.1 44±4 80±7 47±8 20.5

Inosit 150 10 1.7±0.1 58±9 158±34 33±4 19.1

Inositl 150 10 10 1.9±0.2 44-fcl 77±8 47±3 20.7

Trehalose 150 2 1.4±0.1 35±3 83±5 68±14 23.9

Trehalose 150 10 l.l±0.1 20±5 58±7 56±6 11.4

Trehalose 150 10 10 1.4±0.1 38±3 100±12 59±8 22.4

L929-Zellen

Inosit 100 2 1.9±0.1 85±1 182±10 16±2 13.7

Inosit 100 10 1.5±0.1 75±4 104±19 12±1 9.1

Inosit 100 10 10 1.8±0.1 87±1 355±22 16±2 14.1

Trehalose 100 2 l.&fcO.l 71±1 177±21 31±4 21.9

Trehalose 100 10 1.3±0.1 60±5 133±28 28±2 16.8

Trehalose 100 10 10 1.5±0.2 69±2 188=1=10 45±9 31.0

Legende zu Tabelle 4: ^a T ist die Dauer der hypotonen Behandlung vor dem ersten Elektropuls; v(7) ist das relative

Zellvolumen zur Zeit T der Pulsapplikation nach dem hypotonen Schock. ^b Die TA- und GE- Werte repräsentieren den Prozentsatz bzw. den geometrischen Mittelwert der Fluoreszenzintensität von GFP-positiven Zellen, ermittelt aus GF-Histogrammen.

Die geometrischen GE-Mittelwerte von nicht-transfizierten Zellen (d.h., die

Autofluoreszenz) waren 3 ± 0.3 a.u. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SA von

3-9 Experimenten. ^c PF ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen 48 h nach einer Elektrotransfektion, angegeben als Prozentsatz der ursprünglichen Anzahl von Zellen. ^d Die Transfektionseffizenz TE ist definiert als TA x PF in Prozent. TE ist proportional zur

Anzahl der lebenden Zellen, die das Reportergen exprimieren.

Die folgenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.

BEISPIEL 1

Elektroporation/transfektion von Zellen, deren Plasmamembran mit lipophilen Anionen dotiert wurde

Für die Elektrotransfektion wurden Jurkat-T-Lymphozyten-Zellen, HEK 293-Zellen und Maus-Fibroblasten-L929-Zellen in vollständigem RMPI- Wachstumsmedium („Complete Growth Medium"; abgekürzt CGM), ergänzt mit 10 % (Vol/Vol.) fötalem Kalbserum, bei 37 °C unter 5 % CO ₂ gezüchtet. Vor der Elektrotransfektion wurden die adhärenten Zellen (d.h. HEK 293 und L929-Zellen) mit 0,5 mg/ml Trypsin ohne EDTA abgelöst, um die Kontaminierung des Pulsmediums mit diesem Chelatbildner zu vermeiden. Das Enzym wurde durch Waschen mit CGM entfernt.

Die Elektrotransfektions/Porationsprotokolle beinhalteten die folgenden Schritte:

1. Waschen der Zellen mit einer isotonen Waschlösung (IWS-P, siehe Tabelle 1);

2. Suspension von Zellen (10 ⁶ Zellen/ml) in einer hypotonen Pulslösung (HPS, Tabelle 1), enthaltend 10 μg/ml pEGFP-Cl (Clontech, Heidelberg, Deutschland), kodierend für ein grünes Fluoreszenzprotein (GFP);

3. Inkubation der Zellen für 2 oder 10 min. in HPS;

4. Applikation eines einzigen exponentiell abnehmenden Pulses bei den Zellproben (-800 μl) bei Raumtemperatur (RT etwa 22-24°C) unter Verwendung des Multiporators (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und steriler Küvetten mit planaren Aluminiumelektroden in einem Abstand von 4 mm;

5. Nachinkubation der Zellen in Pulsmedium für 10 min bei RT;

6. Sanfte überführung der Zellen in 5 ml vorgewärmtes CGM und 2tägige Kultivierung, um die maximale GFP-Epression erzielen;

7. Analyse mittels Durchflußzytometrie und elektronischer Zellzählung .

L929-Zellen wurden mit einem Puls von 3 kV/cm Feldstärke und 100 μs Dauer in 100 mOsm Pulsmedien (HPS, Tabelle 1) elektrotransfiziert. Jurkat-Zellen wurden mit 1,2 kV/cm und 40 μs in 100 mOsm HPS transfiziert. HEK-Zellen wurden mit 1,5 kV/cm und 70 μs in 150 mOsm HPS-Pulsmedien behandelt.

Zur Untersuchung der Wirkung eines lipophilen Anions hisichtlich der Vermeidung bzw. Minimierung von unerwünschten Elektrolytverlusten und der Stabilisierung des Zellvolumens wurden verschiedene Porationsmedien mit 10 μM des lipophilen Wolframkomplexes der obigen Formel 3, abgekürzt LTC („lipophilic tungsten complex") versetzt.

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse, die bei verschiedenen Mediumzusammensetzungen und Zeitbedingungen für den hypotonen Schock erhalten wurden.

Die Zugabe des LTC führte, insbesondere bei den längeren Inkubationszeiten in hypotonen Medien, zu einer deutlichen Steigerung der Transfektionseffizienzen.

Die verbesserten Transfektionsausbeuten konnten auch in zusätzlichen Experimenten unter Elektroinjektion des Markers Propidiumiodid bestätigt werden (Fig. 8). Hierbei enthielten die Pulsmedien 25 μg/ml Propidiumiodid (PI), einen kationischen, normalerweise nicht Membran-permeablen Farbstoff, der nach Bindung an Nukleinsäuren eine starke Fluoreszenz zeigt. PI erfüllte zwei Aufgaben, erstens als Farbstoff, mit dem lebende Zellen von toten unterschieden werden können (Kurzzeit- Vitalitätstest) und zweitens als Indikator der vorübergehenden elektrisch induzierten Membranpermeabilität. Die PI-Anfärbung der Zellen wurde innerhalb von 10-15 Minuten nach der Pulsapplikation mittels Durchflusszytometrie analysiert.

BEISPIEL 2 Elektrofusion von Zellen

Für die Elektrofusion wurden humane B-Lymphozyten aus dem peripheren Blut gesunder Spender isoliert und mit 2,4 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA-L) aktiviert wie bekannt. Die aktivierten Zellen wurden bei 37°C in einer mit 5% CO ₂ angereicherten Atmosphäre kultiviert. Als die Zelldichte ~ 5x10 ⁶ Zellen/ml überstieg, wurden die Zellen auf eine Dichte von 1x10 ⁶ Zellen/ml verdünnt. Die aktivierten B-Lymphozyten wurden mit der Human- Maus-Heteromyelom-Zellinie H73C11 fusioniert (hier im folgenden als H7-Zellen bezeichnet), die unter Standardbedingungen gezüchtet worden war.

Für die Elektrofusion wurden B-Lymphozyten und H7-Zellen in CGM in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, durch Zentrifugation bei 200 x g für 10 min pelletiert und in einer hypotonen, Zucker-ergänzten Fusionslösung (HFS) mit einer Osmolalität von 75 oder 100 mOsm (siehe Tab. 2) resuspendiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit HFS gewaschen (erneute Zentrifugation bei 200 x g für 10 min und Resuspension). 200 μl der Zellsuspension in HFS wurden in eine helikale Kammer pipettiert, bestehend aus einem Perspex-Röhrchen, um das zwei Platindrähte in einem Abstand von 200 μm gewunden waren. Die endgültige Zelldichte betrug 3 x 10 ⁵ Zellen/ml. Nach diesem Standardprotokoll wurden die Zellen einem hypotonen Stress für mindestens zwanzig Minuten während der Waschschritte ausgesetzt, bevor der erste Fusionspuls appliziert wurde. Bei den verbesserten Protokollen wurde die Dauer des hypotonen Stresses durch die Verwendung isotoner Waschlösungen (IWS-F, Tab. 2) signifikant verringert.

Zur Elektrofusion wurde der Eppendorf-Multiporator verwendet. Die Zellen wurden zunächst dielektrophoretisch durch ein alternierendes Feld von 45 Vpp Amplitude und 2 MHz Frequenz für 30 s angenähert. Danach wurde das Hochfrequenzfeld abgeschaltet und die Fusion durch drei rechteckige Gleichstrom-Pulse von 30 V Amplitude und 15 μs Dauer initiiert. Dann wurde erneut ein 2-MHz-Feld von 5 Vpp Amplitude appliziert, um die Zellen während des folgenden Fusionsprozesses in Position zu halten. Die helikale Kammer wurde dann ohne Störungen für 10 min bei RT gehalten. Die Kammer wurde dann mit 1 ml isotonem CGM gespült und die Zellen wurden in 4 Mulden einer 24-Muldenplatte, mit jeweils ImI isotonem CGM gefüllt, platziert. Nach 24 h wurde das Selektions-HAT- Medium, worin nur die Hybridomzellen proliferierten, den Mulden zugegeben. Hybridom- Kolonien wurden 1 -3 Wochen nach der Elektrofusion gezählt.

Die Gegenwart von lipophilen Anionen, z.B. WW, erhöhte die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Elektrofusion, insbesondere bei längerer Dauer des hypotonen Stresses, deutlich. Insbesondere wurde reproduzierbar eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Hybridzellen erhalten.

BEISPIEL 3

Bestimmung des durch lipophile Anionen induzierten Membrankapazitätsverlaufs bei Oozyten in Abhängigkeit von der Membranspannung

Die Messungen wurden an Xenopus laevis-Oozyten unter Verwendung der Zwei- Elektroden-Spannungs-Klemm-Technik in ND96-Lösung durchgeführt. Zur Berechnung der Membrankapazität Cm (U _H ) in An- und Abwesenheit der lipophilen Anionen wurden mit der Software Clampex 9.2 ^® Spannungsrampen-Protokolle programmiert. Bei diesen wurde zuerst das Potential auf einen bestimmten Wert geklemmt und Spannungsrampen (dU/dt) bis zu definierten Spannungen gefahren. (Es wurden auch Messungen bei der natürlichen Membranspannung ohne Spannungsklemme vorgenommen).

Die ND96-Lösung enthielt 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl ₂ , 1 mM MgCl ₂ , 5 mM Hepes und war mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt. Bei ND96 + 2,8 mM BaCl ₂ waren 1,8 mM CaCl ₂ und 1 mM MgCl ₂ durch 2,8 mM BaCl ₂ ersetzt.

Für die Messungen wurden mit Collagenase behandelte Oozyten der Stadien IV-VI verwendet.

Die Ergebnisse der Messungen mit drei verschiedenen lipophilen Anionen (Verbindungen 1 bis 3) sind in Fig. 4 dargestellt.

Die Bestimmung der Spannungabhängigkeit der Kapazitätserhöhung („Glockenkurve") für die Ionen 1 bis 3 zeigt, daß DPA und WO nahezu identische Glockenkurven aufweisen. Hingegen weist WW (LTC) eine stark verschobene Glockenkurve auf, mit einem Maximum von -130 mV (in Vergleich zu -70 mV und -80 mV bei DPA bzw. WO).

Es ist daher anzunehmen, dass bei normalen Zellpotentialen im Fall von WO und DPA eine Verteilung der lipophilen Ionen vorliegt (V _M = -30 - -70 mV), die nahe an der Gleichverteilung liegt. Hingegen sollte LTC (WW) unter normalen Zellbedingungen ungleich auf der Seite des Zytosols akkumuliert sein.

Zitierte Literatur

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