Métodos e Kits para a identificação de animais com maior potencial para caracterísiticas desejáveis e para identificação precoce de deposição de gordura em bovinos.

5 CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para identificação de animais com maior potencial para deposição de gordura subcutânea, por meio de análise de marcadores moleculares específicos. A identificação cor- reta e simples proporcionada pelo uso do método pode ser de grande efeti- 0 vidade no melhoramento genético de bovinos.

ESTADO DA TÉCNICA

Atualmente o Brasil apresenta o segundo maior rebanho de bovinos do mundo, ficando atrás somente da índia (USDA. PRODUCTION, SUPPLY AND DISTRIBUTION ONLINE. Reports. Livestock. Cattle selected5 countries summary. Washington, D.C., 2009. Disponível em:

<http://www.fas.usda.gov/psdonline/psdReport.aspx7hidRepo rtRetrievalNam e=Cattle+Summary+Selected+Countries&hidReportRetrievallD =1648&hidRe portRetrievalTemplatelD=7 >. Acesso em: jan. 2009).

O Brasil apresenta em sua maioria bovinos Bos indicus os quais0 são bem adaptados ao ambiente brasileiro, no entanto são os Bos taurus, também conhecidos como gado europeu, que apresentam melhor qualidade de carcaça.

O rebanho de bovinos brasileiro é constituído principalmente por raças zebuínas, sendo a raça Nelore a que apresenta maior expressão.5 Considerando toda extensão do território brasileiro, a raça nelore se destaca em número de animais e tem sido fundamental em cruzamentos com as raças de origem européia. O gado Nelore é de origem Indiana e se adaptou bem ao Brasil devido às condições climáticas do país serem semelhantes com as condições encontradas na índia (RESTLE, J.; VAZ, F. N.; FEIJÓ, G.0 L. D.; BRONDANI, I. L; ALVES FILHO, D. C; BERNARDES, R. A. C; FA- TURI, C; PACHECO, P. S. Características de Carcaça de Bovinos de Corte Inteiros ou Castrados de Diferentes Composições Raciais Charolês X Nelo- re. Rev. Bras. Zootec, v.29, n.5, p.1371 -1379, 2000).

As raças zebuínas, apesar de estarem incluídas em programas de melhoramento e sendo selecionadas principalmente para características de crescimento, características reprodutivas e características morfológicas, foram menos intensamente selecionadas para alguns atributos de valor económico, entre eles, a qualidade de carne, especialmente no que diz respeito à maciez das fibras musculares.

A carne, como produto, é o objetivo final e principal de todo programa de melhoramento de bovinos de corte e também das atividades liga- das ao abate e comercialização destes animais. Devido ao grande número de raças e cruzas que geram os bovinos destinados ao abate, observa-se uma grande variabilidade de carcaças que devem ser classificadas, permitindo assim atender às necessidades de diferentes mercados consumidores (Bonfim, L. M. Características Qualitativas das Carcaças: Tipificação de Car- caça e Área de Olho de Lombo. Disponível em <http://www.rehaqro.com.br/ siterehagro/publicacao.do?cdnoticia=505>2003).

O valor comercial da carcaça bovina é determinado por uma série de características, dentre elas pode-se destacar o peso, a gordura de cobertura (gordura subcutânea) e a gordura intramuscular ou marmoreio (PE- ROTTO, D.; MOLETTA, J.L.; CUBAS, A.C. Características da carcaça de bovinos canchim e aberdeen angus e de seus cruzamentos recíprocos terminados em confinamento. Ciência Rural, Santa Maria, v. 29, n. 2, p. 331- 338, 1999). A indústria frigorífica tem evitado carcaças com espessura de gordura abaixo de 3 mm e acima de 6 mm, pois um produto com cobertura de gordura inferior a 3 mm sofre escurecimento da parte externa dos músculos pelo frio das câmaras frigoríficas, e encurtamento das fibras musculares em função da maior velocidade de resfriamento, o que afeta negativamente a maciez da carne. A gordura também é importante componente do sabor da carne bovina.

Várias medidas lineares realizadas na carcaça ou na superfície de cortes cárneos têm sido estudadas com o objetivo de se identificar quais podem servir como índices confiáveis de composição. O desenvolvimento muscular pode ser melhor estimado através da observação da área da seção transversal do músculo Longissimus dorsi na altura da última costela, que é denominado de área de olho de lombo (AOL). Conseqúentemente, a área do músculo Longissimus dorsi tem sido usada mais do que qualquer outra medida como um índice de musculosidade por pesquisadores, pela indústria da carne e pelas associações de raça. O estabelecimento de relações entre a AOL e o peso de carcaça fria também têm sido pesquisado. A medida da área de olho de lombo expressa em relação ao peso da carcaça fria (AOU100 kg carcaça fria), permite uma melhor interpretação da informa- ção referente à área de olho de lombo, e conseqúentemente, facilita a identificação de animais superiores quanto à musculosidade (Bonfim, L. M. Características Qualitativas das Carcaças: Tipificação de Carcaça e Área de Olho de Lombo. Disponível em <http://www.rehaqro.com.br/siterehagro/ publica- cao.do?cdnoticia=505>2003).

Os mercados nacional e internacional têm a cada dia exigido produtos com maior qualidade e dentro de padrões pré-estabelecidos. Assim, a obtenção de produtos de alta qualidade e com baixo custo tem sido almejada pelos pecuaristas e pela indústria frigorífica. Nesse contexto, o melhoramento animal apresenta grande importância. Os programas de melho- ramento genético tradicionais promovem progressos fundamentais no desempenho produtivo e reprodutivo de bovinos, porém estes possuem limitações quando se trata da seleção de características de difícil mensuração ou de mensuração tardia e de características que possuem baixa herdabilidade. Neste âmbito, os marcadores moleculares podem auxiliar o melhoramento genético animal.

A acurácia da seleção tradicional pode ser aumentada com a implementação da Seleção Assistida por Marcadores (MAS), a qual se utiliza de marcadores moleculares para detecção de indivíduos geneticamente superiores. A incorporação de MAS em programas de melhoramento oferece maior benefício quando a característica sob seleção é de baixa herdabilidade, difícil e/ou de alto custo de mensuração ou que só pode ser medida em uma idade avançada como características de resistência a doenças, de qua- lidade de carne (maciez, deposição de gordura, dentre outras), fertilidade, eficiência produtiva e características relacionadas à produção de leite (BRITO, F.V.; CARDOSO, V.; CARVALHEIRO, R. et al. A biotecnologia no melhoramento genético animal. 26/12/2006 Disponível em <http://www.beefpoint.com.br/?noticialD=33237&actA=7& amp;arealD=60&secaol D=170>) e, ainda, características como habilidade materna, rendimento de carcaça, fertilidade e características limitadas pelo sexo (EENENNAAM, A. V. Marker-Assisted Selection in Beef Cattle. Disponível em: <http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/Outreach/ Marker_Assisted_ Selection_in_Beef_Cattle.pdf > 2004).

As análises do genoma bovino, incluindo mapeamento de Quan- titative trait loci (QTLs), polimorfismo de um nucleotídeo (SNPs) e mais recentemente a genotipagem em larga escala, poderão contribuir para a sele- ção precoce de bovinos. Assim com o uso dos marcadores moleculares pretende-se aumentar a eficiência da seleção, antecipando o tempo de seleção, ou aumentando a acurácia da seleção (DAVIS, G. P; DANISE S. K. The Impact of Genetic Markers on Selection. J. Anim. Sei. v. 76 p. 2331- 2339, 1998).

Um dos marcadores mais estudados é o SNP (polimorfismo de um nucleotídeo), que consiste na mudança de uma única base na sequência de DNA com a possibilidade de dois tipos de nucleotídeos em uma dada posição. A origem de SNPs está em variações individuais, oriundas de mutações de ponto (substituições, adições ou deleções de nucleotídeos).

A detecção de um SNP pode ser realizada através de sequenci- amento do DNA. O Sequenciamento didesoxi ou por terminação da cadeia se baseia na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinu- cleotídeos (ddNTPs) a uma fita de DNA que está sendo formada utilizando como molde o DNA de interesse. Assim que os ddNTPs são adicionados a cadeia, a extensão da mesma é interrompida pois os ddNTPs não possuem um grupo hidroxila (OH) 3' necessário para a ligação do próximo desoxinu- cleotídeo (dNTP). Esses ddNTPs são marcados podendo ser detectados e a sequência dos nucleotídeos identificada. Ao final de vários ciclos são obtidas várias cadeias de DNA de diversos tamanhos terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente serão identificados em sequenciador automático (REGITANO, L.C.A., et al. Protocolos de Biologia Molecular Aplicada à Produção Animal. 1. ed. on-line. Embrapa Pecuária Sudeste, 2007).

Muitos trabalhos já foram realizados utilizando marcadores moleculares com o objetivo de estudar características economicamente importantes. Moore e colaboradores (MOORE, S. S.; LI, C; BASARAB, J. et al. Fine mapping of quantitative trait loci and assessment of positional candidate genes for backfat on bovine chromosome 14 in a commercial line of Bos tau- rus . Journal of Animal Science, v. 81 , p. 1919-1925, 2003.) e Casas e colaboradores (CASAS, E.; SHACKELFORD, S.D.; KEELE, J.W. et al. Quantitative trait loci affecting growth and carcass composition of cattle segregating alternate forms of myostatin. Journal of Animal Science, v. 78, p. 560-569, 2000) descreveram um QTL (Quantitative Trait Loci) para espessura de gor- dura na região centromérica do BTA14. Nessa região posteriormente foi ma- peado o gene para tireoglobulina o qual, por algum tempo foi apontado como gene candidato para características de deposição de gordura em gado de corte.

Muitos trabalhos como os de Ge et al., 2001 (GE, W.; DAVIS, M.E.; HINES, H.C.; IRVIN, K. M.; SIMMEN, R. C. Association of a genetic marker with blood serum insulin-like growth factor-l concentration and growth traits in Angus cattle. J. Anim Sei., v. 79, p.1757-1762, 2001); Cho et al., 2008 (CHO, S.; PARK, T.S.; CHEONG, H.S.; NAMGOONG. S.; PARK, B.L.; LEE, H.W.; HAN, C.S.; CHEONG, I.C.; KIM, H.; SHIN, H.D. Identification of genetic polymorphisms in FABP3 and FABP4 and putative association with back fat thickness in Korean native cattle. BMB Rep. v.41 , n.1 , p.29-34, 2008) e Guo et al., 2008 (GUO, H.; LIU, W.S.; TAKASUGA, A.; EYER, K.; LANDRITO, E.; XU, S.Z.; GAO, X.; REN, H.Y.; Mapping Expression, and Association Study of the bovine PSMC1 Gene. Springer Science, v. 46, p. 347-355, 2008), já foram realizados utilizando marcadores moleculares com o objetivo de estudar características economicamente importantes.

Moore e colaboradores descreveram um QTL para espessura de gordura na região centromérica do BTA14. Nessa região posteriormente foi mapeado o gene para tireoglobulina o qual, por algum tempo foi apontado como gene candidato para características de deposição de gordura em gado de corte (S. S. Moore, C. Li, J. Basarab, W. M. Snelling, J. Kneeland, B. Murdoch, C. Hansen and B. Benkel) Fine mapping of quantitative trait loci and assessment of positional candidate genes for backfat on bovine chromo- some 14 in a commercial line of Bos taurus. Journal of Animal Science, v. 81, p. 1919-1925, 2003 e (E. Casas, S. D. Shackelford, J. W. Keele, R. T. Stone, S. M. Kappes and M. Koohmaraie) Quantitative trait loci affecting growth and carcass composition of cattle segregating alternate forms of myostatin. Journal of Animal Science, v. 78, p. 560-569, 2000).

Barendse et al. (BARENDSE, W.; BUNCH, R.; THOMAS, M. et ai. The TG5 DNa marker test formarbling capacity in Australian feedlot cattle. Disponível em: <www.Beef.crc.org.au/Publications/ Mar- blingsym/Day1/ Tg5DNA>. Acesso em: Março 2006,2001) e Wood et al.(WOOD, I. A.; MOSER, G.; BURRELL, D. L; MENGERSEN, K. L. & HET- ZEL, D. J.S. A meta-analytic assessment of a Thyroglobulin marker for mar- bling in beef cattle.Genetics Selection Evolution, v. 38, p. 479-494, 2006) associaram um polimorfismo na sequência 5 ^' líder do gene da tireoglobulina com marmoreio e, este polimorfismo é a base do teste comercial GeneStar Marbling TM (Genetic Solution). No entanto, Casas e colaboradores (CASAS, E.; WHITE, S. N.; RILEY, D. G. et al. Assessment of single nucleotide polymorphisms in genes residing on chromosomes 14 and 29 for association with carcass composition traits in Bos indicus cattle. Journal of animal Scien- ce, v. 83, p.13-19, 2005) encontraram associação do mesmo polimorfismo com espessura de gordura, mas não com marmoreio, assim como Rincker et al. (RINCKER, C. B.; PYATT, N.A.; BERGER, LL et al. Relationship among GeneSTAR marbling marker, intramuscular fat deposition, and expected progeny differences in early weaned Simental steers. Journal of Animal Science, v. 84, p. 686-692, 2006) que também não encontraram associação de Tg5 com gordura intramuscular.

Em 2007 foi realizado um estudo de teste de associação de es- J J pessura de gordura de animais compostos (Canchim- 5/8 Charolês e 3/8 Ze- bu) com Tg5 e, não foi obtido resultado significativo (Veneroni, 2007). Associação da região centromérica do cromossomo 14 com espessura de gordura em bovinos da raça Canchim. São Carlos, 2007. Dissertação de mestrado - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde - Universidade Federal de São Carlos). Nesse mesmo estudo também foi testada associação com o micros- satélite CSSM066 (localizado a 2,95 Mb no BTA14, próximo ao gene da tire- oglobulina) e o mesmo foi significativo para a característica em questão.

Esses resultados corroboram os resultados de Moore et al. (2003) (S. S. Moore, C. Li, J. Basarab, W. M. Snelling, J. Kneeland, B. Mur- doch, C. Hansen and B. Benkel) Fine mapping of quantitative trait loci and assessment of positional candidate genes for backfat on bovine chromosome 14 in a commercial line of Bos taurus. Journal of Animal Science, v. 81 , p. 1919-1925, 2003, que também não identificaram associação entre Tg5 e es- timativas de valores genéticos (EBV) para espessura de gordura, mas sim com o locus CSSM066.

Portanto, apesar de haverem disponíveis trabalhos que indicam a existência de um QTL para espessura de gordura na região centromérica do BTA14, as informações não são conclusivas, uma vez que alguns traba- lhos não encontraram associação entre o possível gene candidato, a tireo- globulina, e a característica em questão.

A anotação do genoma bovino Build 4.0 - based on Btau_4.0, disponível no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov) relatou outros genes envolvidos no me- tabolismo de lipídeos e diferenciação de adipócitos e que, se encontram na região de QTL para espessura de gordura na região centromérica do BTA14, como o gene do fator de aumento de desenvolvimento e de diferenciação 1 (DDEF1) que poderia ser testado para associação com espessura de gordura e outras características de produção de carne.

Wood et al. 2006 (WOOD, I. A.; MOSER, G.; BURRELL, D. L;

MENGERSEN, K. L. & HETZEL, D. J.S. A meta-analytic assessment of a Thyroglobulin marker for marbling in beef cattle. Genetics Selection Evolu- tion, v. 38, p. 479-494, 2006) associaram um polimorfismo na sequência 5' líder do gene da tireoglobulina com marmoreio e, este polimorfismo é a base do teste comercial GeneStar Marbling TM (Genetic Solution). No entanto, vários autores não encontraram associação de Tg5 com gordura intramuscu- lar mas sim mostraram que o mesmo tinha associação com o locus CSSM066 (localizado a 2,95 Mb no BTA14, próximo ao gene da tireoglobulina).

O gene DDEF1 (Fator de Aumento de Diferenciação e de Desenvolvimento 1) encontra-se a 9,7 Mb no BTA14, possui 31 éxons e um transcrito de 5,330 pares de bases (BIRNEY, E.; ANDREWS, D.; CACCA- MO, M. et al. Ensembl 2006. Nucleic Acids Research Jan 1 ; 34. Database issue:D556-D561. 2009). O DDEF1 , também conhecido como Arf-GAP, é uma proteína ativadora do fator de GTPase (domínio Arf-GAP) que ribosila ADP. Interage com proteínas de transdução de sinais envolvidas no cresci- mento e diferenciação celular (como SRK, FAK, fosfatidilinositol 4,5 bifosfato e CRK) e ainda, regula o remodelamento do citoesqueleto de actina que é necessário para a motilidade celular (LIU, Y.; LOIJENS, J.C.; MARTIN, K.H. et al. The association of AS AP1, an ADP ribosylation factor-GTPase activat- ing protein, with focal adhesion 18 kinase contributes to the process off ocal adhesion assembly. Mol. Biol. Celi. v.13. p.2147- 56, 2002).

Estudos realizados com o gene DDEF1 indicam que o seu produto é uma importante proteína de transdução de sinal envolvida na adipo- gênese (Frederick J. King, Erding Hu, David F. Harris, Pasha Sarraf, Bruce M. Spiegelman, and Thomas M. Roberts) DEF-1 , a novel Src SH3 binding protein that promotes adipogenesis in fibroblastic cell lines. Mol Celi. Biol. v. 9. p. 2330-7, 1999). O gene DDEF1 está localizado no BTA 14 e é um gene candidato para características de produção de carne. Veneroni et al. 2008 (VENERONI, G.B, MEIRELLES, S.L, GOUVEIA, J.J.S., SANTIAGO, A.C., OLIVEIRA, H.N., ALENCAR, M.M., REGITANO, L.C.A. Identificação de SNPs no gene DDEF1 bovino. In: 54° Congresso Brasileiro de Genética. Anais... Salvador, p.231 , 2008.) identificaram um SNP no intron 13 do gene DDEF1 e investigaram a possível associação deste com espessura de gor- dura em bovinos da raça Canchim.

Existem no estado da técnica alguns documentos relatando o uso de marcadores moleculares relacionados com características da carne. No entanto, até o presente momento, não foi relatada nenhuma informação relacionando o marcador molecular do gene DDEF1 , objeto da presente invenção, com as características de qualidade da carne, área do olho do lombo (AOL), peso a desmama, peso ao sobreano e maciez de carne.

No documento CN 101624598 são relacionados dois primers para sequência do gene calpain 1 (CAPN1), que contem 520 pb. Estes primers podem ser utilizados como marcador molecular auxiliando na seleção assistida de bovinos. O gene CAPN1 está relacionado à maciez do músculo Lon- gissimus em bovinos. O presente documento relaciona um marcador com uma característica (maciez de carne), em nossa invenção descrevemos um marcador diferente do descrito pelo documento CN101624598 relacionado com outras características de produção (área de olho, peso a desmama e peso ao sobreano).

O documento US2002142315 reivindica um método para obtenção de bovinos de corte compreendendo a predisposição genética para o aumento ou a redução para as carcaças ou peso a desmama. O método compreende os passos: (a) ensaio do material genético provindo de pelo menos um animal para a associação do polimorfismo genético ao promotor P1 do exon 1A do gene para o receptor do hormônio de crescimento bovino (bovine growth hormone receptor gene), onde o referido polimorfismo é associado com o aumento ou a redução para as carcaças ou peso a desmama; e a seleção de bovinos de corte compreendendo o referido polimorfismo. Peso a desmama é uma característica quantitativa. Características quantitativas são influenciadas por muitos genes em vários loci, na presente invenção, associamos um gene específico (DDEF1), diferente do gene descrito no documento US2002142315. O gene DDEF1 nunca havia sido associado com características de produção e este contribui para a variação fenotípica total da característica peso a desmama.

O documento US2007224623 diz respeito a um método de iden- tificação de animais possuindo desejáveis níveis de carne de marmóreo e/ou gordura subcutânea, quando comparados à população geral de animais dessa espécie. O método compreende a determinação da presença de um ou mais polimorfismo de um nucleotídeo (SNP) no gene DOPEY2 e/ou KIA- A1462 do animal, onde o polimorfismo de um nucleotídeo é indicativo de "carne marmorizada", gordura subcutânea, ou uma combinação desses. As características de produção, como por exemplo, deposição de gordura, que são denominadas quantitativas são influenciadas por muitos genes. O gene DDEF1 nunca havia sido associado com características de produção, sendo assim, identificamos um novo gene que contribui para a variação fenotípica total de algumas características de produção.

O documento WO2009059417 diz respeito a um método para identificar um animal que tenha características desejáveis para: qualidade carcaça, crescimento e/ou eficiência na alimentação, em comparação à po- pulação geral de animais desta espécie, compreendendo a determinação da presença de um ou mais polimorfismo de um nucleotídeo (SNP) no gene CBFA2T1 e/ou DECRI, onde o polimorfismo de um nucleotídeo é indicativo da qualidade da carcaça, do crescimento e/ou da eficiência alimentar. Na presente invenção identificamos um novo gene associado com característi- cas de produção e descrevemos essa associação para animais Bos indicus (raça Nelore) que apresentam maior destaque na pecuária de corte Nacional.

O documento PI0501474-3 refere-se a um teste genético e seus marcadores moleculares (oligonucleotídeos iniciadores ou primers) para uti- lização na amplificação do fragmento de 361 pares de bases que contém as mutações C313Y e E291X no terceiro exon do gene da miostatina em bovinos, para uso em seleção assistida por marcadores em bovinos de corte das raças Piemontesa e Marchigiana. Laboratórios de biologia molecular, fazendas de criação com vistas à genotipagem de crias e para uso em programas de cruzamentos e seleção, frigoríficos e casas de carne, com vistas a melhorar a produtividade e a maciez da carne, são potenciais usuários desse teste. O documento JP2001008688 relata a obtenção de um novo pri- mer incompatível que contenha a sequência base-específica e seja capaz de detectar exatamente e rapidamente o mutante do gene PPARv que é um importante fator para julgar a carnosidade da carne e uma peça fundamental para cruzamento de gordura de bovino.

O pedido de patente KR20040108418 reivindica um método para a seleção de bovinos de corte apresentando alta acumulação de gordura no músculo, selecionando assim carne bovina de alta qualidade com confiança, reprodutibilidade e rapidez sem ocasionar a morte do animal.

O documento US6569629 revela um método de identificação de bovinos ou carcaças possuindo um marcador genético para marmoreio ou maciez da carne compreendendo: (a) extração de DNA de células em uma amostra obtida a partir do animal ou de sua carcaça; (b) ensaio da referida amostra de DNA para a detecção de um fragmento compreendendo a se- qiiência que é idêntica ou complementar a uma parte ou toda a SEQ ID NO. 1 , onde a presença deste fragmento de DNA indica que o animal ou a sua carcaça possui o marcador genético do marmoreio. Em outro aspecto, o marcador genético é um marcador de maciez, e compreende as sequências descritas no grupo de SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 ou com- binações das mesmas. As composições incluem primers que amplificam marcadores de carne marmorizada ou macia presente em bovinos ou geno- ma da carcaça e hibridizam com sondas para detectar marcadores de marmoreio ou maciez.

O documento WO9803677 trata de um marcador genético usado para distinguir entre os animais para a produção de leite ou para a produção de carne, o referido marcador genético compreende uma mutação no fragmento do gene Pit-1 onde, após a digestão com endonucleases de restrição, são observados três padrões de alelos no qual um destes referidos padrões de alelos é completamente mutado e torna se um indicativo da musculatura do animal, enquanto os dois outros padrões de alelos, um mutado e outro não, ou o padrão, não mutado/não mutado no referido animal é um indicativo para a produção de leite. O documento WO9923248 refere-se a um método de avaliação das características do metabolismo da gordura de um animal, compreendendo a etapa de testes do animal para detectar a presença ou ausência de um ou mais marcadores selecionados do grupo constituído por: a) um alelo da região 5' não traduzida do gene que codifica para a tireoglobulina; b) um alelo do polimorfismo de DNA do CSSM34, associado com o gene que codifica para o receptor gama do ácido retinóico (RARG); c) um alelo do polimorfismo de DNA do ETH10, associada com o 11-cis, 9-cis-desidrogenase (re- tinol RDH5).

O documento WO2007012119 apresenta um método para avaliar uma característica em um bovino selecionando a partir de um grupo contendo as características: força de pico do dorso Longissimus, gordura intramuscular, o rendimento de carne de varejo e consumo de alimentos líquidos e/ou os traços que o compõem, compreendendo as etapas: (1) Obtenção de ácido nucléico do animal ou de sua carcaça; (2) ensaio para a ocorrência de um polimorfismo de um nucleotídeo (SNP) identificado (a) em qualquer uma das posições da SEQ ID Nos:1 a 1635 onde a identificação do referido nucleotídeo conforme estabelecido na SEQ ID Nos:1171 a 1631 é associada com a variação na força de pico do dorso Longissimus, (b) em qualquer uma das posições da SEQ ID Nos: 214 a 842 onde é associada com a deposição de gordura intramuscular, (c) em qualquer uma das posições da SEQ ID Nos: 843 a 1170 onde é associada a produção de carne em retalho e (d) em qualquer uma das posições da SEQ ID Nos: 213 a 1632 onde é associada a ingestão de alimentos líquidos e/ou os seus componentes.

O documento US2009092978 reivindica um método para a identificação de animal possuindo scores desejáveis de marmóreo (BMS), deposição de gordura subcutânea (SFD), atividade stearoyl-CoA desaturase estimada como R1 = (14:1/14:0) x 100%, R2 = (16:1/16:0) x 100% e R3 = (18:1/18:0) x 100%, quantidades relativas de ácidos graxos saturados (AGS), monoinsaturados (AGM) e ácidos graxos poliinsaturados (AGPI), ácido linoléico conjugado mg/100 g de músculo seco (CLA), colesterol mg/100 g de músculo seco (CHOL), área de olho de lombo (AOL) ou percentual de rim, pélvica e gordura do coração (KPH) ou qualquer combinação dos mesmos, quando comparado em relação à população geral de animais desta espécie, incluindo a determinação da presença de polimorfismo de um nucleo- tídeo em um gene UQCRCI, onde polimorfismo de um nucleotídeo é indicati- vos de carne de marmoreio desejável (BMS), espessura de gordura subcutânea (SFD), atividade estearoil-CoA desaturase designadas como Ri = (14:1 / 14:0) x 100%, R2 = (16:1 / 16 : 0) x 100%e R3 = (18:1/18:0) x 100%, quantidades relativas de ácidos graxos saturados (AGS), monoinsaturados (AGM) e ácidos graxos poliinsaturados (AGPI), ácido linoléico conjugado mg/100 g de músculo seco (CLA), colesterol mg/100 g de músculo seco (CHOL), área de olho de lombo (AOL) ou percentual de rim, pélvica e gordura do coração (KPH) ou qualquer combinação desses.

No documento US 7.303.878 foi descrito um método para avaliação de suinos baseado em marcadores relacionados ao gene MC4R, que são indicados para a seleção de animais de características superiores, entre elas o marmoreio, pH e coloração de carne. O método é baseado em reação de PCR, podendo os marcadores serem identificados por varias técnicas de análise conhecidas, especialmente RFLPs.

No documento US 7.468.268 são revelados métodos e sistemas para inferência de características bovinas. Ditos métodos, sistemas e composições permitem a identificação e seleção de animais superiores por meio da diversidade genética observada em gados, para melhorar a qualidade e uniformidade da produção de carne. Os métodos utilizam informação genética e suas variações, especialmente marcadores tipo SNPs, relacionados a características como o que aparece na posição 300 da sequência por eles denominada Seq. ID 21645 e que permite inferir informações sobre marmoreio, maciez, espessura de gordura, produção de carne vermelha ou média diária de ganho de peso. A sequência SEQ ID 21645 possui similaridade com as sequências presentes no BTA4: ref|NW_001494915.2| Bt4_WGA463_4 e ref|NW_0014949 1.2|Bt4_WGA462_4. Portanto as sequências dessa patente se referem ao cromossomo 4 e não ao 14.

A proteína DDEF1 se localiza em complexos focais em formação na periferia das células e regula a mudança cíclica no citoesqueleto e adesões focais (Randazzo PA, Andrade J, Miura K, et al. The Arf GTPase- activating protein ASAP1 regulates the actin cytoskeleton. Proc Natl Acad Sei U S A 2000;97:4011-6. A super expressão da proteína DDEF1 interrom- pe a re-adesão focal, desse modo bloqueando a expansão e promovendo a motilidade celular (Furman C, Short SM, Subramanian RR, Zetter BR, Roberts TM. DEF-1/ASAP1 is a GTPase-activating protein (GAP) for ARF1 that enhances cell motility through a GAP-dependent mechanism. J Biol Chem 2002;277:7962-9). A relação entre DDEF1 e adipogênese foi demonstrada por King et al. (King, F.J.; Hu, E.; Harris, D.F. et al. DEF-1 , a novel Src SH3 binding protein that promotes adipogenesis in fibroblastic cell lines. Cellular and molecular biology. v.19. p. 2330-7, 1999) que purificaram e clonaram a proteína DDEF1 de células de cérebro bovino e observaram na cultura de células que a expressão desta proteína resultou na diferenciação de fibro- blastos em adipócitos. Essa observação evidencia o papel do gene na diferenciação de adipócitos, o que o torna um gene candidato a influenciar a variação da espessura de gordura. Entretanto, isso não implica necessariamente em uma relação direta de variações na sequência desse gene e variações na espessura de gordura.

A deposição de gordura agrega muito valor e qualidade ao produto e é a cada dia mais exigida pelo consumidor. Em geral essa medida é feita utilizando-se a técnica de ultrasonografia, mas essa deve ser feita até os 18 meses de idade do animal pois, após isso, os processos transversos das vértebras tornam-se mais pronunciados e impossibilitam o encaixe cor- reto da sonda do ultrasom, para uma medida mais acurada.

Dessa forma, a possibilidade de prever ou determinar precocemente e com elevada acurácia essa característica pode aumentar muito a eficiência de programas de melhoramento, além de aumentar o valor de reprodutores (touros e matrizes) sabidamente possuidores dessa característi- ca.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à identificação de marcadores moleculares com alta correlação com a deposição de gordura subcutânea.

Uma primeira concretização da invenção refere-se a um método para identificar precocemente e com precisão a deposição de gordura subcutânea em bovinos compreendendo as etapas de: (i) extração de DNA dos animais com potencial aumento de deposição de gordura subcutânea; (ii) genotipagem o gene DDEF1 ; (iii) identificação, na sequência genômica caracterizada em (ii), do genótipo ou genótipos, ou da variante genética, asso- ciado(s) à maior e à menor deposição de gordura, e (iv) estabelecimento de associação genótipo x fenótipo levando em consideração as frequências alé- liças na população estudada. Preferencialmente são utilizados, na etapa (ii) os primers correspondentes às SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID N°3 e SEQ. ID N° 4.

SEQ ID N° 1 : ATATGGGAATCCTAGAGAGGAGACGTAAC

SEQ ID N° 2:GGGAATCCTAGAGAGGAGACGTAAT SEQ ID No. 3 (Left): GACTAGAAATAGGAGACCCGGACC

SEQ ID No. 4 (Right): GCCTTCCTCAAACCACACAT A identificação do genótipo ou genótipos, ou da variante genética feita na etapa (iii) pode ser processada por meio de procedimentos de análise de SNP conhecidos, tais como PCR-RFLP, Espectrome- tria de massa, sequenciamento, High resolution melting, sonda alelo específica (TaqMan) e ampliação com primers alelo específicos (ARMS- PCR).

Uma segunda concretização da invenção refere-se a um kit de identificação de animais com potencial de maior deposição de gordura, com- posto por 2 primers externos ao polimorfismo, um iniciador interno específico para cada alelo, reagentes utilizados em reação de PCR. Alternativamente, podem ser utilizadas 2 sondas alelo-específicas de cada alelo do SNP marcadas com fluorescência ou endonuclease de restrição específica, e manual com instruções para identificação dos resultados.

A presente invenção refere-se também a um método para identificação de animais com maior potencial para características de qualidade de carne, por meio de análise de marcadores moleculares específicos. Mais es- pecificamente a presente tecnologia diz respeito a polimorfismos no gene DDEF1 e a associação destes como a área de olho de lombo (AOL), peso a desmama e peso ao sobreano em bovinos.

Em uma concretização, a invenção refere-se às moléculas iso- ladas de ácido nucléico caracterizadas por serem seqiiências selecionadas do grupo descrito em SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4.

Uma segunda concretização desse método, a invenção refere- se a um método para identificar precocemente e com precisão as caracterís- ticas de produção de carne em bovinos compreendendo as etapas de: (i) ex- tração de DNA dos animais com potenciais características desejáveis de produção de carne; (ii) genotipagem do gene DDEF1 ; (iii) identificação, na sequência genômica caracterizada em (ii), do genótipo ou genótipos, ou da variante genética, associado(s) à área do olho do lombo (AOL), ao peso a desmama e peso ao sobreano, e (iv) estabelecimento de associação genótipo x fenótipo levando em consideração as frequências alélicas na população estudada.

A terceira concretização desse método, a invenção refere-se ao uso de marcador molecular específico selecionado do grupo descrito em SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4 no reconhecimento do polimorfismo de base única (SNP) localizado no íntron 13 do gene DDEF1 , associado às características: área de olho de lombo (AOL), peso a desmama e peso ao sobreano em bovinos.

Uma quarta concretização desse método, a invenção refere- se a um kit de identificação de animais com maior potencial para características de qualidade de carne, caracterizado por compreender 2 primers externos ao polimorfismo, um iniciador interno específico para cada alelo, reagentes utilizados em reação de PCR e, alternativamente, 2 sondas ale- lo-específicas de cada alelo do SNP marcadas com fluorescência ou en- donuclease de restrição específica, e manual com instruções para identificação dos resultados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Gel de agarose 1% para visualização dos fragmentos amplificados. A canaleta 1 corresponde ao marcador de peso molecular Low DNA mass, e as canaletas de 2 a 25correspondem, respectivamente, aos amplicons dos primers RP2, RP2, negativo de RP2.R2AG, R2AG, negativo de R2AG, R3A, R3A, negativo de R3A, R2S, R2S, negativo de R2S.R1A, R1A, negativo de R1A, RP1 , RP1 , negativo de RP1 , R1S, R1S, negativo de R1S, R2A.R2A e negativo de R2A.

Figura 2. Gel de agarose 1% para visualização dos fragmentos amplificados. A canaleta 1 corresponde ao marcador de peso molecular Low DNA mass, e as canaletas de 2 a 16 correspondem, respectivamente, aos amplicons dos primers R3AG, R3AG, negativo de R3AG, R4AG, R4AG, negativo de R4AG, R4P, R4P, negativo de R4P, R3P, R3P, negativo de R3P.R5P, R5P e negativo de R5P.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para identificação de animais com maior potencial para deposição de gordura subcutânea, por meio de análise de marcadores moleculares específicos.

Utiliza-se da identificação experimental de associação significativa entre genótipos da região centromérica do BTA 14 e a espessura de gor- dura subcutânea.

O método proposto consiste das seguintes etapas:

1- Extração de amostras de DNA dos animais realizada a partir de sangue ou sémen. A extração pode ser feita utilizando os procedimentos descritos por REGITANO (REGITANO, L.C.A. Introdução ao uso de marca- dores moleculares In: Regitano L. C. A. And Coutinho LL (Eds.) Biologia molecular aplicada à produção animal. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2001) ou qualquer procedimento que permita ter acesso ao DNA do núcleo da célula.

2- Genotipagem para o SNP do gene DDEF1 que pode ser reali- zada por PCR-ARMS utilizando, preferencialmente os primers listados na

Tabela 1 :

Tabela 1: Primers desenhados para genotipagem do SNP no gene DDEF1 Amplicon

Primer Gene Seqiiência em pb

ATATGGGAATCCTAGAGAGGAGACG-

DDEF1 In TAAC

R alelo G DDEF1 234

DDEF1 In GGGAATCCTAGAGAGGAGACGTAAT

R alelo A DDEF1 230

DDEF1 GACTAGAAATAGGAGACCCGGACC

Outer F DDEF1

DDEF1

outer R DDEF! GCCTTCCTCAAACCACACAT 570

As análises dos produtos de PCR (genotipagem) são, preferencialmente, realizadas em um seqiienciador ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystems). Os genótipos podem ser determinados com a utilização dos programas GeneScan (versão 3.7.1) e Genotyper (versão 3.7). A genotipa- gem também pode ser realizada por qualquer metodologia de análise de SNP, tais como PCR-RFLP, Espectrometria de massa, sequenciamento, Hi- gh resolution melting, ou por sonda alelo específica (TaqMan).

3- Identificação do genótipo ou genótipos, ou da variante genética, associados à maior e à menor deposição de gordura.

4- Aplicação de métodos estatísticos adequados para interpretação dos resultados.

Essa associação genótipo x fenótipo pode ser variável dependendo da raça/população analisada, ou seja, o mesmo genótipo pode estar associado positivamente em uma população e não estar em outra. Sendo assim, apenas após a aplicação de metodologia estatística apropriada, que leva em consideração as frequências alélicas na população estudada e a distribuição dos dados de uma amostra da população onde se pretende aplicar o método diagnóstico, é possível determinar qual o genótipo que deverá ser selecionado. Tal análise pode ser realizada utilizando um modelo animal, sob o método de máxima verossimilhança restrita.

A invenção é concretizada também na forma de um kit de identificação de animais com maior tendência a deposição de gordura, contendo os 4 primers selecionados, frascos com reagentes comuns e necessários à reação de genotipagem, já em suas concentrações ajustadas (Tris-HCI, KCI, DMSO, MgC , dNTP, Taq DNA Polimerase).e manual com instruções para identificação e interpretação dos resultados.

Na etapa de extração do DNA são utilizados condições e reagentes conhecidos. Por exemplo, a extração pode ser realizada de acordo com os procedimentos descritos por Regitano (2001) que, resumidamente consiste em obter leucócitos pelo tratamento do sangue total com uma solução que promove a lise das células vermelhas; romper os leucócitos assim preparados em presença de um detergente como o SDS e uma enzima pro- teolítica como a Proteinase K; remover as proteínas da solução por precipitação em presença de alta concentração de íons como Na ⁺ Cl ^" ; precipitar o DNA em presença de um álcool como o etanol ou o isopropanol e re-hidratá- lo em solução aquosa preferencialmente o tampão Tris-EDTA.

As proteínas podem ser alternativamente excluídas da solução por solventes orgânicos, como o fenol em presença ou não de clorofórmio e álcool isoamílico. Pode-se também utilizar filtração em coluna de celulose seguida de eluição do DNA que fica aderido à mesma.

A amplificação das sequências SNPs é feita utilizando-se a téc- nica de PCR. Resumidamente, utiliza-se de 20 a 200 ng de DNA genômico; 0,1 a 0,3 mM de dNTPs; 1 a 2,0 mM MgCI2; 20 mM TRIS pH 8,3; 50 mM KCI e 0,05 a 0,2 μΜ de cada primer. As amplificações são feitas em um equipamento termociclador que controla as temperaturas e o tempo desejados. As condições de termociclagem consistem em desnaturação inicial a 90 - 95°C por dois a cinco minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 90 - 95°C por 30 a 60 segundos, seguidos por anelamento dos primers entre 55 e 60 °C, por 30 a 60 segundos, e extensão a 70 - 74°C durante 30s. Pode-se fazer uma extensão final entre 70 e 74°C por até 45 minutos. Após as amplificações, os produtos são analisados em um sequenciador automático e os padrões de amplificação, tamanho dos produtos de PCR em pares de bases e interpretados através de softwares específicos que acompanham o equipamento, fornecendo uma tabela com o número do animal e o seu respecti- vo genótipo. Alternativamente se pode utilizar sistemas de eletroforese vertical com géis de poliacrilamida de alta resolução, como descrito em Regitano e Tambasco (REGITANO, L. C.de A.; TAMBASCO, D. D. Protocolo de análise de marcadores microssatelites. In: REGITANO, L. C. de A.; COUTINHO, L. L. (Org.)- BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À PRODUÇÃO ANIMAL. Brasília - DF, 2001 , p. 195-206.) ou pode-se utilizar PCR em tempo real.

A presente invenção também se refere a um método para identificação de animais com maior potencial para características de qualidade de carne, por meio de análise de marcadores específicos.

Na descrição que segue, um número de termos são utilizados extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

O termo "molécula isolada de ácido nucléico" é utilizado para se referenciar aos ácidos nucléicos da presente invenção. Este termo, quando aplicado para o DNA da presente invenção, refere-se a marcadores de DNA isolados do gene DDEF1 e descritos em SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4. Por exemplo, a "molécula isolada de ácido nucléico" pode ser utilizada em reações de amplificação com o intuito de realizar o diagnóstico de um material.

O termo "oligonucleotídeo" é referido aqui como 'primers' e 'sondas' da presente invenção e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo cerca de 20 nucleotídeos. O tamanho exato dos pri- mers/sondas é dependente dos fatores experimentais particulares de cada etapa do processo. Os oligonucleotídeos são frequentemente usados como sondas para detectar DNA complementar ou RNA.

O termo "hibridizando especificamente" diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam sequências suficientemente complementares para permitir tal hibridiza- ção sob condições pré-determinadas geralmente descritas no estado da téc- nica. Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições a- propriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica. Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridiza- ção entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press):

Tm = 81 ,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% forma- mida)-600/pb no duplex (sonda).

Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e

50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.

O termo "sonda" utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma sequência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de "hibridizar especificamente" ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Consequentemente, a sequência da sonda não necessita refletir exatamente a sequência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5' ou 3' da sonda, com o restante da seqiiência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou sequências longas podem estar intercala- das dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele.

O termo "primer" como utilizado aqui se refere a um oligonucleo- tídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3' pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O 'primer' pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o 'primer' oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O 'primer' deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a sequência do 'primer' deva representar um com- plemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleo- tídeo não complementar pode ser ligada ao final 5' de um 'primer' complementar. Alternativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da sequência de oligonucleotídeo do 'primer', desde que o 'primer' tenha complementaridade suficiente com a sequência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.

Na presente invenção o termo "marcador molecular" diz respeito a um segmento específico de DNA (correspondentemente a regiões expressas ou não do genoma) que identifica a variabilidade do DNA relacionada a uma característica desejável, que permite localizar sua posição dentro do cromossomo. Os marcadores moleculares da presente invenção são aqueles selecionados do grupo descrito em SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4. Atualmente através da genotipagem em larga escala há a possibilidade de análise de milhares de marcadores simultaneamente. Esta análise em larga escala pode ser aplicada, por exemplo, na seleção genômica.

O termo "gene" corresponde a uma sequência nucleotídica específica localizada em uma região em particular do cromossomo, sendo responsável por codificar um produto final específico. O gene também carrega em sua estrutura primária toda a informação necessária para os processos de transcrição e tradução biológica, como por exemplo, regiões promotoras e reguladoras da transcrição.

O termo "bovinos", na presente invenção, refere-se ao animal mamífero, ruminante, artiodáctilo, com par de chifres não ramificados, ocos e permanentes, do género Bos em que se incluem as espécies domesticadas pelo homem. Preferencialmente a presente invenção diz respeito aos bovi- nos Bos indicus.

O termo "PCR" ou "amplificação" diz respeito à técnica de rea- ção em cadeia por polimerase que permite produzir múltiplas cópias de um gene ou fragmento de DNA.

A presente invenção utiliza a técnica de PCR para amplificação do fragmento que contem o íntron 13 do gene DDEF1 que contém o polimorfismo que associamos com diferentes características de produção.

O termo "variante genética" se refere às diferentes combinações de seqiiência de nucleotídeos que podem existir para uma mesma região do genoma, também denominados alelos de um loco.

A presente invenção utiliza-se da identificação experimental de associação significativa entre genótipos da região centromérica do BTA 14 e a área do olho do lombo (AOL), o peso a desmama e peso ao sobreano.

A invenção diz respeito a moléculas isoladas de ácido nucléico caracterizadas por serem sequências selecionadas do grupo descrito em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4. Essas moléculas podem ser utilizadas como marcadores moleculares.

O método da presente invenção consiste das seguintes etapas: (i) extração de DNA dos animais com potenciais características desejáveis de produção de carne; (ii) genotipagem do gene DDEF1 ; (iii) identificação, na sequência genômica caracterizada em (ii), do genótipo ou genótipos, ou da variante genética, associado(s) a área do olho do lombo (AOL), o peso a desmama e peso ao sobreano, e (iv) estabelecimento de associação genótipo x fenótipo levando em consideração as frequências alélicas na população estudada.

A extração de amostras de DNA dos animais pode ser realizada a partir de sangue ou sémen. A extração pode ser feita utilizando os proce- dimentos descritos por REGITANO (REGITANO, L.C.A. Introdução ao uso de marcadores moleculares In: Regitano L. C. A. And Coutinho LL (Eds.) Biologia molecular aplicada à produção animal. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2001) ou qualquer procedimento que permita ter acesso ao DNA do núcleo da célula como, por exemplo, métodos que utilizam a solven- tes orgânicos. Na etapa de extração do DNA são utilizados condições e reagentes conhecidos como, por exemplo, na extração realizada de acordo com os procedimentos descritos por Regitano (REGITANO, L. C.de A.; TAM- BASCO, D. D. Protocolo de análise de marcadores microssatelites. In: REGITANO, L. C. de A.; COUTINHO, L L. (Org ). BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À PRODUÇÃO ANIMAL. Brasília - DF, 2001 , p. 195-206) os leucócitos são obtidos pelo tratamento do sangue total com uma solução que promove a lise das células vermelhas; rompimento dos leucócitos assim preparados em presença de um detergente como o SDS (dodecil sulfato de sódio) e uma enzima proteolítica como a Proteinase K; remoção das proteí- nas da solução por precipitação em presença de alta concentração de íons como Na ⁺ Cl ^" ; precipitação do DNA em presença de um álcool como o etanol ou o isopropanol e re-hidratação em solução aquosa preferencialmente o tampão Tris-EDTA. As proteínas podem ser alternativamente excluídas da solução por solventes orgânicos, como o fenol em presença ou não de cloro- fórmio e álcool isoamílico. Pode-se também utilizar filtração em coluna de celulose seguida de eluição do DNA que fica aderido à mesma.

A mensuração da área de olho de lombo, in vivo, deve ser reali- zada através de medidas ultrassonográficas, entre a 12 ^a e 13 ^a costela do a- nimal logo acima do músculo longissimus, sendo estas medidas obtidas quando os animais atingirem entre 18 e 20 meses de idade, uma vez que, após esta idade os processos transversos das vértebras tornam-se mais pronunciados e impossibilitam o encaixe correto da sonda do ultrassom para uma medida precisa.

Para isso, é utilizado um equipamento de ultrassom, os animais são colocados em troncos de contenção para que seja possível obter as i- magens ultrassonográficas. As imagens que fornecem as medidas de AOL obtidas no corte transversal do músculo Longissimus são analisadas e interpretadas para obtenção das medidas de AOL em centímetros quadrado (cm ² ).

A pesagem dos animais deve ser realizada quando estes forem desmamados e quando atingirem entre 16 e 18 meses de idade, para obten- ção do peso a desmama e ao sobreano, respectivamente.

A genotipagem da etapa (ii) do método pode ser realizada com as sequências selecionadas do grupo descrito em SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4.

A Genotipagem para o SNP do gene DDEF1 pode ser realizada por ARMS-PCR, como por exemplo, utilizando, preferencialmente os prímers listados na Tabela 1 acima.

Além desta técnica, outras podem ser utilizadas para genotipagem deste SNP, como por exemplo, por meio da PCR em Tempo Real através do sistema de detecção TaqMan™ em que prímers e sonda que pa- reiam na região alvo do DNA permitem a identificação dos diferentes alelos.

A amplificação das sequências SNPs é feita utilizando-se a técnica de PCR. Preferencialmente a presente invenção utiliza-se de 20 a 200 ng de DNA genômico; 0,1 a 0,3 mM de dNTPs; 1 a 2,0 mM MgCI2; 20 mM TRIS pH 8,3; 50 mM KCI e 0,05 a 0,2 μΜ de cada primer OS 4 PRÍMERS SÃO UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO DO INTRON 13 DO GENE DDEF1 E PARA O RECONHECIMENTO DOS DIFERENTES ALE- LOS DO SNP). As amplificações são feitas em um equipamento termocicla- dor que controla as temperaturas e o tempo desejados. As condições de termociclagem consistem em desnaturação inicial a 90-95°C por dois a cinco minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 90-95°C por 30 a 60 segundos, seguidos por anelamento dos prímers entre 55 e 60°C, por 30 a 60 segundos, e extensão a 70-74°C durante 30 segundos. Pode-se fazer uma extensão final entre 70 e 74°C por até 45 minutos. Após as amplificações, os produtos são analisados em um sequenciador automático e os padrões de amplificação, tamanho dos produtos de PCR em pares de bases e interpretados através de softwares específicos que acompanham o equipamento, fornecendo uma tabela com o número do animal e o seu respectivo genóti- po. Alternativamente se pode utilizar sistemas de eletroforese vertical com géis de poliacrilamida de alta resolução, como descrito em Regitano e Tam- basco (REGITANO, L. C.de A.; TAMBASCO, D. D. Protocolo de análise de marcadores microssatelites. In: REGITANO, L. C. de A.; COUTINHO, L. L. (Org.). BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À PRODUÇÃO ANIMAL. Brasília - DF, 2001 , p. 195-206.) ou pode-se utilizar PCR em tempo real.

A identificação da etapa (iii) alternativamente pode ser realizada em uma variante genética do dito genótipo ou genótipos. A dita identificação da etapa (iii) pode ser realizada por um procedimento de análise de SNP que pode ser selecionado do grupo consistindo de, mas não estando limitado a PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism), Espectrometria de massa, seqíienciamento, High resolution melting, sonda alelo específica TaqMan e, opcionalmente, ampliação com primers alelo específicos (técnica de ARMS-PCR).

As análises dos produtos de PCR (genotipagem) podem ser realizadas em diferentes sistemas de eletroforese. Preferencialmente, as análises são realizadas em um sequenciador ABI Prism 3 00 Avant (Applied Bi- osystems). Os genótipos podem ser determinados com a utilização dos programas GeneScan (versão 3.7.1) e Genotyper (versão 3.7). A genotipagem também pode ser realizada por qualquer metodologia de análise de SNP, tais como PCR-RFLP, Espectrometria de massa, seqiienciamento, High resolution melting, ou por sonda alelo específica (TaqMan). O estabelecimento de associação genótipo x fenótipo pode ser feito por metodologia estatística relacionando as frequências alélicas na população estudada com a distribuição dos dados de uma amostra da população da qual é selecionado o genótipo, por análise de variância, na qual a va- riável resposta é a característica fenotípica e os genótipos para o marcador são efeitos fixos, ou ainda por análise de regressão utilizando-se um coeficiente para o número de cópias de um dado alelo que estão representadas no genótipo de cada animal. As análises podem utilizar estimadores Baysianos, método dos quadrados mínimos, máxima verossimilhança restrita e podem ou não levar em consideração a co-variância entre indivíduos aparentados (modelo animal). Preferencialmente na presente invenção a metodologia estatística é realizada pelo método de máxima verossimilhança restrita em modelo animal. Essa associação genótipo x fenótipo pode ser variável dependendo da raça/população analisada, ou seja, o mesmo genótipo pode estar associado positivamente em uma população e não estar em outra. Sendo assim, apenas após a aplicação de metodologia estatística apropriada, que leva em consideração as frequências alélicas na população estudada e a distribuição dos dados de uma amostra da população onde se pretende aplicar o método diagnóstico, é possível determinar qual o genótipo que deverá ser selecionado.

A identificação do genótipo ou genótipos, ou da variante genética, são associados à área do olho do lombo (AOL), ao peso a desmama e peso ao sobreano.

A invenção é concretizada também na forma de um kit para de identificação de animais com maior tendência a características desejáveis na produção de carne caracterizado por compreender os componentes: (i) pri- mers apropriados de amplificação de uma das partes da sequência do gene DDEF1 , (ii) reagentes utilizados em reação de genotipagem; e (iii) e manual com instruções para identificação e interpretação dos resultados. As caracte- rísticas desejáveis na produção de carne são, preferencialmente, área do olho do lombo (AOL), ao peso a desmama e peso ao sobreano.

Os primers utilizados no kit são sequências selecionadas do grupo descrito em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4.

Os reagentes utilizados no kit são aqueles utilizados em reação de genotipagem serem selecionados entre Tris-HCI, KCI, DMSO, MgCI2, dNTP, Taq DNA Polimerase, entre outros.

A invenção ainda á caracterizada pelo uso de marcadores moleculares específicos selecionados do grupo descrito em SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4 no reconhecimento do polimorfismo de um nucleotídeo, associado às características: a área de olho de lombo, ao peso a desmama e peso ao sobreano em animais. O uso desses marcado- res é caracterizado pelo fato do polimorfismo de base única estar localizado no íntron 13 do gene DDEF1.

O método e o kit da presente invenção podem ser utilizados para identificar animais criados a pasto e terminados em confinamento. Preferencialmente a presente invenção utiliza o método e o kit para identificação em raças bovinas. Mais preferencialmente as raças utilizadas são as canchim e nelore.

EXEMPLOS

A invenção será agora descrita em maiores detalhes por meio dos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitati- vos do escopo da invenção.

Exemplo 1: coleta de material, extração de DNA

Primeiramente, 1171 animais com cerca de 18 meses, tiveram sua espessura de gordura determinada por ultra som. As medidas de espessura de gordura subcutânea apresentaram média total de 1 ,94 ± 0,79 mm, sendo que o menor valor observado foi de 0,6 mm e o maior valor observado foi de 5,4 mm.

Foram coletadas amostras de sangue ou sémen de todos os a- nimais avaliados para espessura de gordura subcutânea e dos pais desses animais para extração de DNA. Foram coletadas amostras de 5 ml de san- gue por punção da veia jugular ou da veia caudal em tubos para coleta a vácuo contendo 50 μΙ EDTA potássico (K3) a 15% (para evitar coagulação) e mantidas refrigeradas até o início do processo de extração. Amostras de sémen de alguns reprodutores foram fornecidas pelas fazendas já em palhetas, que foram mantidas congeladas até o processo de extração de DNA.

A extração foi feita utilizando os procedimentos descritos em Regitano (2001) ou qualquer procedimento que permita ter acesso ao DNA do núcleo da célula. Após a extração o DNA foi quantificado em espectrofo- tômetro e em seguida foram diluídos em água para se obter uma concentração final de 40 ng/μΙ e conservadas em freezer - 30 C°.

A qualidade do DNA extraído foi verificada em espectofotômetro, considerando valores acima de 1 ,6 e em gel de agarose 1%, permitindo a observação de uma única banda.

Exemplo 2: identificação de polimorfismos

Com base na sequência depositada no GeneBank foram desenhados 13 pares de primers flanqueando os éxons codificadores dos principais domínios da proteína DDEF1.

Para identificação de polimorfismos no gene DDEF1 , primeiramente foi calculado o valor genético (VG) para espessura de gordura de 113 touros, pais dos 1171 animais avaliados para espessura de gordura.

Em seguida os touros foram ordenados segundo o valor genético e acurácia e, foram escolhidos 6 touros com maior valor genético e maior acurácia e 6 touros com menor valor genético e maior acurácia. Os DNAs desses touros foram utilizados nas reações de amplificações e sequencia- mentos, para identificação de polimorfismos nas 13 regiões escolhidas do gene DDEF1.

Exemplo3: Desenho dos primers

Verificou-se que o tamanho do gene DDEF1 dificultaria seu completo sequenciamento, assim foram identificados os principais domínios conservados da proteína codificada por esse gene e localizadas na sequência de nucleotídeos do gene as regiões codificadoras dos mesmos. Esses domínios são: o domínio homólogo da centaurina plecstrina (Centaurin Plekstrin Homology domain -P H centaurina), repetições anquinas (ANK), domínio homólogo Src 3 (Src homology 3 domains - SH3) e ArfGap. Em seguida foram identificadas no RNAm as bases codificadoras desses domínios. Logo após, foram localizadas, na sequência genômica, as regiões correspondentes a tais domínios.

De posse dessas informações, foi verificado que os éxons codificadores dos 5 domínios conservados distavam muito um do outro. Sendo assim não havia possibilidade de amplificação de um conjunto ou conjuntos de éxons simultaneamente. Assim foram desenhados 13 pares de prímers (um para cada éxon).

Os prímers foram desenhados com a utilização do programa Primer3 e para evitar que as regiões de éxons perdessem qualidade, dese- nhou-se prímers que amplificassem uma pequena região de íntron antes e depois dos éxons de interesse.

Os prímers desenhados receberam as denominações apresentadas na Tabela 2:

Tabela 2: Denominações dos prímers desenhados

Os 13 pares de prímers desenhados para amplificação dos 4 estão representados na Tabela 3:

Tabela 3: Prímers desenhados para amplificação dos domínios PH Centaurina, ArfGap, ANK e SH3 do gene DDEF1 Pri- Gene Domínio Localiza- Seqiiência Amplicon mer ção em pb

RP1 DDE PH Cen- Exon 12, 13 Left:ATTGCTCACCTGCC 517

F1 taurina CAGTTT

Right:GCCTTCCTCAAAC

CACACAT

RP2 DDE PH Cen- Exon 1 Left: TAA- 323

F1 taurina TAAACGGCAGCCCA- GAC

Right:CCCCACATGTTAA

ACACACG

RP3 DDE PH Cen- Exon 15 Left: CGCACAGT- 399

F1 taurina TAAAAGCCATTG

RightCCAGCATACACCT

CCTCTCA

DDE PH Cen- Exon 16 Left: GCTGAAA- 322

F1 taurina CAAAAAGGTGCAA

Right: ACAGCTAAGCAG

GGGAAACC

RP5 DDE PH Cen- Exon 17 Left: 488

F1 taurina TTCCCTCCTGTTACTGC

TTGA

Right: CTCCACGTCCA- TAATGCTGA

R2A DDE ArfGap Éxon 18 Left: GGGTGTTTCA- 557 G F1 TAGGCCTCAC

Right: CAT- GATTCGCCAGTTCTTCA

R3A DDE ArfGap Éxon 19 Left: CATGGTTCCAC- 506 G F1 CAGTCCATT

Right: CGATTGAAGC- CACTGAACAA

R4A DDE ArfGap Éxon 20 Left:TCAGCTGGAATGTT 466 G F1 GAAGAGAA

Right: TAACAG- CAGCCCCTTTCAGT

DDE ANK Exon 21 Left: 408 F1 TGAAAGGGGCTGCTGT

TAAT

Right: TGGCCATGCTCACTTG

TTTA

R2A DDE ANK Exon 22 Left: 476

F1 TCGTCTTCCCTGCCTCT

AAG

Right:

GAATGGGCATGTCTCA GTTG

R3A DDE ANK Exon 23 Left: 296

F1 ATGCCCATTCCGTTGTA

CTC

Right:

GTGCTGGCCTGAATTT CTTT

R1S DDE SH3 Exon 30 Left: 379

F1 CCGTGATGTTTGCTCT

CAGAT

Right:

GGGCCAGTGTTGAAT- GAGTT

R2S DDE SH3 Exon 31 Left: 550

F1 GGTCATCGTGTCCTCC

Right:

GGGCCAGTGTTGAAT- GAGTT

A especificidade dos primers foi comprovada pela aplicação do produto de PCR desses primers em gel de agarose 1%, permitindo a observação de uma única banda para cada produto de amplificação Figuras 1 e 2.

Exemplo 4: Amplificação dos fragmentos

Os primers RA1 , RA2, RP2, RP3, RP4, RP5, RAG2 foram utilizados em uma reação que conteve 200 ng de DNA genômico, Tris-HCI 10mM (pH 8,3), MgCI2 1 ,95 mM, KCI 50 mM, 200 μΜ de cada dNTP, 0,165 μΜ de cada primer e 1 ,3 unidades de Taq DNA Polimerase em um volume final de reação de 30 μΙ. E, os primers RP1 , RAG3, RAG4, RS1 , RS2, RA3 foram amplificados sob as mesmas condições exceto na quantidade de Mg- CI2 que foi de 1 ,5 mM.

A reação de amplificação constou de uma desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento, com temperatura específica de cada primer, por 30 segundos, e extensão a 72°C por 30 segundos. Após os 35 ciclos, o produto amplificado foi submetido à extensão final por 10 minutos.

As temperaturas de anelamento de cada primer são descritas na

Tabela 4:

Tabela 4: Temperaturas de anelamento dos primers

Para a averiguação de amplificação específica foi realizada uma eletroforese em gel de agarose 1 %, corado com brometo de etídeo. Utilizou- se tampão TBE 1X (Tris base 90 mM, ácido bórico 90 mM e EDTA 2 mM pH 8,0) e foi aplicada uma voltagem de 3 V/cm. Um volume de 5 μΙ de cada produto de amplificação foi aplicado no gel, acrescido de 1 μΙ de loading buf- fer (glicerol, TBE 10X, azul de bromofenol 1%, água deionizada). Ao término da eletroforese os produtos de amplificação foram visualizados sob ilumina- ção ultravioleta.

As reações de PCR foram purificadas com a utilização do kit Wi- zard SV gel and PCR clean-up system. Os produtos de PCR purificados foram quantificados em espectrofotômetro e diluídos a uma concentração final de 32 ng/pl.

Exemplo 5: Sequenciamento dos fragmentos

As reações de sequenciamento foram realizadas segundo adaptações do protocolo descrito por Regitano et al. 2007 utilizando o Kit ABI PRISM® Big Dye terminator v. 3.1 cycle sequencing da Applied. Cada rea- ção constou de: 2 μΙ_ de água, 2 μΙ_ de Big dye (DNA Polimerase, dNTPs e ddNTPs), 2 μΐ_ de tampão (Mg+2 e Tris-HCI), 2 pL de primer (2 pmol), 2 pl_ de produto de PCR (32 ng/pL). As condições para a reação de sequenciamento foram: Pré- incubação a 94 °C por 2 minutos; amplificação em 25 ciclos de 96 °C por 20", temperatura em °C específica de cada primer por 10"(conforme Tabela 2) e 60 °C por 04'; Resfriamento a 4 °C por□.

Foram sequenciadas duas vezes cada fita de DNA das regiões analisadas.

Os produtos de sequenciamento foram purificados e precipitados para evitar que os ddNTPs, dNTPs, prímers e enzima não incorporados interferissem na leitura do sequenciador. Adicionou-se 40μΙ_ de isopropanol 65% a temperatura ambiente. Vortexou-se a mistura alguns segundos e in- cubou-se no escuro a temperatura ambiente (TA) por 15 minutos. Em seguida centrifugou-se por 25 minutos a 14000 rpm a TA. Descartou-se o sobre- nadante por inversão e foram adicionados 200 μΙ_ de etanol 60%, a temperatura ambiente, e centrifugou-se por 5 minutos a 14000 rpm a TA. Descartou- se o sobrenadante por inversão (a lavagem com etanol 60% foi repetida duas vezes). As reações ficaram secando no escuro por 1 hora e depois foram armazenadas em freezer -20°C (adaptação de Regitano 2007).

Os produtos das reações de sequenciamento foram analisados em um sequenciador ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystems). Os eletro- ferogramas gerados pelo sequenciador foram analisados com os programas Phred, Phrap e Consed com o objetivo de escolher sequências de boa qualidade e visualizar os possíveis polimorfismos que ocorressem em indivíduos heterozigotos para os mesmos. Para identificar polimorfismos que ocorressem entre indivíduos homozigotos foi utilizado o programa Clustal W. De posse dos SNPs, identificou-se na sequência genômica suas localizações no gene completo. Os 12 touros foram genotipados para todos SNPs identificados e então um teste exato de Fisher foi aplicado para checar a distribuição de frequência alélica entre os touros extremos de Valor Genético para espessura de gordura subcutânea. Foi investigado se os SNPs presentes em éxons resultam em alteração de aminoácidos na proteína.

Para verificação de predominância de um alelo de um dado SNP em um dos extremos para espessura de gordura, segundo o Valor Genético, foi realizado um teste exato de Fisher para cada SNP encontrado. Este teste foi escolhido ao invés do teste de Qui quadrado porque é mais adequado quando se tem um N menor que 20. O SNP que apresentou menor valor de P foi escolhido para validação na população de canchins filhos dos touros utilizados na identificação de SNPs.

Foram identificados 73 polimorfismos no gene DDEF1 , sendo que 13 estão localizados em éxons. O teste exato de Fisher revelou um valor de P=0.0167 para um SNP localizado no íntron 13 do gene DDEF1 na posição 279401 pb (Tabela 5) e, foi testado em uma população de 987 animais e a associação foi validada.

Tabela 5: Resultado do teste exato de Fisherpara todas as regiões analisadas do gene DDEF1 , organizado na forma decrescente segundo o valor de P.

Gene Região Localização no Região do Sequência Ge- P gene DDEF1 em gene nóti- pb po

DDEF1 RP1 279401 íntron 13 TCCATGA A/G 0.0167*

DDEF1 RP1 279348 íntron 13 TCCGTGG G/A 0.032*

DDEF1 R4AG 302474 Intron 21 GTAACAG A/C 0.0466*

DDEF1 RP1 279523 íntron 14 GTATGTC T/C 0.0706

□

DDEF1 RP3 289841 íntron 16 TCCTGGG T/C 0.0829

□

DDEF1 RP1 279709 íntron 14 CTGATCT A/G 0.0888

□

DDEF1 RP3 289810 Exon 15 I I I CGAC C/T 0.0888

□

DDEF1 RP1 279578 íntron 14 AGTGACC G/A 0.1087

0

DDEF1 R4AG 302359 Exon 20 ATCAGCT A/T 0.1087

□

DDEF1 R3AG 298921 Intron 19 I C I I I G/A 0.1398

□

DDEF1 RP3 289636 íntron 15 TTATCGA T/C 0.1555

DDEF1 R1S 335016 Intron 31 TGCATGG A/G 0.1555

DDEF1 R1AG 295329 Intron 18 ACCCGTG C T 0.1635

DDEF1 RP3 289729 íntron 15 TCATGTC T/C 0.2391

DDEF1 R2AG 297005 Intron 19 TACAAAG A/C 0.2391

DDEF1 R4AG 302361 Exon 20 GAACGAA C/T 0.2391

DDEF1 R1S 334712 Intron 30 GGCCCTT C T 0.2391

DDEF1 R1S 334730 Intron 30 GCACCCA C T 0.2391

DDEF1 R1S 334788 Intron 30 GCTCGG C/T 0.2391

C

DDEF1 RP1 279388 íntron 13 GGCAT- A/T 0.2484

GA

DDEF1 R1AG 295286 Intron 18 CACATAC A/G 0.2751

DDEF1 R2AG 296691 Intron 18 GCTCCCT C/A 0.2998

DDEF1 RP1 279270 íntron 12 TCCACTA A/G 0.3

DDEF1 R2AG 296832 Exon 18 GGGTATC T/C 0.3198 Gene Região Localização no Região do Sequência Ge- P gene DDEF1 em gene nóti- pb po

DDEF1 RP2 280457 íntron 14 GTGTTTG T/A 0.3332

DDEF1 R2A 304307 Intron 23 CACTGGA T/C 0.3332

DDEF1 RP2 280466 íntron 14 TCCATCC A/G 0.3416

DDEF1 RP3 289610 íntron 15 AGTATTC A/G 0.3416

DDEF1 R2AG 296805 Exon18 AGA- A/G 0.3416

ACCCT

DDEF1 RP3 289705 íntron 15 GCG I I I G/A 0.3416

DDEF1 R2AG 297037 Intron 19 TGCGTAG G/A 0.3416

DDEF1 R3AG 298842 Intron 19 GAGG- G/A 0.3416

GAA

DDEF1 RP5 295091 Exon 17 GACGAAC G/A 0.3633

DDEF1 RP1 279616 íntron 14 GACG- G/A 0.3913

CAC

DDEF1 RP2 280448 íntron 14 TATTGGG T/C 0.3913

DDEF1 RP2 280559 íntron 15 GCTTGTT T/C 0.3913

DDEF1 RP3 289777 Exon 15 CCAGGT G/A 0.3913

G

DDEF1 R3AG 299102 Intron 20 TTCATGG A/G 0.3913

DDEF1 R4AG 302193 Intron 20 CTTGGCG G/C 0.3913

DDEF1 R1A 302926 Intron 22 GGTATCT A/G 0.3913

DDEF1 R2A 304153 Exon 22 CCTAGAT A/G 0.3913

DDEF1 RP5 295041 Intron 17 GCACTCA C/T 0.3973

DDEF1 RP5 294998 Intron 17 TCCGAGT G/A 0.4

DDEF1 RP5 295067 Intron 17 TGGCGG CÍT 0.4

C

DDEF1 R1AG 295211 Exon 17 CGACGTC C/T 0.4

DDEF1 R1AG 295277 Intron 18 CACGCC G/A 0.4

C

DDEF1 R1AG 295316 Intron 18 TCCGAGT G/A 0.4

DDEF1 RP3 289732 íntron 15 TGTCCAG C/T 0.4099

DDEF1 R2AG 296709 Intron 18 CTTTCCC T/C 0.4099

DDEF1 R2AG 296728 Intron 18 AAAA I I I A/T 0.4099

DDEF1 R3AG 298765 Intron 19 ACTATCT A/C 0.4099 Gene Região Localização no Região do Sequência Ge- P gene DDEF1 em gene nóti- pb po

DDEF1 R3AG 299072 Intron 20 TAACTGT C/T 0.4099

DDEF1 R4AG 302287 Exon 20 GACCGTA crr 0.4099

DDEF1 RP2 280615 íntron 15 AGCGCAT G/T 0.4545

DDEF1 R4AG 302353 Exon 20 ATCCTCA C/T 0.4545

DDEF1 RP5 295023 Intron 17 AACGCAG G/A 0.4632

DDEF1 RP5 295106 Exon 7 GGAGGC G/A 0.4632

C

DDEF1 R1AG 295266 Intron 18 GCACGC crr 0.4632

C

DDEF1 R1AG 295293 Intron 18 TCCCAAC C/G 0.4632

DDEF1 RP1 279481 Éxon 13 CGG- C/T 0.5

CAGC

DDEF1 RP1 279624 íntron 14 TTACAGT C/G 0.5

DDEF1 R2AG 296675 Intron 18 AGTTTTA T/C 0.5

DDEF1 R2AG 296765 Intron 18 CACTCTA T/A 0.5

DDEF1 R3AG 299054 Intron 20 GAATTCT T/A 0.5

DDEF1 R2A 304327 Intron 23 AAACTCC C/T 0.5

DDEF1 R3A 304683 Intron 24 GGGCGT CfT 0.5

T

DDEF1 R1S 335110 Intron 31 CTTATCA A G 0.5

DDEF1 RP3 289874 íntron 16 CCCATTC A/G 0.5217

DDEF1 RP4 291964 Intron 17 CACGG- G/A 0.5217

CA

DDEF1 R2AG 296956 Intron 19 TCACGAA crr 0.5217

DDEF1 R4AG 302428 Exon 20 TGCA- A/C 0.5217

GAG

DDEF1 R4AG 302499 Intron 21 GAG- G/C 0.5217

GAGG

DDEF1 R1AG 295321 Intron 18 GTGCGG C/T 0.6

T

^* P> 0,05

Um análise de máxima verossimilhança restrita demonstrou um indicativo de associação (P < 0.07) do SNP, do gene DDEF1 testado (Tabela 6), com a espessura de gordura subcutânea na população estudada. Este marcador teve um efeito de substituição alélica significativo (P=0.027) (Tabela 7). Um valor positivo para o efeito aditivo implica que o alelo resulta em um aumento na média fenotípica. O alelo A aumentaria a média de espessu- ra de gordura em relação ao homozigoto G em 0,063 mm na população estudada (Tabela 7).

Tabela 6 . Resultados da Análise de máxima verossimilhança restrita

SNP DDEF1

Efeito GL Valor P

Média 1 <0,01

GC 32 <0,01

SNP DDEF1 2 0,071

Idade 1 <0,01

GC= grupos contemporâneos;GL= grau de liberdade; P= Probabilidade associada ao teste de razão de variância

Tabela 7 . Resultados da análise do efeito de substituição alélica do marcador DDEF1 sobre a espessura de gordura subcutânea de Canchim e, estimativa para determinar a contribuição do alelo A do marcador DDEF1 no fenótipo

Marcador DDEF1 Efeito do alelo

(mm)

Efeito GL Valor P -

Média 1 <0,01 -

GC 32 <0,01 -

Alelo A 1 0,027 0,06322

Alelo G - - -

Idade 1 <0,01 - GC= grupos contemporâneos; GL= grau de liberdade; P= Probabilidade associada ao teste de razão de variância

Essa associação é variável dependendo da raça/população analisada. Sendo assim, apenas após a aplicação de metodologia estatística a- propriada, que considera as frequências alélicas na população estudada e a distribuição dos dados fenotípicos de uma amostra da população onde se pretende aplicar o método, é possível determinar qual o genótipo que deverá ser selecionado.

EXEMPLO 6 - Seleção de animais

A seleção dos touros foi realizada a partir de consultas aos catálogos das principais centros de inseminação do país. A partir de um número total de 616 touros Nelore das variedades mocha e aspada foram eleitos para a composição desta amostra 20 touros ativos na população, ou seja, que tem sémen disponível no mercado, cujo valor não excede R$ 50,00, a fim de representar touros acessíveis ao produtor típico da raça, cujas genealogias são representativas das principais linhagens que compõem a raça Nelore, de uso comercial mais frequente dentro da raça. A escolha foi feita de maneira minimizar o grau de parentesco entre eles.

EXEMPLO 7 - Coleta de amostras e Extração do DNA As amostras utilizadas para obtenção de DNA dos touros foram palhetas de sémen congelado provenientes de centrais de inseminação. Para extração do DNA, foi utilizado o método de desproteinação com solventes orgânicos (fenol, clorofórmio e álcool isoamílico.

Para os novilhos descendentes dos 30 touros foram coletadas amostras de 5 mL de sangue dos animais, por punção da jugular, em tubos para coleta a vácuo contendo EDTA potássico (K3). As amostras foram mantidas refrigeradas até o início do processo de extração. As extrações de DNA foram realizadas a partir de leucócitos através do método salting out de a- cordo com os protocolos descritos por Regitano (REGITANO, L. C.de A.; TAMBASCO, D. D. Protocolo de análise de marcadores microssatelites. In: REGITANO, L. C. de A.; COUTINHO, L. L. (Org.). BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA À PRODUÇÃO ANIMAL Brasília - DF, 2001 , p. 195-206).

EXEMPLO 8 - Mensuração da área de olho de lombo Para mensurar a AOL in vivo, foram feitas medidas quando os animais apresentaram aproximadamente 18 meses de idade. Para isso, foi utilizado um equipamento de ultrassom Piemedical Scanner 200 Vet, com transdutor linear de 18 cm e 3,5 MHz. Os animais foram colocados em tron- cos de contenção para que fosse possível obter as imagens ultrassonográfi- cas. As imagens que fornecem as medidas de EGS (Espessura de gordura subcutânea) e AOL foram obtidas no corte transversal do músculo Longissi- mus, entre a 12 ^a e 13 ^a costela do animal. Essas imagens foram analisadas e interpretadas para obtenção das medidas de AOL em centímetros quadrado (cm ² ). Para análise das imagens que fornecem as medidas de AOL foi utilizado o programa ODT (Open data ίΓβηείθή, que acompanha o equipamento de ultrassom.

EXEMPLO 9 - Pesagem dos animais

Os animais foram pesados quando desmamados e quando atingiram entre 16 e 18 meses de idade, para obtenção do peso a desmama e ao sobreano, respectivamente. Os pesos a desmama foram ajustados para 240 dias, e os pesos ao sobreano foram ajustados para 450 dias, seguindo a fórmula de ajuste de pesos utilizada pelo programa de melhoramento da Embrapa CNPGC.

Fórmula utilizada para ajustar o peso a desmama para 240 dias: PD - 30 x 240+30

ID

Fórmula utilizada para ajustar o peso ao sobreano para 450 dias: PS - PD x (450 - IS) + PS

IS - ID

PD=Peso ao desmame

PS= Peso ao sobreano

ID= Idade ao desmame

IS= Idade ao sobreano

EXEMPLO 10. Mensuração da Maciez da carne

Por ocasião do abate, foram coletados bifes de 2,5 cm de espessura do músculo longissimus (contra filé), entre a 12 ^a e 13 ^a costela. Estes bifes foram identificados, embalados a vácuo e, se necessário, congelados para posterior análise.

Para análise da maciez, os bifes foram assados em forno elétri- co à temperatura de 180°C. As temperaturas internas dos bifes foram acom- panhadas através de termómetros digitais. Os bifes foram retirados do forno quando os termómetros acusaram 70°C e, após o resfriamento dos mesmos, foram retirados oito cilindros, paralelamente ao sentido das fibras musculares, utilizando-se um vazador com 1 ,27 cm de diâmetro, para determinar a força necessária para cortar transversalmente cada cilindro em texturômetro Texture Analyzer TA - XT2i, acoplado à lâmina Warner-Bratzler com 1 ,016 mm de espessura.

As análises de maciez foram realizadas quando as amostras de carne foram disponibilizadas pelo frigorífico, aproximadamente 24 horas a- pós o abate.

EXEMPLO 11 - Genotipagem do polimorfismo

O SNP do gene DDEF1 (DDEF1_g.279401A>G - número de acesso requerido: 181800428, descrito por Veneroni et al. (VENERONI, G.B, MEIRELLES, S.L, GOUVEIA, J.J.S., SANTIAGO, A.C., OLIVEIRA, H.N., A- LENCAR, M.M., REGITANO, L.C.A. Identificação de SNPs no gene DDEF1 bovino. In: 54° Congresso Brasileiro de Genética. Anais... Salvador, p.231 , 2008) foi genotipado pela metodologia de ARMS adaptada por Buitkamp e Semmer (BUITKAMP, J. e SEMMER, J. A robust, low- to medium-throughput prnp genotyping system in sheep. BMC Infectious Diseases, v.4, p. 30, 2004.).

A análise dos produtos da PCR foi realizada no sequenciador ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystems). Os genótipos foram determinados com a utilização do programa GeneScan (versão 3.7.1).

EXEMPLO 12 - Efeito do marcador sobre a característica AOL Para verificar os efeitos do ambiente e efeitos genéticos que influenciam a característica de carcaça AOL, foram feitas análises de variância pela metodologia dos quadrados mínimos, cujo modelo estatístico incluiu os efeitos de grupo de contemporâneo, e a covariável idade do animal na data da medida como efeitos fixos e o pai do animal como efeito aleatório. Assim, foram formados seis grupos de contemporâneos (GC) compostos pelas variáveis: local de nascimento e mês de nascimento.

Na Tabela 1 pode ser observado um resumo da analise de vari- ância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre AOL. Foi encontrada associação significativa P<0,05, entre o gene DDEF1 e AOL.

Tabela 8. Resumo das análises de variância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre área de olho de lombo (AOL) em bovinos da raça Nelore.

AOL

Graus de liber¬

Fonte de variação dade Valor de P

GC 5 0,092*

DDEF1 2 0,0203 ^**

Idade 1 0,5587

GC= grupo de contemporâneos; DDEF1= marcador; ldade= Idade do Animal na data da medida; ^* P<0,10; * ^* P<0,05.

Não há relatos de associação do gene DDEF1 com AOL, sendo este documento é o primeiro que investigou esta associação e observou e- feito significativo. A AOL é uma característica correlacionada com musculo- sidade e por isso pode influenciar na qualidade da carcaça. A associação entre um marcador e AOL pode contribuir para seleção precoce, já que esta característica é de mensuração tardia (quando animal atinge cerca de 18 meses ou após o abate) e consequentemente contribuir para o melhoramen- to animal, possibilitando incluir esta característica em programas de melhoramento.

Nas análises para avaliar a influência do marcador sobre AOL u- tilizou-se um modelo animal com os efeitos fixos de grupo de contemporâneos e genótipos e a idade do animal na data da medida (efeito linear) como covariável, além do efeito aleatório do touro. As análises foram feitas pelo método da máxima verossimilhança restrita (REML) utilizando o procedimento PROC MIXED do programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2000- SAS Institute Inc. SAS procedures guide. 8. ed. Cary, 2000).

EXEMPLO 13 - Efeito do marcador sobre peso a desmama e peso ao sobreano

Para verificar os efeitos do ambiente e efeitos genéticos que in- fluenciam as características de crescimento peso a desmama e peso ao so- breano, foram feitas análises de variância pela metodologia dos quadrados mínimos. Nas análises para avaliar a influência do marcador sobre as características utilizou-se um modelo animal com os efeitos fixos de local de nas- cimento e genótipos e a idade do animal na data da pesagem (efeito linear) como covariável, além do efeito aleatório do touro. As análises foram feitas pelo método da máxima verossimilhança restrita (REML) (utilizando o procedimento PROC MIXED do programa Statistical Analysis System (SAS) (SAS Institute Inc., 2000- SAS Institute Inc. SAS procedures guide. 8. ed. Cary, 2000).

Na Tabela 9 pode ser observado um resumo da analise de variância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre peso a desmama. Foi encontrada associação significativa P<0,05 entre o gene DDEF1 e peso a desmama.

Tabela 9. Resumo das análises de variância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre peso a desmama em bovinos da raça Nelore.

Peso a desmama

Graus de liber¬

Fonte de variação dade Valor de P

Local de nascimento 5 <.0001 ^***

DDEF1 2 0.0159 ^**

Idade 1 < 0001 ^***

ldade= Idade do animal na data da pesagem; **P<0,05;

** ^* P<0,01

Na Tabela 3 pode ser observado um resumo da análise de vari- ância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre peso ao sobreano. Foi encontrada associação altamente significativa P<0,01 entre o gene DDEF1 e peso ao sobreano.

Tabela 10. Resumo das análises de variância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre peso ao sobreano em bovinos da raça Nelore.

Peso a desmama Graus de liber- Fonte de variação dade Valor de P

Local de nascimento 5 < ooor

DDEF1 2 0.0023 ^*

Idade 1 0,0503

ldade= Idade do animal na data da pesagem; ^** P<0,05;

^*** P<0,01

Não há descritos estudos de associação entre o gene DDEF1 e características de crescimento como peso a desmama e peso ao sobreano, assim, este trabalho foi o primeiro que investigou esta associação e observou efeito significativo entre estas características e o marcador. A avaliação da eficiência produtiva é importante para a exploração de bovinos de corte e pode ser quantificada, por exemplo, pela quantidade de quilogramas de bezerros desmamados por vaca durante o ano, o que reflete a rentabilidade do rebanho.

Implantar programas de melhoramento que permitam aumentar os ganhos dos animais é importante, pois o peso a desmama serve para a- valiar o potencial genético de crescimento do indivíduo bem como a habilidade materna da vaca (SOUZA, J.C.; RAMOS, A.A.; SILVA, L.O.C.; EUCLI- DES FILHO, K.; ALENCAR, WECHSLER, F.S.; FERRAZ FILHO, P.B. Fato- res ambientais sobre o peso ao desmame de bezerros da raça Nelore em regiões tropicais brasileiras. Cienc. Rural, v.30 n.5, 2000). O peso ao sobreano também pode ser um indicador do potencial genético de crescimento do individuo. A identificação de um marcador associado com características de crescimento pode ajudar na seleção de reprodutores a fim de produzir rebanhos mais rentáveis e pode permitir estabelecer um perfil produtivo para características economicamente importante desde o nascimento.

EXEMPLO 14 - Efeito do marcador sobre maciez de carne

Nas análises para avaliar a influência do marcador sobre a ca- racterística maciez de carne utilizou-se um modelo animal com os efeitos fixos de genótipos e de grupo de contemporâneos composto pelos efeitos local de nascimento, mês de nascimento e lote de abate e a idade do animal na data do abate (efeito linear) e o pH como covariáveis, além do efeito alea- tório do touro. As análises foram feitas pelo método da máxima verossimi- Ihança restrita (REML) (utilizando o procedimento PROC MIXED do programa Statistical Analysis System (SAS) (SAS Institute Inc., 2000- SAS Institute Inc. SAS procedures guide. 8. ed. Cary, 2000).

Para essa análise foram utilizados somente os animais que foram confinados na Embrapa CPPSE, totalizando 137 animais.

Na Tabela 11 pode ser observado um resumo da análise de variância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre maciez de carne. Foi encontrada associação altamente significativa P<0,01 entre o gene DDEF1 e maciez de carne.

Tabela 11. Resumo das análises de variância incluindo o efeito do marcador DDEF1 sobre maciez em bovinos da raça Nelore.

Maciez de carne

Fonte de variação Graus de liberdade Valor de P

GC 17 0.0010* ^* *

DDEF1 2 0.0083 ^***

pH 1 0,0878 ^*

Idade 1 0,0349**

Gc = Grupo de contemporâneos, Idade = idade do animal na da- ta do abate, ^* P<0,10; ^* P<0,05; ^*** P<0,01

Foi encontrada associação significativa (P<0,05) entre o marcador localizado no gene DDEF1 e as características área de olho de lombo (AOL) e peso a desmama, e associação altamente significativa (P<0,01) entre o marcador e as características peso ao sobreano e maciez de carne. Es- tudos de associação entre esse gene e características economicamente importantes para produção de carne em outras populações de bovinos podem auxiliar na validação dessa associação e na inclusão desta característica em programas de melhoramento. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

INFORMAÇÕES GERAIS:

l.a) Requerente: EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA

l.b) Endereço: Parque Estação Biológica PqEB, Av. W3 Norte (Final), Brasília DF

II) Título da Invenção: Método para identificação de animais com maior potencial para características desejáveis de qualidade da carne, área do olho do lombo (AOL), peso a desmama e peso ao sobreano

III) Número de Sequências: 4 (quatro).

IV) Formato para leitura em computador:

IV.a) Meio utilizado: CD.

IV.b) Computador utilizado: compatível com IBM PC.

IV.c) Sistema operacional: PC-DOS/MS-DOS.

INFORMAÇÕES GERAIS DAS SEQUÊNCIAS:

I. a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 01

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 29

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP

ATATGGGAAT CCTAGAGAGG AGACGTAAC 29

I. a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 02

II) Características da seqiiência:

II. a) tamanho: 25

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP

GGGAATCCTA GAGAGGAGAC GTAAT 25 l.a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 03 II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 24

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GACTAGAAAT AGGAGACCCG GACC 24

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 04

II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

II I. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GCCTTCCTCA AACCACACAT 20

I. a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 05

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

II I. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP ATTGCTCACCTGCCCAGTTT 20

I. a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 06

II) Características da seqiiência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GCCTTCCTCAAACCACACAT 20 l.a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 07 II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TAATAAACGGCAGCCCAGAC 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 08

II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

II I. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CCCCACATGTTAAACACACG 20

I. a) Número identificador da seqúência: SEQ ID N° 09

II) Características da seqúência:

II. a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqúência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CGCACAGTTAAAAGCCATTG 20

I. a) Número identificador da seqúência: SEQ ID N° 10

II) Características da seqúência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqúência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CCAGCATACACCTCCTCTCA 20 l.a) Número identificador da seqúência: SEQ ID N° 11 II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GCTGAAACAAAAAGGTGCAA 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 12

II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

II I. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP ACAGCTAAGCAGGGGAAACC 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 13

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 21

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TTCCCTCCTGTTACTGCTTGA 21

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 14

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 19

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CTCCACGTCCATAATGCTGA 19 l.a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 15 II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GGGTGTTTCATAGGCCTCAC 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 16

II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

I I I. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CATGATTCGCCAGTTCTTCA 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 17

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CATGGTTCCACCAGTCCATT 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 18

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CGATTGAAGCCACTGAACAA 20 l.a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 19 II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 22

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TCAGCTGGAATGTTGAAGAGAA 22

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 20

II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TAACAGCAGCCCCTTTCAGT 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 21

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TGAAAGGGGCTGCTGTTAAT 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 22

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

lll.a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TGGCCATGCTCACTTGTTTA 20 l.a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 23 II) Características da seqiiência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP TCGTCTTCCCTGCCTCTAAG 20 La) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 24

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GAATGGGCATGTCTCAGTTG 20

La) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 25

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

ll.c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP ATGCCCATTCCGTTGTACTC 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 26

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GTGCTGGCCTGAATTTCTTT 20 l.a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 27 II) Características da sequência:

Il.a) tamanho: 21

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP CCGTGATGTTTGCTCTCAGAT 21

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 28

II) Características da sequência:

Il.a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GGGCCAGTGTTGAATGAGTT 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 29

II) Características da seqúência:

II. a) tamanho: 20

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GGTCATCGTGTCCTCCTTTC 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 30

II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

ll.c) organismo: seqiiência artificial

III) Característica:

lll.a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP GGGCCAGTGTTGAATGAGTT 20 l.a) Número identificador da seqiiência: SEQ ID N° 31 II) Características da sequência:

II. a) tamanho: 20

ll.b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP

ATCAGTTCTGCCCACCGTTT 20

I. a) Número identificador da sequência: SEQ ID N° 32

II) Características da sequência:

ll.a) tamanho: 22

II. b) tipo: DNA

II. c) organismo: sequência artificial

III) Característica:

III. a) outra informação relevante: primer para genotipagem de SNP

GATGGTCTTGATGGTCTGATGA 22