PELOS REFERIDOS PROCESSOS E SEUS USOS CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere à síntese e caracterização de complexos fosfínicos de rutênio (II) contendo o ion picolinato e/ou diiminas e/ou bifosfinas com ótima atividade farmacológica na inibição do crescimento da micobactéria da tuberculose. Tais complexos poderão primeiramente ser utilizados na indústria química e a médio e longo prazo na indústria farmacêutica. A presente invenção descreve também como foi realizada a determinação da atividade contra o bacilo da tuberculose, bem como avalia a toxicidade dos complexos contra as células de macrófagos onde o bacilo da tuberculose se internaliza.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A tuberculose (TB) continua sendo a doença infecciosa de maior morbidade e mortalidade em todo mundo. Um terço da população mundial está infectada com Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico de TB. Segundo as estimativas da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2007), ocorrem anualmente de oito a dez milhões de casos novos de TB. Com o crescente aumento de cepas de M. tuberculosis resistentes às drogas utilizadas no tratamento convencional, uma nova variante da tuberculose foi descoberta, a TB com resistência a múltiplas drogas (MDR- TB) . A MDR-TB tem aumentado sua incidência, não só em países em desenvolvimento, mas também nos industrializados. Logo, o crescente número de casos de MDR-TB tem levado os pesquisadores a procurar novas drogas com ação antimicobacteriana, enfatizando a importância do desenvolvimento de novos medicamentos ativos contra o bacilo da TB e, consequentemente, para o controle eficaz da TB- DR .

Além do crescente número de casos de MDR-TB, o tratamento da Tuberculose é também bastante complexo. Não só pelo diagnóstico ser excessivamente tardio, favorecendo a propagação do bacilo e retardando o inicio do tratamento, mas também pela duração do tratamento ser muito longa.

Acrescenta-se, ainda a isso, a problemática da co- infecção M. tuberculosis com o Vírus da imunodeficiência (HIV) . As pessoas com AIDS têm um risco significativamente maior de morte, quando co-infectadas com TB (Public Health Watch, 2006) . Estima-se que 10% das pessoas com TB sejam HIV - positivas e que cerca de 20% das pessoas com AIDS sofram de TB pulmonar.

Devido à problemática exposta acima, percebe-se a importância da pesquisa científica nesta área. Desta forma, duas estratégias podem ser utilizadas no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose: melhorar a atividade dos quimioterápicos já existentes ou procurar estruturas químicas novas com atividade antimicobacteriana melhorada e reduzindo o tempo de tratamento (SRIRAN et al., 2006) .

ESTADO DA TÉCNICA

Várias estruturas químicas utilizadas no tratamento de infecções bacterianas, especificamente as micobacterianas , já são conhecidas no estado da técnica.

No campo dos compostos complexos, alguns trabalhos destacando os efeitos bactericidas de compostos de coordenação com os metais prata e ferro já estão descritos na literatura. Entretanto, sobre o rutênio muito pouco é conhecido nesta área.

O pedido de patente brasileiro 0300770, depositado em 29/01/2003, se refere a complexos de metais de transição baseados na estrutura do ion pentacianoferrato (II) e do ion pentaamina de rutênio (II), seus métodos de preparação e sua aplicação bactericida no tratamento da tuberculose.

Apesar da aplicação do composto ser a mesma, isto é, utilização no tratamento da tuberculose, o composto complexo utilizado é diferente dos compostos utilizados na presente invenção. Além disso, as propriedades micobactericidas dos compostos de rutênio obtidos não foram descritas .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção tem como principal objetivo sintetizar e caracterizar complexos fosfinicos de Rutênio (II) contendo o ion picolinato e/ou diiminas com atividade contra o bacilo da tuberculose e determinar sua atividade antimicobacteriana .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção faz referência aos complexos fosfinicos de rutênio (II) contendo diiminas, óxido nítrico e/ou monóxido de carbono como coligantes. Mais especificamente, a presente invenção se refere a processos de preparação dos complexos fosfinicos de rutênio contendo como ligantes o óxido nítrico, monóxido de carbono, ion picolinato e/ou diiminas e/ou bifosfinas em suas estruturas bem como seus compostos. Os compostos objetos deste invento são obtidos como sais complexos contendo o ânion PF ₆ ^~ , BF ₄ ^" ou C10 ₄ ^~ como contra-ions e apresentam a fórmula geral:

[RuCl (L) (N-N) ( P-P) ] ⁺

Onde :

(N-N) representa um ligante diiminico, tal como: bipiridina (bipy) e seus derivados: [ 4 , 4 ' -dimetil-2 , 2 ' - bipiridina ou 5 , 5 ' -dimetil-2 , 2 ^' -bipiridina - Me-bipy) , 4, 4 ' -dimetóxi-2, 2 ' -bipiridina (MeO-bipy) ; 4 , 4 ' -cloro-2 , 2 ' - bipiridina (Cl-bipy) ; fenantrolina (fen), 4,7-difenil- 1 , 10 ^' -fenantrolina, 2-acetilpiridina, 2-benzoilpiridina, etilenodiamina (en) , entre outros.

(P-P) representa um ligante bifosfinico, tal como:

1, -bis (difenilfosfina) butano - (dppb) ,

1, 3-bis (difenilfosfina) propano - (dppp) ,

1, 2-bis (difenilfosfina) etano - (dppe) ,

bis (difenilfosfina) metano - (dppm) ,

1 , 1 ^' - (difenilfosfinaferroceno ) - (dppf) ; e

1, 2-bis (diciclohexilfosfina) etano - (dcype).

(L) é um N-heterociclico, tal como: piridina (py) e seus derivados, 4 , 6-dimetil-2-mercaptopirimidina, monóxido de carbono, óxido nítrico, etc..

Quando (L) é NO ⁺ , a formula geral é [RuCl (NO) (N-N) ( P- P)] ²⁺ , sendo o óxido nítrico como ligante;

Quando (L) é CO, a formula geral é [RuCl (CO) (N-N) (P- P)] ⁺ , sendo o monóxido de carbono como ligante;

Quando (L) é o íon picolinato (pie) , a formula geral é [Ru (pie) (N-N) (P-P) ] ⁺ .

Verificou-se também nos ensaios biológicos que tais complexos de rutênio possuem alta atividade bactericida e/ou bacteriostática em relação ao agente da tuberculose {M. tuberculosis) e baixa toxicidade para células eucarióticas (citotoxicidade) .

Sendo assim, tais complexos poderão primeiramente ser utilizados na indústria química uma vez que podem ser adicionados a desinfetantes quando do descarte de espécimes clínicos infectados como escarro, lavado brônquico e gástrico e, a médio e longo prazo, na indústria farmacêutica. Na indústria farmacêutica, os complexos da presente invenção poderão ser inicialmente usados na preparação de medicamentos úteis na prevenção e tratamento de infecções de pele produzidas por micobactérias , quando acrescidos aos antissépticos . A longo prazo, após triagem clínica e estudos para avaliar uma formulação adequada para a sua dispensação, poderão ser utilizados para a preparação de medicamentos que serão empregados no tratamento da tuberculose e de outras micobacterioses .

Preparação do complexo de rutênio

De uma maneira geral, a preparação dos compostos complexos de rutênio contendo o íon picolinato e/ou diiminas e/ou bifosfinas em sua estrutura se dá pela reação de um complexo precursor do tipo eis- [RuCl ₂ (dppb) (N-N) ] com o ácido picolínico ou diiminas (co-ligante) utilizando metanol como solvente, sempre em quantidades previamente calculadas para a formação dos compostos.

Em outras palavras, o precursor desejado é dissolvido em metanol e em seguida, o ácido picolínico ou diiminas é adicionado a eles, sob agitação constante. Após 12 horas de agitação adiciona-se NH PF ₆ a esta solução, concentra-se a solução e adiciona-se água, observando-se a formação de um sólido amarelo-alaranj ado . 0 sólido amarelo é filtrado, sob vácuo, em funil de vidro sinterizado e lavado três vezes com água e éter dietilico. 0 composto é seco em dessecador sob pentóxido de fósforo (P ₄ Oi ₀ ) .

Entretanto, a presente invenção se limitou a estudar cinco processos específicos de síntese.

Exemplo 1) Preparação do sal complexo de [Ru (pie) (dppb) (bipy)]PF ₆

50 mg (0,067 mmol) do complexo precursor de fórmula eis- [RuCl ₂ (dppb) (bipy) ] foram solubilizados em 25 mL de metanol. 24,6 mg (0,200 mmol) de ácido picolínico foram adicionados a esta solução. A reação foi mantida sob argônio por aproximadamente 24 horas resultando em uma solução avermelhada. Após este tempo, foram adicionados 16,2 mg (0,100 mmol) de NH PF ₆ à solução e mantida a agitação por mais 1 h. A solução foi concentrada até um volume de 5 mL e 10 mL de água foram adicionados. Observou- se a precipitação de um sólido alaranjado que foi lavado com água e éter dietilico antes de ser armazenado em dessecador.

Os resultados percentuais da análise elementar foram: Encontrado/Calculado: C = 55,12/55,58; N = 4,46/4,42; H = 4,74/4,24. Destes se obtém a seguinte fórmula mínima: C ₄ H ₄ oP3N ₃ 0 ₂ F ₆ Ru e a fórmula molecular: [Ru (pie) (dppb) (bipy) ] PF ₆ .

Exemplo 2) Preparação do sal complexo de [Ru (pie) (dppb) (Me-bipy) ] PF ₆

50 mg (0,064 mmol) do complexo precursor de fórmula eis- [RuCl ₂ (dppb) (Me-bipy)] foram solubilizados em 25 mL de metanol. 24,6 mg (0,200 mmol) de ácido picolínico foram adicionados a esta solução. A reação foi mantida sob argônio por aproximadamente 24 horas resultando em uma solução avermelhada. Após este tempo, foram adicionados 16,2 mg (0,100 mmol) de NH ₄ PF ₆ à solução e mantida a agitação por mais 1 h. A solução foi concentrada até um volume de 5 mL e 10 mL de água foram adicionados. Observou- se a precipitação de um sólido alaranjado que foi lavado com água e éter dietilico antes de ser armazenado em dessecador .

Os resultados percentuais da análise elementar foram: Encontrado/Calculado: C = 56,25/56,44; N = 4,23/4,29; H = 4,50/4,53. Destes se obtém a seguinte fórmula mínima: C4 ₆ H ₄ 4P _{3 3} 0 ₂ F ₆ Ru e a fórmula molecular: [Ru (pie) (dppb) (Me- bipy)]PF ₆ .

Exemplo 3) Preparação do sal complexo de [Ru (pie) (dppb) (Cl-bipy) ]PF ₆

50 mg (0,061 mmol) do complexo precursor de fórmula eis- [RuCl ₂ (dppb) (Cl-bipy)] foram solubilizados em 25 mL de metanol. 24,6 mg (0,200 mmol) de ácido picolínico foram adicionados a esta solução. A reação foi mantida sob argônio por aproximadamente 24 horas resultando em uma solução avermelhada. Após este tempo, foram adicionados 16,2 mg (0,100 mmol) de NH ₄ PF ₆ à solução e mantida a agitação por mais 1 h. A solução foi concentrada até um volume de 5 mL e 10 mL de água foram adicionados. Observou- se a precipitação de um sólido alaranjado que foi lavado com água e éter dietilico antes de ser armazenado em dessecador .

Os resultados percentuais da análise elementar foram: Encontrado/Calculado: C = 51,73/51,83; N = 4,51/4,12; H = 4,17/3,76. Destes se obtém a seguinte fórmula mínima: C ₄₄ H3 ₈ P ₃ N ₃ 0 ₂ Cl ₂ F ₆ Ru e a fórmula molecular: [Ru (pie) (dppb) (Cl- bipy) ] PF ₆ .

Exemplo 4) Preparação do sal complexo de [Ru (pie) (dppb) (fen) ] PF ₆

50 mg (0,064 mmol) do complexo precursor de fórmula eis- [RuCl ₂ (dppb) (fen)] foram solubilizados em 25 mL de metanol. 24,6 mg (0,200 mmol) de ácido picolínico foram adicionados a esta solução. A reação foi mantida sob argônio por aproximadamente 24 horas resultando em uma solução avermelhada. Após este tempo, foram adicionados 16,2 mg (0,100 mmol) de NH ₄ PF ₆ à solução e mantida a agitação por mais 1 h. A solução foi concentrada até um volume de 5 mL e 10 mL de água foram adicionados. Observou- se a precipitação de um sólido alaranjado que foi lavado com água e éter dietilico antes de ser armazenado em dessecador .

Os resultados percentuais da análise elementar foram: Encontrado/Calculado: C = 56,25/56,68; N = 4,23/4,31; H = 4,50/4,14. Destes se obtém a seguinte fórmula mínima: C ₄₆ H4oP3N302 F ₆ Ru e a fórmula molecular:

[Ru(pic) (dppb) (fen) ] PF ₆ .

Exemplo 5) Preparação dos sais complexos [Ru (pie) (dppe) ₂ ]PF ₆ e [Ru (pie) (dppm) ₂ ]PF ₆

100 mg (0,103 mmol) do complexo precursor de fórmula eis- [RuCl ₂ (dppe) ₂ ] ou eis- [RuCl ₂ (dppm) ₂ ] _/ respectivamente, juntamente com 36,9 mg (0,300 mmol) de ácido picolínico (em excesso) e 24,3 mg (0,150 mmol) de NH ₄ PF6 foram solubilizados em 20 mL de metanol. A reação foi mantida sob argônio por aproximadamente 24 horas de agitação resultando em uma solução amarela. A referida solução foi concentrada até um volume de 3 mL e 10 mL de água foram adicionados. Observou-se a precipitação de um sólido amarelo-alaranj ado que foi filtrado e lavado com água e éter dietilico antes de ser armazenado em dessecador.

Os resultados percentuais da análise elementar foram: Encontrado/Calculado: C = 59,60/59,80; N = 1,13/1,20; H = 4,70/4,50. Destes se obtém a seguinte fórmula mínima: C ₅₈ H52P5N0 ₂ F ₆ Ru para o sal complexo eis- [Ru (pie) (dppe) ₂ ]PF ₆ ; e C = 59,38/59,16; N = 1,10/1,23; H = 4,15/4,25, cuja fórmula mínima é C ₅₆ H4 ₈ P ₅ N0 ₂ F ₆ Ru para o sal complexo cis- [Ru (pie) (dppm) ₂ ] PF ₆ .

Medidas Condutimétricas

Foram realizadas medidas de condutividade a 25°C empregando o condutímetro Meterlab CDM 230. Para tal, utilizou-se uma solução de complexo 10 ^~3 M em diclorometano para determinar o tipo de eletrólito (número de íons por molécula de complexo) [13], e uma solução 10 ^~4 M em D SO para estudar a estabilidade dos complexos no solvente usado nos estudos microbiológicos. As medidas realizadas demonstraram que os compostos são isentos de carga (carga zero) e são estáveis em DMSO durante 48 horas.

Atividade Antimicobacteriana e Determinação da Citotoxicidade dos ligantes liyres e dos complexos de Rutênio

A atividade antimicobacteriana in vitro dos ligantes livres e dos complexos de Rutênio foi avaliada de acordo com a técnica do MABA, proposta por COLLINS & FRANZBLAU, (1997), onde foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) necessária para inibir 90% dos bacilos da tuberculose. Para tal foram empregadas placas estéreis de 96 poços (Falcon 3072; Becton Dickinson, Lincoln Park, o NJ) , meio de Middlebrook 7H9 (Difco) enriquecido com OADC (BBL/Becton-Dikinson, Sparks, MD, USA) e Mycobacterium tuberculosis H ₃₇ RV, proveniente da coleção internacional (ATCC 27294) .

A avaliação da citotoxicidade dos ligantes livres e dos complexos de rutênio foi determinada utilizando macrofagos de linhagem (J774) empregando a técnica proposta por AHMED et al., (1994). Esta técnica determina a maior concentração da substância em análise que ainda permita a viabilidade de 50% das células (IC ₅₀ ). Da razão entre IC50/CIM foi estabelecido o índice de seletividade (IS). Para ORME et al., (2001), um complexo com IS>10 e valor de CIM promissor contra o bacilo da tuberculose, é um candidato a nova droga anti-TB, pois é pouco tóxico para células de mamíferos mas bastante ativo contra o M. tuberculosis .

A seguir demonstram-se a CIM obtida para os complexos de rutênio e as respectivas toxicidades (IC50) e índice de seletividade (IS).

1) Determinação da atividade contra o bacilo da tuberculose (M. tuberculosis) e da toxicidade celular dos ligantes dppb, bipy, HFIC e do complexo [Ru (pie) (dppb) (bipy) ] PF ₆ .

Os ligantes e o complexo foram dissolvidos em DMSO para obtenção de uma solução estoque na concentração de 10.000 μg/mL. As soluções posteriores foram preparadas pela adição ao meio líquido 7H9. A suspensão de M. tuberculosis ATCC 27294 foi incubada juntamente com as diluições dos ligantes, em placas com 96 poços a 37°C por 7 dias. A sensibilidade e/ou resistência dos micro-organismos foi determinada pelo crescimento bacteriano indicado pela mudança de cor do corante resazurina, de azul (inibição) para rosa (multiplicação) . A interpretação final dos resultados foi obtida a partir da fluorescência emitida e quantificada por um microfluorimetro SpectraFluor Plus (TECAN ) , onde foram utilizados filtros de excitação e de emissão nos comprimentos de onda de 530 e 590 nm, respectivamente. Os resultados da atividade antimicobacteriana e da toxicidade celular são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Atividade do complexo [Ru (pie) (dppb) (bipy) ]PF ₆ e dos ligantes dppb, bipy e HPIC frente ao M. tuberculosis H37Rv e aos macrófagos J774, expressos em ug/mL e M.

Os resultados mostram que o complexo

[Ru (pie) (dppb) (bipy) ] PF ₆ foi extremamente ativo contra o bacilo da tuberculose apresentando, CIM de 0,26 g/mL e baixa citotoxicidade (IC ₅₀ 3, 90 μg/mL e IS de 15) . A complexação do metal ao ligante melhorou a atividade contra o bacilo. O valor de 0,26 μg/mL é comparável aos das drogas de primeira linha utilizadas no tratamento da tuberculose, como a Etionamida (2,50 μg/mL) , Pirazinamida ( 50-100μg/mL) e a Rifampicina (0,5 μg/mL) (WHO, 2007). 2) Determinação da atividade contra o bacilo da tuberculose (M. tuberculosis) e da toxicidade celular dos ligantes dppb, Me-bipy, HPIC e do complexo [Ru (pie) (dppb) (Me-bipy) ] PF ₆ .

Os ligantes e o complexo foram dissolvidos em DMSO para obtenção de uma solução estoque na concentração de 10.000 μς/πι]_,. As soluções posteriores foram preparadas pela adição ao meio líquido 7H9. A suspensão de M. tuberculosis ATCC 27294 foi incubada juntamente com as diluições dos ligantes, em placas com 96 poços a 37°C por 7 dias. A sensibilidade e/ou resistência dos micro-organismos foi determinada pelo crescimento bacteriano indicado pela mudança de cor do corante resazurina, de azul (inibição) para rosa (multiplicação) . A interpretação final dos resultados foi obtida a partir da fluorescência emitida e quantificada por um microfluorímetro SpectraFluor Plus (TECAN ^® ) , onde foram utilizados filtros de excitação e de emissão nos comprimentos de onda de 530 e 590 nm, respectivamente. Os resultados da atividade antimicobacteriana e da toxicidade celular são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: Atividade do complexo [Ru (pie) (dppb) (Me-bipy) ]PF ₆ e dos ligantes dppb, Me-bipy e HPIC frente ao M. tuberculosis H37Rv e aos macrófagos J774, expressos em g/mL e uM.

Compostos CIM ic ₅₀ IS pg/mL μΜ g/mL μΜ ClM/ICsc dppb > 50 > 117,20 625 1465 > 12,50

Me-bipy 25 135, 70 < 9,80 < 53,20 < 0,40

HPIC > 50 > 406 312, 50 2538 6,25 [Ru (pie) (dppb) (Me- 0, 91 0, 95 31, 30 32, 60 34, 40 bipy) ] PF ₆

resultados mostram que a atividade do complexo

[Ru (pie) (dppb) (Me-bipy) ] PF ₆ frente ao bacilo da tuberculose foi extremamente promissor, quando comparado a seus ligantes livres, apresentando CIM de 0,91 μg/mL. A toxicidade celular foi baixa (IC ₅₀ 31,30 μg/mL) propiciando um IS superior a 10 (34, 40) . A complexação do metal ao ligante melhorou a atividade contra o bacilo. O valor de 0, 91 μg/mL é comparável aos das drogas de primeira linha utilizadas no tratamento da tuberculose, como a Etionamida (2,50 μg/mL) , Pirazinamida ( 50-100μg/mL) e a Rifampicina (0,5 μg/mL) (WHO, 2007) .

3) Determinação da atividade contra o bacilo da tuberculose (M. túberculosis) e da toxicidade celular dos ligantes dppb, Cl-bipy e HPIC e do complexo cis- [Ru (pie) (dppb) (Cl-bipy) ] PF ₆ .

Os ligantes e o complexo foram dissolvidos em DMSO para obtenção de uma solução estoque na concentração de 10.000 μg/mL. As soluções posteriores foram preparadas pela adição ao meio liquido 7H9. A suspensão de M. túberculosis ATCC 27294 foi incubada juntamente com as diluições dos ligantes, em placas com 96 poços a 37°C por 7 dias. A sensibilidade e/ou resistência dos micro-organismos foi determinada pelo crescimento bacteriano indicado pela mudança de cor do corante resazurina, de azul (inibição) para rosa (multiplicação) . A interpretação final dos resultados foi obtida a partir da fluorescência emitida e quantificada por um microfluorimetro SpectraFluor Plus (TECAN ) , onde foram utilizados filtros de excitação e de emissão nos comprimentos de onda de 530 e 590 nm, respectivamente. Os resultados da atividade antimicobacteriana e da toxicidade celular são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3: Atividade do complexo eis- [Ru (pie) (dppb) (Cl- bipy) ]PF ₆ e dos ligantes dppb, HPIC e Cl-bipy frente ao M. tub rculosis H37Rv e aos macrófagos J774, expressos em ug/mL e uM.

Os resultados mostram que os ligantes livres não apresentaram atividade contra o bacilo da Tuberculose. A complexação com o metal eis- [Ru (pie) (dppb) (Cl-bipy) ] PF ₆ aumentou a atividade frente ao bacilo (6,25 yg/mL) e reduziu a citotoxicidade aos macrófagos (IC50 de 19,50 e IS de 3,12) . 0 valor de 6,25 yg/mL é comparável ao das drogas de segunda linha utilizadas no tratamento da tuberculose, como a cicloserina (CIM de 12,50-50 μg/m ) , gentamicina (CIM de 2-4 yg/mL) , kanamicina (CIM de 1,25-5 g/mL) e tobramicina (CIM de 4-8 ug/mL) (WHO, 2007) .

4) Determinação da atividade contra o bacilo da tuberculose (M. tuberculosis) e da toxicidade celular dos ligantes dppb, HPIC e fenantrolina (fen) e do complexo [Ru (pie) (dppb) (fen) ]PF ₆ .

Os ligantes e o complexo foram dissolvidos em DMSO para obtenção de uma solução estoque na concentração de 10.000 μς/πΛ. As soluções posteriores foram preparadas pela adição ao meio liquido 7H9. A suspensão de M. tuberculosis ATCC 27294 foi incubada juntamente com as diluições dos ligantes, em placas com 96 poços a 37°C por 7 dias. A sensibilidade e/ou resistência dos micro-organismos foi determinada pelo crescimento bacteriano indicado pela mudança de cor do corante resazurina, de azul (inibição) para rosa (multiplicação) . A interpretação final dos resultados foi obtida a partir da fluorescência emitida e quantificada por um microfluorimetro SpectraFluor Plus (TECAN ) , onde foram utilizados filtros de excitação e de emissão nos comprimentos de onda de 530 e 590 nm, respectivamente. Os resultados da atividade antimicobacteriana e da toxicidade celular são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4: Atividade do complexo [Ru (pie) (dppb) (fen) ]PF ₆ e dos ligantes dppb, HPIC e fen frente ao M. tuberculosis H37Rv e aos macrófagos J774, expressos em ug/mL e uM.

Os resultados mostram que o ligante livre fen apresentou alta atividade contra o bacilo bem como toxicidade celular elevada. Os outros ligantes livres não apresentaram atividade contra o bacilo da Tuberculose. A complexação do metal com o ([Ru (pie) (dppb) (fen)]PF ₆ ) aumentou a atividade frente ao bacilo (0,49 g/mL) e reduziu a citotoxicidade aos macrófagos (IC ₅₀ de 11,70 e IS de 23,90) . O valor de 0,49 μg/mL é melhor ou comparável ao das drogas de primeira e segunda linha utilizadas no tratamento da tuberculose, como a ciprofloxacino (CIM = 2 μg/mL) , ácido p-aminosalicilico (CIM = 0,50-2 μg/mL) , Etionamida (CIM de 0,63-1,25 μg/mL) , cicloserina (CIM de 12,50-50 ug/mL) , gentamicina (CIM de 2-4 μg/mL) , Etambutol (CIM de 0,94-1,88 μg/mL) , kanamicina (CIM de 1,25-5 μg/mL) , tobramicina (CIM de 4-8 μg/mL) , claritromicina (CIM de 8-16 μg/mL) e tiacetazona (CIM de 0,13-2 μg/mL) e a Rifampicina (0,5 μg/mL) (WHO, 2007) .

5) Determinação da atividade contra o bacilo da tuberculose (M. tuberculosis) e da toxicidade celular dos ligantes HPIC, dppe e do complexo eis- [Ru(pic) (dppe) ₂ ]PF ₆ .

O ligante e o complexo foram dissolvidos em DMSO para obtenção de uma solução estoque na concentração de 10.000 μg/mL. As soluções posteriores foram preparadas pela adição no meio liquido 7H9. A suspensão de M. tuberculosis ATCC 27294 foi incubada juntamente com as diluições dos ligantes e do complexo, em placas com 96 poços a 37°C por 7 dias. A sensibilidade e/ou resistência dos micro-organismos ao referido composto foi determinada pelo crescimento bacteriano indicado pela mudança de cor do corante resazurina, de azul (inibição da multiplicação bacteriana) para rosa (multiplicação) . A interpretação final dos resultados foi obtida a partir da medida da fluorescência emitida em um microfluorimetro SpectraFluor Plus (TECAN ) , com filtros de excitação e de emissão respectivamente de 530 e 590 nm. Os resultados da atividade antimicobacteriana e da toxicidade celular são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5: Atividade do complexo eis- [Ru (pie) (dppe) ₂ ]PFe dos ligantes HPIC e dppe frente ao M. tuberculosis H37Rv aos macrófagos J774, expressos em ug/mL e uM.

Os resultados mostram que o ligante livre dppe (CIM de 6,25 μg/mL) foi ativo contra o bacilo da tuberculose e o ligante HPIC (CIM > 50 μg/mL) foi pouco ativo. Já o complexo eis- [Ru (pie) (dppe) ₂ ]PF6 foi muito mais ativo, com uma CIM de 0,63 μg/mL e pouco tóxico (IC ₅ o 19,50 e IS de 31) para as células de mamífero. A complexação do metal ao ligante melhorou a atividade antimicobacteriana . O valor de 0, 63 pg/mL é comparável aos das drogas de primeira linha utilizadas no tratamento da tuberculose, como a Etionamida (2,50 μg/mL) , Pirazinamida ( 50-100μg/mL) e a Rifampicina (0,5 μg/mL) (WHO, 2007).

Ficará claro aos versados na técnica que variações não somente nos componentes, mas também em suas quantidades no processo podem ser feitas, sem com isso fugir do conceito inventivo e escopo da invenção. Assim, pretende-se que a presente invenção cubra as modificações e variações dessa invenção, contanto que elas se encontrem no escopo das reivindicações apensas e seus equivalentes.