BERMUDO REDONDO, Mª, Carmen (Avinguda del Països Catalans 26, Tarragona, E-43007, ES)
KATAKIS, Ioannis (Avinguda del Països Catalans 26, Tarragona, E-43007, ES)
ICREA INSTITUCIO CATALANA DE RECERCA I ESTUDIS AVANÇATS (Passeig Lluis Companys nº 23, Barcelona, E-08010, ES)
O'SULLIVAN, Ciara, Kathleen (Avinguda del Països Catalans 26, Barcelona, E-43007, ES)
BERMUDO REDONDO, Mª, Carmen (Avinguda del Països Catalans 26, Tarragona, E-43007, ES)
KATAKIS, Ioannis (Avinguda del Països Catalans 26, Tarragona, E-43007, ES)
| REIVINDICACIONES 1. Composición que consiste en un agente reductor para Ia reducción irreversible de puentes de disulfuro y un disolvente con alto punto de ebullición y/o alta constante dieléctrica, en un tampón con un pH entre 4 y 9. 2. Composición según Ia reivindicación 1 , en Ia que el agente reductor es un agente reductor no tóxico con una concentración superior a 0,1 mM. 3. Composición según Ia reivindicación 2, en Ia que el agente reductor es Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). 4. Composición según Ia reivindicación 1 , en Ia que el disolvente se selecciona de entre DMF, DMSO o glicerol, con una concentración comprendida entre el 30-70% v/v. 5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que consiste en TCEP, como agente reductor, un disolvente seleccionado de entre glicerol, DMSO o DMF, en tampón HEPES o PBS, con un pH entre 4 y 9. 6. Procedimiento para Ia extracción simultánea de gliadinas y gluteninas, en muestras de alimento, procesados o no procesados por calor, que comprende extraer el contenido en gliadinas y gluteninas en presencia de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5. 7. Procedimiento según Ia reivindicación 6, que comprende: a) mezclar Ia muestra de alimento con una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, y b) incubar Ia mezcla resultante a una temperatura superior a 50QC, durante un periodo de tiempo superior a 2 minutos. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, que comprende repetir este procedimiento en un intervalo de 2 a 10 veces. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que, antes de Ia extracción, se lleva a cabo una etapa de desengrasado. 10. Procedimiento según Ia reivindicación 9, en el que Ia etapa de desengrasado se lleva a cabo usando acetona. 1 1 . Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que, tras Ia extracción, se lleva a cabo una etapa de cuantificación de las gliadinas y gluteninas extraídas usando ELISA. 12. Kit que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 13. Kit según Ia reivindicación 12, que comprende además los reactivos necesarios para realizar un ELISA para cuantificar el contenido en gliadinas y gluteninas de ambas muestras de alimento, procesado por calor y no procesado por calor. |
GLUTEN EN CELIAQUÍA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere de forma general al análisis de alimentos, procesados y no procesados por calor, para determinar su contenido en gluten (gliadinas y gluteninas), y más específicamente a un procedimiento para extraer el gluten (gliadinas y gluteninas) de productos alimenticios, compatible con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), que permite detectar el gluten hidrolizado y no hidrolizado (gliadinas y gluteninas).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La celiaquía es una enfermedad inflamatoria del intestino delgado superior y resulta de Ia ingestión de gluten en individuos genéticamente susceptibles, siendo Ia única enteropatía inducida por nutrientes que dura toda Ia vida.
La celiaquía se desencadena en individuos susceptibles por Ia ingestión de prolaminas de gluten de trigo, cebada, centeno y posiblemente avena, Io que provoca cambios histológicos en Ia mucosa del intestino delgado, conduciendo a un síndrome de intolerancia [1 ]. Se conoce desde 1953 que Ia afección se agrava cuando los pacientes comen alimentos que contienen harina de trigo y que ulteriormente también estaban implicados el centeno y Ia cebada, un cruce artificial entre trigo y centeno, denominado triticale y, posiblemente, Ia avena. El único tratamiento para Ia celiaquía es una dieta estricta sin gluten. Cuanto menos sigan los individuos esta dieta, mayor es Ia posibilidad de desarrollar malnutrición y otras complicaciones. Sin embargo, todos los problemas revierten cuando se establece una dieta estricta sin gluten [2].
El gluten es el contenido en proteínas del trigo, centeno, avena, cebada y maíz, y puede dividirse en glutenina y gliadina (fracción soluble en alcohol). Las gluteninas son insolubles en agua o alcohol pero pueden volverse solubles una vez que se reducen los puentes disulfuro intercatenarios. Pueden dividirse adicionalmente en fracciones de alto peso molecular (HMW) y bajo peso molecular (LMW) y Ia gliadina puede subdividirse en fracciones α, γ y ω, en base a sus secuencias de aminoácidos N-terminales. Las proteínas correspondientes en centeno, cebada y avena se conocen como secalinas, hordeínas y aveninas, respectivamente.
Los pacientes celíacos presentan un amplio rango de sensibilidad a Ia ingestión de gluten, con manifestaciones clínicas a cantidades mínimas de gliadina observadas [3]. Por consiguiente, para certificar productos sin gluten, es obligatorio el uso de ensayos altamente sensibles. La Unión Europea, Ia Organización Mundial de Ia Salud y el Codex Alimentarius exigen una medición fiable de Ia prolamina del trigo, Ia gliadina (así como de las prolaminas de otros cereales), más que de todas las proteínas derivadas del trigo, que incluyen albúminas, globulinas y proteínas de los granulos de almidón [4]. Un problema importante en Ia producción de materias primas "sin gluten", y en Ia producción de alimento sin gluten, es Ia contaminación durante el procesado. Con bastante frecuencia, ingredientes y productos que comenzaron su vida libres de gluten, se contaminan y se vuelven peligrosos para el consumo en personas celíacas. Los límites oficiales descritos en el Codex Draft Revised Standard (Norma revisada del borrador del código) (2000) son de 20 ppm para los productos alimenticios libres de gluten por naturaleza, 200 ppm para productos alimenticios que se han convertido en libres de gluten, productos alimenticios sólidos a base de materia seca y productos alimenticios líquidos partiendo de Ia base del producto original. El progreso en el desarrollo de un procedimiento fiable de análisis para determinar el gluten es difícil.
Los kits disponibles actualmente para Ia medición del gluten: son ensayos tipo sandwich indirectos que llevan mucho tiempo [5-8],
- no pueden detectar Ia gliadina de manera equivalente en los diversos cereales [5, 7],
- no son específicos para Ia gliadina tóxica en Ia celiaquía [8, 9], no detectan las formas hidrolizadas de gliadina [6, 10] y
- se destruyen por los agentes reductores empleados comúnmente en Ia extracción del gluten del alimento (que desnaturalizan anticuerpos y marcadores enzimáticos) [7, 10].
Por tanto, a Io largo de los últimos años no ha existido un procedimiento fiable para medir el contenido en gluten de artículos alimenticios.
En Ia actualidad, el gluten se mide mediante procedimientos dependientes de epítopos, tales como ELISA, que usan anticuerpos monoclonales o policlonales. Una técnica ELISA útil para cuantificar el contenido en gluten de productos alimenticios se describe en Bermudo et a/ (2005) (64). Tradicionalmente, se creía que Ia fracción de gliadina del gluten de trigo era Ia tóxica. Existía poca información concerniente a las gluteninas, debido a las dificultades en su separación y purificación. Pruebas recientes sugieren que ciertos péptidos de Ia glutenina y subunidades de las gluteninas recombinantes pueden estimular las células T del intestino delgado celíaco aisladas in vitro [17]. La consecuencia es que éstas son tóxicas in vivo. Sin embargo, los datos in vivo están restringidos en Ia actualidad a un artículo [18]. Este estudio mostraba un efecto tóxico in vivo en 4 de 4 pacientes celíacos expuestos a una mezcla de cuatro subunidades de glutenina de alto peso molecular (HMW). En Ia actualidad hay pocos datos disponibles concernientes a Ia toxicidad de las gluteninas de bajo peso molecular, sin embargo debe considerarse como posible que estas proteínas sean también tóxicas.
Las gliadinas se extraen fácilmente de productos alimenticios crudos usando etanol, pero esto da como resultado sólo una extracción conjunta de un pequeño porcentaje de gluteninas, y se requiere una extracción más intensa que implica el uso de agentes reductores para solubilizar las gluteninas. Esto se debe a que las gluteninas son polímeros que no se extraen fácilmente hasta que se rompen los puentes disulfuro intercatenarios. Además, estas condiciones se requieren también para Ia extracción de gliadinas y gluteninas de alimentos cocinados. Cuando se calientan las gliadinas, las moléculas de azufre presentes en las gliadinas alfa y gamma, pero no en las omega, forman puentes disulfuro, de modo que Ia mayoría de las gliadinas se convierten en polímeros con los mismos problemas de solubilidad que las gluteninas. De modo que los procedimientos rutinarios para Ia extracción de gluten de productos alimenticios procesados por calor se basan en el uso de alcoholes, tales como etanol y propanol mezclados con agentes reductores tales como mercaptoetanol, ditiotreitol, agentes disociantes tales como urea, dodecilsulfato de sodio, clorhidrato de guanidina y mezclas de estos. Las composiciones resultantes usadas para Ia extracción son tóxicas, inflamables, inestables y tienen un olor acre. Por tanto, a Ia luz del descubrimiento reciente de que las gluteninas HMW también agravan Ia celiaquía, es esencial tener un protocolo universal que pueda usarse para extraer gliadinas y gluteninas de alimentos crudos y procesados.
Se han llevado a cabo diversos protocolos de extracción para Ia extracción de gliadinas y gluteninas de productos alimenticios. Se ha usado comúnmente etanol, al 50-70% v/v [19-27] y propanol, al 50-70% v/v [24-33] para Ia extracción de gliadinas. También se ha usado cloruro de litio para Ia extracción de gliadinas [34], así como dimetilsulfóxido (DMSO) [27, 35, 36] y dimetilformamida [27, 37]. Siguiendo el protocolo de Osborne, que implica Ia extracción secuencial de las diferentes proteínas presentes en el gluten, se han extraído gluteninas con agentes reductores, tales como mercaptoetanol (al 1 -2% p/v) [27, 31 , 38] y ditiotreitol (al 0,1 - 2% p/v) [24, 25, 28, 30, 32, 33, 39-43], ácido acético (al 0,7% p/v) [31 , 33, 44] y agentes disociantes tales como urea (2-8 M) [27, 32, 37, 41], clorhidrato de guanidina (2-6 M) [45] y SDS (al 1 -2%) [45, 46]. Básicamente, los procedimientos de extracción usados eran los mismos, que implicaban agitación rápida con vórtex y un periodo de extracción (que oscila entre 15 minutos y 120 minutos), seguido de centrifugación (durante un periodo de 15 minutos a 60 minutos), normalmente a temperatura ambiente, aunque hay algunos informes en los que se eleva Ia temperatura hasta 60 Q C [28, 31 , 41 , 43]. En las extracciones se empleó un tampón, como Tris(hidroximetil)aminometano (Tris) (0,05 M-0, 08 M, pH 7,5-8,0), tampón borato (0,05 M, pH 8,5) o tampón fosfato de sodio (0,05 M), a pH 7,8. Diversos informes han detallado el uso de una mezcla de agentes reductores y agentes disociantes. En un ejemplo, se usó tampón Tris más un agente disociante (urea 8M, clorhidrato de guanidina 6M o SDS al 2% p/v) ajustado hasta pH 7,5 con ácido nítrico para Ia extracción de gluteninas [19]. Las gluteninas se redujeron entonces con 2-mercaptoetanol al 5% p/v o ditiotreitol al 0,1% p/v durante 2 horas a temperatura ambiente. En otro ejemplo, se usó propanol al 50% v/v para extraer gliadinas, seguido de una mezcla de propanol al 50% v/v, urea 2M y ditiotreitol al 1% p/v en tampón Tris (pH 7,5) - extrayendo en un formato gradual por medio de ciclos de 2 minutos de agitación con vórtex, 10-20 minutos de agitación magnética y 15 minutos de centrifugación [32]. También se extrajeron gluteninas usando una mezcla de mercaptoetanol (al 2% p/v) y urea (2-8M) en tampón borato (pH 8,5), llevándose a cabo Ia extracción durante 60 minutos a temperatura ambiente seguido de 20 minutos de centrifugación [38]. En un procedimiento alternativo, se empleó una mezcla de agentes reductores y disociantes, que comprende urea 9,2M con ditiotreitol al 1 ,5% p/v, y se solubilizaron granos en esta mezcla durante Ia noche y posteriormente se centrifugaron durante
2 horas [47].
Adicionalmente, Wieser eí a/ (1998) describieron un ensayo para evaluar Ia capacidad de extracción de proteínas de gluten en muestras de alimentos no procesados y procesados. Los autores de este artículo demuestran que para una extracción exhaustiva y completa de gliadinas de las muestras procesadas, es necesario usar un agente reductor y aumentar Ia temperatura. Usando estas disoluciones, también demostraron Ia extracción conjunta de gluteninas y gliadinas [50]. En otro artículo de los mismos autores, se describe una composición para Ia extracción de gluteninas, que usa DTT, urea y propanol al 50% v/v, en tampón Tris- HCI (pH 7,5) [51]. Nicolás et al describen un protocolo en el que extraen secuencialmente las diversas proteínas encontradas en el gluten y para Ia extracción de gluteninas usan una mezcla de un agente disociante (SDS), un agente reductor (mercaptoetanol) en tampón tetraborato, pH 8,5 [53]. Huebner et al describen una extracción secuencial de gliadinas (usando 2 extracciones con etanol al 70% v/v) seguido de gluteninas (extraídas usando una mezcla de DTT y urea, o DTT y una combinación de urea y clorhidrato de guanidina, en tampón PBS, pH 7,7
[54]. Mamone et al describen Ia detección de gliadinas y gluteninas extraídas de diferentes variedades de trigo usando cromatografía de líquidos y espectrometría de masas por electropulverización. Para ello, se extraen las gliadinas con etanol al 70% y se extraen las gluteninas en 3 etapas usando una disolución de Tris-HCI, DTT, urea y propanol al 50% v/v, pH 7,5. También incluyen un procedimiento de reducción al que se expone posteriormente Ia fracción de glutenina durante 2 horas a 37 Q C, en el que Ia mezcla de extracción consiste en clorhidrato de guanidina, EDTA, DTT en tampón Tris-HCI, pH 7,5 [55].
Una publicación reciente implica Ia extracción con mercaptoetanol al 2% p/v y clorhidrato de guanidina 2 M durante 40 minutos a 50 Q C, seguido de una agitación rápida con vórtex y 1 hora de incubación a temperatura ambiente, y, finalmente, centrifugación [48]. El contenido de esta publicación es el objetivo de Ia patente ES 2182698 [49]. Dicha invención describe una composición que incluye un agente reductor, (por ejemplo, mercaptoetanol, DTT), un agente disociante (por ejemplo, clorhidrato de guanidina, SDS), en un tampón (PBS, Tris), de pH entre 7 y 8. Esta composición es útil para Ia extracción de gluten a partir de alimentos procesados y no procesados. La muestra de alimento se incuba con esta composición durante un periodo de tiempo que varía entre 30 y 60 minutos, a una temperatura entre 37 Q C y 50 Q C. Entonces se enfría Ia disolución hasta temperatura ambiente y se incuba con etanol (al 50-70% v/v).
Sin embargo, el documento ES 2182698 todavía no resuelve el problema en su totalidad por los siguientes motivos:
Inconveniencia de uso: los agentes reductores, mercaptoetanol o DTT, reivindicados en el documento ES 2182698 son agentes tóxicos, nocivos y de olor acre, considerados no convenientes para su uso a diario por muchos usuarios. Las altas concentraciones en Ia invención reivindicada en el documento ES 2182698 afectan a Ia actividad de las enzimas marcadoras del ELISA y por tanto hacen imposible su uso en algunos tipos de ELISA, particularmente el uso de ensayos de competición para Ia detección de hidrolizados.
- Fiabilidad: parece que el procedimiento declarado en el documento ES 2182698 podría ser un patrón con el que comparar otros procedimientos; sin embargo no extrae de manera exhaustiva todo el gluten (gliadinas y gluteninas). - La detección de hidrolizados de gluten ha demostrado ser, en general, insatisfactoria debido principalmente al hecho de que los hidrolizados peptídicos pequeños se reconocen mediante captura pero no mediante anticuerpos de detección posteriores, debido al impedimento estérico, requiriendo por tanto el uso de un ensayo competitivo en el que el marcador enzimático entre en contacto directo con el tampón de extracción, necesitando por tanto el uso de un tampón de extracción compatible.
Por consiguiente, no existen procedimientos fiables para Ia medición y extracción conjunta de prolaminas tóxicas en Ia celiaquía (gliadinas y gluteninas) en ambas formas, hidrolizada y no hidrolizada, en ambos procesados y no procesados por calor.
Algunos documentos recientes detallan otros protocolos de extracción. Una patente reciente, WO2007/104825, se refiere a un procedimiento para Ia extracción de gluten de productos alimenticios procesados por calor, que usa una composición constituida por una mezcla de un agente reductor (mercaptoetanol, DTT y mezclas de estos), y un agente desnaturalizante (SDS, detergentes no iónicos tales como
Tween, y mezclas de estos), en un tampón de pH 7-8. El protocolo consiste en mezclar e incubar Ia muestra a una temperatura de 30-70 Q C, durante 10-60 minutos, enfriando hasta temperatura ambiente. Los fragmentos desnaturalizados y reducidos se disuelven en etanol (al 50-70% v/v), se centrifugan y el gluten extraído permanece en el sobrenadante [56]. Hurkman et al, extrajeron las diversas proteínas de Ia harina usando una mezcla de urea (2 M), glicerol (al 10% v/v), DTT
(65 mM) en tampón Tris-HCI, pH 8,0 [57]. Dupont et al comparan diferentes procedimientos para Ia extracción secuencial de gliadinas y gluteninas, empleando propanol al 50% v/v, para extraer las gliadinas, y propanol al 50% v/v mezclado con
DTT 25 mM para extraer las gluteninas. En ambos casos el tampón usado es Tris- HCI, pH 8 [58].
Además, para ciertas muestras de alimento, es necesario realizar una etapa de desengrasado antes de Ia extracción de gluten (gliadinas y gluteninas). Informes previos indican el uso de éter de petróleo [22] o butanol [21 ] como agentes desengrasantes, con los que se mezclan las muestras durante 15 minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos.
Los agentes reductores usando en los procedimientos de extracción conocidos, tales como 2-mercaptoetanol y ditiotreitol, son agentes reductores que contienen grupos sulfhidrilo que tienden a oxidarse y perder rápidamente su potencia y por tanto no son adecuados para el almacenamiento a largo plazo.
Además presentan otras desventajas como Ia baja capacidad de reducción a pH alto y bajo, así como su toxicidad y mal olor [60].
La Tris(2-carboxietil)fosfina, TCEP, es un reductor identificado recientemente que se ha observado que proporciona una reducción altamente estable y eficaz de tioles de proteínas [59]. Una publicación reciente ha dado una idea general de Ia posibilidad de usar Ia TCEP soluble en agua como una alternativa atractiva a DTT y 2-ME [61]. Se ha demostrado que Ia TCEP es un mejor reductor que el DTT en medios neutros, ácidos y alcalinos [62]. La TCEP ha mostrado ser también un agente protector mucho más seguro para los compuestos de tiol en presencia de iones metálicos que el DTT y adicionalmente actúa como reductor y agente alquilante, eliminando por tanto Ia necesidad de agentes alquilantes tales como vinilpiridina.
Los alcoholes usados rutinariamente para Ia extracción de gliadinas, tales como etanol, tienen puntos de ebullición bajos, limitando por tanto Ia temperatura que puede aplicarse durante Ia extracción.
A Ia luz de los inconvenientes derivados de los procedimientos de extracción de gluten actuales, los autores de Ia presente invención han llevado a cabo un estudio de investigación a fondo para encontrar un procedimiento fiable para Ia extracción simultánea de gliadinas y gluteninas en alimentos procesados y no procesados.
Como resultado de dichos estudios, los autores han descubierto sorprendentemente que el uso de una composición constituida por un disolvente con alto punto de ebullición (superior a 100 Q C) y/o alta constante dieléctrica, en comparación con otros disolventes, mezclada con un agente que puede proporcionar Ia reducción irreversible de grupos disulfuro, en tampón a pH 4-9, llevándose a cabo Ia extracción a más de 50 Q C durante una duración de más de 2 minutos, facilita Ia disolución del gluten (gliadinas y gluteninas), dejando que se determine cuantitativamente el contenido en gluten (gliadinas y gluteninas) en bebidas y alimentos procesados por calor y no procesados por calor. No se requiere el uso de un agente disociante. En base a estos avances, Ia presente invención es un procedimiento mucho más simplificado para Ia extracción simultánea de gliadinas y gluteninas a partir de alimentos crudos y procesados. La invención se basa en el uso de disolventes de altos puntos de ebullición y/o altas constantes dieléctricas, Io que facilita Ia aplicación de temperaturas elevadas durante el procedimiento de extracción, eliminando Ia necesidad del uso de un agente disociante.
Las características de Ia composición de Ia invención permiten llevar a cabo un procedimiento de extracción de gliadinas y gluteninas compatible con ELISA, Io que permite Ia extracción simultánea rápida y fiable del gluten (gliadinas y gluteninas) a partir de muestras de alimento no procesado y procesado por calor, y Ia detección de dicho gluten (gliadinas y gluteninas) en ambas formas, no hidrolizada e hidrolizada.
La composición de Ia invención para Ia extracción simultánea de gluten (gliadina y glutenina) de productos alimenticios no procesados y procesados por calor, presenta múltiples ventajas en comparación con aquellas composiciones usadas en el estado de Ia técnica. Así, esta composición no tiene mal olor y es respetuosa con el medio ambiente, a diferencia de los olores acres de los agentes reductores y disociantes usados en los procedimientos rutinarios.
Adicionalmente, Ia composición para Ia extracción de gluten (gliadina y glutenina) de ambos productos alimenticios, no procesados y procesados por calor, presenta una mayor estabilidad en almacenamiento, en comparación con cualquiera de las composiciones usadas rutinariamente a base de etanol o propanol, con cualquiera de los agentes reductores mercaptoetanol, ditiotreitol, y/o agentes disociantes urea, clorhidrato de guanidina, dodecilsulfato de sodio y mezclas de agentes disociantes y reductores con diferentes alcoholes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Resumen de las variables estudiadas para Ia dilucidación del protocolo de extracción óptimo. C: Composición a estudiar: 1.25 mi de disolvente al x% v/v en x mM de tampón x, pH x con x% p/v de agente reductor x.
Figura 2. Extracción de prolaminas en presencia de diferentes disolventes (al 60% v/v): extracción secuencial de gliadina (a) y glutenina (b), y extracción conjunta de gliadinas y gluteninas (c), las dos últimas en presencia de TCEP al 1% p/v. Las barras de error representan Ia DER de 6 extracciones llevadas a cabo en paralelo. Figura 3. Electroforesis en gel de gliadinas y gluteninas extraídas usando diferentes disolventes al 60% v/v a) etanol y glicerol; b) propanol, DMSO, DMF, en presencia de TCEP al 1% p/v. Se llevaron a cabo cuatro extracciones tal como se muestra en los electroferogramas en gel.
Figura 4. Extracción conjunta frente a extracción secuencial de proteínas de gluten.
Figura 5. Efecto de Ia temperatura sobre Ia capacidad de extracción de las proteínas de gluten.
Figura 6. Extracción conjunta de proteínas de gluten en presencia de agentes reductores (TCEP, DTT) en glicerol al 60% v/v. (M: muestra) Figura 7. Uso de agentes disociantes, (a) Ensayo que compara clorhidrato de guanidina o urea (1 , 3 y 5 M) con glicerol al 60% con TCEP al 0,1 % p/v en HEPES, pH 7,4 con glicerol al 60% con TCEP al 0,1% p/v en HEPES, pH 7,4 (b) Visualización del resultado en gel de electroforesis.
Figura 8 (a) Electroforesis de diferentes agentes desengrasantes usados para someter a prueba su efecto sobre Ia extracción de las proteínas de gluten, (b)
Extracción y detección de Bradford de proteína en harina sin desengrasado (No D), con desengrasado añadiendo inmediatamente Ia disolución de extracción tras Ia etapa de extracción con desengrasado sin secar Ia muestra (D+DS ext); sin desengrasado tras 24 horas (No D (24)); y desengrasado añadiendo disolución de extracción 24 horas más tarde, es decir, secando Ia muestra durante 24 h (D+Ds ext (24 h)).
Figura 9. Estudios de estabilidad de una disolución de extracción que incluye DTT (barra negra), TCEP (gris) o mercaptoetanol (blanca). 300 días de almacenamiento a temperatura ambiente (TA), 4 Q C y 37 Q C. Figura 10. Compatibilidad de Ia composición de Ia invención con a) ensayos tipo sandwich y b) ensayos ELISA competitivos usando un anticuerpo frente al supuesto epítopo inmunodominante. Los resultados normalizados se presentan con B/Bo representando el valor de absorbancia obtenido a concentraciones específicas normalizado mediante Ia absorbancia obtenida a concentración cero. Figura 11. Análisis de electroforesis en gel de gluten extraído a temperatura ambiente usando TCEP al 0,1% p/v en glicerol al 60% v/v con tampón HEPES 50 mM, pH 7 para (a) muestras no procesadas por calor (harina de trigo que contiene gluten cruda) y (b) muestras procesadas por calor ("base de pizza").
Figura 12. Gluten extraído en cada extracción a partir de muestras no procesadas por calor ("harina") y muestras procesadas por calor ("base de pizza"), llevándose a cabo Ia extracción a temperatura ambiente (i) o a 85 Q C (ii), con Ia cantidad extraída observada visualmente usando electroforesis (a) y representada por medio de cantidades absolutas (b).
Figura 13. Comparación de Ia extracción de proteínas de gluten usando (A) etanol al 60%, mercaptoetanol 250 mM, clorhidrato de guanidina 2 M, llevándose a cabo Ia extracción a temperatura ambiente; (B) etanol al 60%, mercaptoetanol 250 mM, clorhidrato de guanidina 2 M, llevándose a cabo Ia extracción a 60 Q C; (C) protocolo inventado (Pl), extracción 1 (D) protocolo inventado (Pl), extracción 2. a) gel de electroforesis y b) análisis de Bradford. OBJETIVO DE LA INVENCIÓN
Un objetivo principal de Ia invención se refiere a una composición constituida por un agente para Ia reducción irreversible de agentes de disulfuro y un disolvente con alto punto de ebullición y/o altas constantes dieléctricas en un tampón con un pH entre 4 y 9. Otro objetivo de Ia invención es el procedimiento para Ia extracción simultánea de gliadinas y gluteninas, de muestras de alimento, procesado o no procesado por calor, de manera que sea compatible con ELISA, que comprende extraer el contenido en gliadinas y gluteninas en presencia de Ia composición definida en Ia presente invención, siendo Ia invención altamente reproducible, permitiendo una determinación cuantitativa del gluten extraído.
Finalmente, un tercer objetivo de Ia invención se refiere a un kit para cuantificar el contenido en gliadinas y gluteninas de muestras de alimento, procesados por calor y no procesados por calor, que comprende dicha composición.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una composición ("composición de Ia invención"), que consiste en un agente para Ia reducción irreversible de puentes disulfuro y un disolvente con alto punto de ebullición y/o alta constante dieléctrica, en una disolución tampón con un pH comprendido entre 4 y 9, tal como HEPES, Tris-HCI, PBS, etc.
La composición de Ia invención permite Ia extracción conjunta de las prolaminas tóxicas en Ia celiaquía (tanto gliadinas como gluteninas) de productos alimenticios no procesados y procesados por calor. El agente que proporciona Ia reducción irreversible de grupos disulfuro es un agente reductor no tóxico, que no contiene grupos sulfhidrilo y por tanto no tiende a oxidarse, tal como tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). La concentración de este agente reductor de grupos disulfuro que no contiene sulfhidrilo es ampliamente variable, requiriendo únicamente ser superior a 0,1 mM. En una realización particular, el disolvente usado en Ia composición se selecciona de entre DMF, DMSO o glicerol, con una concentración comprendida entre el 30-70% v/v.
En otra realización particular, el agente reductor empleado es TCEP, el disolvente con alto punto de ebullición es DMSO, glicerol o DMF, y el tampón es HEPES o PBS, con un pH entre 4 y 9.
La composición de Ia invención es compatible con ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas competitivos (ELISA), que pueden detectar ambas formas, no hidrolizadas e hidrolizadas, de gluten (tanto gliadinas como gluteninas) y no tiene ningún efecto adverso sobre Ia cuantificación ELISA (competitivo o tipo sandwich) del contenido total en gluten tóxico en Ia celiaquía de las muestras de alimento.
Otro aspecto principal de Ia invención se refiere a un procedimiento para Ia extracción simultánea, tanto de gliadinas como gluteninas, a partir de una muestra de alimento, procesado o no procesado por calor, denominado a partir de ahora " procedimiento de Ia invención", que comprende extraer el contenido en gluten
(gliadina y gluteninas) de Ia muestra, en presencia de Ia composición de Ia invención.
En una realización particular, el procedimiento comprende a) mezclar Ia muestra de alimento con Ia composición de Ia invención, y b) incubar Ia mezcla resultante a una temperatura superior a 50 Q C, durante un periodo de tiempo superior a 2 minutos.
Este procedimiento permite ahorrar un tiempo considerable respecto a los procedimientos previamente descritos y no presenta diferencias en Ia capacidad de extracción, por Io que es adecuado como procedimiento de extracción combinada. La muestra de alimento que va a analizarse se prepara mediante procedimientos rutinarios, cuando sea relevante. Se someten muestras de harina a un procedimiento de muestreo representativo para garantizar Ia homogeneidad. Las muestras de alimento procesado se trituran, usando una mano de mortero y un mortero antes de Ia molienda, y Ia muestra triturada homogéneamente se pesa entonces de manera precisa. Posteriormente se introduce Ia composición de Ia invención en un tubo eppendorf, se cierra Ia tapa del tubo y se agita con vórtex durante un periodo de tiempo superior a 10 segundos. Entonces se deja reposar el tubo durante un periodo de tiempo superior a 10 segundos, antes de calentarse a una temperatura superior a 50 Q C, durante un periodo superior a 2 minutos, antes de centrifugarse a una velocidad de un intervalo de al menos 3000 rpm, durante un periodo superior a
5 segundos. El sobrenadante, que contiene las gliadinas y gluteninas extraídas, se retira.
Una vez eliminado el sobrenadante, se vuelve a añadir opcionalmente Ia composición de Ia invención recién preparada y se repite el procedimiento descrito anteriormente. Este procedimiento puede repetirse de dos a diez veces, hasta que se consigue Ia extracción completa de gluten (gliadinas y gluteninas).
En una realización particular, el procedimiento de Ia invención comprende el uso, durante Ia etapa de extracción, de un disolvente con alto punto de ebullición seleccionado entre DMSO, que tiene un punto de ebullición de 189 Q C, glicerol, que tiene un punto de ebullición de 290 Q C, y DMF, que tiene un punto de ebullición de
153 Q C, permitiendo aplicar temperaturas elevadas (superiores a 50 Q C), facilitando y potenciando así Ia extracción del gluten (gliadinas y gluteninas).
En una realización particular, Ia extracción de gluten (gliadinas y gluteninas) se lleva a cabo con una disolución acuosa de DMSO, glicerol o DMF con TCEP, con una temperatura aplicada durante Ia extracción superior a 50 Q C, durante un periodo de tiempo superior a 2 minutos.
La concentración de disolvente en Ia disolución acuosa puede variar dentro de un amplio intervalo y en una realización particular Ia disolución acuosa (de DMSO, glicerol o DMF) puede variar entre el 50% v/v y el 70% v/v. La concentración de TCEP en Ia disolución acuosa puede variar dentro de un amplio intervalo y en una realización particular Ia concentración de TCEP es superior a 0,1 mM.
El procedimiento de extracción también es compatible con un procedimiento de desengrasado previo, antes de Ia etapa de extracción. En una realización particular, Ia muestra de alimento se desengrasa mezclando con acetona, se separa por Ia acetona (centrifugando o filtrando), dejando posteriormente que Ia acetona se evapore y usando inmediatamente esta muestra desengrasada para el procedimiento de extracción.
El procedimiento de Ia presente invención puede usarse para extraer las gliadinas y gluteninas contenidas en una muestra de alimento procesado o no procesado por calor, seguido de Ia cuantificación de estas prolaminas mediante
ELISA. Por tanto, en una realización particular del procedimiento de Ia invención, tras Ia extracción se lleva a cabo una etapa de cuantificación de las gliadinas y gluteninas extraídas usando ELISA (por ejemplo, técnica tipo sandwich o ELISA competitivo). En el procedimiento de Ia invención, el uso de glicerol, DMSO o DMF y
TCEP permite Ia aplicación de una temperatura elevada, Io que a su vez facilita Ia ruptura completa de los puentes disulfuro que se encuentran en las gliadinas procesadas por calor y gluteninas. En Ia primera extracción, se rompen los puentes disulfuro y aproximadamente el 85% de los fragmentos producidos se disuelven en Ia composición de Ia invención. En Ia segunda extracción y siguientes, los fragmentos restantes se disuelven en Ia composición de Ia invención. Sistemáticamente se observa que el 85% del gluten total se extrae en Ia primera extracción y el 15% restante en extracciones posteriores y se ha establecido una base de factor de correlación con respecto a esta observación de modo que sólo se requiere una extracción para Ia cuantificación de las gliadinas totales y tóxicas en Ia celiaquía.
Este procedimiento es adecuado para análisis de alimentos, particularmente para productos alimenticios concebidos para personas que padecen celiaquía y puede aplicarse a una extracción basada en un microsistema y una detección biosensorial posterior.
Finalmente, otro aspecto principal de Ia presente invención se refiere a un kit que comprende Ia composición de Ia invención y además todos aquellos reactivos necesarios para realizar un ELISA para cuantificar el contenido en gliadinas y gluteninas de muestras de alimento, procesado y no procesado por calor. El kit usa ensayos de ELISA competitivos o bien tipo sandwich, con anticuerpos desarrollados directamente frente a las gluteninas HMW y el epítopo inmunodominante putativo de gliadina.
EJEMPLOS
Se llevaron a cabo muchos experimentos previamente, dando como resultado el procedimiento de Ia invención. En los ejemplos 1 -4 se muestran diferentes realizaciones del procedimiento de Ia invención a muestras no tratadas por calor, tratadas por calor e hidrolizadas. En un trabajo de desarrollo inicial se cuantificó Ia proteína total extraída usando un ensayo de Bradford y se visualizó usando electroforesis en gel. Se muestra un resumen del esquema de extracción en
Ia figura 1.
Ensayo de Bradford: Usando el kit Coomasie Plus Bradford de Pierce, se añadieron 150 μl de extracto a 150 μl de reactivo Coomassie Plus en un pocilio de microplacas y se mezclaron bien antes de incubar brevemente y medir Ia absorbancia a 560 nm. Se estimaron las concentraciones de proteínas mediante referencia a Ia absorbancia obtenida para una serie de diluciones de proteína convencionales, que varían entre 50 Dg/ml y 0 Dg/ml (patrón de gliadina para gliadinas y gluteninas, patrón de BSA para albúminas y globulinas), que se sometieron a ensayo junto con las muestras desconocidas. Electroforesis en gel: Para Ia electroforesis se hicieron precipitar las muestras con Ia mitad del volumen de TCA al 30% p/v durante 1 h a 4 Q C. Tras centrifugación a 14000 rpm durante 10 minutos, se lavaron los residuos de muestra 3 veces con 200 Dl de acetona y se secaron a vacío (<2 h). Tras Ia reconstitución en 10-20 Dl de tampón de corrida SDS, se calentaron las muestras hasta 95 Q C durante 5-8 minutos. Se cargaron las muestras en geles desnaturalizantes de acrilamida (resolución al 12%, concentrados al 4% preparados en tampón Tris-SDS pH 8,8 y pH 6,8, respectivamente) preparadas en tampón Tris-SDS pH 6,5. Se hicieron pasar los geles en el mismo tampón Tris-SDS pH 8,3 en un equipo de electroforesis en agarosa Sub-cell GT de BioRad a temperatura ambiente (aplicando una constante de 100-120 V para el gel 10 V/cm). Se llevó a cabo una tinción mediante Ia inmersión de los geles en BioSafe Coomassie (BioRad). Se tomaron imágenes de los geles usando un analizador de imágenes GelDocTM EQ (BioRad).
En un primer experimento, los autores de Ia invención compararon los diferentes disolventes (al 60% v/v) para determinar Ia capacidad de extracción de las proteínas de gluten a temperatura ambiente (figura 2). La figura muestra los valores obtenidos para cada disolvente para Ia extracción secuencial de gliadina (a) y glutenina (b), y finalmente Ia extracción conjunta de gliadinas y gluteninas (c), las últimas dos en presencia de TCEP al 1 % p/v (las barras de error representan Ia desviación estándar relativa (DER) de 6 extracciones llevadas a cabo en paralelo).
Los resultados del experimento mostraron que el DMSO y DMF eran los disolventes óptimos para Ia extracción de gliadinas; mientras que el glicerol era el disolvente óptimo para Ia extracción de gluteninas, cuando cada una de las gliadinas y gluteninas se extrajeron secuencialmente. Cuando se extrajeron simultáneamente las prolaminas, cualquiera de DMSO, DMF o glicerol era óptimo, especialmente cuando se tiene en consideración su punto de ebullición, Io que permite una extracción significativamente potenciada, especialmente de gluteninas HMW.
Tabla 1. Efecto de diferentes disolventes en Ia extracción de proteínas de gluten (secuencial y simultánea)
Se visualizaron las gliadinas y gluteninas extraídas usando el 60% v/v de diversos disolventes en presencia de TCEP al 1% p/v, a temperatura ambiente en electroforesis en gel (figura 3), cuando puede visualizarse Ia capacidad de extracción del disolvente para que sea glicerol >DMF > DMSO > etanol > propanol.
En un segundo experimento, se comparó Ia extracción conjunta frente a Ia extracción secuencial de proteínas de gluten usando agua y NaCI 0,4 M en HNa 2 PO 4 0,067 M, para globulinas y albúminas, respectivamente. Se extrajeron las gliadinas con glicerol al 60% p/v y las gluteninas usando glicerol al 60% v/v en HEPES 50 mM pH 7,4 con TCEP al 0,1 % p/v en HEPES 50 mM pH 7,4. Se extrajo cada proteína pesando 125 mg de muestra, añadiendo 1 ,25 mi de disolución de extracción, mezclando en el termomezclador a 40 Q C durante 20 minutos a 1 .400 rpm y centrifugando durante 3 minutos a 12.000 rpm.
Tal como puede observarse en Ia figura 4, no se observó ninguna diferencia en Ia capacidad de extracción entre Ia extracción simultánea y Ia secuencial.
En otro experimento, se sometió a ensayo el efecto de Ia temperatura sobre Ia capacidad de extracción de las prolaminas (figura 5). Se mostró Ia necesidad de una temperatura elevada para Ia extracción de gluten a partir de muestras procesadas por calor, con una temperatura de 85 Q C, siendo óptimo usar glicerol como disolvente y TCEP como agente reductor.
En otro experimento, se analizó Ia extracción conjunta de proteínas de gluten en presencia de TCEP o DTT, en glicerol al 60% v/v. Se extrae Ia proteína pesando 125 mg de muestra, añadiendo 1 ,25 mi de Ia composición de Ia invención. Tras Ia extracción durante 7 minutos a 85 Q C, se centrifugó el sedimento durante 3 minutos a 12.000 rpm y se usó el sobrenadante para el análisis por electroforesis (figura 6). Este ensayo demostró las diferencias entre el uso de diferentes agentes reductores, y tal como puede observarse, Ia TCEP es un agente reductor más eficaz. Esto se debe al hecho de que el punto de ebullición del DTT es 125 Q C, del 2- ME es 157 Q C, considerablemente inferior al de Ia TCEP, que es de 330 Q C (por tanto, Ia TCEP puede retener más actividad a Ia temperatura de extracción aplicada de 85 9 C). En otro experimento, se sometió a ensayo el uso de agentes disociantes
(figura 7). Se desarrolló un ensayo que comparaba clorhidrato de guanidina o urea (1 , 3, 5 M) con glicerol al 60% con TCEP al 0,1 % p/v en HEPES, pH 7,4 con glicerol al 60% con TCEP al 0,1% p/v en HEPES, pH 7,4. Se llevaron a cabo las extracciones pesando 125 mg de muestra, añadiendo 1 ,25 mi de disolución de extracción, mezclando en el termomezclador a 40 Q C durante 20 minutos a 1400 rpm y centrifugando durante 3 minutos a 12,000 rpm (figura 7 (a)). Se visualizaron los resultados en un gel de electroforesis (figura 7 (b)).
Este ensayo demostró que en el procedimiento de Ia invención, Ia adición de agentes disociantes no da como resultado una extracción adicional de gluten a partir de productos alimenticios crudos o cocinados, ya que el uso de una temperatura elevada es suficiente para extraer de manera exhaustiva el gluten.
En otro experimento, se sometió a prueba el uso de agentes desengrasantes. Se llevó a cabo una electroforesis de diferentes agentes desengrasantes usada para someter a prueba su efecto sobre Ia extracción de las proteínas de gluten (figura 8(a)). Se pesaron 125 mg de Ia muestra y se añadieron a
1 ,25 mi de cada agente desengrasante. Tras agitar con vórtex durante 30 segundos, se dejó sedimentar Ia disolución durante 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó durante 15 minutos y se llevó a cabo Ia electroforesis de manera normal. Se desarrolló una extracción y detección de Bradford de las proteínas en harina después de Ia etapa de extracción con desengrasado sin secar
Ia muestra, secando Ia muestra durante 24 h (figura 8 (b)). Se llevó a cabo el procedimiento de extracción pesando Ia muestra (75 mg), añadiendo 0,75 mi de disolución de extracción, agitando con vórtex durante 30 segundos, mezclando en un termomezclador a 1 .400 rpm a 85 Q C y centrifugando durante 3 minutos a 12.000 rpm a temperatura ambiente. Se mostró que Ia acetona no extraía las gliadinas o gluteninas, y puede usarse por tanto como un agente desengrasante. Los resultados también mostraron que el desengrasado puede ir seguido directamente de extracción, sin necesidad de secar Ia muestra.
Además se llevaron a cabo estudios de estabilidad de Ia disolución de extracción usando DTT, mercaptoetanol o TCEP, y glicerol al 60% (v/v) en tampón, usando 125 mg de harina en 1 ,25 mi de disolución de extracción. Se almacenaron tres disoluciones de extracción a TA, 4 Q C y 37 Q C (figura 9). Estos estudios dan una idea general de Ia estabilidad en tiempo real a TA y 4 Q C y Ia estabilidad acelerada (a 37 Q C) del cóctel de extracción con DTT/2-ME o bien glicerol al 60% v/v, en tampón HEPES 50 mM, pH 7,4, y Ia TCEP es marcadamente más estable cuando se almacena a 4 Q C.
Finalmente, en ensayo ELISA desarrollado por los autores, basado en usar anticuerpos frente al epítopo inmunodominante putativo (figura 10) demostró que Ia disolución de extracción de Ia invención es extremadamente compatible con ELISA tanto tipo sandwich como competitivo. Los resultados mostrados en Ia figura 10 se normalizan relacionando Ia absorbancia a una concentración de gliadina dada, con Ia absorbancia obtenida a concentración cero en el caso del ensayo competitivo, o con Ia absorbancia obtenida a una concentración máxima (por ejemplo 1 Dg/ml) en el caso del ensayo tipo sandwich. En ambos ensayos, el tampón de extracción es completamente compatible a diluciones de 1 en 5 y superiores.
Ejemplo 1. Recuperación de gluten a partir de alimentos no tratados por calor
Se llevó a cabo este experimento para mostrar Ia eficacia del procedimiento de Ia invención en Ia extracción de gluten a partir de alimentos no tratados por calor.
Preparación de muestras dopadas
Se llevaron a cabo estudios con adiciones conocidas con muestras crudas para comprobar Ia eficacia de los protocolos de extracción desarrollados. A harina de maíz se realizaron adiciones conocidas de gliadina del grupo de trabajo de prolamina IRMM-480 en un intervalo de concentraciones desde 20 ppm hasta 800 ppm. Entonces se usó un ELISA para cuantificar Ia gliadina extraída usando gliadina IRMM-480 como patrón, ya que ésta había sido Ia gliadina que se había usado para realizar adiciones conocidas a las muestras. Los patrones usados variaron entre 25 ppm y 1 ,56 ppm y por tanto fue necesario diluir las muestras con adiciones conocidas para que estuvieran dentro de este intervalo. Las diluciones de muestra empleadas se muestran en Ia tabla 2:
Tabla 2. Diluciones de muestra
Procedimiento para Ia extracción simultánea de gluten a partir de alimentos no tratados por calor
Para llevar a cabo el procedimiento, se introdujeron 125 mg de muestra homogeneizada en un tubo eppendorf. Posteriormente, 1 ,25 mi de Ia composición del procedimiento, compuesta por TCEP al 0,1 % p/v en glicerol al 60% v/v con tampón HEPES 50 mM, pH 7,4 seguido de una agitación con vórtex rápida de 30 segundos a 2500 rpm (VELP Scientifica, Madrid, España). Entonces se cerraron los tubos y se sellaron con Parafilm que evitar cualquier pérdida debida a evaporación y se mezclaron en un termomezclador a 95 Q C durante 5 minutos (modelo Thermomixer Compact), antes de centrifugarse finalmente (Eppendorf modelo 5417R) a 12.000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. Por tanto, Ia extracción pudo completarse en menos de 10 minutos.
Entonces se transfirió el sobrenadante a tubos eppendorf de polisulfona limpios para el análisis usando ELISA.
Se preparó tampón HEPES, pH 7,4 añadiendo 4 g de NaOH de Panreac (VidraFoc, Tarragona, España) a 1 ,19 g de HEPES (Sigma, Barcelona, España), en 100 mi de agua Millipore.
Se prepara Ia composición compuesta por TCEP al 0,1 % p/v y tampón HEPES 50 mM, por ejemplo, pesando 286,65 mg de TCEP. HCI en 10 mi de tampón HEPES 50 mM y añadiendo entonces esto a una disolución preparada previamente de 60 mi de glicerol con 30 mi de tampón HEPES 50 mM, hasta un volumen final de 100 mi, con TCEP al 0,01 % p/v en glicerol al 60% v/v en HEPES 50 mM, pH 7,4.
Resultados
Se requirieron dos etapas de extracción para Ia extracción completa de gluten a partir de productos alimenticios crudos y se llevó a cabo un estudio para observar si había un factor de correlación entre Ia cantidad de proteína extraída en Ia primera extracción y Ia proteína extraíble total. En un estudio de 100 muestras, se observó que Ia proteína extraída en Ia primera extracción era el 86,5% de Ia proteína extraíble total, con un % de desviación estándar relativa (DER) de 1 ,28 para n=100, Io que sugiere que podía emplearse una extracción y usarse un factor de correlación para extrapolar Ia proteína total presente en Ia muestra. Es por tanto recomendable llevar a cabo dos extracciones o usar el factor de correlación de 1 ,16 (es decir multiplicar el valor de Ia cantidad de proteína extraída en el primer extracto por 1 ,16) para extrapolar Ia proteína extraída en Ia primera extracción con respecto a Ia cantidad total de proteína extraíble.
La tabla 3 muestra el porcentaje de recuperación conseguido con las muestras de harina de maíz a las que se habían realizado adiciones conocidas de PWG y que oscila de manera aceptable entre el 99% y el 108% (particularmente si se permite un error de ±15% asociado comúnmente con Ia detección mediante ELISA).
Tabla 3 Porcentaje de recuperación de muestras crudas de harina de maíz con adiciones conocidas
Ejemplo 2. Recuperación de gluten a partir de alimentos tratados por calor
Se llevó a cabo este experimento para demostrar que en ausencia de un agente disociante, se requiere un aumento en Ia temperatura por encima de los
80 Q C, necesitando por tanto el uso de un disolvente con altas temperatura de ebullición. Se llevó a cabo Ia demostración usando muestras procesadas por calor preparadas (a) a partir de harina que contiene gluten y (b) harina de maíz.
Materiales
- Muestras procesadas por calor a partir de harina que contiene gluten Se prepararon muestras procesadas por calor a partir de harina que contiene gluten añadiendo 5 mi de agua destilada a 10 mg de muestra cruda, es decir harina de trigo. Se mezcló a mano Ia disolución hasta que se obtuvo una masa flexible. Se estiró Ia masa usando un rodillo manual hasta un espesor de 2 mm y se cocinó en un horno precalentado durante 10 minutos a 180 Q C. Tras el enfriamiento, se molieron las muestras cocinadas con una batidora durante 3 minutos hasta que se obtuvo un polvo homogéneo de muestra procesada por calor.
- Muestras procesadas por calor a partir de harina de maíz sin gluten a Ia que se realizaron dopajes con gliadina IRMM-480 (IRMM = Institute for Reference Materials and Measurements)
Se realizaron adiciones conocidas de diferentes cantidades de gliadina IRMM-480 a harina de maíz blanco precocinado (P.A.N. Venezuela), que se esperaba que estuviera sin gluten. Para 0, 20, 50, 100, 200, 400, 800 ppm de gliadina en harina, se añadieron respectivamente, 0, 1 , 2,5, 5, 10, 20 y 40 mg de gliadina PWG IRMM-480 a harina de maíz hasta que se obtuvo una cantidad final de 50 g. Brevemente, se añadió Ia harina, muy gradualmente, a Ia gliadina pesada y se mezcló meticulosamente durante 10 minutos con una mano de mortero y un mortero con el fin de obtener Ia mezcla más homogénea posible. Una vez que se obtuvieron muestras con adiciones conocidas representativas, se añadieron 10 mg de muestra a 5 mi de agua destilada, y se mezclaron a mano hasta que se obtuvo una masa flexible. Entonces se estiró Ia masa usando un rodillo de mano hasta un espesor de aproximadamente 2 mm, y entonces se cocinó a 180 Q C durante 10 minutos. Cuando las muestras procesadas por calor estaban frías, se molieron durante 3 minutos usando una mezcladora comercial Moulinex, hasta que se obtuvo un polvo homogéneo de Ia muestra procesada por calor. Procedimiento de Ia invención
Para llevar a cabo el procedimiento, se introdujeron 125 mg de muestra homogeneizada en un tubo eppendorf. Posteriormente, 1 ,25 mi de Ia composición del procedimiento, compuesta por TCEP al 0,1 % p/v en glicerol al 60% v/v con tampón HEPES 50 mM, pH 7,4 seguido de una agitación con vórtex rápida de 30 segundos a 2500 rpm (VELP Scientifica, Madrid, España). Entonces se cerraron los tubos y se sellaron con Parafilm para evitar cualquier pérdida debido a evaporación y se mezclaron en un termomezclador a 95 Q C durante 5 minutos (modelo
Thermomixer Compact), antes de centrifugarse finalmente (Eppendorf modelo 5417R) a 12.000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. Por tanto, Ia extracción pudo completarse en menos de 10 minutos.
Entonces se transfirió el sobrenadante a tubos eppendorf de polisulfona limpios para su análisis usando ELISA.
Se preparó tampón HEPES, pH 7,4 añadiendo 4 g de NaOH de Panreac (VidraFoc, Tarragona, España) a 1 ,19 g de HEPES (Sigma, Barcelona, España), en
100 mi de agua Millipore.
Se prepara Ia composición compuesta por TCEP al 0,1 % p/v y tampón
HEPES 50 mM, por ejemplo, pesando 286,65 mg de TCEP. HCI en 10 mi de tampón
HEPES 50 mM, y añadiendo entonces esto a una disolución preparada previamente de 60 mi de glicerol con 30 mi de tampón HEPES 50 mM, hasta un volumen final de
100 mi, con TCEP al 0,01 % p/v en glicerol al 60% v/v en HEPES 50 mM, pH 7,4.
Resultados
- Efecto de Ia temperatura sobre Ia extracción de muestras no procesadas por calor y procesadas por calor
Se llevó a cabo un análisis de electroforesis en gel del gluten extraído a temperatura ambiente usando TCEP al 0,1% p/v en glicerol al 60% v/v con tampón HEPES 50 mM, pH 7 para muestras no procesadas por calor (harina de trigo cruda que contienen gluten) y muestras procesadas por calor (Ia misma harina de trigo que contiene gluten preparada como base de pizza y cocinada a 180 Q C durante 10 minutos).
La figura 1 1 muestra el requisito para aumentar Ia temperatura de extracción para extraer eficazmente a partir de muestras procesadas por calor. A temperatura ambiente, se extrajo el gluten en dos extracciones a partir de harina que contiene gluten no procesada por calor. Sin embargo, para las muestras procesadas por calor ("base de pizza"), tras 13 extracciones el gluten no se había extraído completamente, liberándose sólo una pequeña fracción del gluten para cada extracción.
En Ia figura 12, se representa el gluten extraído en cada extracción a partir de muestras no procesadas por calor ("harina") y procesadas por calor ("base de pizza"), llevándose a cabo Ia extracción a temperatura ambiente (a) o a 85 Q C (b). Se consiguió Ia extracción completa a 85 Q C con sólo dos extracciones.
Se mostró que aumentando Ia temperatura de extracción desde temperatura ambiente hasta 85 Q C, el gluten total puede extraerse de ambas muestras de alimento, crudo y procesado por calor, en las primeras dos extracciones.
- Número de extracciones y factor de correlación
Se requieren dos extracciones para Ia extracción completa del gluten a partir de productos alimenticios cocinados, tal como en el caso de los productos alimenticios crudos, extrayéndose más gluteninas HMW en Ia segunda extracción. De nuevo, tal como en el caso de los productos alimenticios crudos, hay un factor de correlación entre Ia cantidad de proteína extraída en Ia primera extracción con respecto a Ia proteína extraíble total, que es 58,1 , n=400, % de DER= 7,87. Por tanto, para las muestras cocinadas, el factor de correlación requiere multiplicar el valor de Ia cantidad extraída en el primer extracto por 1 ,72.
- Recuperación de gluten a partir de harina de maíz procesada por calor a Ia que se Ie ha añadido de manera conocida gluten
La tabla 4 muestra el porcentaje de recuperación conseguido con las muestras de harina de maíz a las que se Ie ha añadido de manera conocida PWG, y que oscila de manera aceptable entre el 96% y el 1 1 1 % (particularmente si se permite un error del ±15% asociado comúnmente con Ia detección de ELISA).
Tabla 4 Porcentaje de recuperación de muestras de harina de maíz con adiciones conocidas procesadas por calor
Ejemplo 3. Comparación del procedimiento de Ia invención con el protocolo de extracción de Ia patente ES2182698 El objetivo de este ejemplo es comparar Ia eficacia de Ia extracción del protocolo y Ia composición inventados (protocolo de extracción A) con el procedimiento y el protocolo descritos en Ia solicitud de patente ES2182698 (protocolo de extracción B).
Materiales
Preparación de muestras con adiciones conocidas (sin gluten): Se prepararon muestras con adiciones conocidas mezclando diferentes concentraciones de gliadina PWG diluida en etanol al 60% v/v con harina de trigo Maizena. Para 0, 20, 25, 50, 100, 150 ppm de gliadina en harina, se diluyeron 0, 1 , 1 ,25, 2,5, 5, 7,5 mg de gliadina PWG en 25 mi de etanol 60% v/v en HEPES 50 mM pH 7,4 y se mezclaron con Ia harina de maíz alcanzando un total de 50 g de sólidos en los 25 mi. Tras una homogeneización meticulosa, se secaron las muestras a temperatura ambiente. Se extrajeron las muestras con adiciones conocidas usando el protocolo de extracción A y B, y se analizaron usando el kit Ingezim Gluten ELISA.
Preparación de muestras procesadas por calor a partir de harina de trigo que contiene gluten: Se prepararon muestras procesadas por calor a partir de harina que contiene gluten añadiendo 5 mi de agua destilada a 10 mg de muestra cruda, es decir harina de trigo. Se mezcló a mano Ia disolución hasta que se obtuvo una masa flexible. Se estiró Ia masa usando un rodillo manual hasta un espesor de
2 mm y se cocinó en un horno precalentado durante 10 minutos a 180 Q C. Tras el enfriamiento, se molieron las muestras cocinadas con una batidora durante 3 minutos hasta que se obtuvo un polvo homogéneo de muestras procesada por calor.
Procedimiento
Protocolo de extracción A: Se introdujeron 125 mg de muestra homogeneizada en un tubo eppendorf. Posteriormente, 1 ,25 mi de Ia composición del procedimiento, compuesta por TCEP al 0,1 % p/v en glicerol al 60% v/v con tampón HEPES 50 mM, pH 7,4 seguido de una agitación con vórtex rápida de 30 segundos a 2500 rpm (VELP Scientifica, Madrid, España). Entonces se cerraron y se sellaron los tubos con Parafilm para evitar cualquier pérdida debido a evaporación y se mezclaron en un termomezclador a 95 Q C durante 5 minutos (modelo Thermomixer Compact), antes de centrifugarse finalmente (Eppendorf modelo 5417R) a 12.000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. Por tanto, pudo completarse Ia extracción en menos de 10 minutos.
El protocolo de extracción B consistía en pesar 250 mg de muestra y añadir 2,5 mi de 2-mercaptoetanol 250 mM y clorhidrato de guanidina 2 M en etanol al 80% v/v y agitar con vórtex durante 5 segundos. Tras mezclar durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 7,5 mi de etanol al 80% v/v en H 2 O desionizada, se mezclaron durante 1 hora más y se centrifugaron durante 10 minutos a 12000 rpm.
Para ambos protocolos de extracción, se transfirió entonces el sobrenadante a tubos eppendorf de polisulfona limpios para su análisis usando ELISA.
Se preparó tampón HEPES, pH 7,4 añadiendo 4 g de NaOH de Panreac (VidraFoc, Tarragona, España) a 1 ,19 g de HEPES (Sigma, Barcelona, España), en 100 mi agua Millipore.
Se preparó Ia composición del protocolo de extracción A compuesta por TCEP al 0,1% p/v y tampón HEPES 50 mM, por ejemplo, pesando 286,65 mg de
TCEP. HCI en 10 mi de tampón HEPES 50 mM, y añadiendo entonces esto a una disolución preparada previamente de 60 mi de glicerol con 30 mi de tampón HEPES 50 mM, hasta un volumen final de 100 mi, con TCEP al 0,01 % p/v en glicerol al 60% v/v en HEPES 50 mM, pH 7,4. También se intentó aumentar Ia temperatura de extracción de Ia primera etapa del protocolo de extracción B, hasta Ia misma temperatura que Ia usada en el protocolo de extracción A (por ejemplo 85 Q C), pero debido al bajo punto de ebullición del etanol sólo pudo aumentarse Ia temperatura hasta 60 Q C.
Resultados
Comparando el porcentaje de recuperación a partir de muestras procesadas por calor, conseguida usando los protocolos de extracción, y analizándolas usando un kit comercial de ELISA R5 Sandwich, que detecta una secuencia de pentámeros repetida encontrada en Ia gliadina, las recuperaciones son comparables, demostrando el procedimiento de esta invención una mejor recuperación a concentraciones inferiores. Tabla 5 Comparación de Ia recuperación de extracción usando el procedimiento de Ia invención y Ia invención según el documento US2004/0137137A1
Adicionalmente, se comparó Ia extracción a partir de muestras procesadas por calor usando el análisis de Bradford y electroforesis. Para esta demostración se usó harina de trigo que contiene gluten para preparar muestras procesadas por calor. Tal como se muestra en Ia figura 13.a), se extrajo casi tres veces más proteína (en términos de proteína total) usando el protocolo de extracción A, que extrae 4,21 mg de una muestra de 25 mg de base de pizza en comparación con los 1 ,47 mg extraídos usando el protocolo de extracción B. De Ia manera más probable esto no se mide usando el ELISA Ingezim R5 Sandwich, ya que Ia principal diferencia en Io que está extrayéndose es principalmente gluteninas LMW y HMW. Se comparó también el efecto de aumentar Ia temperatura de extracción del protocolo B y, tal como se muestra en Ia figura 13.a), se consiguió una extracción de las gluteninas HMW potenciada, extrayéndose 2,66 mg de proteína total en comparación con los 1 ,47 mg extraídos a temperatura ambiente. Se llevó a cabo Ia electroforesis de extracción de proteínas de gluten (figura
13.a) out usando (A) etanol al 60%, mercaptoetanol 250 mM, clorhidrato de guanidina 2 M, llevándose a cabo Ia extracción a temperatura ambiente (B) etanol al 60%, mercaptoetanol 250 mM, clorhidrato de guanidina 2 M, llevándose a cabo Ia extracción a 60 Q C y (C) protocolo inventado, extracción 1 (D) protocolo inventado, extracción 2.
Ejemplo 4. Extracción de gluten en de muestras sin gluten disponibles comercialmente e hidrolizados de gluten
Materiales
Las muestras comerciales estudiadas pueden dividirse en cuatro grupos:
Muestras que contienen gluten - Muestras de alimento sin gluten
Muestras de alimento sin gluten que requieren desengrasado - Hidrolizados de gluten
Se tomaron cinco muestras de diferentes partes de Ia muestra de alimento y se combinaron hasta una cantidad de 1 g, homogeneizando a continuación meticulosamente con una batidora. Entonces se usó un muestreo representativo para proporcionar una muestra homogénea, para su análisis.
Desengrasado de muestras: En el caso de las muestras que requerían desengrasado, se añadieron 1 ,25 mi de acetona a Ia muestra homogeneizada (125 mg) y se agitaron con vórtex durante 30 segundos a temperatura ambiente, se dejaron sedimentar durante 5 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos a 14000 rpm a temperatura ambiente. Inmediatamente tras el desengrasado se aplicó el sedimento obtenido tras Ia centrifugación al procedimiento de Ia invención.
Se introdujeron 125 mg de muestra homogeneizada en un tubo eppendorf. Posteriormente, 1 ,25 mi de Ia composición del procedimiento, compuesta por TCEP al 0,1 % p/v en glicerol al 60% v/v con tampón HEPES 50 mM, pH 7,4 seguido de una agitación con vórtex rápida de 30 segundos a 2500 rpm (VELP Scientifica,
Madrid, España). Entonces se cerraron los tubos y se sellaron con Parafilm para evitar cualquier pérdida debido a evaporación y se mezclaron en un termomezclador a 95 Q C durante 5 minutos (modelo Thermomixer Compact), antes de centrifugarse finalmente (Eppendorf modelo 5417R) a 12.000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. Por tanto, pudo completarse Ia extracción en menos de 10 minutos.
Entonces se transfirió el sobrenadante a tubos eppendorf de polisulfona limpios para su análisis usando ELISA. Se preparó tampón de pH 7,4 añadiendo 4 g de NaOH de Panreac (VidraFoc, Tarragona, España) a 1 ,19 g de HEPES (Sigma, Barcelona, España), en 100 mi de agua Millipore. Se prepara Ia composición del protocolo de extracción A compuesta por TCEP al 0,1 % p/v y tampón HEPES 50 mM, por ejemplo, pesando 286,65 mg de TCEP. HCI en 10 mi de tampón HEPES 50 mM, y añadiendo entonces esto a una disolución preparada previamente de 60 mi de glicerol con 30 mi de tampón HEPES 50 mM, hasta un volumen final de 100 mi, con TCEP al 0,01 % p/v en glicerol al 60% v/v en HEPES 50 mM, pH 7,4.
Tabla 6. Gliadina extraída y detectada usando un ELISA propio
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