Die Erfindung betrifft Verfahren zur gezielten Herstellung von Lysobactindeπvaten durch kombi¬ nierte chemische und enzymatische Modifikationen. In besonderer Weise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung vom Lysobactinfragment 4-11 durch chemische Reduktion und Spal- tung der entstehenden Produkte durch Chymotrypsin.

Lysobactin ist ein cyclisches Depsipeptid, das aus einem Screeningprogramm zur Auffindung neu¬ er in die Biosynthese bakterieller Zellwände eingreifender Antibiotika stammt (O'Sullivan J. et al. (1988) J. Antibiot. 41 (12), 1740-1744 und Bonner, D. P. et al. (1988) J. Antibiot. 41 (12), 1745- 1751; Tymiak, A. A. et al. (1989) J. Org. Chem. 54, 1149-1157). Es zeigt eine hohe Wirksamkeit gegenüber Gram-positiven aeroben und anaeroben Bakterien. Ungewöhnlich ist die hohe Anzahl an nicht-proteinogenen Aminosäuren im Molekül. Neben den drei ß-Hydroxyaminosäuren (2S,3R)-ß-Hydroxy-Leucin, (2S,3R)-ß-Hydroxy-Phenylalanin und (2S,3S)-ß-Hydroxy-Asparagin kommen auch die D-Aminosäuren D-Leucin und D-Arginin sowie allo-Threonin vor. Diese Kom¬ plexität und die Größe des Naturstoffs Lysobactin stellen für gezielte chemische Modifikationen eine große Hürde dar.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative Syntheseverfahren zur gezielten Synthese von Lysobactinfragmenten zur Verfügung zu stellen, um die Herstellung von neuen Antibiotika unter Verwendung von Lysobactinfragmenten zu ermöglichen.

Einen Ausweg bietet die gezielte enzymatische Spaltung, die gezielte enzymatische Herstellung und die nachfolgende Verknüpfung von Lysobactinfragmenten in Kombination mit chemischen Modifikationsschritten, z. B. der Hydrierung..

Enzymatische Verdauexperimente von Lysobactin und der durch Hydrolyse erhaltenen offenketti- gen Form („open-chain Lysobactin"; Verbindung der Formel (I)) mit Enzymen wie Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin und mucosalen Peptidase zeigten keinen (wie z. B. bei Pepsin) oder nur einen unzureichenden enzymatischen Verdau (R. A. Blackburn et. al. (1993) Drug Metab. Dispos. 21(4), 573-579). Zu einer sehr langsamen, meffizienten enzymatischen Spaltung von Lysobactin kommt es erst nach Öffnung des Ringes durch Hydrolyse im verwendeten Puffer. Dies führt als unerwünschte Nebenreaktion zu einer Seitenketten-Deamidierung am (2S,3S)-ß-Hydroxy- Asparagin. D.h. die ß-Hydroxy-Asparagin-Einheit wandelt sich in eine ß-Hydroxy-Aspartat- Einheit um.

Überraschender Weise wurde gefunden, dass das Lysobactinfragment 4-11 hocheffizient und quantitativ durch enzymatische Spaltung mit Chymotrypsin aus Dihydro-Lysobactin (Verbindung

der Formel (H)) und Octahydro-Lysobactin (Verbindung der Formel (IH)) sowie aus einem Ge¬ misch beider Komponenten hergestellt werden kann. Die Spaltung geht so schnell vonstatten, dass praktisch nach dem Zusammengeben der Reaktionspartner (Substrat und Enzym) die Fragmente 1— 3 und 4-11 entstehen. Unerwünschte Nebenreaktionen in den Aminosäure-Seitenketten finden nicht statt.

OH H

Dihydro-Lysobactin und Octahydro-Lysobactin erhält man durch hydrogenolytische Öffnung von Lysobactin mit Wasserstoff, wobei die (2S,3R)-ß-Hydroxy-Phenylalanm-Einheit in eine Phenyla- lanin bzw. 3-Cyclohexylalanin-Einheit überfuhrt wird. Die entstehenden Lysobactin-fragmente Dihydro-Lysobactin und Octahydro-Lysobactin werden dann für den enzymatischen Verdau einge¬ setzt.

Überraschenderweise sind Dihydro-Lysobactin und Octahydro-Lysobactin auch für andere Enzy¬ me gute Substrate, so dass sich durch Auswahl des Enzyms auch andere Fragmente in hoher Aus- beute herstellen lassen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro-Lysobactin, bei dem Lysobactin durch hydrogenolytische Ringöffhung mit Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrier-Katalysators in einem Lösungsmittel in Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro-Lysobactin überfuhrt wird.

Hydrierkatalysatoren sind beispielsweise Palladium-, Ruthenium-, Rhodium-, Iridium- und Platin- Katalysatoren, oder Raney-Nickel. Diese Katalysatoren können als Salze (z. B. Platindioxid, Rho- dium(IH)chlorid) oder als Trägerkatalysatoren (z. B. Palladium auf Kohle (5-30%ig) oder Rhodi-

um auf Kohle (5%ig)) eingesetzt werden. Geeignete Trägermaterialien für Trägerkatalysatoren sind beispielsweise Aktivkohle, Kieselgur, Kieselgel, Bentonite, Kaolin, Bimsstein, Alumosilicate oder Aluminiumoxid. Bevorzugtes Trägermaterial ist Aktivkohle.

Es können auch bimetallische Katalysatoren oder aber Mehrstoffkatalysatoren eingesetzt werden.

Bevorzugt sind Palladium-Katalysatoren, beispielsweise Palladium auf Kohle (5-30%ig), beson¬ ders bevorzugt ist Palladium auf Kohle (10%ig).

Die hydrogenolytische Ringöffnung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 150 ⁰ C, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 80 ⁰ C, in einem Normaldruckbereich von Normaldruck bis 200 bar, be- vorzugt in einem Druckbereich von 3 bis 80 bar.

Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Isoropanol, oder Gemi¬ sche der Alkohole mit Wasser, oder Essigsäure oder wässrige Lösungen von Essigsäure, oder THF- Wasser Gemische, oder Dioxan- Wasser-Gemische, oder aber ternäre Gemische der vorher genannten Lösungsmittel, z. B. Isopropanol-Wasser-Essigsäure. Bevorzugt ist ein Isopropanol- Wasser Gemisch.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Lysobactinfragment 4— 11 und Lysobactinfragment 1-3, bei dem Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro-Lysobactin enzymatisch zum Lysobactinfragment 4—11 und Lysobactin-fragment 1-3 gespalten wird.

Bevorzugt ist eine enzymatische Spaltung von Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro- Lysobactin, wobei als Enzym eine eukaryontische Serinprotease oder eine mikrobielle Serinpro- tease verwendet wird.

Eukaryontische Serinproteasen sind beispielsweise Chymotrypsin, Cathepsin G, Chymase oder andere Enzyme der Chymotrypsinfamilie oder andere eukaryontische Serinproteasen, die nach aromatischen Aminosäuren spalten, bevorzugt ist Chymotrypsin.

Mikrobielle Serinproteasen sind beispielsweise Subtilisin, Proteinase K, Streptomyces protease A oder andere Enzyme die nach aromatischen Aminosäuren spalten, bevorzugt ist Subtilisin.

Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Dihydro- Lysobactin und/oder Octahydro-Lysobactin zu kleineren Lysobactinfragmenten.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von Lyso- bactinfragment 3-11 und/oder Lysobactinfragment 5-11 und/oder Lysobactinfragment 4-10

und/oder Lysobactinfragment 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro-Lysobactin enzymatisch zum Lysobactinfragment 3-11 und/oder Lysobactinfragment 5-11 und/oder Lysobactinfragment 4-10 und/oder Lysobactinfragment 1-9 gespalten wird.

Bevorzugt ist eine enzymatische Spaltung von Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro- Lysobactin, wobei als Enzym eine Metalloprotease oder eine Cysteinprotease verwendet wird.

Metalloproteasen sind beispielsweise Thermolysin oder Mycolysin.

Cysteinproteasen sind beispielsweise Papain, Bromelain oder Ficin.

Die enzymatische Spaltung erfolgt im Allgemeinen in einem wässrigen Spaltpuffer, unter Zugabe eines Ci-C ₄ -Alkohols oder Acetonitril, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 10 ⁰ C bis 40 ⁰ C, bevorzugt in einem pH-Bereich von 6 bis 9 bei Normaldruck.

Ein wässriger Spaltpuffer enthält beispielsweise Ammoniumhydrogencarbonat und Harnstoff, oder Natriumphosphat, Cystein und EDTA, oder Natriumtetraborat, oder andere Zusatzstoffe mit denen ein Pufferbereich von pH 6 bis 9 abgedeckt wird, bevorzugt ist Ammoniumhydrogencarbonat und Harnstoff.

Der Ci-C ₄ -Alkohol ist beispielsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, bevorzugt ist Methanol.

Besonders bevorzugt findet die enzymatische Spaltung in einem Temperaturbereich von 30 ⁰ C bis 37 ⁰ C statt.

Die Alkoholkonzentration im Reaktionsmedium beträgt 0% bis 40%, bevorzugt 10% bis 15%.

Das Verhältnis von Enzym zu Substrat (Dihydro-Lysobactin und/oder Octahydro-Lysobactin) be- trägt 1 : 1 bis 1 :4000, bevorzugt 1 :25 bis 1 : 100.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Lysobactinfragment 4-11 zur Synthe¬ se von Lysobactin-Derivaten.

Bei diesen Lysobactin-Derivaten handelt es sich um Derivate, bei denen ein oder mehrere Amino¬ säuren im Ringsystem des Lysobactins ausgetauscht sind.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von open-chain-Lysobactin- Derivaten, bei dem das Lysobactinfragment 4-11 mit einem Tripeptid mit einer C-terminalen aro¬ matischen oder hydrophoben Aminosäure in einem Puffermedium unter Zugabe eines Ci^-

Alkohols umgesetzt wird, wobei das Tripeptid in Form der freien Säure oder eines Esters vorliegt und wobei die Konzentration des C^-Alkohols im Reaktionsmedium größer als 40% ist.

Der Crd-Alkohol ist beispielsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, bevorzugt ist Methanol.

Bevorzugt ist ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von open-chain-Lysobactin-Derivaten aus dem Lysobactinfragment 4-11 und dem Tripeptid H-D-X-Y-Phe-OR oder H-D-X-Y-(3- cyclohexyl)Ala-OR in einem Puffermedium unter Zugabe von Methanol, wobei die Methanolkon¬ zentration im Reaktionsmedium größer als 40% ist,

R für Wasserstoff oder C ₁ -C ₄ -AUCyI, bevorzugt für Ethyl oder Methyl, besonders bevorzugt für Methyl steht,

D-X für eine D-konfigurierte natürliche oder synthetische α-Aminosäure steht,

und

Y für eine L-konfigurierte natürliche oder synthetische α-Aminosäure steht.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von open-chain-Lysobactin- Derivaten aus dem Lysobactinfragment 4-11 und dem Tripeptid H-D-Leu-Leu-Phe-OMethyl, H-D-Leu-Leu-Phe-OH, H-D-Leu-Leu-(3-cyclohexyl)Ala-OMethyl oder H-D-Leu-Leu-(3-cyclo- hexyl)Ala-OH, wobei als Enzym Chymotrypsin verwendet wird, in einem Puffermedium unter Zugabe von Methanol, wobei die Methanolkonzentration im Reaktionsmedium größer als 40% ist.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 : Zeitlicher Verlauf einer präparativen enzymatischen Spaltung mit Chymotrypsin (Beispiel 11). Überlagerung von HPLC-Diagrammen einer präparativen enzymatischen Spaltung mit Chy¬ motrypsin eines Gemisches aus Dihydro- und Octahydro-Lysobactin. Die Trennbedingungen sind wie in der Beschreibung unter Beispiel 30 angegeben (UV-Detektion 210 nm).

Abb. 2: Zeitlicher Verlauf einer enzymatischen Spaltung von Octahydro-Lysobactin mit Chymo¬ trypsin (Beispiel 5). Überlagerung von CZE-Diagrammen einer enzymatischen Spaltung mit Chy- motrypsin von Octahydro-Lysobactin. Die Trennbedingungen sind wie in der Beschreibung unter Beispiel 31 angegeben (UV-Detektion 210 nm).

Definitionen

Dihydro-Lysobacπni D-Leu-Leu-Phe-Leu^^-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-AsnCO^-Ser

Octahydro-Lysobactin: D-Leu-Leu-Ala(3-cyclohexyl)-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-G ly-

Asn(OH)-Ser

Lysobactinfragment 4-11 : Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser

Lysobactinfragment 1-3: D-Leu-Leu-Phe oder D-Leu-Leu-Ala(3-cyclohexyl)

Nachstehend werden die im Verlaufe der chemischen und enzymatischen Reaktionen und analyti¬ schen Charakterisierungen eingesetzten Methoden aufgeführt.

Beispiele

Abkürzungen

atm Atmosphäre (Druckeinheit)

Bsp. Beispiel

CZE Kapillarzonenelektrophorese

DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)

DCM Dichlormethan

DMSO Dimethylsulfoxid

A Th. der Theorie

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)

EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

Fa. Firma h Stunde(n)

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

HR High Resolution (Hochauflösung) konz. konzentriert

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie

LLF D-Leu-Leu-Phe

LL(3-Cyclohexyl)A D-Leu-Leu-(3-Cyclohexyl)Ala min Minute/Minuten

MS Massenspektroskopie neg. negativ

NMR Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance)

Pd Palladium

Pd-C Palladium auf Kohle pos. positiv proz. Prozentig

PTFE Polytetrafluorethylen quant. quantitativ

RP-HPLC Reverse Phase HPLC

RT Raumtemperatur

R, Retentionszeit (bei HPLC)

TFA Trifluoressigsäure

TOF Flugzeit (time of night)

UV Ultraviolett

Vis sichtbar (visible) wässr. wässrig(e)

Literatur

Zur Nomenklatur der Peptide und Cyclodepsipeptide vergleiche:

1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientifϊc publications.

2. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983. IUPAC- IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219,

345-373. Sowie zitierte Literatur.

Allgemeine Methoden LC-MS. HR-MS und HPLC

Methode 1 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2 μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 2.5 min 30% A -> 3.0 min 5% A -» 4.5 min 5% A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 2 (präparative HPLC; Symmetry; Trifluoressigsäure): Gerät: Gilson Abimed HPLC; UV Detektor 210 nm; binäres Pumpensystem; Säule: SymmetryPrep™Ci ₈ , Fa. Waters, 7 μm; 300 x 19 mm; Eluent A: 0.05% Trifluoressigsäure in Wasser, Eluent B: 0.05% Trifluoroessigsäure in Acetonitril; Gradient: 0-5 min 5% B mit Flussrate 20 ml/min, 5-30 min Gradientrampe von 5 bis 60% B mit folgender Flussratenerhöhungen: 22 ml/min ab 6 min, 23 ml/min ab 10 min, 24 ml/min ab 15 min; 30-35 min Gradientrampe von 60% bis 98% B mit Flussrateverminderung zu 21 ml/min ab 38 min; 40-45 min 10% B.

Methode 3 (Methode zur präparativen Trennung von Dihydro- und Octahydro-Lysobactin durch HPLC): Säule: SymmetryPrep™C _I8 , Fa. Waters, 7 μm 300 x 19 mm; Fluss 25 ml/min; RT; Eluent A: 0.2% TFA in Wasser, Eluent B: Acetonitril, 0-10 mm Gradient: 80% A, 20% B bis 35% A, 65% B; 10.01-15 min: 80% A, 20% B; Detektion 210 nm. Fraktionen mittels LC-MS (Metho- de 1) kontrolliert, am Rotationsverdampfer von Acetonitril befreit und lyophilisiert.

Metbode 4 (Analytische HPLC 1100, ZQ2, Phenomenex, Synergi, Hydro-RP): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Fa. Phenomenex, MercuryMS, Synergi 2 μ Hydro-RP 20 x 4 mm; Eluent A: Wasser/0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0.0-2.5 min, 90-30% A, Fluss 1-2 ml/min, 2.5-3.0 min, 30-5% A, Fluss 2.0 ml/min, 3.0-4.5 min, 5% A; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 5 (TOF-HR-MS): TOF-HR-MS-ESI+ Spektren werden mit einem Micromass LCT Ge¬ rät (Kapillarspannung: 3.2 KV, Cone-Spanmmg: 42 V, Quellentemperatur: 120 ⁰ C, Desolvations- Temperatur: 280 ⁰ C) aufgenommen. Hierzu wird eine Spritzenpumpe (Fa. Harvard Apparatus) für die Probenzuführung verwendet. Als Standart dient Leucin-Enkephalin (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu).

Methode 6 (HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD Säule: Zorbax Eclipse XBD-C8 (Agilent), 150 mm x 4.6 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO ₄ /I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gra¬ dient: 0-1 min 10% B, 1-4 min 10-90% B, 4-5 min 90% B; Fluss: 2.0 ml/min; Ofen: 30 ⁰ C; UV- Detektion: 210 und 254 nm.

Methode 7 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO ₄ /I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B, 0.5 min 2% B, 4.5 min 90% B, 9 min 90% B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 30 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 8 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO ₄ /I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 5% B, 10 min 95% B; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 9 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 μm; Eluent A: 2 ml HCIO ₄ /I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Isokratisch: 45% B, 55% A; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40 ⁰ C; UV- Detektion: 210 nm.

Methode 10 (HPLC): Gerät: Agilent 1100 mit DAD (G1315B), binärer Pumpe (G1312A), Auto- sampler (G1313A), Lösemittel-Entgaser (G1379A) und Säulenthermostat (G1316A); Säule: Agi- lent Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 x 5 mm; Säulentemperatur: 40 ⁰ C; Eluent A: 0.05% von 70% Perchlorsäure in Wasser; Eluent B: Methanol; Fluss: 2.00 ml/min; Isokratisch: 0-7 min 55% B.

Methode 11 (HPLC): Analytische HPLC-Methode Bromelain- / Chymotrypsinspaltung. Ca.20 μg der enzymatischen Spaltprodukte bzw. der Ausgangsverbindungen werden an einer 3OOSB-C18- column (4.6 mm x 125 mm; 3.5 μm Material; 300 Angström Porendurchmesser) chroma- tographiert. Als Eluent wird ein Acetonitril / TFA-Gradient verwendet. Eluent A: 0.1% TFA in Wasser, Eluent B: 0.1% TFA in 60% Acetonitril/40% Wasser; Gradient: 0 min 0% B, 2 min 10%

B, 50 min 80% B, 52 min 100% B, 55 min 0% B, 60 min 0% B; Fluss: 0.7 ml/min; Säulentempera¬ tur: 40 ⁰ C; Detektion: 210 nm.

Proteinchemische Charakterisierung von Dihydro-, Octahvdro-Lysobactin und der enzyma- tischen Spaltprodukte

Geräte

Die Sequenzanalysen werden mit einen Proteinsequenzer Procise™ der Fa. Applied Biosystems durchgeführt. Das Standardsequenzierungsprogramm wird verwendet. Der Sequenzer, die ver¬ schiedenen Sequenzierungsprogramme sowie das PTH-Detektionssystem sind im Detail im Bedie¬ nungshandbuch beschrieben User's Manual Set, Protein Sequencing System Procise™ (1994), Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A.

Die Reagenzien für den Betrieb des Sequenzers und die HPLC-Säule für die PTH-Detektion wer¬ den von Applied Biosystems bezogen.

Die HPLC-Analysen werden mit einem HP1100 HPLC-System von Agilent durchgeführt. Eine Zorbax 300SB-C18-column (4.6 mm x 150 mm; 3.5 μm Material; 300 Angström Porendurchmes- ser) von Agilent (D- Waldbronn) wird für die Trennungen verwendet.

Die verwendeten Reagenzien sind von HPLC-Qualität und werden von Merck (D-Darmstadt) be¬ zogen.

Die Kapillarelektrophorese Modell 270A-HT ist von Applied Biosystems. Die Proben werden in der Regel hydrodynamisch über verschiedene Zeitintervalle injiziert. Die verwendete Kapillarsäule (50 μm Durchmessser x 72 cm Länge) ist von Applied Biosystems. Trennprogramme und die Funktion des Analysators sind ausführlich im Handbuch des Gerätes beschrieben (User's manual capillary electrophoresis System model 270A HT; Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A.; 1989).

Die verwendeten Reagenzien sind von biochemischer Qualität und werden von Merck (D-Darm- Stadt) oder Sigma (D-Deisenhofen) bezogen.

Die Aminosäureanalysen werden mit einem Aminosäureanalysator LC3000 von Eppendorf / Bi- otronik durchgeführt. Ein leicht modifiziertes Standardtrennprogramm von Eppendorf / Biotronik wird benutzt. Die Trennprogramme und die Funktion des Analysators sind ausführlich im Hand¬ buch des Gerätes beschrieben (Handbuch des Aminosäureanalysators LC 3000, Wissenschaftliche Geräte GmbH Biotronik, Maintal, 1996).

Die verwendeten Reagenzien sind von biochemischer Qualität und werden von Merck (D- Darmstadt), Fluka (D-Neu-Ulm) oder Sigma (D-Deisenhofen) bezogen.

Die Molekulargewichte werden mit einem ZQ-I System von Micromass (Manchester, UK) be¬ stimmt. Die Fragmente werden dabei mittels RP-18-HPLC-Chromatographie (HPl lOO-System) getrennt und das Molekulargewicht durch Elektronenspray-Ionisation (ESI) bestimmt. Eine externe Kalibrierung wird durchgeführt. Die Kalibrierung und Funktion des Systems sind ausführlich im Handbuch des Gerätes beschrieben.

Die eingesetzten Enzyme und Chemikalien sind von biochemischer Qualität und werden von den Firmen Fluka, Calbiochem (D-Heidelberg) und Sigma bezogen.

Das Material für die präparative Chromatographie Source 15RPC wird von Amersham Bioscience (D-Freiburg) bezogen. Die präparative Trennung wird mit einem ÄKTA™-System von Amersham Bioscience durchgeführt.

Die in der Erfindung erwähnten chemischen Verbindungen können auch in Form von Salzen, SoI- vaten oder Solvaten der Salze vorliegen.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfin¬ dungsgemäß herstell- oder verwendbaren Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäß herstell- oder verwendbaren Verbindungen verwendet werden können oder Mischsalze.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfϊndungsgemäß herstell- oder verwendbaren Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäß herstell- oder verwendbaren Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.

AIs Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäß herstell- oder verwendbaren Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordinati¬ on mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.

Beispiel 1

D-Leucyl-N ¹ -{(3S,6S,12S,15S,18R,21S,24S,27S,28R)-6-[(lS)-2-amino- l-hydroxy-2-oxoethyl]-18- (3- { [amino(imino)methyl] amino} propyl)- 12-[(1S)-I -hydroxyethyl] -3 -(hydroxymethyl)-24-[( 1 R)- 1 - hydroxy-2-methylpropyl]-21-isobutyl-15-[(lS)-l-methylpropyl] -2,5,8,l l,14,17,20,23,26-nonaoxo- 28-phenyl- 1 -oxa-4,7, 10, 13, 16, 19,22,25-octaazacyclooctacosan-27-yl} -L-leucinamid-bistrifluor- acetat

{D-Leucyl-L-leucyl-[(3R)-3-hydroxy-L-phenylalanyl)]-[(3R) -3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L- asparaginyl]-L-serin-C ¹ "-O ^{3 3} -lacton- bistrifluoracetat} (Lysobactin)

Fermentation:

Kultur Medium:

YM: Hefe-Malz Agar: D-Glucose (4 g/l), Hefe Extrakt (4 g/l), Malz Extrakt (10 g/l), 1 Liter Lewa- tit Wasser. Vor dem Sterilisieren (20 Minuten bei 121 ⁰ C) wird der pH auf 7.2 eingestellt.

HPM: Mannit (5.4 g/l), Hefe Extrakt (5 g/l), Fleischpepton (3 g/l).

Arbeitskonserve: Der lyophilisierte Stamm (ATCC 53042) wird in 50 ml YM Medium angezogen.

Kolbenfermentation: 150 ml YM Medium oder 100 ml HPM Medium in einem 1 1 Erlenmeyerkol- ben werden mit 2 ml der Arbeitskonserve beimpft und für 30-48 Stunden bei 28 ⁰ C auf einem Schüttler bei 240 Upm wachsen gelassen.

30 1 Fermentation: 300 ml der Kolbenfermentation (HPM Medium) werden zum Animpfen einer sterilen 30 1 Nährmedienlösung verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1). Diese Kultur wird für 21 Stunden bei 28 ⁰ C, 300 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 wm wachsen gelassen. Der pH wird mit 1 M Salzsäure auf pH = 7.2 konstant gehalten. Insgesamt werden während der Kultivierungszeit 880 ml 1 M Salzsäure zugeführt.

Hauptkultur (200 1): 15 x 150 ml YM Medium in 1 1 Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Ar¬ beitskonserve beimpft und bei 28°C für 48 Stunden und 240 Upm auf dem Schüttler wachsen ge¬ lassen. 2250 ml dieser Kultur werden zum Beimpfen einer sterilen 200 1 Nährmedienlösung (YM) verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1) und für 18.5 Stunden bei 28°C, 150 Upm und einer Belüf¬ tung mit steriler Luft von 0.3 wm wachsen gelassen.

Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufs werden stündlich Proben (50 ml) entnommen. 2 ml dieser Kulturbrühe werden mit 1 ml Methanol (0.5% Trifluoressigsäure) versetzt und über einen 0.45 μm Filter filtriert. 30 μl dieser Suspension werden mittels HPLC analysiert (Methode 6 und Metho¬ de 7).

Nach 18.5 Stunden wird die Kulturbrühe der Hauptkultur bei 17000 Upm in Überstand und Sedi- ment getrennt.

Isolierung:

Der Überstand (183 1) wird mit konzentrierter Trifluoressigsäure bzw. Natronlauge auf pH 6.5 bis 7 eingestellt und auf eine Lewapolsäule (OC 1064, 60 1 Inhalt) aufgetragen. Anschließend wird mit reinem Wasser, Wasser/Methanol 1:1 und anschließend mit reinem Methanol (mit 0.1% Trifluo- ressigsäure) eluiert. Diese organische Phase wird im Vakuum bis zu einem verbleibenden wässri- gen Rest von 11.5 1 eingeengt.

Die verbleibende wässrige Phase wird an Kieselgel C _J8 gebunden und aufgetrennt (MPLC, Biotage Flash 75, 75 x 30 cm, KP-C18-WP, 15-20 μm, Fluss: 30 ml; Eluent: Acetonitril/ Wasser mit 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 10%, 15% and 40% Acetonitril). Die 40% Acetonitril Phase, die die Hauptmenge von Beispiel IA enthält, wird im Vakuum eingeengt und anschließend lyophilisiert (ca. 13 g). Dieses Feststoffgemisch wird in 1.2 g Portionen zunächst an einer präparativen HPLC

(Methode 1 ), anschließend durch Gelfiltration an Sephadex LH-20 (5 x 70 cm, Acetonitril/Wasser 1 :1, jeweils mit 0.05% Trifluoressigsäure) und einer weiteren präparativen HPLC (Methode 8) getrennt.

Dieser Prozess liefert 2250 mg Beispiel 1.

Das Sediment wird in 4 1 Aceton/Wasser 4: 1 aufgenommen, mit 2 kg Celite versetzt, mit Trifluo¬ ressigsäure auf pH = 6 eingestellt, ausgerührt und zentrifugiert. Das Lösungsmittel wird im Vaku¬ um eingeengt und der Rückstand gefriergetrocknet. Das erhaltene Lyophilisat (89.9 g) wird in Me¬ thanol aufgenommen, abfiltriert, eingeengt und an Kieselgel (Methode 9) getrennt. Beispiel IA wird danach per Gelfiltration (Sephadex LH-20, 5 x 68 cm, Wasser/Acetonitril 9:1 (mit 0.05% Trifluoressigsäure), Fluss: 2.7 ml/min, Fraktionsgröße 13.5 ml) zur Reinsubstanz aufgereinigt.

Dieser Prozess liefert 447 mg Beispiel 1.

HPLC (Methode 6): R, = 6.19 min

MS (ESIpos): m/z = 1277 [M + H] ⁺

¹ H NMR (500.13 MHz, αVDMSO): δ = 0.75 (d, 3H), 0.78 (d, 6H), 0.80 (t, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.91 (d, 3H), 0.92 (d, 3H), 0.95 (d, 3H), 0.96 (d, 3H), 1.05 (m, IH), 1.19 (d, 3H), 1.25 (m,

2H), 1.50 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.55 (m, IH), 1.61 (m, IH), 1.65 (m, IH), 1.84 (m, IH), 1.85 (m,

IH), 1.86 (m, IH), 1.89 (m, IH), 1.95 (m, IH), 2.75 (m, 2H), 3.40 (m, IH), 3.52 (m, 2H), 3.53 (dd,

IH), 3.64 (m, 2H), 3.66 (m, IH), 3.68 (dd, IH), 3.73 (m, 2H), 4.00 (dd, IH), 4.02 Qx., IH), 4.13

Qx., IH), 4.32 (dd, IH), 4.39 (t, IH), 4.55 (m, IH), 4.75 (dd, IH), 5.19 (t, IH), 5.29 (d, IH), 5.30 Qx., IH), 5.58 (m, 2H), 6.68 (m, 3H), 6.89 (d, IH), 6.93 (m, 3H), 6.94 Qx., IH), 6.98 (d, IH), 7.12

Qx., IH), 7.20 (JbT., 2H), 7.23 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.54 (d, IH), 7.58 (d, IH), 8.32 Qx., IH), 9.18

Qx., IH), 9.20 (m, 2H), 9.50 Qx., IH).

¹³ C-NMR (125.77 MHz, d ₆ -DMSO): δ = 10.3, 15.3, 19.0, 19.2, 19.6, 20.0, 20.9, 22.0, 22.4, 23.0, 23.2, 24.3, 24.4, 25.0, 25.4, 26.0, 27.8, 30.9, 35.4, 39.5, 40.8, 40.9, 41.6, 44.1, 51.5, 52.7, 55.9, 56.2, 56.4, 57.9, 58.8, 60.2, 61.1, 62.6, 70.1, 71.6, 71.7, 75.5, 128.1, 128.6, 136.7, 156.8, 168.2, 170.1, 170.4, 171.2, 171.5, 171.9, 172.2, 172.4, 173.7.

Die Zuordnung der Signale erfolgte nach der in der Literatur beschriebenen Zuordnung (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui, J. Antibiot, 1988, 61, 719-725).

Beispiel 2 und Beispiel 3

D-Leu-Leu-Phe-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3 S)-3-Asn(3-OH)]-Ser-trifluoracetat (Dihydro-Lysobactin) und

D-Leu-Leu-Ala(3-cyclohexyl)-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-He -aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]- Ser-trifluoracetat (Octahydro-Lysobactin)

Dihydro-Lysobaction

Hydrierverfahren 1;

Die Verbindung aus Beispiel 1 (Lysobactin, 250 mg, 170 μmol) wird in Isopropanol/Wasser (2:1, 60 ml) gelöst und in Gegenwart von 200 mg Pd (10% auf Kohle) unter 1 atm Wasserstoff hydriert. Der Verlauf der Reaktion wird mittels LC-MS (Methode 1) verfolgt. Nach nahezu vollständigem Umsatz (>95%) wird der Katalysator abfϊltriert, mit Isopropanol gewaschen und das Filtrat lyophy- lisiert. In diesem Rohprodukt verteilen sich laut LC-MS die Produkte wie folgt: Dihydro- Lysobactin ca. 74%, Octahydro-Lysobactin ca. 12%. Der Rückstand wird durch HPLC (Methode 2) gereinigt. Nach Lyophilisierung der geeigneten Fraktionen erhält man die reine Verbindung Beispiel 2 (81.5 mg, 31% d. Th.).

LC-MS: (Methode 1): R ₁ = 1.56 min ES ⁺ : m/z = 1279 [M + H] ⁺ , 640.1 [M + 2H] ²⁺ ; ES ^" : m/z = 1277 [M - H]-, 638.1 [M - 2H] ² -.

Peptidsequenzen der Hydro-Lysobactine siehe Tabelle 1.

Hydrierverfahren 2:

Mit Hydrierung unter Wasserstoffdruck von 3 atm erhält man in dem sonst mit Hydrierverfahren 1 identischen Verfahren die durch LC-MS bestimmte folgende Verteilung im Rohprodukt: Dihydro- Lysobactin ca. 80%, Octahydro-Lysobactin ca. 17%. Nach HPLC-Reinigung (Methode 2) erhält man die reine Verbindung Beispiel 2 (86 mg, 33% d. Th).

Hydrierverfahren 3:

Bei verlängerter Hydrierungsdauer bei 3 bar Wasserstoff oder mit mehr Druck (bis 80 bar Wasser¬ stoffdruck) kann man anteilig mehr Octahydro-Lysobactin erhalten. In den meisten Fällen werden die Rohmischungen von Dihydro- und Octahydro-Lysobactin nicht getrennt, sondern direkt in die enzymatische Spaltung eingesetzt.

Hydrierverfahren 4:

Im folgendem Fall wird die Verbindung Octahydro-Lysobactin auch in reiner Form isoliert:

Lysobactin (Beispiel 1, 1.04 g, 0.69 mmol) wird in Isopropanol/Wasser (2:1, 90 ml) gelöst und in Gegenwart von 200 mg Pd (10% auf Kohle) unter 3 atm Wasserstoff für 7 Tagen hydriert. Der

Katalysator wird abfϊltriert, mit Isopropanol gewaschen und das Filtrat am Rotationsverdampfer vom Isopropanol befreit und dann lyophylisiert. In diesem Rohprodukt verteilen sich laut LC-MS

(Methode 1) die Produkte wie folgt: Dihydro-Lysobactin ca. 65%, Octahydro-Lysobactin ca. 35%.

Der Rückstand wird durch HPLC (Methode 2, anschließend Methode 3) gereinigt. Man erhält Di- hydro-Lysobactin (Beispiel 2) (280 mg, 27% d. Th.) und Octahydro-Lysobactin (Beispiel 3) (212 mg, 20% d. Th.).

LC-MS: (Methode 1): R,= 1.63 min ESIpos.: m/z = 643.3 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg.: m/z = 1283 [M - H]-, 641.2 [M - 2H] ^2" .

Hvdrierverfahren 5:

Als Beispiel für eine Hydrierung bei hohem Druck Wasserstoff erhält man nach 4 Tagen bei 40 ⁰ C und 50 bar Wasserstoff die folgende Rohmischung laut LC-MS (Methode 1): 45% Dihydro- Lysobactin und 45% Octahydro-Lysobactin.

Hvdriervβrfahren 6:

Lysobactin-bistrifluoracetat (Beispiel 1, 500 mg, 0.33 mmol) wird in Isopropanol/Wasser 2:1 (30 ml) gelöst. Unter Argonschutzgasatmosphäre wird lOproz. Palladium auf Kohle (100 mg) zu¬ gegeben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) in einem Druckautoklaven bei 80-70 bar Wasserstoff und RT für 48 h gerührt. Zur Reaktion wird erneut lOproz. Palladium auf Kohle (100 mg) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) erneut in einem Druckauto¬ klaven bei 80-70 bar Wasserstoff und RT für 48 h gerührt. Nun ist mittels HPLC (z. B. Methode 4) kein Lysobactin mehr detektierbar. Das Reaktionsgemisch wird über einer Glasfritte (Porengrö¬ ße 2 oder 3) filtriert, im Vakuum eingeengt, erneut in Methanol/0.2% Eisessig aufgenommen, über einem Spritzenfilter (Fa. Biotage, PTFE) filtriert, im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum ge¬ trocknet. Man erhält 496 mg (quant.) Produkt (80% Dihydro-Lysobactin, 20% Octahydro- Lysobactin).

Hydriervcrfahren 7:

Lysobactin-Monotrifluoracetat-monoacetat (5 mg, 3.45 μmol) wird in einer Mischung von Isopro- panol (2 ml), Wasser (0.25 ml) und Essigsäure (0.05 ml) in Gegenwart von Platindioxid (20 mg) bei 80 bar und 5O ⁰ C hydriert. Nach 17 h wird der Druck ausgelassen, mit Argon gelüftet und die Suspension durch Mikrofϊlter vom Katalysator befreit. LC-MS-Analyse des Filtrats (Methode 4) zeigt 7% d. Th. Octahydro-Lysobactin (R ₍ = 1.54 min, Methode 4).

Hvdrierverfahren 8:

Lysobactin-bistrifluoracetat (Beispiel IA, 10 g, 6.65 mmol) wird in Isopropanol/Wasser 9:2 (110 ml) gelöst. Unter Argonschutzgasatmosphäre wird Palladium auf Kohle (10%ig; 5 g) zugege¬ ben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) in einem Druckautoklaven bei 80-70 bar Was¬ serstoffdruck und 40 ⁰ C für 12 h gerührt. Zur Reaktion wird erneut Palladium auf Kohle (10%ig; 5 g) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) erneut in einem Druckautoklaven bei 80-70 bar Wasserstoffdruck und 40 ⁰ C für 12 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entga¬ sung) wieder einmal in einem Druckautoklaven bei 80-70 bar Wasserstoffdruck und 4O ⁰ C für 12 h gerührt. Nun ist mittels analytischer HPLC (Methode 10) kein Lysobactin mehr detektierbar. Das Reaktionsgemisch wird über Kieselgur filtriert, im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum ge¬ trocknet. Man erhält 9.17 g (99% d. Th.) Produkt (60% Dihydrolysobactin, 40% Octahydrolyso- bactin).

i

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Hvdrierverfahren 9:

Lysobactin-bistrifluoracetat (Beispiel IA, 5 g, 3.32 mmol) wird in Isopropanol/Wasser 9:2 (110 ml) gelöst. Unter Argonschutzgasatmosphäre wird Palladium auf Kohle (10%ig; 5 g) zuge¬ geben. Das Reaktionsgemisch wird (nach Entgasung) in einem Druckautoklaven bei 80 bar Was- serstoffdruck und 40 ⁰ C für 12 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird über Kieseiguhr filtriert, im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Die Hydrierung wird noch dreimal mit je 5.0 g Lysobactin-bistrifluoracetat wiederholt (gesamt: 4 Durchgänge). Man erhält als vereinigte Pro- duktfraktion 18.27 g Produkt (Dihydrolysobactin:Octahydrolysobactin, ca. 5:4).

Beispiel 4

Chymotrypsinspaltung von Dihydro-Lysobactin Verhältnis Enzym / Substrat 1:50

200 μg Dihydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 4 μg Chymotrypsin (1 :50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abge- stoppt. Die Proben werden bis zur Analyse mit der HPLC, der Kapillarzonenelektrophorese, der Sequenzanalyse, der Aminosäureanalyse oder MS-Untersuchung bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

Beispiel 5

Chymotrypsinspaltung von Octahydro-Lysobactin Verhältnis Enzym / Substrat 1:50

200 μg Octahydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 4 μg Chymotrypsin (1:50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37 ⁰ C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abge¬ stoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

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Beispiel 6

Analytische Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Ver¬ hältnis Enzym / Substrat 1:25

20Θ μg Dihydro- (59%) und Octahydro-Lysobactin (34%) werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) ver¬ setzt. 8 μg Chymotrypsin (1:25) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37 ⁰ C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -2O ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

Beispiel 7

Analytische Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Ver¬ hältnis Enzym / Substrat 1:400

150 μg Dihydro- (59%) und Octahydro-Lysobactin (34%) werden in 15 μl Ethanol gelöst und dann mit 126 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 0.38 μg Chymotrypsin (9 μl Chymotrypsinlösung Wasser/ Ethylenglykol / Spaltpuffer, 0.2 mg/ml; 1:400) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 25 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3 h entnommen und die Enzymspaltung mit 25 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA ab¬ gestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

Beispiel 8

Analytische Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Sub¬ stratkonzentration 6 mg/ml

900 μg Dihydro- (59%) und Octahydro-Lysobactin (34%) werden in 15 μl Methanol gelöst und dann mit 99 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 36 μg Chymotrypsin (36 μl Chymotrypsinlösung Wasser/ Ethylenglykol 1:1, 1 mg/ml; 1:25) wer¬ den hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 25 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3 h entnommen und die Enzymspaltung mit 25 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

Beispiel 9

Analytische Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Lö¬ sungsmittelkonzentration 30% Methanol

150 μg Dihydro- (59%) und Octahydro-Lysobactin (34%) werden in 45 μl Methanol gelöst und dann mit 99 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 6 μg Chymotrypsin (6 μl Chymotrypsinlösung Wasser/Ethylenglykol 1: 1, 1 mg/ml; 1:25) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 25 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3 h entnommen und die Enzymspaltung mit 25 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Pro¬ ben werden bis zur Analyse bei -2O ⁰ C gelagert. Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

Beispiel 10

Analytische Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Spal¬ tung bei Raumtemperatur

200 μg Dihydro- (59%) und Octahydro-Lysobactin (34%) werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) ver¬ setzt. 8 μg Chymotrypsin (8 μl Chymotrypsinlösung Wasser/ Ethylenglykol 1:1, 1 mg/ml; 1:25) werden hinzugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25 ^c C) durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl 30% Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Chymotrypsin-Spaltprodukte siehe Tabelle 2.

Beispiel 11

Fragment 4-11

[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH) ]-Ser-trifluoracetat

Präparative Chymotrypsinspaltung vom Dihydro-Lysobactin Substratkonzentration 1 mg/ml

2 x 80 mg Dihydro-Lysobactin (35.3 μmol und 33.8μmol reines Peptid bestimmt durch Aminosäu¬ reanalyse) werden in je 8 ml Methanol gelöst und dann mit je 69 ml Spaltpuffer (0.1 M Ammoni- umhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. Vor der Enzymzugabe werden die Lösun¬ gen im Trockenschrank auf 37°C erwärmt. 3.2 mg Chymotrypsin (3.2 ml Chymotrypsinlösung Wasser / Ethylenglykol 1: 1, 1 mg/ml; 1:25; 37°C vorgewärmt) werden hinzugegeben und die Re¬ aktionen bei 37 ⁰ C durchgeführt. Es werden 200 μl Aliquots nach 0.5, 1 h entnommen und die En¬ zymspaltungen mit 200 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Proben werden mit der HPLC parallel zu den Enzymspaltungen innerhalb von 15 min analysiert (Retentionszeit Fragment 4-11 ca. 3.6 min, Fragment 1-3 (LLF) ca. 9.6 min, Bedingungen: Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1% TFA, Gradient: 0 min 30% B, 10 min 80% B, 11 min 100% B, 12 min 30% B, 15 min 30% B; Fluss 0.7 ml/min, 40 ⁰ C, UV-Detektion 210 nm). Die Enzymreaktionen werden nach ca. 70 min mit 3 ml Acetonitril und ca. 0.6 ml TFA abgestoppt. Der pH- Wert der Lösung liegt zwischen 1 und 2. Bis zur präparativen Trennung können die Lösungen bei — 20 ⁰ C gelagert werden.

Präparative Trennung der Fragmente 1-3 und 4 -11

2 x ca. 80 ml der Spaltlösungen werden über einen Filter (0.2 μm) filtriert und dann vereinigt. Die Lösung wird in vier Portionen je ca. 38.5 ml (gesamt 154 ml) aufgeteilt und jeweils an einer Sour- ce 15RPC-Säule (3 ml) mit einem Acetonitril/TFA-Gradienten chromatographiert. Bedingungen: Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 0.1% TFA/Acetonitril; Gradient: 0% B nach 45% B in 40 min; Fluss 2 ml/ min; UV-Detektion 210 nm. Die vier Läufe werden nacheinander durchgeführt und die Fraktionen im gleichen Röhrchen gesammelt. Die resultierenden Chromatogramme sind deckungs¬ gleich.

Die Fragmente 4-11 (R _t = ca. 15 min) und 1-3 (LLF) (R _t = ca. 25 min) werden zusammengegeben, mit Wasser 1:1 verdünnt und dann lyophilisiert.

200 μl Aliquots der jeweiligen Pools werden für die Aminosäureanalyse, analytische HPLC, Ka- pillarzonenelektrophorese (CZE), Sequenzanalyse und Massenspektrometrie getrennt lyophilisiert.

Die Ausbeute an Fragment 4-11 beträgt nach der Aminosäureanalyse 68.3μmol (99% d. Th.) und an Fragment 1-3 67.4μmol (98% d. Th.).

Beispiel 12

Präparative Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin 1 mg/ml

Ansatz 1

2 x 700 mg Dihydro- (56%) und Octahydro-Lysobactin (21%) (682 μmol Dihydro- und Octahydro- Lysobactin enthalten als reine Peptide bestimmt durch Aminosäureanalyse) werden in je 70 ml Methanol gelöst und dann mit je 602 ml Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. Vor der Enzymzugabe werden die Lösungen im Trockenschrank auf 37°C erwärmt. 28 mg Chymotrypsin (28 ml Chymotrypsinlösung Wasser / Ethylenglykol 1 :1, 1 mg/ml; 1 :25; 37 ⁰ C vorgewärmt) werden hinzugegeben und die Reaktionen bei 37°C durchgeführt. Es werden 200 μl Aliquots nach 0.5, 1 h entnommen und die Enzymspaltungen mit 200 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Proben werden mit der HPLC parallel zu den Enzymspal¬ tungen innerhalb von 15 min analysiert (Retentionszeit Fragment 4-11 ca. 3.6 min, Fragment 1-3 (LLF) ca. 9.6 min, Fragment 1-3 (LL(3-Cyclohexyl)A) ca. 11.3 min, Bedingungen: Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1 % TFA, Gradient: 0 min 30% B, 10 min 80% B, 11 min 100% B, 12 min 30% B, 15 min 30% B; Fluss 0.7 ml/min, 4O ⁰ C, UV-Detektion 210 nm). Die En- zymreaktionen werden nach ca. 60 min mit 30 ml Acetonitril und ca. 6 ml TFA abgestoppt. Der

pH-Wert der Lösung liegt zwischen 1 und 2. Bis zur präparativen Trennung können die Lösungen bei — 20 ⁰ C gelagert werden.

Ansatz 2

775 mg Dihydro- (45%) und Octahydro-Lysobactin (48%) (468 μmol Dihydrp- und Octahydro- Lysobactin enthalten als reine Peptide bestimmt durch Aminosäureanalyse) werden in 77.5 ml Methanol gelöst und dann mit 667 ml Spaltpuffer (0.1M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5M Harnstoff pH 8) versetzt. Vor der Enzymzugabe wird die Lösung im Trockenschrank auf 37°C erwärmt. 31 mg Chymotrypsin (31 ml Chymotrypsinlösung Wasser / Ethylenglykol 1:1, lmg/ml; 1:25; 37 ⁰ C vorgewärmt) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37 ⁰ C durchgeführt. Es werden 200 μl Aliquots nach 0.5, 1 Std. entnommen und die Enzymspaltung mit 200 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Proben werden mit der HPLC parallel zur Enzymspaltung innerhalb von 15 min. analysiert (Retentionszeit Fragment 4-11 ca. 3.6 min, Fragment 1-3 (LLF) ca. 9.6 min, Fragment 1-3 (LL(3-Cyclohexyl)A) ca. 11.3 min) (Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1% TFA, Gradient 0 min 30% B, 10 min 80% B, 11 min 100% B, 12 min 30% B, 15 min 30% B; Fluss: 0.7 ml/min, Temperatur: 40 ⁰ C, UV-Detektion 210 nm). Die Enzymreaktion wird nach 60 min. mit 30 ml Acetonitril und ca. 6 ml TFA abgestoppt. Der pH- Wert der Lösung soll zwischen 1 und 2 liegen. Bis zur präparativen Trennung kann die Lösung bei -20 ⁰ C gelagert werden.

Präparative Trennung der Fragmente 1-3 und 4 -11

Die Spaltansätze 1 und 2 werden über einen Filter (0.2 μm) filtriert und dann vereinigt. Die Lö¬ sung wird in mehreren Portionen aufgeteilt und jeweils an einer Source 15RPC-Säule mit einem Acetonitril/TFA-Gradienten wie oben beschrieben chromatographiert. Die Läufe werden nachein¬ ander durchgeführt und die Fraktionen im gleichen Röhrchen gesammelt. Die resultierenden Chromatogramme sind deckungsgleich.

Das Fragment 4-11 (Rt. ca. 15 min) wird zusammengegeben, mit Wasser 1:1 verdünnt und dann lyophilisiert.

Die Ausbeute an Fragment 4-11 beträgt nach der Lyophilisation 1.1 g (1095 μmol) Bei einem Einsatz von 1150 μmol an spaltbarem Material ist die Ausbeute an Fragment 4-11 (95% d. Th.).

Beispiel 13

Präparative Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Sub¬ stratkonzentration 3 mg/ml

2 x 0.995 g eines Gemisches aus Dihydro- (52%) und Octahydro-Lysobactin (37%) werden in je 33 ml Methanol gelöst und dann mit je 257 ml Spaltpuffer (0.1M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5M Harnstoff pH 8) versetzt. Vor der Enzymzugabe wird die Lösung im Trockenschrank auf 37°C erwärmt. 39.6 mg Chymotrypsin (39.6 ml Chymotrypsinlösung Wasser / Ethylenglykol 1 :1, 1 mg/ml; 1:25; 37°C vorgewärmt) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37 ⁰ C durchgeführt. Es werden 200 μl Aliquots nach 0.5, 1 Std. entnommen und die Enzymspaltung mit 200 μl 30% Ace- tonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Proben werden mit der HPLC parallel zur Enzymspaltung innerhalb von 15 min. analysiert (Retentionszeit Fragment 4-11 ca. 3.6 min, Fragment 1-3 (LLF) ca. 9.6 min., Fragment 1-3 (LL(3-Cyclohexyl)A) ca. 11.3 min) (Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1% TFA, Gradient 0 min 30% B, 10 min 80% B, 11 min 100% B, 12 min 30% B, 15 min 30% B; Fluss: 0.7 ml/min, Temperatur: 40 ⁰ C, UV-Detektion 210 nm). Die Enzymreak- tionen werden nach 60 min. mit je 30 ml Acetom ^' tril und ca. 2.5 ml TFA abgestoppt. Der pH-Wert der Lösung soll zwischen 1 und 2 liegen. Bis zur präparativen Trennung kann die Lösung bei - 20 ⁰ C gelagert werden.

Beispiel 14

Präparative Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Octahydro-Lysobactin Sub- stratkonzentration 5 mg/ml

10 g Dihydro- (ca. 40%) und Octahydro-Lysobactin (ca. 60%) werden in 200 ml Methanol gelöst und dann mit 1700 ml Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. Vor der Enzymzugabe wird die Lösung im Trockenschrank auf 37°C erwärmt. 400 mg Chymotrypsin (100 ml Chymotrypsinlösung Wasser / Ethylenglykol 1: 1, 4 mg/ml; 1:25; 37 ⁰ C vor- gewärmt) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 200 μl Ali¬ quots nach 0.5, 1 h entnommen und die Enzymspaltung mit 200 μl 30% Acetonitril / 0.1% TFA abgestoppt. Die Proben werden mit der HPLC parallel zur Enzymspaltung innerhalb von 15 min analysiert (Retentionszeit Fragment 4-11 ca. 3.6 min, Fragment 1-3 (LLF) ca. 9.6 mm, Fragment 1-3 (LLA(3-cyclohexyl)) ca. 11.3 min) (Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1% TFA, Gradient 0 min 30% B, 10 min 80% B, 11 min 100% B, 12 min 30% B, 15 min 30% B; Fluss: 0.7 ml/min, Temperatur: 40 ⁰ C, UV-Detektion 210 nm). Die Enzymreaktion wird nach 60 min mit 75 ml Acetonitril und ca. 15 ml TFA abgestoppt. Der pH- Wert der Lösung soll zwi¬ schen 1 und 2 liegen. Bis zur präparativen Trennung kann die Lösung bei -20 ⁰ C gelagert werden.

Das Fragment 4-11 wird wie oben beschrieben in mehreren Läufen durch präparative HPLC iso¬ liert.

Die Aktivität der eingesetzten Chymotrypsincharge (70U/mg) wird durch eine Kontrollspaltung mit dem Protein Interleukin-4-Doppelmutein Arg(121) → Asp(121) / Tyr(124) → Asp(124) (BAYER Healthcare AG ₁ D- Wuppertal) überprüft.

Beispiel 15

Subtilisin-Spaltung von Dihydro-Lysobactin

200 μg Dihydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 4 μg Subtilisin (1:50) wer- den hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -2O ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Subtilisin-Spaltprodukte siehe Tabelle 3.

Beispiel 16

Subtilisin-Spaltung von Octahydro-Lysobactin

200 μg Octahydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 4 μg Subtilisin (1:50) wer¬ den hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Subtilisin-Spaltprodukte siehe Tabelle 3.

Die Aktivität der eingesetzten Subtilisincharge (ca.12 U/mg) wird durch eine Kontrollspaltung mit dem Protein Literleukin-4-Doppelmutein Arg(121) →- Asp(121) / Tyr(124) → Asp(124) (BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal) überprüft.

Beispiel 17

Thermolysin-Spaltung von Dihydro-Lysobactin

200 μg Dihydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan / 5 mM Calciumchlorid pH 7.45) versetzt. 4 μg Ther-

molysin (1:50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Thermolysin-Spaltprodukte siehe Tabelle 4.

Beispiel 18

Thermolysin-Spaltung von Octahydro-Lysobactin

200 μg Octahydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Ammoniumhydrogencarbonat / 0.5 M Harnstoff pH 8) versetzt. 4 μg Thermolysin (1:50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37 ⁰ C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abge¬ stoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Thermolysin-Spaltprodukte siehe Tabelle 4.

Die Aktivität der eingesetzten Thermolysincharge (ca. 55U/mg) wird durch eine Kontrollspaltung mit dem Protein Interleukin-4-Doppelmutem Arg(121) → Asp(121) / Tyr(124) → Asp(124) (BAYER Healthcare AG, D- Wuppertal) überprüft.

Beispiel 19

Papain-Spaltung von Dihydro-Lysobactin

200 μg Dihydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Natriumphosphat / 10 mM Cystein, 2 mM EDTA pH 6.5) versetzt. 4 μg Papain (1:50) wer- den hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Papain-Spaltprodukte siehe Tabelle 5.

Beispiel 20

Papain-Spaltung von Octahydro-Lysobactin

200 μg Octahydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Natriumphosphat / 10 mM Cystein, 2 mM EDTA pH 6.5) versetzt. 4 μg Papain (1:50) wer¬ den hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5,

1, 3, 6 imd 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Papain-Spaltprodukte siehe Tabelle 5.

Die Aktivität der eingesetzten Papaincharge (ca.11 U/mg) wird durch eine Kontrollspaltung mit dem Protein Interleukin-4-Doppelmutein Arg(121) → Asp(121) / Tyr(124) → Asp(124) (BAYER Healthcare AG, D- Wuppertal) überprüft.

Beispiel 21

Proteinase K-Spaltυng von Dihydro-Lysobactin

200 μg Dihydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Natriumtetraborat pH 9) versetzt. 4 μg Proteinase K (1:50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnom¬ men und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Proteinase K-Spaltprodukte siehe Tabelle 6.

Beispiel 22

Proteinase K-Spaltung von Octahydro-Lysobactin

200 μg Octahydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Natriumtetraborat pH 9) versetzt. 4 μg Proteinase K (1:50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnom- men und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Proteinase K-Spaltprodukte siehe Tabelle 6.

Die Aktivität der eingesetzten Proteinase K Charge (ca.30U/mg) wird durch eine Kontrollspaltung mit dem Protein Interleukin-4-Doppelmutein Arg(121) -» Asp(121) / Tyr(124) → Asp(124) (BAYER Healthcare AG, D- Wuppertal) überprüft.

Beispiel 23

Bromelain-Spaltung von Dihydro-Lysobactin

200 μg Dihydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Natriumphosphat, 10 mM Cystein, 2 πiM EDTA pH 6.5) versetzt. 4 g Bromelain (1:50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abge¬ stoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Bromelain-Spaltprodukte siehe Tabelle 7.

Beispiel 24

Bromelain-Spaltung von Octahydro-Lysobactin

200 μg Octahydro-Lysobactin werden in 10 μl Methanol gelöst und dann mit 190 μl Spaltpuffer (0.1 M Natriumphosphat, 10 mM Cystein, 2 mM EDTA pH 6.5) versetzt. 4 μg Bromelain (1 :50) werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Enzymspaltung mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abge- stoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -2O ⁰ C gelagert.

Peptidsequenzen der Bromelain-Spaltprodukte siehe Tabelle 7.

Die Aktivität der eingesetzten Bromelain Charge (ca.4U/mg) wird durch eine Kontrollspaltung mit dem Protein Interleukin-4-Doppelmutein Arg(121) → Asp(121) / Tyr(124) → Asp(124) (BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal) überprüft.

Beispiel 25

Enzymatische Synthese von Dihydro-Lysobactin mit Chymotrypsin

800 μg Peptid Leu-Leu-PheOMe und 100 μg Peptid 4-11 werden in 200 μl Methanol gelöst und dann mit 200 μl Synthesepuffer (0.1 M Natriumtetraborat pH 9) versetzt. 24 μg Chymotrypsin werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Synthese mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20°C gelagert.

Der Nachweis von Dihydro-Lysobactin erfolgt mittels HPLC und CZE.

Beispiel 26

Enzymatische Synthese von Dihydro-Lysobactinderivaten mit Chymotrypsin

800 μg Peptid Boc-Leu-Leu-PheOMe werden in 200 μl Tetrachlormethan gelöst und dann mit 200 μl Synthesepuffer (0.1 M Natriumtetraborat pH 9) der 100 μg Peptid 4-11 enthält versetzt. 24 μg Chymotrypsin werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Synthese mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -2O ⁰ C gelagert.

Der Nachweis von Dihydro-Lysobactinderivaten erfolgt mittels HPLC und CZE.

Beispiel 27

Enzymatische Synthese von Octahydro-Lysobactin mit Chymotrypsin

800 μg Peptid Leu-Leu-Ala(3-cyclohexyl)OMe und 100 μg Peptid 4-11 werden in 200 μl Metha¬ nol gelöst und dann mit 200 μl Synthesepuffer (0.1 M Natriumtetraborat pH 9) versetzt. 24 μg Chymotrypsin werden hinzugegeben und die Reaktion bei 37°C durchgeführt. Es werden 30 μl Aliquots nach 0, 0.5, 1, 3, 6 und 24 h entnommen und die Synthese mit 30 μl Acetonitril / 1% TFA abgestoppt. Die Proben werden bis zur Analyse bei -20 ⁰ C gelagert.

Der Nachweis von Octahydro-Lysobactin erfolgt mittels HPLC und CZE.

Beispiel 28

TV-terminale Sequenzanalyse

3 nmol in 60% Acetonitril/0.1% TFA gelöste Fragmente werden auf ein Sequenzer-sheet, das mit Polybren ^R vorinkubiert ist, geladen. Die Proteine werden mit dem normalen Sequenzerzyklus se¬ quenziert. Die PTH-Aminosäuren werden mittels Online-HPLC mit Hilfe eines 40 pmol PTH- Standards identifiziert. Die nicht proteinogenen Aminosäuren werden durch ihre relative Lage zu den Staπdardaminosäuren identifiziert. Die Reinheit der Peptide wird über die Aminosäure des l.PTH-Zyklus abgeschätzt. Die verschiedenen Peptide werden über 4 bis 12 Stufen sequenziert. Die Tabellen 1 bis 7 zeigen die bestimmten Proteinsequenzen.

Tabelle 1: Peptidsequenzen der Substrate

Tabelle 2: Sequenzanalyse von verschiedenen Peptiden (1-3) bzw. Peptidfragmenten (1-3) der Chymotrypsin-Spaltung.

*Die PTHAla(3-cyclohexyl) ist mit dem verwendeten PTH-System als Peak nicht detektierbar.

Tabelle 3: Sequenzanalyse von verschiedenen Peptiden bzw. Peptidfragmenten der Subtilisin- Spaltung von Dihydro- und Octahydro-Lysobactin (1^4). Das Spaltprodukt 4-10 entsteht in größe¬ rem Umfang erst nach 24 h.

*Die PTHAla(3-cyclohexyl) ist mit dem verwendeten PTH-System als Peak nicht detektierbar.

Tabelle 4: Sequenzanalyse von verschiedenen Peptiden bzw. Peptidfragmenten der Thermolysin- Spaltung von Dihydro- und Octahydro-Lysobactin (1-3).

"Die PTHAla(3-cyclohexyl) ist mit dem verwendeten PTH-System als Peak nicht detektierbar.

Tabelle 5: Sequenzanalyse von verschiedenen Peptiden bzw. Peptidfragmenten der Papain- Spaltung von Dihydro- (1, 2, 3, 4) und Octahydro-Lysobactin (1, 2, 3, 5). Das Spaltprodukt 4-10 entsteht in größerem Umfang erst nach 24 h.

^♦ Die PTHAla(3-cyclohexyl) ist mit dem verwendeten PTH-System als Peak nicht detektierbar.

Tabelle 6: Sequenzanalyse von verschiedenen Peptiden bzw. Peptidfragmenten der Proteinase K- Spaltung von Dihydro- (1, 2) und Octahydro-Lysobactin (3, 4).

Tabelle 7: Sequenzanalyse von verschiedenen Peptiden bzw. Peptidfragmenten der Bromelain- Spaltung von open-chain-Lysobactin (1, 4), Dihydro- (2, 4) und Octahydro-Lysobactin (3, 4).

*Die PTHAla(3-cyclohexyl) ist mit dem verwendeten PTH-System als Peak nicht detektierbar.

Beispiel 29

Amiiiosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse stellt einen wichtigen qualitativen und quantitativen Parameter für die Charakterisierung von Proteinen dar. Neben dem Proteingehalt wird bei bekannter Primärstruktur die Anzahl der Einzelaminosäuren ermittelt. Die Aminosäureanalyse Lysobactinderivate bzw. Pep- tidfragmente ist in guter Übereinstimmung mit den theoretischen Werten aus der Primärstruktur (Tabelle 8). Nichtproteinogene Aminosäuren werden nur bei dem Vorhandensein von entspre¬ chenden Standards quantifiziert.

100 μg der Lysobactinderivate bzw Peptidfragmente werden in 200 μl 6 N Salzsäure gelöst und 1 h bei 166°C hydrolysiert. Ca. 5 nmoi der Proben wird auf den Aminosäureanalysator gegeben Die Menge an Aminosäure wird über einen 4 nmol Aminosäurestandard ermittelt.

Tabelle 8: Aminosäureanalyse von Dihydro-, Octahydro-Lysobactm, Dihydro- + Octahydro- Ly- sobactin, Fragment 4-11 und 1-3. Die ganzen Zahlen sind auf He = 1 bzw. Leu = 2 bezogen

Beispiel 30

Reverse Phase Chromatographie

Bei der HPLC-Chromatographie von Proteinen an chemisch gebundene Umkehrphasen kommt es über eine hydrophoben Wechselwirkung der Proteine zu einer Bindung an die verwendete Phase. Die Peptide werden gemäß der Stärke ihrer Bindung an die stationäre Phase von organischen Lö¬ sungsmitteln (mobile Phase) verdrängt. Aus diesem Grund ist diese Methode ein gutes Kriterium für die Beurteilung der Reinheit eines Peptids und zur Kontrolle der Geschwindigkeit der enzyma- tischen Spaltung und der entstehenden Spaltprodukte. Die Peptide Dihydro-Lysobactin und Octa- hydro-Lysobactin eluieren bei ca. 35 min und ca. 38 min, das Fragment 4-11 bei ca. 16 min, 1-3 (LLF) bei ca. 31 min und 1-3 (LLA(3-cyclohexyl)) bei ca. 37 min von der RP-18-Phase. Die Ab¬ bildung 1 zeigt den zeitlichen Verlauf einer präparativen enzymatischen Spaltung mit Chy- motrypsin (Beispiel 11).

Ca. 20 μg der enzymatischen Spaltprodukte bzw. der Ausgangsverbindungen Dihydro-Lysobactin und Octahydro-Lysobactin oder des Gemisch werden an einer Zobax 300SB-Ci ₈ -column (4.6 mm x 150 mm; 3.5 μm Material; 300 Angström Porendurchmesser) chromatographiert. Als Eluent wird ein Acetonitril/TFA-Gradient verwendet. Bedingungen: Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1% TFA; Fluss 0.7 ml/min, Säulentemperatur 4O ⁰ C, UV-Detektion 210 nm, Lö¬ sungsmittel A 0.1% TFA, Lösungsmittel B 0.1% TFA / 60% Acetonitril; Gradient: 0 min 0% B, 2 min 10% B, 50 min 80% B, 52 min 100% B, 55 min 0% B, 60 min 0% B.

Beispiel 31

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

Die Kapillarelektrophorese erlaubt die Trennung von Peptiden und Proteinen aufgrund ihrer La¬ dung im elektrischen Feld. Die Güte der Trennung hängt dabei vom Puffer, dem pH-Wert, der Temperatur und den verwendeten Additiven ab. Als Kapillaren werden sogenannte "fused silica" Säulen mit einem Innendurchmesser von 50-100 μm eingesetzt. Diese Methode ist ein sehr gutes Kriterium für die Beurteilung der Reinheit eines Peptids und zur Kontrolle der Entstehung von enzymatischen Spaltprodukten. Die Peptide Dihydro-Lysobactin und Octahydro-Lysobactin eluie¬ ren bei ca. 21 min, das Fragment 4-11 bei ca. 18 min, 1-3 (LLF) bei ca. 24 min, 1-3 (LLA(3- cyclohexyl)) bei ca. 22 min, die deamidierten Formen als Doppelpeak bei ca. 30 min (1-11) und 24 min (4-11) von der Kapillarsäule. Die Abbildung 2 zeigt den zeitlichen Verlauf einer enzymati¬ schen Spaltung von Octahydro-Lysobactin mit Chymotrypsin (Beispiel 5). Man sieht deutlich die starke Zunahme der deamidierten Produkte nach 24 h im Puffer.

Ca. 4 ng der enzymatischen Spaltprodukte bzw. der Ausgangsverbindungen Dihydro-Lysobactin und Octahydro-Lysobactin oder des Gemisch werden mittels Kapillarelektrophorese an einer Glas¬ säule (Länge 72 cm, Innendurchmesser 50 μm) untersucht. Bedingungen: Stromstärke 90 uA, Säu¬ lentemperatur 25°C, 100 mM Phosphatpuffer pH 3.0, UV-Detektion 210 nm, Aufgabe unter Druck 3 Sekunden.

Beispiel 32

Molekulargewichtsbestimmung durch HPLC-ESI-MS

Peptide und enzymatische Spaltprodukte werden mittels RP-18-HPLC-Chromatographie getrennt und das Molekulargewicht durch Elektronenspray-Ionisation (ESI) bestimmt.

Ca. 100 μg Chymotrypsinspalrung vom Gemisch aus Dihydro-Lysobactin und Octahydro- Lysobactin werden mit einer Zorbax C18-HPLC-Säule unter folgenden Bedingungen aufgetrennt: Solvent A 0.1% TFA, Solvent B 60% Acetonitril/0.1% TFA; Fluss 0.7 ml/min, Säulentemperatur 4O ⁰ C, UV-Detektion 210 nm, Lösungsmittel A 0.1% TFA ₅ Lösungsmittel B 0.1% TFA / 60% Ace- tonitril; Gradient: 0 min 0% B, 2 min 10% B, 50 min 80% B, 52 min 100% B, 55 min 0% B, 60 min 0% B. Die Peptide werden in die Atmosphärendruckionenquelle des Massenspektrometers überführt und dort ionisiert. Von dort werden die Ionen in den Hochvakuumbereich des Mas¬ senspektrometers überführt und detektiert. Die Tabelle 9 zeigt die bestimmten Molekulargewichte.

Tabelle 9: Molekulargewichte von Dihydro-Lysobactin, Octahydro-Lysobactin und von enzymati¬ schen Spaltprodukten im Vergleich mit den theoretischen Molekulargewichten (MW) in Dalton.

Beispiel 33

Präparative Chymotrypsinspaltung vom Gemisch Dihydro- / Oktahydro-Lysobactin

18.27 g Dihydro- und Okta-Lysobactin (ca. 5:4) werden in 365 ml Methanol gelöst und mit Chy- motrypsin (731 mg) und Spaltpuffer auf 3654 ml verdünnt. Die Reaktion wird 30 min. bei 37 ⁰ C durchgeführt und dann mit 20 ml TFA und 150 ml Acetonitril abgestoppt. Vor der Enzymzugabe werden die Lösungen im Trockenschrank auf 37°C erwärmt. Es werden 200 μl Aliquote nach 0 und 0.5 h entnommen und die Enzymspaltung mit 200 μl 0.1% TFA in 30% Acetonitril / 70% Wasser abgestoppt. Die Proben werden mit der HPLC analysiert (Retentionszeit Fragment 4-11 ca. 3.6 min., Fragment 1-3 (LLF) ca. 9.6 min., Fragment 1-3 (LL(Hexahydro)F) ca. 11.3 min.) (Eluent A: 0.1% TFA in Wasser, Eluent B: 0.1% TFA in 60% Acetonitril/ 40% Wasser, Gradient: 0 min 30% B, 10 min 80% B, 11 min 100% B, 12 min 30% B, 15 min 30% B; Fluss: 0.7 ml/min, Säulen¬ temperatur: 40°C, Detektion: 210 nm). Alternativ wird Methode 11 verwendet. Die Lösung wird auf 9 x 500 ml Portionen verteilt und bis zur präparativen RP-Trennung bei -70 ⁰ C tiefgefroren. Das Fragment 4-11 wird in mehreren Läufen durch präparative HPLC isoliert.

Präparative Trennung der Fragmente 1-3 und 4 -11:

Ca. 800 ml der Spaltlösung werden über eine Kartusche (0.2 μm) filtriert und in zwei Portionen zu ca. 400 ml an einer Source 15RPC-Säule (Säulengröße: 2360 ml) mit einem Methanol/TFA- Gradienten chromatographiert. Eluent A: 0.1% TFA in Wasser, Eluent B: 0.1% TFA in 100% Me¬ thanol; Fluss: 30 ml/min.; Detektion 215 nm. Der Gradient wird nach Säulenvolumen gefahren: Nach dem Auftrag wird mit 3.6 Säulenvolumen Eluent A gewaschen, dann in 18 Säulenvolumen nach 45%B, in 0.67 Säulenvolumen nach 100% B, 1.3 Säulenvolumen 100%B, in 0.67 nach 0%B, 7 Säulenvolumen Eluent A zur Äquilibrierung.

Als Produkt erhält man 10.36 g (77% d. Th.) Fragment 4-11.

HPLC/UV-Vis (Methode 4): R ₁ = 0.5 min.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.0 min;

MS (ESIpos.): m/z (%) = 453.6 (100) [M + 2H] ²⁺ , 906 (10) [M + H] ⁺ .

MS (ESIneg.): m/z (%) = 904 (100) [M - H] ^" .