MéTODO PARA BLOQUEAR LA INFECCIóN POR FLAVIVIRUS, MOLéCULAS Y

USOS. Campo de Ia invención

La presente invención esta relacionada con el campo de Ia virología, Ia biotecnología y Ia industria farmacéutica. En particular esta relacionada con métodos para el modular o bloquear Ia infección con virus Dengue (VD) basados en el bloqueo de Ia interacción del virus con su receptor celular. El virus Dengue (VD) emplea el receptor de Ia Alfa 2-macroglobulina (A2MR) para su entrada en células de mamíferos y que puede emplear Ia Alfa 2-macroglobulina (A2M) como proteína portadora que facilita Ia interacción del virus con este receptor. La presente invención establece Ia interacción directa con Ia A2M humana y define una región de Ia proteína de Ia E del virus involucrada en esta interacción. Además, en Ia presente invención se definen péptidos derivados de Ia proteína E que interfieren en Ia interacción del virus con su receptor celular A2MR e inhiben Ia infección a células de mamíferos. Estas moléculas constituyen por Io tanto potenciales agentes farmacológicos para Ia prevención y el tratamiento de Ia enfermedad causada por infección con VD.

Arte Previo El virus dengue (VD) pertenece a Ia familia Flavivirídae, género Flavivirus (FV). Existen cuatro VD genéticamente relacionados pero que son reconocidos como serotipos diferentes (VD1 , VD2, VD3 y VD4) {Henchal E.A. and Putnak J. R. 1990 The dengue viruses. Clin. Microbiol. Rev. 3: 376-396). La homología de secuencia del genoma completo de estos es de aproximadamente un 70%. La infección por un serotipo del virus confiere inmunidad duradera para el serotipo homólogo, no siendo así para el resto de los serotipos. Las infecciones secundarias con serotipos heterólogos son muy comunes y están relacionadas con el desarrollo de las formas más graves de Ia enfermedad (Halstead,S.B. Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. (2003) Adv. Virus Res. 60:421-67., 421-467. Hammon WMc. (1960) New haemorragic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians; 73: 140-155). Al desarrollar una vacuna para el VD es preciso garantizar protección contra los cuatro serotipos. La variación

existente aún en cepas del mismo serotipo puede conllevar a que los anticuerpos generados contra una cepa no logren proteger ante Ia infección por una segunda cepa del mismo serotipo. Esto convierte el desarrollo de una vacuna efectiva, segura y además económica, en un reto cada vez mayor. Una estrategia alternativa para uso terapéutico Ia constituye el uso de moléculas con actividad antiviral.

El ciclo replicativo de los viriones del VD comienza con Ia entrada de las partículas virales a! interior de las células hospederas. En células de mamíferos los viriones penetran a las células hospederas a través de un mecanismo de endocitosis mediada por receptor (Hase T., Summers .PL. and Eckels K.H. (1989) Flavivirus entry into cultured mosquito cells and human peripheral blood monocytes. Arch Virol. 104: 129-143). El descenso del valor de pH en los endosomas provoca un cambio conformacional irreversible en los viriones que induce Ia fusión de estos a Ia membrana endosomal y el desensamblaje de los mismos (Mukhopadhyay S., Kuhn RJ. and Rossmann M. G. (2005) A structural perspective of the flavivirus Ufe cycle. Nat Rev Microbiol. 3: 13-22).

El genoma liberado al citoplasma se traduce en una única poliproteína que es procesada co- y post-traduccionalmente por proteasas virales y celulares. El ensamblaje de los nuevos viriones se lleva a cabo en Ia superficie del retículo endoplasmático desde donde las proteínas estructurales y las moléculas de ARN genómico pasan al lumen y continúan a través del complejo de golgi. Desde este último compartimento salen en vesículas intracelulares como viriones maduros que son liberados al exterior por exocitosis (Mukhopadhyay S., Kuhn RJ. and Rossmann M. G. (2005) A structural perspective of the flavivirus Ufe cycle. Nat Rev Microbiol. 3: 13-22). La entrada del VD a las células hospederas depende de Ia interacción que establezcan estas partículas con moléculas receptoras específicas en Ia superficie celular. Hasta el momento se han identificado varias moléculas de superficie con evidencias de que intervienen en Ia entrada de los viriones a las células y son considerados posibles receptores del virus. Experimentalmente, los eventos iniciales de Ia interacción del VD con las células que dan lugar a Ia infección viral se han podido diferenciar en una etapa de adsorción del virus por interacción con moléculas

de Ia superficie que tiene lugar a 4 ^o C y otra etapa de penetración por endocitosis mediada por receptor que requiere de Ia incubación de las células a 37° C para tener lugar (Hung SL, Lee PL, Chen HW, Chen LK, Kao CL, King CC (1999) Analysis of the steps involved in Dengue virus entry into host cells Virology; 257:156- 67). En estas etapas pueden estar involucradas tanto diferentes regiones de Ia proteína de Ia envoltura del virus como diferentes moléculas de Ia superficie de las células (CrM WD, Roehrig JT (2001) Monoclonal antibodies that binó to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells. J Virol. 75:7769-73). Entre las moléculas de superficie identificadas aparecen los proteoglicanos (Chen Y., Maguire T., H ¡lemán R.E., Fromm J. R., Esko J. D., Linhardt RJ. and Marks RM. (1997) Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nat. Med. 3: 866-871), las que se ha propuesto que funcionan concentrando las partículas virales en Ia superficie celular para su posterior interacción con los receptores específicos de alta afinidad (Halstead S. B., Heinz FX., BarrettA.D. and Roehrig J. T. (2005) Dengue virus: molecular basis of cell entry and pathogenesis, 25-27 June 2003, Vienna, Austria. Vaccine. 23: 849-856). Por otro lado también se ha descrito que las proteínas asociadas a CD14 en macrófagos y monocitos pudiesen actuar como receptores del virus en estas células (Chen Y.C., Wang S. Y. and King CC. (1999) Bacterial lipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent mechanism. J Virol. 73: 2650-2657). Otras moléculas propuestas como receptores del VD son GRP78/Bip (Jindadamrongwech S. and Smith DR. (2004) Virus Overlay Protein Binding Assay (VOPBA) reveáis serotype specific heterogeneity of dengue virus binding proteins on HepG2 human liver cells. Intervirology. 47: 370-373. Reyes-Del Valle J., Chavez-Salinas S., Medina F. and Del ángel RM. (2005) Heat shock protein 90 and heat shock protein 70 are components of dengue virus receptor complex in human cells. J Virol. 279: 4557- 4567) y el receptor de laminina (Thepparit C. and Smith D. R. (2004) Serotype- specific entry of dengue virus into liver cells: identification of the 37-kilodalton/67- kilodalton high-affinity laminin receptor as a dengue virus serotype 1 receptor. J Virol. 278: 12647-12656. Tío P.H., Jong W.W. and Cerdosa MJ. (2005) Two

dimensional VOPBA reveáis laminin receptor (LAMR1) interaction with dengue virus serotypes 1, 2 and 3. Virol J. 2: 25).

En células dendríticas inmaduras Ia proteína DC-SIGN desempeña un rol muy importante en Ia entrada de los viriones del VD. Sin embargo, el papel preciso de esta proteína parece estar relacionado igualmente con Ia concentración de las partículas virales en Ia superficie de las células y no con Ia endocitosis de las partículas virales. (Tassaneetrithp B., Burgess T.H., Granelli-Piperno A., Trumpfheller C ₁ Finke J., Sun W., Eller M.A., Pattanapanyasat K., Sarasombath S., Birx D. L. Steinman R.M., Schlesinger S., and Marovich M.A. (2003) DC-SIGN (CD209) mediates Dengue Virus infection of human dendritic cells. J. Exp. Med. 197: 823-829. Navarro-Sánchez E., Altmeyer R., Amara A, Schwartz O, Fieschi F, Virelizier JL, Arenzana-Seisdedos F. and Despres P. (2003) Dendritic-cell-specific ICAM3-grabbing non-integrín is essential for the productive infection of human dendritic cells by mosquito-cell-derived dengue viruses. EMBO Rep. 4: 723-728. Lozach PY, Burleigh L, Staropoli I, Navarro-Sánchez E ₁ Harriague J, Virelizier JL, Rey FA, Despres P, Arenzana-Seisdedos F, Amara A (2005) Dendritic cell-specific intercellular adhesión molecule 3-grabbing non-integrín (DC-SIGN)-mediated enhancement of dengue virus infection is independent of DC-SIGN internalization signáis. J Biol Chem. 280:23698-708). La proteína de Ia envoltura (E) del VD y demás FV juega un papel fundamental en Ia unión a los receptores celulares, Ia fusión de membranas y el ensamblaje de los viriones. En consecuencia, sus propiedades son determinantes importantes del rango de hospedero y Ia virulencia, así como de Ia inducción de inmunidad protectora (Heinz F. X. (1986) Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. Adv Virol. Res. 31: 103-168. Modis Y., Ogata S., Clements D. and Harrison S. C. (2005) Variable suríace epitopes in the crystal structure of dengue virus type 3 envelope glycoprotein. J Virol. 79: 1223-1231). Esta proteína tiene una masa molecular de 53 a 54 kDa y es el más conservado de los polipéptidos estructurales, con aproximadamente un 40% de identidad en su secuencia aminoacídica entre los FV (Mukhopadhyay S., Kuhn RJ. and Rossmann M. G. (2005) A structural perspective of the flavivirus Ufe cycle. Nat Rev Microbiol. 3: 13-22). Estudios de cristalografía de rayos X (Modis Y., Ogata S., Clements D. and Harrison S. C. (2003) A ligand-binding

pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc Nati Acad Sci U S A. 100: 6986-6991) y crio-microscopía electrónica {Kuhn R. J., Zhang W., Rossmann, M. G., Pletnev S.V., Corver J., Lenches E., Jones C T. , Mukhopadhyay S., Chipman P.R., Strauss E.G., Baker TS. and Strauss J.H. (2002) Structure of Dengue Virus: Implications for Flavivirus Organizaron, Maturation, and Fusión. CeII. 108: 717-725) revelan que, al igual que en otros FV, Ia proteína E del VD se encuentra formando dímeros en Ia superficie de los viriones maduros.

De los aproximadamente 500 residuos de aminoácido de cada monómero de la proteína E, el 80 % se encuentra formando parte del ectodominio N-terminal. El resto constituye Ia región transmembranaria que ancla Ia proteína E en Ia envoltura lipídica. En Ia estructura primaria de Ia proteína E aparecen 12 residuos de Cys estrictamente conservados que forman 6 puentes disulfuro (Nowak T. and Wengler G. (1987) Analysis of the disulphides present in the membrane protein of the West NiIe flaviviruses. Virology. 156: 127-137. Hahn Y.S., Daller R., Hunkapiller T, Dalrymple J. M., Strauss J. H., and Strauss E. G. (1988) Nucleotide sequence of Dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses. Virology. 162: 167-180), los cuales juegan un papel muy importante en Ia expresión de epitopos de esta proteína (Roehrig J. T., Volpe K.E., Squires J., Hunt A.R., Davis B. S. and Chang GJ. (2004) Contríbution of disulfide bridging to epitope expression of the dengue type 2 virus envelope glycoprotein. J Virol. 78: 2648-2652).

La cadena polipeptídica que conforma el fragmento soluble de Ia proteína E se ensambla en tres dominios estructurales: un dominio central en hoja plegada (dominio I), una región de dimerización elongada (dominio II) y una tercera región tipo inmunoglobulina (dominio III) (Rey F.A, Heinz FX, and Mandl C. (1995) The envelope glycoprotein from tick-bome encephalitis virus at 2 A resolution. Nature. 375: 291-298. Modis Y., Ogata S., Clements D. and Harrison S.C. (2003) A ligand- binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc Nati Acad Sci U S A. 100: 6986-6991).

El dominio III de Ia proteína E del VD El dominio III (DIII) es una región de gran importancia funcional en Ia proteína E. Mutantes de escape de anticuerpos neutralizantes, así como mutaciones que

alteran el fenotipo viral, tales como mutaciones de atenuación o determinantes de virulencia, están localizados en Ia superficie superior y lateral de este dominio. Está ubicado hacia el carboxilo terminal de cada monómero de Ia proteína E, y comprende los residuos de aminoácidos del 294 al 392. Este dominio constituye Ia región más prominente de los viriones, en los que se encuentra exponiendo su cara lateral y se ubica alrededor de los ejes de simetría 5X y 3X, en cada uno de los cuales aparecen 60 moléculas de dominio (Kuhn RJ. , Zhang W., Rossmann, M. G., Pletnev S. V., Corver J., Lenches E, Jones C T. , Mukhopadhyay S., Chipman P.R., Strauss E.G., Baker TS. and Strauss J. H. (2002) Structure of Dengue Virus: Implications for Flavivirus Organization, Maturation, and Fusión. CeII. 108: 717-725).

La estructura del DIII es muy similar a Ia de las regiones constantes de las inmunoglobulinas. El mismo consiste en un barril β formado por dos hojas beta antiparalelas, una compuesta por las hebras beta A, B, C, D y E, y Ia otra por Ia C, F y G. La estructura terciaria del DIII depende en gran medida de un único puente disulfuro que se establece entre 2 residuos de Cys estrictamente conservados entre todos los FV. La reducción de este puente afecta el reconocimiento de anticuerpos neutralizantes específicos contra el DIII. Numerosos datos provenientes del análisis de Ia estructura de Ia proteína E y de los viriones del VD, así como evidencias experimentales indican que el DIII forma parte de Ia región de interacción de Ia proteína E con los receptores celulares (Hung JJ, Hsieh MT, Young MJ, Kao CL, King CC, Chang W (2004) An external loop región of domain III of dengue virus type 2 envelope protein is involved In serotype-specific binding to mosquito but not mammalian cells. J Viro!. 78:378-88, Críll WD, Roehrig JT (2001) Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells. J Viro!. 75:7769-73, Thullier P, Demangel C, Bedouelle H, Megret F, Jouan A, Deubel V, Mazie JC, Lafaye P (2001) Mapping of a dengue virus neutralizing epitope critical for the infectivity of all serotypes: insight into the neutralization mechanism J Gen Viro!. 82(Pt 8):1885-92).

Péptidos sintéticos también han sido ampliamente utilizados en los estudios de Ia relación estructura-función del DIII. Así, se ha reportado que el péptido 386-397, que incluye Ia región correspondiente a Ia hebra beta G del VD 2, es reconocido por el anticuerpo neutralizante 3H5, el cual interfiere en Ia unión del virus a las células e

inhibe la hemoaglutinación de eritrocitos (Roehríg JT ₁ Bolín RA, Kelly RG (1998) Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica Virology. 246:317-28). Sin embargo mutaciones en esta región de Ia proteína E, no afectan el reconocimiento de virus por el anticuerpo (Hiramatsu K, ládano M, Men R, Lai CJ (1996) Mutational analysis of a neutralization epitope on the dengue type 2 virus (DEN2) envelope protein: monoclonal antibody resistant DEN2/DEN4 chimeras exhibit reduced mouse neurovirulence. Virology. 1996, 224:437-45). En cambio, mutaciones de los residuos E383, P384 y G385, eliminan este reconocimiento. También se ha mostrado que el péptido 380-389, correspondiente a el lazo F-G y parte de Ia hebra G, bloquea Ia interacción del DIII con células de mosquito, pero no con células de mamíferos. (Hung JJ, Hsieh MT, Young MJ, Kao CL, King CC, Chang W (2004) An external loop región of domain III of dengue virus type 2 envelope protein is involved in serotype-specific binding to mosquito but not mammalian cells. J Virol. 78:378-88). Por otra parte, el péptido 306-314 del VD1 , correspondiente a Ia hebra beta A, es reconocido por el anticuerpo neutralizante 4E11 (Thullier P, Demangel C, Bedouelle H, Megret F, Jouan A, Deubel V, Mazie JC, Lafaye P (2001) Mapping of a dengue virus neutralizing epitope critical for the infectivity of all serotypes: insight into the neutralization mechanism J Gen Virol. 82(Pt 8):1885-92). Este péptido inhibe Ia infección del virus en células Vero a altas concentraciones de aproximadamente 500 μM.

Alfa 2-macroglobulina (A2M)

La A2M humana pertenece a Ia familia de las alfa macroglobulinas. Las proteínas de esta familia comparten Ia función de unir un gran número de péptidos, proteínas y partículas sirviendo como barrera de defensa humoral en el plasma y tejidos de los vertebrados. Homólogos de Ia A2M humana se pueden encontrar en Ia circulación de vertebrados e invertebrados así como en Ia clara del huevo de aves y reptiles (Borth W. (1992) Alpha 2-macroglobulin, a multifunctional binding protein with targeting characteristics. 6:3345-53). La A2M humana es una glicoproteína formada por cuatro subunidades de 180 kDa que conforman un homotetrámero de 720 kDa. Esta proteína es sintetizada por

diversos tipos de células, por ejemplo fibroblastos de pulmón, monocitos- macrófagos, hepatocitos y astrocitos. Se han caracterizado cinco sitios reactivos presentes en cada una de las subunidades: 1) La región de "carnada", que consiste en una región de 25 aminoácidos que se sitúa en el medio de cada subunidad y que puede ser cortada virtualmente por proteasas de cualquier clase mecanística, provenientes del mismo organismo o de microorganismos; 2) Un enlace de éster de tiol formado entre las cadenas laterales de una cisteína y una glutamina. Este enlace puede cortarse por calor, por Ia presencia de nucleófilos pequeños como las aminas primarias, agentes reductores y por el agua; 3) El sitio de unión al receptor que comprende 138 aminoácidos del C-terminal de cada subunidad y que queda expuesto luego del corte del éster de tiol; 4) Un sitio de unión a transglutaminasa situado 20 aminoácidos antes de Ia región de "carnada" y 5) un sitio de unión a Zn ²⁺ .

La A2M humana es capaz de inhibir una gran cantidad de enzimas proteolíticas involucradas en un amplio espectro de procesos biológicos como Ia fibrinolisis, Ia formación del coágulo, Ia digestión, Ia respuesta inmune y el crecimiento invasivo de tejidos. El corte de Ia proteasa en Ia región de "carnada" induce un cambio conformacional en Ia molécula que está estrechamente ligado al corte del éster de tiol y que provoca que Ia proteasa quede atrapada en su estructura. De esta forma el sitio activo de Ia proteasa queda inaccesible a sustratos grandes. El cambio conformacional también da lugar a Ia exposición de Ia región de unión al receptor en cada una de las subunidades que conforman el tetrámero. Los complejos A2M- proteasa son rápidamente eliminados de Ia circulación por endocitosis mediada por receptor (Gonias SL, Balber AE, Hubbard WJ, Pizzo SV (1983) Ligand binding, conformational change and plasma elimination of human, mouse and rat alpha- macroglobulin proteinase inhibitors. Biochem J. 1. 209:99-105).

Además de su actividad como reguladora de proteasas, Ia A2M está involucrada en numerosos procesos a través de Ia unión de diversas moléculas funcionando como proteína portadora que puede liberar sus proteínas cargo en diferentes niveles de Ia vía endocítica. Las funciones de Ia A2M como proteína portadora se han asociado al transporte de Ia vía endocítica al citoplasma, transcitosis y degradación con y sin Ia participación del aparato de presentación antigénica (Pizzo Salvatore V, Gron Hanne (2004) Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex,

US6403092).

La naturaleza química de Ia unión con Ia A2M se ha definido como un factor determinante en el destino final del péptido ó proteína cargo dentro de Ia célula. Las uniones reversibles permiten a los cargos asumir funciones biológicas después de disociarse del complejo en etapas tempranas de Ia vía endocítica. Por el contrario los péptidos ó proteínas unidos irreversiblemente deben alcanzar los compartimentos lisosomales donde tiene lugar su degradación (Borth W. (1992) Alpha 2-macroglobulin, a multifunctional binding protein with targeting characterístics The FASEB journal 6:3345-53). El receptor de Ia Alfa 2-macroglobulina

El receptor de Ia A2M (A2MR) también conocido como proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1) y como CD91 , ha sido relacionado con numerosas funciones de vital importancia como el metabolismo de los lípidos, Ia hemostasia, Ia activación de enzimas lisosomales y Ia neurotransmisión.

A2MR es un heterodímero formado por una cadena α extracelular de 500 kDa unida no covalentemente a Ia cadena β transmembranaria de 85 kDa. La cadena α contiene cuatro agrupaciones de 2, 8, 10 y 11 sitios de unión a ligando del tipo de las regiones ricas en cisternas de las proteínas del complemento. A continuación de cada agrupación de sitios de unión a ligando se encuentra un dominio de similitud con el Factor de crecimiento epidérmico conformado por regiones ricas en cisteínas y dominios YWTD. La cola citoplasmática de Ia cadena β contiene dos secuencias NPxY que sirven de sitios de acoplamiento a las proteínas involucradas en Ia señalización y Ia endocitosis (Herz J, Stríckland DK. (2001) LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor. J Clin Invest. 108:779-84).

A2MR reconoce al menos 30 ligandos diferentes de diferentes familias de proteínas que incluyen lipoproteínas, proteasas, complejos proteasa-inhibidor, proteínas de Ia matriz extracelular, toxinas bacterianas, viruses y varias proteínas intracelulares. Los estudios encaminados a esclarecer las características de Ia interacción de los diferentes ligandos con A2MR revelan que Ia capacidad del receptor para unir esa amplia diversidad de moléculas proviene de Ia presencia de los 31 sitios de unión a

ligando cada uno con una superficie de interacción única. La unión de alta afinidad de las diferentes moléculas al receptor implica por Io general Ia interacción con varios sitios de unión a ligando a Ia vez.

El receptor A2MR humano reconoce ligandos de otras especies con una reactividad de afinidad similar a los ligandos de origen humano.

Descripción detallada de Ia invención.

La interacción de los virus con su receptor celular es un determinante primario del grado de infectividad. El desarrollo de compuestos que bloqueen Ia interacción de un virus con su receptor celular puede conducir a Ia obtención de un potente compuesto antiviral.

En el caso del VD se ha demostrado que existe una alta correlación entre Ia viremia y Ia severidad de Ia enfermedad. La obtención de una droga antiviral efectiva que logre disminuir Ia carga viral alcanzada en un individuo es una estrategia muy atractiva para el control de las formas severas de Ia enfermedad. Para el VD el desarrollo de drogas antivirales basadas en el bloqueo al receptor celular ha estado limitado por el conocimiento del receptor que determina Ia endocitosis del virus, Ia forma de unión y los principios del reconocimiento.

La presente invención se basa en el hallazgo de que el DIII de Ia proteína E del VD2, cepa jamaica (Seq. ID.1) puede formar complejos de unión reversible con Ia

A2M del plasma humano (Seq. ID. 2) y que el bloqueo del receptor A2MR (Seq. ID.

3) empleando anticuerpos anti-receptor o ligandos competitivos inhibe Ia infección por VD en células de mamíferos. Lo anterior sugiere el papel de Ia A2M como proteína portadora del virus al receptor A2MR y por tanto una vía para Ia entrada del virus a las células por endocitosis mediada por este receptor.

La A2M y su receptor A2MR son de una amplia distribución en términos de los tipos de tejidos y los organismos en los que se pueden encontrar homólogos de estas proteínas. Ambas moléculas (A2M y A2MR) provienen de familias ancestrales de proteínas. Existe una alta similitud estructural y de secuencia de aminoácidos entre los miembros de cada familia. Por tanto, Ia actividad de estas moléculas como

receptores del VD potencialmente se aplica a una amplia variedad de tipos celulares y organismos. Dada Ia alta similitud entre los dominios de unión a ligando de los diferentes miembros de Ia familia del receptor de LDL, es posible inferir que puede existir interacción entre el VD y otros receptores miembros de esta familia. Como ejemplo, los miembros de Ia familia menor de los rinovirus emplean como receptores en las células que infectan diferentes miembros de Ia familia del receptor de LDL, éstos son el receptor de lipoproteínas de baja densidad, el receptor de las lipoproteínas de muy baja densidad y LRP1 (Hofer F, Gruenberger M, Kowalski H, Machat H, Huettinger M, Kuechler E ₁ Blass D (1994) Members of the low density lipoprotein receptor family medíate cell entry of a rninor-group common cold virus. Proc Nati Acad Sci 1; 91:1839-42). Se conoce que las proteínas de Ia superficie de esta familia de virus que ¡nteractúan con los receptores son capaces de unir con diferente especificidad miembros de Ia familia del receptor de LDL provenientes de células de primates y murinas. Se ha podido establecer también que esta interacción Ie permite Ia penetración en este tipo de células.

Existe también una alta similitud estructural y de secuencia en Ia proteína E de los FV por Io que potencialmente otros miembros de Ia familia pudieran emplear el receptor A2MR u otro receptor perteneciente a Ia familia del receptor de LDL. El género Flavivirus comprende más de 70 virus muchos de los cuales son potentes patógenos para el hombre. Las enfermedades causadas por los virus de este género se caracterizan por ser síntomas febriles que pueden presentar manifestaciones hemorrágicas, encefalitis y complicaciones hepáticas. Además de los cuatro serotipos del VD, dentro del género FV son de particular importancia para Ia salud humana el virus de Ia Fiebre amarilla, el virus de Ia encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis transmitida por garrapata, el virus de la encefalitis del valle Murray, y el virus del oeste del NiIo.

Con base en los hallazgos anteriormente mencionados, un objeto de Ia presente invención es un método para bloquear Ia infección a células por VD basado en Ia interferencia de Ia interacción del virus con el receptor A2MR. Alternativamente, es posible modular Ia infección con VD interfiriendo Ia interacción con Ia A2M humana. Interferir en Ia interacción con el receptor o en Ia interacción con Ia A2M puede

implicar tanto eliminar Ia interacción como potenciarla. Al eliminar esta interacción se aborta Ia infección viral en una etapa muy temprana porque evita Ia entrada del virus a Ia célula. Al potenciar Ia interacción se puede impedir que el virus endocitado se libere en el medio ligeramente ácido de los endosomas afectando los eventos de fusión de membranas y desnudamiento del ARN viral. Ambos tipos de interferencia han sido efectivos en Ia neutralización de Ia infección para otros virus.

La unión del VD a las células se puede interferir con moléculas que se unan a cualquiera de las dos superficies implicadas en Ia interacción: Ia superficie de interacción en Ia proteína E del virus o Ia superficie de interacción del receptor A2MR. De igual forma es posible interferir Ia unión del VD a las células con moléculas que se unan a Ia superficie de interacción de Ia A2M humana con Ia proteína del virus.

Específicamente en Ia presente invención se muestra que Ia proteína denominada Proteína Asociada al Receptor (que denominaremos RAP en Io adelante en este documento) y que constituye un ligando natural de A2MR así como anticuerpos desarrollados contra el receptor son capaces de inhibir Ia infección del virus a células Vero.

Por tanto, un agente para interferir en Ia interacción del VD con el receptor A2MR puede consistir en un ligando del receptor purificado de su fuente natural o obtenido por vía de ADN recombinante; puede incluir una forma soluble del receptor que comprenda Ia porción extracelular del mismo (región comprendida entre los residuos 20 al 4419, de Ia secuencia identificada en el listado de secuencia como Seq. ID. 3) o un fragmento derivado de esta que mantenga su unión con el VD. Preferiblemente un segmento correspondiente con uno de los dominios de unión a ligando de este receptor (región comprendida entre los residuos 25 al 66, ó 70 al 110, ó 852 al 892, ó 893 al 933, ó 934 al 973, ó 974 al 1013, ó 1014 al 1053, ó 1060 al 1099, ó 1102 al 1142, ó 1143 al 1182, ó 2522 al 2563, ó 2564 al 2602, ó 2603 al 2641 , ó 2642 al 2690, ó 2694 al 2732, ó 2733 al 2771 , ó 2772 al 2814, ó 2816 al 2855, ó 2856 al 2899, ó 2902 al 2940, ó 3332 al 3371 , ó 3372 al 3410, ó 3411 al 3450, ó 3451 al 3491 , ó 3492 al 3533, ó 3534 al 3572, ó 3573 al 3611 , ó 3612 al 3649, ó 3652 al 3692, ó 3693 al 3733, ó 3739 al 3778, de la secuencia identificada en el listado de

secuencia como Seq. ID. 3). Un agente de interferencia puede también consistir en un ligando sintético desarrollado con este objetivo. Un ejemplo de esto último puede ser un péptido sintético desarrollado con métodos que están en el estado del arte y basado en información que se provee en Ia presente invención. Los métodos computacionales se han convertido en herramientas poderosas para el diseño de drogas. Estos métodos son particularmente ventajosos por su capacidad de evaluar una gran cantidad de compuestos con el correspondiente ahorro de tiempo y trabajo experimental. El empleo exitoso de estos métodos requiere de datos sobre Ia estructura tridimensional de las proteínas involucradas en Ia interacción. Son de gran importancia también los datos experimentales que ayudan definir Ia región de interacción en cualquiera de las moléculas reaccionantes.

Considerando el estado del arte de las técnicas de desarrollo de drogas basadas en métodos informáticos de acoplamiento molecular, el hallazgo que se describe en Ia presente invención sobre el papel de Ia A2M y su receptor A2MR en Ia entrada del VD a las células provee una diana para realizar experimentos de búsqueda virtual de compuestos inhibidores de Ia interacción como potenciales antivirales. Se dispone de Ia estructura cristalográfica del VD, y del ectodominio de Ia proteína E. También están disponibles estructuras cristalográficas de dominio estructural que media Ia unión de A2M a A2MR así como de varios dominios de unión de ligando de miembros de Ia familia del receptor de LDL. Por otra parte, en Ia presente invención se definen aminoácidos involucrados en Ia interacción del VD con el receptor celular y se brindan datos acerca de determinantes estructurales de esta interacción.

Por tanto, una vía para obtener las secuencias de péptidos sintéticos y/o moléculas pequeñas para interferir en Ia interacción del VD con el receptor A2MR puede ser el empleo de métodos teóricos que implica el uso de uno o varios métodos de modelaje computacional y de modelos de Ia estructura tridimensional del DIII así como de cualquiera de los dominios de unión a ligando del receptor A2MR. Haciendo uso del (o los) método(s) de modelaje computacional y utilizando las coordenadas espaciales del modelo de Ia estructura del DIII, es posible el modelaje de una cadena principal polipeptídica, formando una estructura tipo horquilla beta antiparalela que incluya un giro beta en el lazo conector entre las hebras beta.

Adicionalmente es posible el modelaje de las cadenas laterales de Ia cadena polipeptídica, de tal manera que Ia Identidad química de estas cadenas y su conformación impliquen contactos atómicos favorables energéticamente. También es posible realizar Ia exploración computacional combinada del espacio de secuencia y del espacio conformacional del péptido, de los rotámeros de cadenas laterales, y Ia selección de las variantes peptídicas más favorables de acuerdo a una evaluación energética de los modelos, indicativo de una mayor afinidad de Ia interacción péptido-proteína.

Las coordenadas del modelo de interacción del DIII con uno y/o varios dominios de unión a ligando del receptor A2MR puede provenir de datos experimentales obtenidos por métodos de difracción de rayos-x y/o RMN o de modelos obtenidos por métodos de modelaje computacional.

También es posible emplear un procedimiento computacional de acoplamiento molecular para reproducir detalles atómicos de Ia interacción entre los péptidos correspondientes a Ia horquilla beta FG del DIII de Ia proteína E de FV con los dominios de unión de ligando del receptor A2MR. De igual forma es posible seleccionar en una base de datos de estructura de moléculas, aquellas que reproduzcan las características de Ia interacción esta interacción como potenciales bloqueadores de Ia infección por un FV. Otro agente de interferencia puede consistir en un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo seleccionado por cualquiera de los métodos en el estado del arte, por ejemplo Ia selección con bibliotecas de fragmentos de anticuerpos expuestas en fagos. En este último caso Ia selección puede propiciar Ia obtención de una respuesta específica contra las regiones de interacción. En el caso de Ia respuesta contra Ia región de interacción del receptor A2MR o alternativamente de Ia A2M, Ia selección debe permitir discriminar entre Ia interferencia en Ia interacción y Ia funcionalidad de estas moléculas.

Un objeto de Ia presente invención es un método para bloquear Ia infección a células por VD basado en el empleo de un agente que interfiera con Ia expresión del receptor A2MR. A partir de los métodos existentes en el estado del arte para el desarrollo de drogas antivirales se puede deducir que un ejemplo puede ser el

empleo de una sonda pequeña de ARN de interferencia que de forma temporal disminuya o suprima Ia expresión del receptor A2MR.

Otro objeto de Ia invención es un método para la prevención o el tratamiento de Ia enfermedad causada por Ia infección con VD que comprende Ia administración de una cantidad efectiva de una molécula con actividad antiviral que interfiera en Ia interacción del VD con un receptor celular siendo el receptor celular A2MR. La molécula con actividad antiviral formulada en condiciones aceptables según las regulaciones para las preparaciones farmacéuticas, puede ser administrada en una cantidad efectiva antes de Ia infección o después de Ia aparición de los síntomas de Ia enfermedad y con diagnóstico confirmatorio de haber sido infectadas por VD.

La molécula con actividad antiviral contra el VD puede emplearse como agente profiláctico antes de Ia exposición en una zona de riesgo de infección por VD. Una zona de riesgo de infección por VD se considera a una región geográfica con circulación conocida del agente transmisor del VD, un mosquito Aedes. Preferiblemente en una zona con circulación de mosquitos Aedes y en Ia que se ha detectado Ia circulación de cualquiera de los serotipos del VD.

Otro objeto de Ia presente invención es un método para prevenir y/o tratar Ia enfermedad causada por Ia infección por VD basado en el empleo de un agente que interfiera Ia interacción del virus con Ia A2M humana. La presente invención también se relaciona con un método para pronosticar Ia susceptibilidad de un tipo de célula a ser infectada con VD. El pronóstico puede ser por detección de Ia presencia del gen que codifica para el receptor A2MR. El término gen incluye el segmento de ADN involucrado en la producción de una cadena polipeptídica, incluye las regiones precedentes y que suceden a Ia región codificante; así como a secuencias intermedias (intrones) entre las secuencias codificantes (exones).

El método comprende el empleo de polinucleótidos de entre 20-50 pares de bases que hibridan con segmentos seleccionados de Ia secuencia del gen que codifica para el receptor A2MR y que en lo adelante denominaremos sonda, en condiciones de interacción que permitan Ia detección dentro de Ia secuencia del gen de regiones entre 80 a 95% de identidad. Los procedimientos para lograr condiciones de

interacción que permitan una mayor selectividad i.e. 95% de identidad, para detectar regiones en el gen de mayor similitud con Ia secuencia de Ia sonda se encuentran bien establecidos en el estado del arte. La sonda que se emplea para hibridar potencialmente puede determinar si el gen codifica para Ia proteína que conserva o no Ia funcionalidad como receptor para el VD.

La presente invención también se relaciona con el empleo de las moléculas desarrolladas para interferir en Ia interacción de VD con el receptor para pronosticar Ia susceptibilidad de un tipo de célula a ser infectada con el virus. El método consiste en Ia detección del receptor A2MR expresado como proteína en Ia superficie de las células. Por ejemplo, puede comprender el empleo de un anticuerpo que reconoce al receptor A2MR, un ligando del receptor o un péptido sintético que interactúa con el receptor que se pone en contacto con las células de interés aisladas y se detecta Ia unión a Ia superficie de las células empleando cualquiera de los métodos en el estado del arte, por ejemplo citometría de flujo asistida por fluoróforos. Un ejemplo de los ligandos que se pueden emplear Io constituyen la A2M y RAP.

La presente invención también se relaciona con un método para pronosticar Ia susceptibilidad de un tipo de célula a ser infectada con VD que consiste en Ia detección del receptor A2MR expresado como proteína. El método comprende Ia obtención de una preparación que contenga Ia totalidad de las proteínas de Ia célula o de una fracción subcelular. Las proteínas previamente separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida o no, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se detecta Ia presencia del receptor A2MR empleando por ejemplo, un anticuerpo que reconozca al receptor y seguidamente detectando Ia unión del anticuerpo. Alternativamente Ia membrana de nitrocelulosa con las proteínas transferidas se pone en contacto con una solución que contiene uno de los ligandos del receptor, por ejemplo A2M o RAP. Posteriormente se detecta Ia presencia del ligando unido.

La presente invención también se relaciona con un método de búsqueda e identificación de un compuesto que proteja de Ia infección por VD y que comprenda

Ia determinación de Ia capacidad de los compuestos en evaluación de bloquear Ia

interacción del VD con el receptor A2MR. Un método basado en este principio puede emplear preparaciones que contengan partículas de VD o alternativamente el ectodominio de Ia proteína de Ia envoltura del VD así como una proteína recombinante que comprenda el DIII de Ia proteína E del virus. El método comprende Ia incubación del receptor A2MR conjuntamente con una preparación que contenga VD y el compuesto potencialmente bloqueador. Comprende además Ia detección de virus unido y Ia comparación con Ia cantidad de virus unido cuando no hay presencia de compuesto inhibidor. La detección se realiza preferiblemente empleando el receptor adsorbido o inmovilizado a una fase sólida y adicionando Ia mezcla del virus y el compuesto potencialmente inhibidor en solución.

La preparación de receptor A2MR puede consistir en una muestra purificada de fuente natural y conteniendo preferiblemente más de un 75% del receptor A2MR respecto al total de proteína presente. La fuente natural se refiere a Ia obtención a partir de homogenados de células/tejidos o a partir de sobrenadante de cultivo de células o de plasma humano. La preparación del receptor puede consistir también en una proteína recombinante que comprenda Ia cadena α del receptor A2MR o un fragmento de Ia misma que mantenga Ia funcionalidad como receptor del VD.

La presente invención también se relaciona con un método de búsqueda e identificación de un compuesto que proteja de Ia infección por VD y que comprenda Ia determinación de Ia capacidad de los compuestos en evaluación de bloquear Ia interacción del VD con A2M humana. Un método basado en este principio puede emplear alternativamente el ectodominio de Ia proteína de Ia envoltura del VD así como una proteína recombinante que comprenda el DIII de Ia proteína de Ia envoltura del virus. Para Ia determinación de los compuestos potenciales antivirales se pone en contacto Ia A2M con el compuesto a evaluar y se mide Ia capacidad de interferir en Ia interacción con el VD, el ectodominio de Ia proteína E o el DIN de esta proteína.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS Figura 1. Caracterización de Ia preparación purificada de DIIIE2J. (A) 45 μg de DIIIE2J se aplicaron a una columna de fase reversa C4. La corrida cromatográfica

se realizó a 37° C empleando un sistema cromatográfico de alta presión equipado con dos bombas y un controlador. Para Ia elución de Ia proteína se aplicó un gradiente de 10 a 60 % (v/v) de acetonitrilo en 0.1 % (v/v) de ácido trifluoroacético a un flujo de 0.8 mL/min y Ia detección se realizó a 226 nm. (B) Análisis en SDS- PAGE 15%. Carril 1 : Patrón de peso molecular. Carril 2: 12 μg de Ia preparación purificada de DIIIE2J diluida 1 :1 en tampón de muestra no reductor. La tinción de las bandas de proteínas se realizó según Ia metodología descrita por Heukeshoven, J. y Dernick, R., (1985). Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 6: 103- 112.

Figura 2. Determinación de Ia masa molecular y Ia formación del puente disulfuro de DIIIE2J por Espectrometría de masas. (A) Secuencia aminoacídica obtenida a partir del segmento de ADN clonado. (B) Masa promedio esperada a partir de Ia secuencia aminoacídica de Ia proteína con Ia Metionina N-terminal no procesada (Met ¹ ) y procesada (Ala ² ). RCM: Masa promedio esperada de Ia proteína comenzando en Ala ² y con Ia incorporación de ¡odoacetamida en cada uno de los residuos de cisteína. (C) Espectros de masas deconvolucionados de DIIIE2J. Nativo: proteína no modificada, colectada del análisis por rp-HPLC. +IAA: Proteína incubada 30 min. a 25° C con iodoacetamida. +DTT +IAA: proteína incubada 2 horas a 37° C con 10 mM DTT seguido de una incubación por 30 min. a 25° C con iodoacetamida.

Figura 3. Dot blotting para el análisis de Ia antigenicidad de DIIIE2J con anticuerpos murinos y humanos. Las líneas horizontales contienen las distintas preparaciones con las que fue sensibilizada Ia membrana de nitrocelulosa mientras que las columnas verticales representan Ia disposición en que se enfrentaron las distintas preparaciones de anticuerpos. C ⁺ : preparaciones de antígenos virales serotipo 2, obtenido por el método de sacarosa-acetona (Clarke D. H. and Casáis J. (1958). Techniques for hemaglutination and hemaglutination inhibition with arthropod-borne viruses. Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573) a partir de homogenados de cerebros de ratones OF1 lactantes inoculados ¡ntracranealmente. C: homogenados de cerebros de ratones no inoculados, procesados por el método de sacarosa acetona.

Figura 4. Reconocimiento de DIIIE2J inmovilizada covalentemente en matriz cromatográfica por anticuerpos anti-VD2. Alícuotas de 20 μL de Ia matriz de afinidad con DIIIE2J como ligando se incubaron con diferentes preparaciones de anticuerpos por 30 min a 25° C. La fracción no unida se separó por centrifugación y Ia matriz se lavó extensivamente con PBS pH 7.4, 0.1 % Tween 20.

Figura 5. Demostración de unión directa de A2M y DIIIE2J con ambas proteínas en solución. (A) Análisis de Ia calidad de Ia preparación de A2M humana purificada que se utilizó en los experimentos de unión directa. SDS-PAGE (10%) en condiciones desnaturalizantes y no reductoras. Carril 1 : Tinción con azul de Coomasie. Carril 2: Inmunoidentificación mediante Western blotting empleando una preparación policlonal anti-A2M humana (Sigma, EEUU). (B-F): Perfiles cromatográficos de las corridas de filtración en gel empleadas en Ia separación de las distintas especies. Se utilizó una columna Superdex 200 HR 10/30 equilibrada en tampón NaHPO ₄ 50 mM pH 7.0, 300 mM NaCI. La corrida se realizó a un flujo de 0.4 mL/min y se monitoreó a 280 nm. Las muestras se aplicaron en un volumen de 200 μL. (A) 100 μg de DIIIE2J. (B) 70 μg de A2M no activada. (C) 100 μg de DIIIE2J incubada por 1 hora a 25° C con 70 μg de A2M no activada. (D) 70 μg de A2 IvMvIeNH ₂ . (E) 100 μg de DIIIE2J incubada por 1 hora a 25° C con 70 μg de A2M A2M_MeNH ₂ . Las flechas señalan en cada cromatograma las fracciones colectadas para su posterior análisis por SDS-PAGE. El asterisco señala el tiempo correspondiente a Ia elución de un volumen total de Ia columna. (G): Análisis en SDS-PAGE 12.5% de las bandas de proteínas presentes en las fracciones colectadas en las distintas corridas cromatográficas. Las muestras colectadas en cada corrida se precipitaron con acetona. Los precipitados de proteínas se resuspendieron en 15 μL de tampón de muestra y se sometieron a análisis por electroforesis. Sobre cada carril se indica Ia letra del cromatograma correspondiente y Ia descripción de Ia muestra aplicada. Con una flecha se destaca Ia posición de Ia banda correspondiente a DIIIE2J en el gel.

Figura 6. Experimentos de Interacción directa de DIIIE2J y A2M en Biacore. Curvas de respuesta obtenidas durante y después de Ia inyección de (B) Anticuerpos monoclonales neutralizantes contra el VD serotipo 2 (3H5) y contra todos los FV

(4G2); (C) Preparaciones policlonales de anticuerpos obtenidas por inmunización de ratones con VD2 y VD1 así como una muestra resultante de Ia unión de sueros de ratones no inmunizados con el virus (Pre-inmune) y (D) diluciones entre 0.3 μMol/L y 3 μMol/L de A2M. La corrida se realizó en PBS pH 7.4. a 25° C. Las diferentes diluciones de A2M se aplicaron a un flujo de 5μL/min por 20 min. La respuesta aparece como las unidades de resonancia (RU) corregidas para Ia unión inespecífica en el canal que no contenía proteína inmovilizada (menos 5%).

Figura 7. Inhibición de Ia unión de DIIIE2J a células Vero por A2M y RAPR13. Las células pre-fijadas se incubaron con las proteínas fluoresceinadas. La intensidad de Ia fluorescencia producto de Ia unión de las proteínas se midió por citometría de flujo. En cada punto experimental se acumularon datos para un mínimo de 20 000 células. (A) Unión de A2M y RAPR13 a las células. El valor en Ia gráfica corresponde al valor de Ia intensidad media de Ia fluorescencia de cada punto en el ensayo menos el valor obtenido para las células sin tratar (B) y (C) Las células se incubaron con DIIIE2J fluoresceinada en presencia o no de los ligandos no fluoresceinados, en Ia relación molar indicada en cada caso. El % de unión se calculó a partir de Ia relación de Ia intensidad media de Ia fluorescencia entre las células incubadas con Ia mezcla de DIIIE2J fluoresceinado y las proteínas y las células incubadas con DIIIE2J fluoresceinado. Figura 8. Efecto de RAP recombinante en Ia infección de células Vero con VD2, cepa S16803. Monocapas de células Vero al 90% de confluencia se preincubaron con diferentes diluciones de RAPR13 o BSA, por 1 hora a 37° C. Seguidamente se añadió Ia preparación viral para una multiplicidad de infección de 1 y se incubaron nuevamente las células por 1 hora a 37° C. Después de eliminar el virus no unido, se añadió medio MEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 1 % SFT, 1% CMC y se incubaron las células por 5 días a 37° C. Para Ia visualización de las placas de lisis se tiñó Ia monocapa con Naphtol Blue Black. Los ensayos se realizaron en placas de 24 pozos. Cada punto del ensayo se obtuvo por duplicado.

Figura 9. Alineamiento múltiple de secuencia de los dominios de unión a ligando del receptor A2MR (SEQ ID. 3, LRP1_human en Ia base de datos SwissProt). El alineamiento se realizó empleando el programa ClustalX (Higgins D., Thompson J.,

Gibson T. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Las flechas señalan los residuos que forman parte de los parches de unión de ligando. En Ia parte inferior aparece Ia representación esquemática del nivel de conservación por residuo.

Figura 10. Modelo de Ia estructura tridimensional del DIII de Ia proteína E del VD. (A) VD1 , (B) VD2, (C) VD3, y (D) VD4. Aparecen sombreados en dos tonos de gris los parches de carga positiva en Ia superficie del DIII: gris oscuro, parches situados en Ia superficie correspondiente a Ia hoja beta definida por las hebras A, B, C, D y E; gris claro, parches localizados en Ia superficie correspondiente o colindante con Ia horquilla beta FG (ver figura 10A).

Figura 11. Diseño de los péptidos bloqueadores de Ia infección por VD, basados en Ia horquilla beta FG. (A) Representación esquemática de la estructura tridimensional del DIII del VD2. En el esquema aparecen resaltados los segmentos de estructura secundaria. (B) Superposición estructural de los modelos de Ia estructura terciaria del DIII de Ia proteína E de los cuatro serotipos del VD. Los modelos están representados en tonos de grises para los diferentes serotipos del virus. Modelo de Ia estructura tridimensional de los péptidos HDIII2CL (C) y HDIII3CL (D). Figura 12. (A) Secuencia de los péptidos diseñados para mimetizar diferentes regiones de Ia superficie del DIII. El número de los residuos corresponde a Ia secuencia de Ia proteína E del VD serotipo 2, cepa Jamaica 1409, disponible en Ia base de datos Swiss-Prot (http://www. ebi. ac. uk/swissprot) con número de acceso P07564. Los residuos subrayados no corresponden a Ia secuencia de Ia proteína E, se introdujeron en el diseño de los péptidos. Los residuos de cisteína se utilizaron para lograr la restricción estructural deseada mediante un puente disulfuro. (B) Reconocimiento del péptido HDIII2Cs por el Mab neutralizante 3H5 en ensayo de Western blotting. 50 μg de los conjugados BSA-péptidos y 20 μg de Ia proteína PD5 se aplicaron a un SDS-PAGE 12.5%, en condiciones desnaturalizantes y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana, se incubó con una dilución (30 μg/mL) del Mab 3H5 por 2 horas a 25° C. El anticuerpo

unido se detectó con un conjugado anti-lgG de ratón-peroxidasa y se realizó el revelado con químioluminiscencia. (C) Dos fragmentos de membrana de nitrocelulosa se sensibilizaron paralelamente con 10 μg de cada una de las variantes de Ia proteína y los péptidos. Una membrana se incubó con el Mab 3H5 en una dilución de 30 μg/ml_. La segunda membrana se incubó con una preparación obtenida por Ia unión de los sueros de los ratones inmunizados con el conjugado HDIII2Cs-KLH. La detección de los anticuerpos unidos se realizó en las mismas condiciones que en el ensayo de Western blotting. RCM: proteína/péptido reducido y carbamidometilado. Figura 13. Reconocimiento del virus por el suero anti-HDIIIE2Cs. (A) Homogenados de células Vero infectadas y no infectadas con VD2 se separaron en SDS-PAGE 10% y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Las membranas bloqueadas se incubaron con una dilución de las diferentes preparaciones de anticuerpos: (A.A) 30 μg/mL del Mab 3H5, (A.B) dilución 1/100 del suero pre-inmune de los ratones inmunizados con el conjugado HDIIIE2Cs-KLH y (A.C) dilución 1/100 del suero de los ratones inmunizados con el conjugado HDIIIE2Cs-KLH después de 5 dosis de inmunización. (B) Inmunoprecipitación de ³⁵ S__VD2 con suero de los ratones inmunizados con diferentes péptidos del DIII. Se empleó una dilución 1/100 de Ia mezcla del suero de los ratones inmunizados con los conjugados péptido-KLH, después de Ia 5 ^ta dosis. Carril 1. Suero anti-pepDIII-1. Carril 2. Suero anti- HDIIIE2Cs. Carril 3. Suero anti-pepDIII-2. Carril 4. Aplicación del tampón de inmunoprecipitación y Carril 5. Mezcla de sueros humanos con respuesta anti-DV2.

Figura 14. Reconocimiento de Ia proteína PD5 por los sueros obtenidos por inmunización en ratones de los conjugados de los péptidos a KLH. Placas multipozos se recubrieron con 0.5 μg/pozo de proteína total de las distintas variantes: no modificada (No mod.), reducida y carbamidometilada (RCM) y carbamidometilada sin previa reducción de sus puentes disulfuro (CM). Diluciones 1 :100 del conjunto de los sueros de cada grupo se incubaron 2 horas a 37° C en PBS-T pH 7.4. En ambos ensayos se empleó para el revelado el conjugado anti-lgG de ratón-POD (dilución 1 :1000). Como sustrato de Ia POD se utilizó H ₂ O ₂ /OPD. La reacción enzimática se detuvo a los 20 min. con 2.5 Mol/L H ₂ SO ₄ y se midió Ia

absorbancia 492 nm. Datos sobre Ia secuencia de los péptidos y Ia región que representan en Ia estructura del dominio del VD se pueden obtener en las figuras 9 y 11.

Figura 15. Representación de Ia región comprendida por los péptidos diseñados, en el DIII de Ia proteína E del VD. Secuencia de las regiones comprendidas entre los residuos 299-318 y 359-397 (numeración de DV2) en el DIN del VD1 , DIII_DV1 y el VD2, DIII_DV2. 3H5pept, reportado en Ia literatura como parte del epitopo del Mab 3H5 (Trirawatanapong T, Chandran B, Putnak R, Padmanabhan R (1992) Mapping of a región of dengue virus type-2 glycoprotein required for binding by a neutralizing monoclonal antibody. Gene. 116:139-50). En letras grises se destacan aminoácidos adicionales no presentes en Ia secuencia original y que fueron introducidos en el diseño de los péptidos. Los dos residuos de cisteína se emplearon para formar el puente disulfuro y lograr Ia restricción estructural deseada. La lisina N-terminal se introdujo con el fin de favorecer Ia formación de los conjugados con las proteínas en los ensayos y el residuo de β-alanina se utilizó como espaciador. En el recuadro sombreado se representan las secuencias de péptidos lineales empleados en estudios precedentes en Ia literatura, DV2-1 , DV1-1 , DV2-2, DV2-3 (Hung JJ ₁ Hsieh MT, Young MJ, Kao CL, King CC, Chang W (2004) An external loop región of domain III of dengue virus type 2 envelope protein is involved In serotype-specific binding to mosquito but not mammalian cells. J Virol. 78:378-88) y P'1 (Thullier P, Demangel C, Bedouelle H, Megret F, Jouan A, Deubel V, Mazie JC, Lafaye P (2001) Mapping of a dengue virus neutralizing epitope critical for the infectivity of all serotypes: insight into the neutralization mechanism J Gen Virol. 82(Pt 8):1885-92). En Ia parte inferior de Ia figura aparece Ia representación de Ia región que abarcan los péptidos (destacados en negro) en Ia estructura del DIII.

Figura 16. Unión de los péptidos HDIII2CL y HDIII3CL a Ia superficie de las células blancas de sangre periférica humana. Las células aisladas por lisis de eritrocitos se lavaron con PBS pH 7.4, 1 % de albúmina de suero bovino (BSA), 0,01 % de NaN ₃ , CaCI ₂ 1 mM, MgCI ₂ 1 mM y se fijaron con paraformaldehido 1 % en PBS pH 7.4. Después de lavadas, las células se incubaron con las diluciones de los péptidos por 30 min. a 4 ^o C en PBS pH 7.4, 1 % de BSA. La detección de los péptidos unidos se realizó empleando un conjugado estreptavidina-FITC y midiendo en citometría de

flujo. Ctrl, de células: células fijadas no tratadas con péptido ni conjugado.

Figura 17. Inhibición de Ia infección de células Vero por VD1 y VD2. (A) Placas de 6 pozos con una monocapa de aproximadamente 90% de confluencia se incubaron por 30 min. a 37° C con las diluciones de los péptidos en medio MEM. Se añadió una dilución de cada uno de los virus DV1 , cepa West Pac 74 y DV2, cepa S16803, para obtener un promedio de 100 placas de lisis por pozo y se incubaron las células por 30 min a 37° C con Ia mezcla virus/péptido. Después de Ia incubación, las células se lavaron dos veces, se añadió medio MEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 1 % suero fetal de ternera, 1 % CMC y se incubaron por 5 días a 37° C en atmósfera de CO ₂ . (B) Efecto inhibitorio de los péptidos a una concentración de 100 μMol/L. NRpep: péptido no relacionado. Datos sobre Ia secuencia de los péptidos 3H5 pept, pepDIII-1 , HIII2CL y HIII3CL, así como de Ia región que representan en Ia estructura del dominio del VD se pueden obtener en Ia figura 11. El cálculo del % de inhibición se describe en Materiales y métodos. (C) Inhibición de Ia infección de VD2 empleando diferentes concentraciones de los péptidos. La visualización de las placas virales se realizó por tinción con Naphtol Blue Black. Ctrl Células: Células sin tratar. Ctrl virus: Células incubadas con virus sin péptido. Para ambos péptidos el 50% de inhibición se obtiene para una concentración entre 45-22 μMol/L. Figura 18. Alineamiento múltiple de secuencia de los residuos correspondientes a Ia horquilla beta FG de FV de interés para Ia salud humana y animal. (YFV) virus de Ia fiebre amarilla, (WNV) virus del oeste del nilo, (JAE) virus de Ia encefalitis japonesa, (TBE) virus de Ia encefalitis transmitida por garrapata, (KUNJ) virus Kunjin, (POW) virus Powasan, (LAN) virus Langat, (MVE) virus de Ia encefalitis del valle Murray y (SLE) virus de Ia encefalitis de St. Louis.

Figura 19. Efecto de Ia incubación simultánea de los péptidos en Ia unión de A2M y RAPR13 a Ia superficie de células Vero. Las proteínas A2M y RAP13 fluoresceinadas se incubaron 30 min. a 4 ^o C con células Vero pre-fijadas, en presencia de diferentes concentraciones de HIII2CL y 3H5pept para lograr las relaciones molares indicadas péptido/proteína. La detección de Ia proteína unida se realizó por citometría de flujo.

Figura 20. Efecto de Ia pre-incubación con A2M en Ia infección de células Vero con VD. Las preparaciones virales se pre-incubaron 1 h a 25 ⁰ C en A y C, o el tiempo indicado en B, con las proteínas i.e. A2M activada (A2Mact), A2M no activada (A2M no act) y una proteína no relacionada (NR). Las mezclas virus-proteína se añadieron a monocapas de células Vero al 90% de confluencia y se incubaron con las células por 1 hora a 37 ⁰ C. Después de eliminar el virus no unido, se añadió medio MEM suplementado con aminoácidos no esenciales, 1 % SFT, 1 % CMC y se incubaron las células por 5 días a 37 ⁰ C. Para Ia visualización de las placas de lisis se tiñó Ia monocapa con Naphtol Blue Black. Los ensayos se realizaron en placas de 24 pozos. Cada punto del ensayo se obtuvo por duplicado.

Figura 21. Perfil cromatográfico de Ia purificación del receptor A2MR en cromatografía de afinidad con A2M inmovilizada (A) y análisis en SDS-PAGE de las fracciones eluidas de Ia cromatografía (B). Se empleó un gel de gradiente de 5-15% de acrilamida. Efecto de Ia pre-incubación con de las distintas fracciones cromatográficas en Ia infección con VD2 (C). El ensayo de neutralización por reducción del número de placas virales se realizó como se describe en Ia figura 20. (D) Ensayo de protección en modelo de encefalitis en ratones Balb/C inducida por inoculación intracraneal de VD2 neuroadaptado.

Figura 22. Ensayo de protección en modelo de encefalitis en ratones Balb/C inducida por inoculación intracraneal de VD2 neuroadaptado. PepNR GAGs binding: péptido formado por un fragmento de unión a glicosaminoglicanos y una secuencia no relacionada con Ia proteína E del VD.

EJEMPLOS DE REALIZACIóN Materiales y métodos

Electroforesis desnaturalizante de proteínas (SDS-PAGE)

Se utilizaron geles de poliacrilamida según las condiciones estándar de Laemmli

(Laemmli, U.K., (1970). Cleavage of structural proteins duríng the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685). Las muestras de las proteínas se diluyeron en tampón de muestra 1 % SDS, 0.3 M Tris-HCI, pH 6.8. Para el análisis

en condiciones reductoras se siguió el mismo procedimiento pero adicionando 2 mM β-mercaptoetanol al tampón de muestra y se calentaron durante 2 min a 95 ⁰ C. La corrida electroforética se realizó a 20 mA/gel en tampón 0.25 M Tris-HCI, 1.92 M glicina, pH 8.3 y 1 % SDS. Se emplearon los procedimientos estándar de tinción con azul de coomasie y tinción con plata. Los geles realizados para Ia identificación de las proteínas se tiñeron según el procedimiento de Ia tinción con plata sin glutaraldehído, compatible con el análisis por espectrometría de masas (Shevchenko, A., WiIIm, M., Vorm, O. y Mann, M., (1996). Anal. Chem. 68: 850-858).

Western blottinα

Las proteínas separadas electroforéticamente se transfirieron del gel a membranas de nitrocelulosa Hybond-ECL de 0.45 μm (Amersham, Reino Unido) en un equipo de transferencia sumergida (Towbin H., Staehelin T. and Golden J. (1979). Electroforetic transfer of protein from polyacrílamide gel to nitrocellulose sheets procedure and some applications. Proc. Nati. Acad. Sci. 76: 4350-4354). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% (p/v) en PBS pH 7.4, 0.1% Tween-20 por incubación durante 1 h a 25° C, con agitación. Seguidamente se incubaron toda Ia noche en agitación a 4 ^o C con el anticuerpo correspondiente diluido en PBS pH 7.4, 0.1 % Tween-20, 5% de leche descremada. Luego de lavados con abundante PBS pH 7.4, 0.1% Tween-20, Ia membrana se incubó 1 h a 25° C, con el conjugado correspondiente según Ia especie de origen de los anticuerpos empleados. En todos los casos se emplearon conjugados de peroxidasa provenientes de las casas comerciales Sigma y Amersham. EI sustrato de Ia peroxidasa empleado para Ia visualización de las bandas con reactividad se indica en Ia descripción de las figuras.

Dot blottinα

Dos membranas de nitrocelulosa se sensibilizaron con cantidades equimolares de

DIIIE2J y BSA durante 1h a 25° C. En ambas membranas se incluyeron como control para Ia reactividad anti-virus de los anticuerpos, una preparación de antígeno

viral del serotipo 2 y su control negativo correspondiente. Las membranas se bloquearon 1 hora, con agitación a 25° C en PBS, 0.1 % Tween 20, conteniendo leche descremada al 5%. La incubación con las diferentes preparaciones de anticuerpos se realizó en PBS, 0.01% Tween 20, leche descremada al 5% durante 2h a 25° C. Al concluir Ia incubación con los sueros las membranas se lavaron extensivamente con PBS 0.01% de Tween 20 y se incubaron con un conjugado anti- IgG murino-peroxidasa (Amersham, Reino Unido) para el sistema murino y anti-lgG humano-peroxidasa (Sigma, EEUU), para el sistema humano, durante 1h a 25° C. Luego de lavar nuevamente Ia membrana, se realizó Ia detección con el sistema ECL Western Blotting Analysis System (Amersham, Reino Unido), sensibilizando un filme CP-G PLUS (AGFA, Bélgica) en un cásete de autorradiografía FBXC 810 (FisherBiotech, EEUU). Finalmente se reveló el filme en un procesador automático de filmes autorradiográficos del tipo Hyperprocessor (Amersham, Reino Unido).

Inmovilización de las proteínas en matriz cromatoqráfica

Una alícuota de 10 mg de proteína purificada se dializó contra 0.1 Mol/L NaHCO ₃ pH 8.3, 0.5 Mol/L NaCI. Para realizar el acoplamiento, Ia solución de proteína se incubó con 1 mL de matriz CNBr-activated Sepharose (Amersham, Reino Unido) por 2 horas a 25° C. La proteína no acoplada se separó de Ia matriz por centrifugación a 500 x g por 5 min. Para determinar Ia eficiencia de Ia reacción se comparó Ia concentración de proteína en solución antes y después del acoplamiento. En todos los casos se logró Ia inmovilización de aproximadamente el 95% de Ia proteína.

Determinación de Ia concentración de proteínas Se utilizó un estuche para determinación de concentración de proteínas por el método del ácido bicinconínico (Pierce, EEUU) y se siguieron las instrucciones del fabricante para los ensayos en placas de 96 pozos. Para obtener Ia curva de calibración se emplearon distintas diluciones (0.025 - 2 mg/mL) de Ia albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma, EEUU).

Inmovilización covalente en chip cm5

Para Ia inmovilización covalente de las proteínas DIIIE2J y LRP1 se empleó un chip cm5 (Biacore, Suecia). El procedimiento de inmovilización se realizó a 25° C, un flujo de 5 μL/min y empleando HBS (Biacore, Suecia) como tampón de corrida. La superficie del chip se activó con Ia aplicación de 35 μL de una solución 0.2 Mol/L N- ethyl-λ/'-(3-diethylamino-propyI) carbodiimide (EDC) y 0.05 Mol/L N- hydroxysuccinimide (NHS). Seguidamente se aplicaron las soluciones de las proteínas disueltas en buffer 10 mM acetato de sodio pH 4.5. Al finalizar se realizó una inyección 35 μL de 1 M etanolamina pH 8 para bloquear los grupos que permanecían activados. En el canal que se empleó en cada caso como control negativo se realizaron solamente las inyecciones de activación con Ia solución EDC:NHS y el bloqueo con etanolamina empleando el mismo flujo y volumen de inyección. Para el análisis de los resultados se empleó el programa BIAevaluation versión 4.1 (Biacore, Suecia).

Análisis por Espectrometría de masas

Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas híbrido con geometría octogonal QTOF-2TM (Micromass, UK) equipado con fuente de ionización por electronebulización Z-spray. El programa de procesamiento y adquisición de los espectros de masas empleado fue el MassLinx, versión 3.5 (Waters, EUA). El espectro ESI-MS de Ia mezcla de péptidos trípticos se deconvolucionó utilizando el programa MaxEntropy v 3.0 (Micromass, Inglaterra). Los programas de identificación que se emplearon fueron el MASCOT y el SeqTag.

Obtención del DIII de Ia proteína E del VD2, genotipo Jamaica (DIIIE2J)

El DIII de Ia proteína E del VD2 se obtuvo mediante técnicas de ADN recombinante, expresando en Ia bacteria Escheríchia coli un fragmento génico que codifica para el mismo. Con este objetivo se sintetizaron en fase sólida, usando el método de los fosforamiditos (Beaucage SL, Caruthers MH, Deoxynucleoside phosphoramidites- A

new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis., Tetrahedron Letters, (1981), 22, 1859), los oligonucleótidos de secuencia CATATGGCCATGGACAAACTACAGCTC (SEQ ID. 19) y

CTCGAGGCCGATGGAACTTCCTTT (SEQ ID. 20), los cuales portan en su extremo 5' Ia secuencia de sitios de corte para las enzimas de restricción Nde I y Xho I, respectivamente (Marcados en negritas en Ia secuencia).

Con estos oligonucleótidos, y partiendo del plasmidio p30-VD2 (Deubel V, Kinney RM, Trent DW ₁ Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the structural proteins of dengue type 2 virus, Jamaica genotype. Virology, (1986), 155, 365), el cual contiene los primeros 2469 nucleótidos del genoma de Ia cepa de DEN2 Jamaica 1409, se amplificó por Reacción en Cadena de Ia Polimerasa (PCR) (Saiki RK, Scharí S, Faloona F ₁ Mullís KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheím N, Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science (1985), 230, 1350) un fragmento de ADN codificante para el DIII de la proteína de Ia envoltura (E) de esta cepa. Este fragmento se clonó en el vector pMOSBlue usando el estuche de reactivos "pMOSBlue blunt-ended cloning kit" (Amersham, Reino Unido, no. catálogo RPN 5110), y purificado posteriormente por digestión con las enzimas Nde I y Xho I (Promega Benelux, b.v., Holanda), según las instrucciones del fabricante, seguida de aislamiento por electroforesis en agarosa de bajo punto de gelificación (Sambrook,J.; Fritsch,E.F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), CoId Spríng Harbor Laboratory Press, New York, USA). A continuación, y usando T4 ADN ligasa (Promega Benelux, b.v., Holanda), dicho fragmento se ligó al plasmidio pET22b+ (Novagen Inc., USA) digerido también con Nde I y Xho I. Las reacciones obtenidas se transformaron en Ia cepa de Escherichia coli XL-1Blue (Bullock WO, Fernández JM, Short JM. XL-1Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli K12 strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques 1987; 5:376-8) según Sambrook et al. (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: CoId Spríng Harbor Laboratory Press; 1989) y los plasmidios presentes en las colonias obtenidas en medio selectivo fueron pesquisados mediante análisis de restricción. La secuencia de varios plasmidios recombinantes resultantes de dicha transformación

se verificó mediante secuenciación automática, y se escogió una molécula representativa cuya secuencia correspondiera con Ia esperada. Este plasmidio finalmente escogido se denominó pET-iDIIIE2_J (SEQ ID. 21), y el mismo codifica para Ia síntesis intracelular, en E. coli, del DIII de Ia proteína E del VD serotipo 2 cepa Jamaica 1409, bajo el control del promotor T7. La proteína obtenida, denominada DIIIE2J (SEQ ID. 22), contiene una secuencia de 6 histidinas consecutivas en el extremo carboxilo terminal para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad por quelatos metálicos (IMAC) (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7). Para Ia purificación de DIIIE2J, el plasmidio pET-¡DIIIE2_J se transformó (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: CoId Spríng Harbor Laboratory Press; 1989) en Ia cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier, F. W. and B. A. Moffatt "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. " J.Mol.Biol. 189.1 (1986): 113-30) y a partir de una colonia aislada se inoculó un cultivo de 50 mL de medio Luria-Bertani suplementado con ampicilina a 50 μg/mL (LBA). El cultivo se dejó crecer por 12 horas a 30° C con una agitación de 350 r.p.m. A partir de este cultivo se inoculó 1 L de medio LBA con una densidad óptica a 620 nm (OD620) de 0.05, que se creció durante 8 h a 28° C hasta fase exponencial tardía y luego inducido mediante Ia adición de isopropiltiogalactósido (IPTG), siguiéndose el crecimiento en las mismas condiciones durante 5 horas más.

El cultivo inducido se centrifugó a 5000 x g por 30 min. a 4° C y Ia biomasa resultante se resuspendió en 30 mL de PBS 1X. Para Ia ruptura Ia biomasa se liso por 3 pases en prensa francesa a 1500 kg/cm ² . Después de centrifugar el usado a 10 000 x g durante 30 min. a 4° C el precipitado, conteniendo Ia proteína como cuerpos de inclusión, se solubilizó en 30 mL de PBS, 6 M hidrocloruro de guanidinio y Ia proteína se renaturalizó por dilución de esta solución en PBS 1X, 10 mM imidazol a una concentración final de 100 μg/mL DIIIE2J.

DIIIE2J en su conformación nativa se purificó de mediante cromatografía de afinidad por quelatos metálicos (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC.

Trends Biotechnol. 3, 1-7) usando Ni-NTA agarosa (Qiagen Benelux B.V., Holanda).

Para la elución se aplicaron a Ia columna lavados sucesivos con soluciones 50, 100 y 300 mMol/L imidazol, usando PBS pH 7.4, 0.3 Mol/L NaCI como tampón de corrida. La proteína obtenida tiene una pureza igual o mayor al 90%, según estimado por análisis de imágenes digitales de Ia tinción con azul de Coomasie de geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), usando las rutinas densitométricas del programa ImageJ (Rasband W., http://rsb.info.nih.gov/ij/) versión 1.35d.

Purificación de A2M humana La A2M humana se purificó a partir de 380 mL de plasma humano resultante de Ia unión de muestras de plasma de personas sanas entre 30 a 40 años de edad. El plasma se dializó contra agua desionizada con cambios frecuentes por 72 horas a 4 ^o C. El material ¡nsoluble se separó por centrifugación a 10000 x g por 30 min. El sobrenadante se dializó contra PBS pH 6 y se aplicó en una columna XK 50/30 (Amersham, Reino Unido) empaquetada con 65 mL de Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham, Reino Unido) previamente cargada con Zn ²⁺ y equilibrada con PBS pH 6. Seguidamente Ia columna se lavó con PBS pH 6 hasta que Ia absorbencia del eluente a 280 nm alcanzó Ia línea base. La proteína unida se eluyó por Ia aplicación de tampón 10 mMol/L de acetato de sodio pH 5, 150 mM NaCI. La proteína colectada se concentró por ultrafiltración empleando una membrana de CO 300 kDa. Posteriormente Ia muestra se aplicó a una columna de filtración en gel (26 x 51 cm) empacada con matriz Superdex 200 (Amersham, Reino Unido), a un flujo de 2 mL/min equilibrada con PBS pH 7.8. La presencia de Ia proteína en Ia fracción de más alto peso molecular se corroboró en un ensayo de western blotting empleando una preparación policlonal anti-A2M humana (Sigma, EEUU). Para Ia activación de Ia A2M purificada se incubó con 200 mMol/L de metilamina en 50 mMol/L fosfato de sodio, 150 mMol/L NaCI, pH 7.4. La A2M_MeNH ₂ se dializó extensivamente contra 50 mMol/L fosfato de sodio, 0.5 Mol/L NaCI pH 7.8.

Obtención de Ia proteína humana LRPAP1 (RAP) recombinante

La proteína humana asociada al receptor LRP1 , conocida como LRPAP1 o, más

comúnmente en Ia literatura científica, como RAP, se obtuvo mediante técnicas de ADN recombinante, expresando en Ia bacteria Escherichia coli un fragmento génico que codifica para Ia misma. Para ello se purificó ARN total de Ia línea celular monocítica de origen humano THP- 1 (Tsuchiya,S.; Yamabe,M.; Yamaguchi, Y.; Kobayashi. Y.; Konno, T.; Tada,K. (1980) Establishment and characterízation of a human acute monocytíc Iθukemia cell Une (THP-1), Int.J. Cáncer 26(2):171) usando el método de Chomczynsky y Sacchi (Chomczynski,P.; Sacchi,N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 162(1):156); y dicho ARN total se retrotranscribió a ADNc usando el estuche de reactivos "GeneAmp RNA PCR Core Kit" de Perkin- Elmer, USA (No. catálogo N808-0143) con hexámeros de secuencia aleatoria. El gen para Ia proteína LRPAP1 (RAP) se amplificó mediante PCR (Saiki,R.K.; Scharf,S.; Faloona,F.; MuIHs ₁ KB.; Horn,G.T.; Erlich,H.A.; Arnheim,N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restríction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230(4732): 1350), usando el estuche de reactivos "GeneAmp RNA PCR Core Kit" de Perkin-Elmer, USA (No. catálogo N808-0143) y los oligonucleótidos

CATATGTACTCGCGGGAGAAGAACCAG (SEQ ID. 23) y

CTCGAGTCAGAGTTCGTTGTGC (SEQ ID. 24), los cuales portan en su extremo 5' Ia secuencia de sitios de corte para las enzimas de restricción Nde I y Xho I, respectivamente (Marcados en negritas en Ia secuencia), previamente sintetizados por el método de los fosforamiditos (Beaucage SL, Caruthers MH, Deoxynucleoside phosphoramidites- A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis., Tetrahedron Letters, (1981), 22, 1859). El fragmento amplificado se clonó en el vector pGEM-T (Promega Benelux b.v., Holanda) usando el estuche de reactivos "pGEM-T Vector System I Kit" (Promega Benelux b.v., Holanda, no. catálogo A3600), y purificado posteriormente por digestión con las enzimas Nde I y Xho I (Promega Benelux, b.v., Holanda), según las instrucciones del fabricante, seguida de aislamiento por electroforesis en agarosa de bajo punto de gelificación (Sambrook,J.; Fritsch,E.F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA). A continuación, y usando T4 ADN ligasa (Promega

Benelux, b.v., Holanda), dicho fragmento fue ligado al plasmidio pET28a+ (Novagen Inc., USA) digerido también con Nde I y Xho I. Las reacciones obtenidas se transformaron en Ia cepa de Escheríchia coli XL-1 Blue (Bullock WO, Fernández JM, Short JM. XL-1Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escheríchia coli K12 strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques 1987; 5:376-8) según Sambrook et al. (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: CoId Spring Harbor Laboratory Press; 1989) y los plasmidios presentes en las colonias obtenidas en medio selectivo se pesquizaron mediante análisis de restricción. La secuencia de varios plasmidios recombinantes resultantes de dicha transformación se verificó mediante secuenciación automática, y se escogió una molécula representativa cuya secuencia correspondiera con Ia esperada. Este plasmidio finalmente escogido se denominó pET-RAP (Secuencia No. 25), y el mismo codifica para Ia síntesis intracelular, en E. coli, de Ia proteína LRPAP1 (RAP) de origen humano, bajo el control del promotor 17. La proteína obtenida, denominada RAPR13 (SEQ ID. 26), contiene una secuencia de 6 histidinas consecutivas en el extremo amino terminal para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad por quelatos metálicos (IMAC) (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1—7), separada del resto de Ia proteína por un sitio de corte para trombina. Para Ia purificación de RAPR13, el plasmidio pET-RAP se transformó (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: CoId Spring Harbor Laboratory Press; 1989) en Ia cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier, F. W. and B. A. Moffatt. "Use of bacteriophage 17 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. " J.Mol.Biol. 189.1 (1986): 113-30) y a partir de una colonia aislada se inoculó un cultivo de 50 mL de medio ZYM5052 (Studier, F. W (2005) Protein production by auto-induction In high density shaking cultures. Protein Expression and Purification 41(1):207) suplementado con kanamicina a 100 μg/mL en un frasco erlenmeyer de 1 L, que fue crecido 16 horas a 28° C con una agitación de 350 r.p.m. El cultivo inducido así obtenido fue centrifugado a 5000 x g por 30 min. a 4° C, y Ia biomasa resultante fue resuspendida en 30 mL de PBS 1X y lisada por 3 pases de ruptura en prensa francesa a 1500 kg/cm ² . Después de centrifugar el lisado a 10 000 x g durante 30 min. a 4 ^o C Ia

proteína se purificó a partir del sobrenadante de ruptura mediante cromatografía de afinidad por quelatos metálicos (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trenos Biotθchnol. 3, 1-7) usando Ni-NTA agarosa (Qiagen Benelux B.V., Holanda), con un gradiente lineal de 10 a 300 mM de imidazol, usando PBS 1X/0.3 M NaCI como tampón de corrida. La proteína obtenida tiene una pureza igual o mayor al 90%, según estimado por análisis de imágenes digitales de Ia tinción con azul de Coomassie de geles de acrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE), usando las rutinas densitométricas del programa ImageJ (Rasband W., http://rsb.info.nih.gov/ii/) versión 1.35d.

Síntesis de péptidos

Se realizó Ia síntesis en fase sólida sobre Ia resina Fmoc-AM-MBHA utilizando Ia estrategia Fmoc/tBu (Barany, G. and Merrífield, R. B. J Am Chem Soc. 99 (1977) 7363-7365). Los aminoácidos se acoplaron utilizando el método de activación con DIC/HOBt y el completamiento de Ia reacción de acoplamiento se verificó empleando el ensayo de ninhidrina (Kaiser, E., Colescott, R. L, Bossinger, C. D., Cook, P. I. Anal Biochem. 34 (1970) 595-598). Los péptidos se separaron de Ia resina por tratamiento con una disolución de TFA/EDT/H ₂ O/TIS (94%/2.5%/2.5%/1%), precipitados con éter y liofilizados durante 72 h. Los péptidos fueron ciclizados por formación de un puente disulfuro con Ia oxidación con DMSO (Andreu, D., Albericio, F., Solé, N. A., Munson, M. C, Ferrer, M. and Barany, G., Pennington, M. W. and Dunn, B. M. (Eds), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, 1994, pp. 91-169) y purificados por RP-HPLC. Las fracciones colectadas se analizaron independientemente en RP-HPLC analítico y Ia preparación final de cada péptido se conformó por Ia unión de las fracciones con más de 99% de pureza. La masa molecular de las preparaciones finales de los péptidos se verificó por espectrometría de masas ESI-MS.

Ensayo de unión a Ia superficie de las células Las células mononucleares de sangre periférica se obtuvieron por lisis de eritrocitos a partir de sangre total de donantes sanos. La sangre se colectó por venopunción en

viales BD Vacutainer K ₃ EDTA. La solución de lisis (0.3 Mol/L NH ₄ CI, 20 mMol/L KHCO ₃ , 20 μMol/L Na ₂ EDTA) se añadió en una relación de 2ml para 100 μl de sangre y se incubó durante aproximadamente 15 minutos a 25° C, agitando Ia mezcla a intervalos de 3 minutos. Para detener Ia reacción las células se colocaron a 4 ^o C y se separaron de Ia solución de lisis por centrifugación a 350 x g durante 5 min. Posterior a Ia centrifugación se decantó el sobrenadante y las células se lavaron con PBS pH 7.4, 1 % de albúmina de suero bovino (BSA), 0,01 % de NaN ₃ , CaCl ₂ 1mM, MgCI ₂ 1 mM. Las células Vero se desprendieron de Ia superficie del frasco de cultivo sin emplear proteasas, por incubación con PBS pH 7.4, 5 mM EDTA por 10 min. a 37° C y aplicando golpes suaves en el exterior del frasco.

Las células recién colectadas y lavadas se incubaron en solución de fijación PBS pH 7.4, 2% paraformaldehido, 0,01 % de NaN ₃ , CaCI ₂ 1 mM, MgCI ₂ 1 mM por 30 min a 4 ^o C. La solución de fijación se eliminó centrifugando a 350 x g por 5 min a 4 ^o C. Un total de 1 x 10 ⁵ células se incubaron durante 1 hora a 4 ^o C en un volumen total de 100 μL de cada dilución de las proteínas fluoresceinadas, en PBS pH 7.4, 1 % BSA, 1 mM CaCI ₂ , 1 mM MgCI ₂ . En cada experimento los controles consistieron en células no tratadas. Al concluir Ia incubación las células se lavaron dos veces y se incubaron nuevamente en solución de fijación. La intensidad de Ia fluorescencia de las células se cuantificó por citometría de flujo en un equipo PAS III (Partee, Alemania). En cada punto experimental se acumularon datos para un mínimo de 20 000 células.

Inhibición de Ia infección viral en células Vero

Las células Vero se crecieron en placas de 24 pozos hasta que Ia monocapa alcanzó aproximadamente 90% de confluencia. Se realizaron dos lavados de Ia monocapa con medio MEM sin SFB, se añadieron las diluciones de las proteínas o los anticuerpos, según el objetivo del ensayo y se incubó 1 hora a 37° C. A continuación, se añadió el virus para una multiplicidad de infección de 0.1 y se incubaron nuevamente las células 1 hora a 37° C. Al concluir esta incubación las células se lavaron nuevamente para eliminar el virus no unido y se incubaron 5 días a 37° C en medio de alta densidad (MEM suplementado con aminoácidos no

esenciales, 1 % SFB, 1 % carboximetilcelulosa), para propiciar Ia formación de las placas de lisis. Para Ia tinción se empleó Naphtol Blue Black 0.1% en acetato de sodio 0.15 Mol/L. En cada experimento se ensayaron dos réplicas por cada punto y se realizaron tres determinaciones independientes. El porcíento de inhibición de Ia

100 x | 1 - ^Nro - ^≠αCαS infección se calculó según Ia expresión L ^ ₀ . ^p lacas .c ^t wi .v ⁱ rus

Ensayo de protección en modelo de encefalitis en ratones Balb/C inducida por inoculación intracraneal de VD

Se emplearon grupos de 12 ratones Balb/C adultos de aproximadamente 2Og de peso. Los ratones se anestesiaron empleando éter y se realizó Ia inoculación por vía intracraneal de dosis letales de Ia preparación viral o de mezclas péptido-virus, diluidas en medio RPMI (volumen 20 μL). Los ratones se observaron diariamente por 21 días y se registró el número de ratones por grupo que desarrollaron los síntomas de encefalitis y murieron.

EJEMPLO 1

Obtención de una matriz de afinidad para el aislamiento de proteínas con afinidad por el DIII del VD

Con el objetivo de obtener una matriz de afinidad con el DIII como ligando para el aislamiento de proteínas de plasma humano como potenciales receptores del virus, se clonó y expresó Ia proteína recombinante DIIIE2J que comprende los residuos Met ₂ 89 a GIy ₄₀ O (Secuencia No. 22) de Ia proteína E del VD2.

La preparación obtenida muestra un alto grado de pureza en el análisis por electroforesis de proteína donde se observa una banda sin contaminantes detectables con Ia tinción con plata empleada (figura 1 B). Para descartar Ia presencia de contaminantes de peso molecular similar que pudieran co-migrar en Ia electroforesis en gel se realizó un análisis en cromatografía de fase reversa (rp- HPLC). Una alícuota de 80 μg de DIIIE2J se aplicó en una columna de fase reversa C4 (4.6x250 mm) (J.T.Baker, EEUU). En el cromatograma obtenido (figura 1A) se

puede observar un único pico que confirma el elevado grado de homogeneidad de Ia preparación.

El DIII contiene numerosos epitopos topográficos que son reconocidos por anticuerpos neutralizantes y que se ha observado que dependen de Ia formación de un puente disulfuro entre sus dos residuos de cisteína (Roehrig JT, Bolín RA, Kelly RG (1998) Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica Virology 246:317-28). Con el objetivo de obtener Ia masa molecular de Ia proteína con una mayor exactitud y verificar Ia formación del puente disulfuro se realizó el análisis por espectrometría de masas de DIIIE2J purificada por rp- HPLC. Como se puede apreciar en Ia figura 2 Ia especie mayoritaria de Ia preparación de DIIIE2J posee una masa molecular de 13515.00 Da, este valor se diferencia en 1.32 Da de Ia masa promedio esperada para Ia proteína comenzando en Ia Ala 2 (Figura 2B), Io que indica que DIIIE2J posee Ia Met N-terminal homogéneamente procesada. Para obtener confirmación de Ia presencia del puente disulfuro, una alícuota de Ia proteína purificada por rp-HPLC se separó en 2 fracciones de igual volumen y se sometió a Ia alquilación con iodoacetamida posterior a su reducción empleando ditiotreitol y sin haber recibido el tratamiento con este agente reductor. Se observó que solo en el caso de Ia alícuota que había sido sometida a las reacciones con ditiotreitol y iodoacetamida ocurrió Ia incorporación del agente alquilante, Io que se evidencia por el valor de masa obtenido de 13631.0 Da que se diferencia solo en 1.2 Da del esperado para Ia proteína reducida y carbamidometilada. En el caso de Ia fracción sometida solo a Ia reacción de alquilación se obtiene el mismo valor de m/z (13515.00 Da) que para Ia proteína sin recibir ningún tratamiento. El resultado anterior confirma que DIIIE2J no posee grupos sulfihidrilos libres y que las dos Cys presentes se encuentran enlazadas formando el puente disulfuro característico del DIII.

Para Ia caracterización antigénica de Ia proteína se realizó un ensayo de Dot- blotting. DIIIE2J es fuertemente reconocida por los sueros murinos anti-DEN presentando una marcada especificidad por el serotipo homólogo (Figura 3). La proteína también es reconocida por el suero de personas infectadas con el virus en

diferentes condiciones epidemiológicas. Este resultado evidencia que Ia proteína DIIIE2J reproduce elementos estructurales existentes en el contexto de las partículas virales completas.

Para ser empleada como ligando en cromatografía de afinidad es importante determinar si Ia proteína inmovilizada en Ia matriz cromatográfica retiene Ia capacidad de reproducir interacciones de Ia proteína en Ia superficie del virión. Con este fin se preparó una matriz de Sepharose 4B con DIIIE2J inmovilizada y se realizaron experimentos de unión de anticuerpos obtenidos contra el virus. Alícuotas de 20 μL de Ia matriz con Ia proteína inmovilizada se equilibraron en el tampón de unión (PBS pH 7,4, 0.1% Tween 20). En cada paso para separar Ia matriz de Ia solución añadida se centrifugaron los tubos durante 5 min a 500 x g. La matriz se incubó con las muestras de anticuerpos diluidas en el tampón de equilibrio por 30 min a 25° C. Después de lavar Ia matriz con abundante tampón de unión, los anticuerpos unidos se eluyeron por incubaciones sucesivas en 20 mM gly pH 2.5 y en tampón de muestra de SDS-PAGE (condiciones reductoras). Los resultados obtenidos en este experimento permitieron evidenciar como Ia proteína recombinante inmovilizada une específicamente anticuerpos obtenidos por inmunización con el virus (Figura 4) Io que confirma que Ia proteína inmovilizada reproduce regiones expuestas en el virión y por tanto puede ser utilizada como ligando para el aislamiento de potenciales receptores virales.

EJEMPLO 2

La A2M humana tiene interacción directa con el DIII de Ia proteína E del VD2.

Se conoce Ia presencia de fragmentos solubles de receptores celulares en el plasma humano. Por otro lado, Ia presencia de suero en los experimentos de infección con VD a células en cultivo puede modificar Ia eficiencia de Ia infección

(Nash DR, Halstead SB, Stenhoυse AC, McCue C. (1971) Nonspecific Factors In

Monkey Tissues and Serum Causing Inhibition of Plaque Formation and

Hemagglutination by Dengue Viruses. Infecí Immun. 3:193-199). Con el objetivo de aislar proteínas con afinidad por el DIII de Ia proteína E como potenciales receptores celulares del VD se empleó plasma humano de personas sanas de 30-40 años de

edad a los que se Ie determinó previamente que no presentaran respuesta de anticuerpos contra el virus. El plasma se inactivo por incubación una hora a 56° C y las proteínas precipitadas se separaron por centrifugación (5000 x g, 10 min.). El sobrenadante de Ia centrifugación se congeló a -80° C hasta su uso. Para realizar Ia corrida cromatográfica, cuatro partes de plasma humano se mezclaron con una parte de HEPES 100 mM pH 6, NaCI 1.75 M, CaCI ₂ 25 mM, MgCI ₂ 5 mM y se aplicaron a una columna empaquetada (1.5 cm diámetro x 1.2 cm altura) con Ia matriz de afinidad con DIIIE2J inmovilizada a un flujo de 10 cm/h. La muestra se dejó recircular a través de Ia columna por 4 horas a 25° C. Posteriormente, Ia columna se lavó con 100 volúmenes de tampón HEPES 20 mM pH 6, NaCI 0.35 M, 5 mM CaCI ₂ , 1 mM MgCI ₂ . Adicionalmente se realizó un lavado con tampón HEPES 20 mM pH 6, NaCI 0.5 M, 5 mM CaCI ₂ , 1 mM MgCI ₂ . Para Ia elución se aplicó a Ia columna 1 O mM GIy pH 2.5 y se registró Ia señal en un detector de ultravioleta a 280 nm. Para Ia identificación de las proteínas presentes en Ia elución, una alícuota de 100 μL de Ia fracción colectada se precipitó con ácido tricloroacético al 10%, se resuspendió en 20 μL de tampón de muestra y se aplicó a SDS-PAGE. Las bandas de proteínas se recortaron y se realizó Ia digestión tríptica de las mismas seguida del análisis por ESI-MS de los péptidos eluídos. En los espectros obtenidos para cada banda de proteína se seleccionaron las señales de mayor intensidad y se fragmentaron para obtener información de secuencia de los péptidos. En todos los casos los péptidos secuenciados correspondieron a fragmentos trípticos de proteínas de plasma humano (tabla 1).

Tabla 1. Resumen de las proteínas identificadas en Ia elución de Ia cromatografía de afinidad con DIIIE2J inmovilizada.

Secuencia del péptido Identificación Descripción de Ia proteína por Mascot ¹

VTAAPQSVCALR

P01023 α2-macroglobulina humana LPPNVVEESAR

VGEYSLYIGR serum Amyloid P cornponent, IVLGQEQDSYGGK humana

LICQATGFSPR

P04220 ^{Cadθna PθSada dθ} LTCLVTDLTTYDSVTISWTR inmunoglobulina tipo M humana

VFDEFKPLVEEPQNLIK

Q645G4 Albúmina de suero humano QNCELFEQLGEYK

Región C de Ia cadena kappa de

DSTYSLSSTLTLSK inmunoglobulina humana tipo G

1 : Número de acceso de la proteina identificada en la base de datos Swiss-Prot de las proteínas identificadas empleando los datos del análisis por ESI-MS y el programa de identificación MASCOT ( Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cot trell JS (1999) Probabili ty-based protein Iden tifica tion by searching seqυence da tabases using mass spectrometry da ta . Electrophoresis 20 : 3551 -67) .

En Ia elución de Ia cromatografía de afinidad pueden encontrarse otras proteínas además de las que están implicadas en Ia unión directa y específica con el ligando inmovilizado. Tanto Ia albúmina (Q645G4, tabla 1) como las inmunoglobulinas tipo M (P04220, tabla 1) y G (P01834, tabla 1) son comúnmente encontradas en experimentos de cromatografía de afinidad empleando ligandos específicos contra otras proteínas, probablemente debido a su abundancia en el plasma humano en el que alcanzan concentraciones de aproximadamente 35 mg/ml en el caso de Ia albúmina, entre 12-15 mg/ml Ia inmunoglobulina G y alrededor de 5 mg/ml Ia inmunoglobulina M. La presencia de las inmunoglobulinas pudiera explicarse también por una reactividad cruzada de anticuerpos presentes en el plasma, con DIIIE2J inmovilizada.

De particular interés se consideró Ia presencia de Ia A2M (P01023, tablai ; Seq. ID. 2) dentro de las proteínas identificadas. Se conoce que Ia A2M funciona como proteína portadora para otras moléculas que puede conducir a Ia endocitosis mediada por su receptor celular A2MR (Seq. ID. 3). Sin embargo, En Ia elución de Ia cromatografía de afinidad también se pueden encontrar proteínas que aunque no participan en Ia interacción directa con el ligando inmovilizado, pueden encontrarse formando parte de un complejo ternario con otras de las proteínas identificadas (Gavin AC, Bosche M, Krause R, Grandi P ₁ Marzioch M, Bauer A ₁ Schultz J, Rick JM, Michon AM, Cruciat CM, Remor M, Hofert C, Schθlder M, Brajenovic M, Ruffner H, Merino A, Klein K, Hudak M, Dickson D ₁ Rudi T ₁ Gnau V, Bauch A, Bastuck S,

Huhse B, Leutwein C, Heurtier MA, Copley RR, Edelmann A, Querfurth E, Rybin V, Drewes G, Raída M ₁ Bouwmeester T ₁ Bork P ₁ Seraphin B ₁ Kuster B, Neubauer G, Superti-Furga G (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis ofprotein complexes Nature. 415:123-4). Para establecer si el aislamiento de Ia A2M se debe a una interacción directa, una alícuota de 100 μg de DIIIE2J en PBS pH 7.4 se incubó en experimentos independientes con 100 μg de A2M humana no activada y activada por tratamiento con metilamina. La concentración de ambas proteínas en Ia mezcla fue de 1.4 x 10 ^"4 mol/L para DIIIE2J y 7 x 10 ^'7 Mol/L para ambas variantes de Ia A2M humana. La reacción se incubó por 1 hora a 37° C. Seguidamente Ia mezcla de las proteínas se aplicó en una columna de filtración en gel Superdex 200 HR 10/30 equilibrada en tampón NaHPO ₄ 50 mM pH 7.0 300 mM NaCI, a un flujo de 0.4 mL/min (Figura 5E y F). Previo a Ia aplicación de Ia mezcla de Ia proteína DIIIE2J y Ia A2M se realizaron corridas con las proteínas por separado para establecer los perfiles de elución y el tiempo de retención de cada una de ellas (Figura 5B-D). En todas las corridas realizadas las fracciones colectadas se precipitaron con acetona y se analizaron por SDS-PAGE 15%, manteniendo en cada caso Ia misma relación respecto al volumen total de cada fracción (1/5). En Ia figura 5G se evidencia Ia formación de un complejo entre DIIIE2J y las dos variantes de Ia A2M por Ia aparición de Ia banda correspondiente a DIIIE2J en Ia fracción de alto peso molecular. Este resultado constituye Ia primera evidencia de Ia interacción del DIII de Ia proteína de Ia envoltura del VD con A2M.

EJEMPLO 3 Determinación de Ia afinidad de Ia interacción entre DIIIE2J y A2M por Biacore

Para determinar Ia fortaleza de Ia interacción entre DIIIE2J y Ia A2M humana se inmovilizaron covalentemente 1600 RU de DIIIE2J en un chip CM5 (canal 1 , figura 6A) (Biacore, Suecia), siguiendo el procedimiento descrito en materiales y métodos.

En experimentos preliminares (figuras 6 B y C) se pudo establecer que en Ia superficie del chip se dispone de proteína inmovilizada que expone regiones de su

superficie que se encuentran expuestas en el contexto de Ia partícula viral a través de Ia interacción específica con diferentes preparaciones de anticuerpos obtenidas por inmunización con VD. Específicamente el reconocimiento con el anticuerpo monoclonal 3H5 (figura 6C) evidencia Ia correcta exposición de un epitopo topográfico que involucra el puente disulfuro formado por las dos cisteínas del dominio.

La aplicación de A2M entre 0.3 μMol/L y 3 μMol/L permitió establecer que Ia interacción entre las dos proteínas es saturable y reversible (figura 6D). A partir de las curvas de asociación y disociación obtenidas se pudo calcular que Ia interacción tiene una kD aparente del orden de 10 ^"7 Mol/L. Este valor de afinidad puede representar una interacción de mayor fortaleza en el contexto del virión debido a que el DIII se encuentra presentando múltiples copias alrededor de un eje de simetría Io cual favorece una unión multipuntual con proteínas oligoméricas como Ia A2M. El hecho de que Ia interacción entre ambas proteínas sea reversible confirma Ia posibilidad de que Ia A2M pueda funcionar como proteína portadora para Ia entrada del virus a las células.

EJEMPLO 4

Lígandos naturales del receptor A2MR inhiben Ia unión de DIIIE2J a células Vero y Ia infección viral.

RAP es Ia chaperona natural de LRP. Esta proteína controla Ia actividad de LRP1 posiblemente provocando un cambio conformacional que impide Ia unión y/o Ia internalización de varios ligandos de este receptor (Herz J, Goldstein JL, Strickland DK, Ho YK, Brown MS. (1991) 39-kDa protein modulates binding of ligands to low density lipoprotein receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor J Biol Chem. 266:21232-8). Por esta razón constituye un ligando ideal para obtener evidencias acerca de si LRP1 esta involucrado en Ia endocitosis del VD en células de mamíferos.

Las células Vero se han empleado ampliamente en el estudio de Ia naturaleza de Ia interacción del VD con sus receptores celulares. Estas células son altamente susceptibles a Ia infección por los cuatro serotipos del virus. Para evaluar actividad

antiviral contra el VD resultan particularmente ventajosas porque permiten Ia realización de ensayos por inhibición de Ia formación de placas de lisis.

Dado que esta línea celular deriva de células de riñon de mono (https://www. atcc. orgfi y los ligandos del receptor A2MR empleados en los ensayos son de origen humano, se corroboró Ia unión de Ia proteína RAPR13 y A2M_MeNH ₂ a las células Vero. Con este fin se realizaron experimentos con las proteínas fluoresceinadas y se midió la unión de las mismas a Ia superficie de células Vero empleando citometría de flujo. Ambas proteínas mostraron una unión dependiente de concentración y saturable en este tipo de células (Figura 7A). Seguidamente investigamos si Ia proteína RAPR13 era capaz de inhibir Ia unión de Ia A2M-MeNH ₂ a las células Vero. Para esto, las células Vero previamente fijadas se incubaron por 30 min. a 4 ^o C con una mezcla de las proteínas A2M_MeNH ₂ fluoresceinada y RAPR13 o EGF humano recombinante, estando estas últimas en un exceso molar de 100 veces. Los resultados obtenidos evidencian disminución en Ia intensidad de Ia fluorescencia de las células incubadas con A2M_MeNH ₂ en presencia de RAPR13, a diferencia de las células incubadas con Ia proteína en presencia de EGF humano recombinante (Figura 7B). Estos resultados corroboran que tanto Ia A2 M-MeNH ₂ como RAPR13 se unen de forma específica y funcional al receptor A2MR en las células Vero. El ensayo de inhibición de infección se realizó empleando placas de 24 pozos sembradas con una monocapa de células Vero, aproximadamente al 90% de confluencia. La dilución del virus se ajustó para obtener aproximadamente 20 placas de lisis por pozo, indicando los focos de infección viral. Los resultados del ensayo mostraron una drástica reducción del número de placas de lisis cuando se realizó la pre-incubación de las células tanto con Ia proteína RAPR13 como con una preparación policlonal de anticuerpos anti-receptor A2MR, antes de añadir Ia preparación viral (tabla 2). No se obtuvo una disminución significativa de Ia infección en los casos en que se pre-incubaron las células con los controles de BSA y Ia preparación de anticuerpos obtenidos contra una proteína no relacionada. Tabla 2. Ensayo de inhibición de Ia infección de células Vero por un ligando natural del receptor A2MR y anticuerpos anti-receptor ¹ .

Proteína VD 1 VD2 VD3 VD4

RAPR13 65 76 60 75

BSA 7 - - - α-A2MR 82 90 90 85

α-NR 5 - - -

1. Los resultados representan el promedio de tres determinaciones independientes. Las cepas virales empleadas en los ensayos fueron West Pac 74 del VDl, S16803 del VD2, CH53489 del VD3 y TVP360 del VD4.

Las proteinas RAP13 y BSA se emplearon a una concentración de 100 μg/mL en el ensayo. α-A2MR: anticuerpos obtenidos por inmunización con el receptor A2MR. α-NR: anticuerpos obtenidos por inmunización con una proteina no relacionada. Las dos preparaciones de anticuerpos se emplearon en una dilución 1/100.

Empleando igualmente un ensayo de reducción del número de placas de lisis se demostró que Ia inhibición de Ia infección obtenida para el VD2 con Ia proteína RAPR13 es dependiente de Ia concentración de Ia proteína empleada en el ensayo (Figura 8). Este resultado constituye una fuerte evidencia de que el VD utiliza el receptor A2MR para realizar Ia entrada a las células que infecta.

EJEMPLO 5 Diseño de péptidos sintéticos topográficos y estructuralmente constreñidos

A pesar de que es ampliamente aceptado el papel esencial del DIII en Ia unión de los FV a las células, no se han reportado péptidos sintéticos con una potente capacidad de inhibición de Ia infección en rango nM o de pocos uM. Hay varias razones que explican este hecho: 1) el mimetismo de los determinantes estructurales de proteínas con péptidos sintéticos no es una tarea trivial, los parches

de Ia superficie de las proteínas involucrados en interacciones proteína-proteína suelen ser topográficos, e involucran a regiones cercanas en Ia estructura 3D pero lejanas en Ia estructura primaria, 2) estos parches de interacción suelen ser superficies extensas, de varios cientos a pocos miles de A2, superior a Ia superficie total de péptidos pequeños, 3) Ia estructura de los péptidos en solución suele ser flexible, Io cual implica una perdida de entropía configuracional considerable al adoptar Ia estructura biológicamente relevante para Ia interacción con Ia proteína ligando, y por tanto una disminución considerable de Ia afinidad del complejo péptido-proteína con respecto al complejo proteína-proteína, 4) además es posible que en solución el péptido pueda adoptar conformaciones relativamente estables diferentes a Ia estructura del mismo en el contexto de Ia proteína nativa, 5) Ia interacción del virus con el (los) receptor(es) de naturaleza proteica es de alta afinidad, y puede involucrar unión multipuntual al presentar el virión múltiples copias simétricas del DIII en su superficie, Io cual impone una barrera energética alta para Ia competencia péptido-virus por el receptor.

Datos obtenidos en estudios de Ia relación estructura función de Ia interacción entre el receptor A2MR y sus ligandos naturales, han mostrado Ia importancia de grupos de residuos básicos y/o de cadenas laterales de Lys/Arg en Ia superficie de los ligandos. Tal es el caso de Ia Lys1370 de Ia proteína A2M (SEQ ID. 2) y Ia Lys57 de Ia exotoxina A de Pseudornona aeruginosa, cuyas mutaciones afectan grandemente Ia unión del ligando al receptor (Arandjθlovic S, Hall BD, Gomias SL (2005) Mutation of lysine 1370 In full-length human alpha2-macroglobulin blocks binding to the low density lipoprotein receptor-related protein-1. Arch Biochem Biophys. 438:29-35, Wedekind JE, Trame CB, Dorywalska M, Koehl P, Raschke TM, McKee M, FitzGerald D, Collier RJ, McKay DB. (2001) Refined crystallographic structure of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its implications for the molecular mechanism of toxicity J Mol Biol. 314:823-37). De forma similar, otros estudios indican Ia relevancia del cluster básico 136-150 y de Ia Arg172 de Ia proteína apoE (Raussens V, Slupsky CM, Ryan RO, Sykes BD (2002) NMR structure and dynamics of a receptor-active apolipoprotein E peptide. J Biol Chem. 277:29172-80).

Por otro lado, los dominios de unión de ligandos del receptor A2MR y en general los de Ia familia de receptores de LDL se caracterizan por un potencial electrostático

negativo significativo en Ia superficie de unión del ligando, al que contribuyen residuos ácidos expuestos y conservados, los cuales pueden interactuar favorablemente con los residuos básicos de los ligandos. Así, Ia estructura cristalográfica del complejo de un fragmento del receptor de VLDL y el rinovirus humano 2, perteneciente al grupo menor de los rinovirus muestra una interacción estrecha entre Ia LYS224 de Ia proteína VP1 de Ia cápsida del virus y los residuos ASP139 y GLU137 del receptor (Verdaguer N, Fita I ₁ Reithmayer M, Moser R, Blaas D (2004) X-ray structure of a minor group human rhinovirus bound to a fragment of its cellular receptor protein. Nat Struct Mol Biol. 11:429-34). La cadena lateral alifática de Ia Lys224 de VP1 , interactúa además con el residuo Trp132 del dominio del receptor, el cual aunque no conservado estrictamente en los dominios de unión de ligando de A2MR, es el aminoácido más frecuente en esa posición (en 20 dominios de un total de 31), mientras Leu aparece en 4 dominios, Phe en 3, Arg en 2 y Lys y Ser en solo 1 (Figura 9). La tabla 3 muestra los parches de unión de ligando del receptor A2MR definidos por las posiciones estructuralmente equivalentes al Trp132, ASP135, GLLM 37 y ASP139 del receptor de VLDL.

Tabla 3. Parches de unión a ligando del receptor A2 M R ¹ .

Res . Res . Nro.

Dominio ^* Pl P2 P3 P4 inicio final aas

Al 25 66 42 W45 D48 E50 D52

A2 70 110 41 R90 N93 V95 D97

A3 852 892 41 W871 D874 D876 D878

A4 893 933 41 W912 D915 D917 D919

A5 934 973 40 W953 D956 D958 D960

A6 974 1013 40 W994 D997 D999 D1001

A7 1013 1053 41 W1032 D1035 D1037 D1039

A8 1060 1099 40 W1080 D1083 D1085 D1087

A9 1102 1142 41 W1123 D1126 D1128 D1130

AlO 1143 1182 40 K1164 D1167 N1169 D1171

AIl 2522 2563 42 L2542 D2545 V2547 H2549

A12 2564 2602 39 L2583 N2586 A2588 D2590

A13 2603 2641 39 S2622 N2625 F2627 D2629

A14 2642 2690 49 W2671 D2674 A2676 D2678

A15 2694 2732 39 W2713 D2716 E2718 D2720

A16 2732 2771 40 W2751 D2754 S2756 D2758

A17 2772 2814 43 W2792 D2795 D2797 D2799

Al 8 2816 2855 40 F2835 D2838 D2840 D2842

A19 2856 2899 44 W2876 D2879 E2881 D2783

A20 2902 2940 39 L2922 N2925 Q2927 D2929

A21 3332 3371 40 W3351 D3354 E3356 D3358

A22 372 3410 39 F3391 3394 D3396 D3398

A23 3411 3450 40 F2431 N2434 Q2436 N2438

A24 3451 3491 41 W3471 D3474 D3476 D3478

A25 3492 3533 42 W3512 D3515 E3517 D3519

A26 3534 3572 39 W3553 D3556 D3558 D3560

A27 3573 3611 39 W3592 D3595 D3597 D3599

A28 3611 3649 39 W3630 D3633 D3635 D3637

A29 3652 3692 41 W3671 D3674 E3576 D3678

A30 3693 3733 41 R3714 D3717 T3619 N3621

A31 3739 3778 40 L3759 N3762 F3764 D3766

1. La numeración en la tabla corresponde a la secuencia del receptor AMR humano (SEQ ID3) . Dominio: Denominación de los dominios de unión a ligando del receptor A2MR humano en la base de datos SwissProt. Res. Inicial y Res. Final, número de los residuos de inicio y final de los diferentes dominios de unión a ligando del receptor. Nro. aas: número de aminoácidos totales que conforman los dominios de unión a ligando. Pl-4 : residuos que conforman los parches de unión a ligando. Atendiendo a Ia importancia de residuos Lys/Arg y en general de las cargas

electrostáticas en Ia interacción con los dominios de unión de ligandos de Ia familia de receptores de LDL, inspeccionamos la localización de los residuos cargados en Ia superficie superior y lateral expuesta de los modelos de Ia estructura tridimensional de los DIII correspondientes a los VD1-4. Para realizar este análisis, utilizamos las estructuras cristalográficas de Ia proteína E del VD2 y el VD3 (ficheros loan y 1 uzg del pdb), y construimos modelos de la estructura 3D de Ia proteína E de los VD1 y VD4, usando el programa MODELLER (A. SaIi, TL. Blundell. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J. Mol. Biol. 234:779-815). Como muestra Ia figura 10, existen cuatro parches superficiales correspondientes a cadenas laterales de usinas conservados en los cuatro serotipos. A excepción del parche definido por Ia Lys310 del VD serotipos 1 , 2 y 4 (Lys308 en VD3), el resto de los parches no se conserva estrictamente a nivel de su localización en Ia estructura primaria, pero si en su posición topográfica en Ia superficie de Ia proteína. Esto es posible debido a Ia aparición de mutaciones correlacionadas en posiciones cercanas de Ia estructura 3D de Ia proteína y el carácter flexible de Ia cadena lateral de Ia lisina. Dos de los parches están situados en Ia superficie expuesta correspondiente a Ia hoja beta definida por las hebras A, B, C, D y E (Figura 11A). Los parches restantes se encuentran localizados en Ia superficie lateral/superior correspondiente o colindante con Ia horquilla beta FG.

Al menos uno de los cuatro parches de lisina conservados en Ia superficie de los DIII, y en especial los dos parches presentes o colindantes en Ia superficie expuesta de Ia horquilla beta FG interactúan favorablemente con los parches de unión de ligando en el receptor A2 M R definidos en Ia tabla 3. Para diseñar péptidos inhibidores de Ia infección de FV basados en el DIII, seleccionamos como base el segmento Ser376-Trp391 (numeración de dengue 2). Este segmento comprende Ia horquilla beta FG, que expone al solvente un área total de 745 A ² , y forma parte de Ia superficie superior/lateral del dominio expuesta en el contexto de Ia estructura del virión maduro. Varias mutaciones en esta región afectan Ia interacción del dominio con anticuerpos neutralizantes, bloqueadores de Ia unión del virus a las células o alteran el fenotipo viral. La estructura de Ia cadena

principal correspondiente a este segmento es conservada en VD2 y VD3 (Figura 11 B), para los cuales se encuentra disponible Ia estructura cristalográfica de Ia proteína E. Esta conservación estructural concierne también al lazo F-G, que incluye un giro beta tipo Il entre los residuos Glu383-Gln386 (según numeración de SEQ ID 1). La conservación de Ia estructura de Ia cadena principal del segmento FG, también es aplicable a los virus VD1 y VD4, considerando Ia similitud de las secuencias correspondientes, unido a Ia similitud estructural de los modelos de Ia estructura 3D de Ia proteína E de estos virus, obtenidos a partir de Ia homología con Ia proteína E de VD3 y VD2 respectivamente (Figura 11 B). La Figura 11 (C y D) muestra Ia estructura primaria y modelos de Ia estructura 3D de los péptidos sintéticos HDIII2CL y HDIII3CL, diseñados sobre Ia base de Ia horquilla FG de los virus VD2 y VD3.

Los péptidos sintéticos incluyen una cisteína en el extremo N-terminal y otra en el C- terminal. Estas císteínas pueden formar un puente disulfuro estructuralmente compatible con Ia estructura de Ia horquilla beta como indican los modelos de Ia estructura tridimensional de estos péptidos (Figura 11 C y D) en los cuales los carbonos alfa correspondientes a las cisteínas están separados por una distancia de 5.7 A, común en puentes disulfuros. La ciclización por puentes disulfuros contribuye a Ia estabilidad de Ia estructura de horquilla del péptido, al disminuir Ia entropía configuracional de Ia cadena principal del mismo.

El diseño permite Ia formación de 6 puentes de hidrógeno de Ia cadena principal entre las hebras beta F y G contribuyendo a Ia estabilidad del mismo (Figura C y D). Los residuos 4 y 6 (hebra F) y 13, 15 y 17 (hebra G) son hidrofóbicos y están orientados hacia Ia misma cara de Ia horquilla, Io que garantiza una interacción hidrofóbica favorable entre estos residuos. Los residuos 4-6 de Ia hebra beta F, son bifurcados en el carbono beta, y se caracterizan por una alta propensidad de adoptar estructuras beta/extendidas.

El péptido HDIII3CL (SEQ ID. 7) incluye los residuos Lys11 y Lys14 correspondientes a dos parches de usina del DIII, sitios putativos de interacción favorable con dominios de unión de ligandos de A2MR. El péptido HDIII2CL (SEQ

ID. 5), solo posee 1 parche, Lys14; mientras que HDIIMCL (VD1 , SEQ ID. 6) posee

dos parches y HDIII4CL (VD4, SEQ ID. 8) ninguno.

Adicionalmente, se diseñaron los péptidos cíclicos HDIII2Cs (Seq. ID. 4) y pepDIII-1 , que se corresponden respectivamente con las secuencias Ile379-Lys388 y Gly381- Gln386 de Ia proteína E del VD2 (Figura 12A). Ambos péptidos, incluyen cisteínas en los extremos N- y C-terminales para su ciclización mediante Ia formación de puentes disulfuros, compatibles estructuralmente con Ia estructura 3D de Ia proteína nativa. El péptido HDIII2Cs, es análogo al péptido HDIII2CL, pero incluye solo una porción de las hebras beta F y G. En cambio, el péptido pepDIII-1 , incluye solo al lazo F-G.

EJEMPLO 6

El péptido HDIII2Cs reproduce un epitopo topográfico del DIII del VD2

Con el objetivo de evaluar el reconocimiento del péptido HDIII2Cs por el Mab 3H5, se obtuvieron conjugados del péptido con BSA que se analizaron por Western blotting con este anticuerpo (Figura 12B). Como control positivo en el ensayo se utilizó Ia proteína recombinante PD5. Esta proteína está formada por el DIII de Ia proteína E del VD2 (residuos 286-426), fusionado al C-terminal de Ia lipoamida deshidrogenasa de Neissería meningitidis (P64K). La proteína PD5 ha sido evaluada como candidato vacunal y es capaz de generar respuesta inmune protectora al reto viral en modelos de infección de ratones y monos (Hermida L., Rodríguez R., Lazo L ₁ Silva R., Zuíueta A., Chinea G., López C ₁ Guzmán M. G. and Guillen G. (2004) A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J Virol Methods. 115: 41-49) Io que evidencia que esta proteína presenta epitopos claves de esta región del virus.

El Mab 3H5 se obtuvo por inmunización con una preparación de VD2 {Gentry MK, Henchal EA, McCown JM, Brandt WE, Dalrymple JM. (1982) Identification of distinct antigenic determinants on dengue-2 virus using monoclonal antibodies Am J Trop Med Hyg. 31(Pt 1):548-55) y tiene un reconocimiento serotipo específico por una región del DIII que compromete al puente disulfuro del dominio. Este anticuerpo es un potente neutralizante de los virus del serotipo 2. Resultados publicados indican

que existe una alta correlación entre Ia actividad neutralizante de este Mab y su capacidad para inhibir Ia unión del virus a sus receptores celulares (He RT, lnnis BL, Nisalak A, Usawattanakul 1/1/, Wang S ₁ Kalayanarooj S, Anderson R (1995) Antibodies that block virus attachment to Vero cells are a major component of the human neutralizing antibody response against dengue virus type 2 J Med. Virol. 45:451-61). El reconocimiento específico de este anticuerpo por el péptido HDIII2Cs evidencia que este logra reproducir un epitopo topográfico de Ia superficie del DIN de gran importancia funcional.

Otra herramienta en Ia caracterización de péptidos topográficos Io constituye Ia obtención y caracterización de sueros anti-péptidos. Con el objetivo de obtener mayores evidencias acerca de cuanto el péptido diseñado lograba reproducir Ia región correspondiente en Ia proteína E del virus se realizó un esquema de inmunización empleando como inmunógeno el péptido HDIII2Cs conjugado a Ia KLH que comprendió Ia administración de cinco dosis del conjugado HDIII2Cs-KLH por vía subcutánea a 10 ratones BaIb C. El título anti-péptido de Ia unión de los sueros de los animales inmunizados (1/2700) se determinó en un ensayo de Elisa indirecto recubriendo las placas con HDIII2Cs y comparando Ia reactividad con el suero de los animales antes de Ia inmunización.

Para evaluar si el péptido HDIII2Cs podía generar una respuesta dependiente de conformación, se realizó un ensayo de dot blotting en el que dos membranas de nitrocelulosa se sensibilizaron con Ia proteína PD5 y el péptido HDIII2Cs sin modificar y ambas moléculas reducidas y carbamidometiladas (Figura 12C). En el ensayo se evidenció una disminución de Ia señal de reconocimiento del suero anti-

HDIII2Cs tanto por el péptido como por PD5 debido a Ia pérdida del puente disulfuro. En este ensayo también se apreció una señal de reconocimiento del Mab

3H5 por el péptido que desaparece totalmente cuando ha sido reducido y carbamidometilado.

Finalmente el suero anti-péptido se evaluó en el reconocimiento del virus obtenido por infección de células Vero en ensayos de western blotting e inmunoprecipitación de ³⁵ S_VD2. En el ensayo de western blotting el suero anti-HDIII2Cs reconoció una banda a Ia misma altura de Ia señal de reconocimiento obtenida con el Mab 3H5 y

que corresponde a Ia masa molecular de Ia proteína E (Figura 13A). No se observó ninguna señal en Ia membrana incubada con el suero pre-inmune de los ratones evidenciando un reconocimiento específico generado por Ia respuesta anti-péptido. El suero anti-HDIII2Cs inmunoprecipitó Ia proteína E del VD2 (Figura 13B). Los resultados obtenidos evidencian que el péptido HDIII2Cs mimetiza un epitopo del DIII de Ia proteína E del VD2 dependiente del puente disulfuro formado entre las dos cisteínas de este dominio y que Ia restricción conformacional impuesta al péptido mediante el puente disulfuro diseñado tiene un efecto dominante en Ia respuesta de anticuerpos que se obtuvo en Ia inmunización y es necesaria para mimetizar eficientemente Ia estructura del epitopo.

Ejemplo 7

El péptido HDIII2CL logra una mejor representación de Ia estructura del epitopo que el péptido HDIII2Cs Se realizó un ensayo de inmunización con el objetivo de determinar si el péptido HDIII2CL podía generar una respuesta superior al péptido HDIII2Cs, evaluando en base a las características conformacionales de esta región antigénica en Ia partícula viral. En el esquema de inmunización se incluyeron además el péptido HDIII2Cs y el péptido pepDIII-1 (Figuras 12A). Para este esquema se obtuvieron igualmente conjugados de los péptidos con Ia proteína KLH y se siguió el mismo esquema de dosis que el descrito en el ejemplo 6.

Con los sueros anti-péptidos obtenidos se realizó un ELISA indirecto en el que se recubrieron las placas con las proteínas PD5 y P64K en las tres variantes: no modificada, carbamidometilada y reducida y carbamidometilada. Tanto el suero anti- HDIII2Cs como el suero anti-HDIII2CL reconocen Ia proteína PD5 con una respuesta dependiente de Ia conformación Io que se evidencia por Ia mayor reactividad con Ia proteína sin modificar que con Ia proteína después de reducida y carbamidometilada (Figura 14). Sin embargo, el impacto que tiene Ia pérdida del puente disulfuro de Ia proteína para el suero anti-HDIII2CL es mayor que para el suero anti-HDIII2Cs y reproduce mejor Ia magnitud del efecto que se observa con el suero antí-VD2, obtenido por inmunización de ratones con una preparación viral

(Figura 14). Este resultado muestra que el rediseño realizado posibilita una mejor representación por el péptido HDIII2CL de Ia conformación que presenta el virus en esta región del DIII.

EJEMPLO 8

Péptidos topográficos correspondientes al giro FG del DIII muestran una inhibición de amplio espectro contra los cuatro serotipos del VD

Se realizó un ensayo con los péptidos HIII2CL y HIII3CL (Figuras 11 C, 1 OD y 15) para determinar su capacidad de reproducir Ia interacción con moléculas de Ia superficie de las células que presenta el DIN. En el ensayo se utilizaron péptidos biotinilados para facilitar su detección en experimentos de citometría de flujo mediante el empleo de un conjugado estreptavidina-FITC. En Ia figura 16 se muestran los histogramas que representan el comportamiento de Ia intensidad de Ia fluorescencia en las células por incubación con diferentes diluciones de los péptidos HIII2CL, HIII3CL y un péptido no relacionado (0.3-0.02 mg/ml). Los resultados obtenidos indican que ambos péptidos HIII2CL y HIII3CL son capaces de unirse a Ia superficie de las células con un comportamiento dependiente de Ia concentración (Figura 16), evidenciando una interacción específica. En el caso del péptido HIII3CL se obtiene un corrimiento significativamente mayor en el histograma que el obtenido para HIII2CL. Este resultado indica que el péptido HIII3CL logra establecer una interacción de mayor afinidad. Este resultado se corresponde con el hecho de que el péptido HIII3CL presenta los dos residuos de usina potencialmente importantes en Ia interacción con el receptor A2MR (Lys11 y Lys14, Figuras 10C y 11 D) mientras que el péptido HIII2CL solo presenta uno de ellos (Lys14, Figuras 10B y 11C). El DIII representa una de las regiones de mayor variabilidad en Ia superficie expuesta de Ia proteína E. De hecho, dentro de las características antigénicas del de este dominio se destaca que los anticuerpos obtenidos contra esta región son predominantemente específicos para cada serotipo (Roehríg JT, Bolín RA, Kelly RG (1998) Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica Virology 246:317-28). Sin embargo, en el ensayo de inhibición con los diferentes serotipos del VD, los péptidos muestran una capacidad inhibitoria de

amplio espectro logrando inhibir eficientemente Ia infección tanto del serotipo homólogo como de los tres serotipos restantes (tabla 3). De hecho, a Ia concentración ensayada (0.1 mg/ml), con excepción del péptido HIII4CL para el VD3, en el resto de los puntos ensayados se obtuvo más de un 50% de inhibición.

Tabla 3. Inhibición de Ia infección de los cuatro serotipos del VD por los péptidos diseñados.

Péptido DV1 DV 2 DV 3 DV 4

HDIIMCL + + + +

HDIII2CL + + + +

HDIII3CL + + + +

HDIII4CL + + +/- +

HDIII2Cs - - - -

3H5pept - - - -

Se presentan los resultados obtenidos evaluando los péptidos en un ensayo de reducción del número de placas virales, realizado en células Vero. Los péptidos se emplearon a una concentración de 0.1 mg/ml. Los símbolos representan el grado de reducción del número de placas virales del punto experimental respecto a un control donde se incubaron las células con virus sin previo tratamiento con los péptidos. (+) Disminución del 50% o más, (+/-) Disminución del 10-50% del número de placas, (-) Disminución de menos del 10% del número de placas.

En Ia Figura 17 se presentan resultados adicionales que confirman Ia potente actividad inhibitoria de los péptidos tanto contra el serotipo homólogo así como contra el resto de los serotipos del virus. El péptido HDIII2CL logra una inhibición de 60% de Ia infección contra su serotipo homólogo (DV2) y de 80% de Ia infección contra VD1 (Figura 17B). Así mismo, el péptido HDIII3CL inhibe Ia infección del VD2 con igual o mayor eficiencia que el péptido HDIII2CL (Figura 17C). En ambos ensayos (Figuras 17B y C), los péptidos HDIII2CL y HDIII3CL muestran un efecto

significativamente mayor que el resto de los péptldos empleados en los ensayos: 3H5pept, NR3pep, pepDIII-1.

Basados en Ia similitud estructural que existe en Ia proteína E, se diseñaron péptidos correspondientes a Ia misma región del DIII de otros FV de interés para Ia salud humana y animal (Figura 18): virus de Ia fiebre amarilla (Seq. ID. 10), virus del oeste del nilo (Seq. ID. 11), virus de Ia encefalitis japonesa (Seq. ID. 12), virus de Ia encefalitis transmitida por garrapata (Seq. ID. 13), virus Kunjin (Seq. ID. 14), virus Powasan (Seq. ID. 15), virus Langat (Seq. ID. 16), virus de Ia encefalitis del valle Murray (Seq. ID. 17) y virus de Ia encefalitis de St. Louis (Seq. ID. 18).

EJEMPLO 9

El péptido HDIII2CL modifica Ia interacción de A2MR y RAPR13 con el receptor A2MR.

Con el objetivo de obtener una evidencia directa de Ia interacción con el receptor A2MR, se investigó el efecto de uno de los péptidos diseñados en Ia unión de los ligandos naturales del receptor a las células Vero. El ensayo se realizó empleando

Ia A2M y RAPR13 fluoresceinadas y comparando Ia unión a células Vero en presencia de concentraciones crecientes del péptido HDIII2CL. La cantidad de proteína unida a las células se midió por citometría de flujo. Como control negativo en el ensayo se empleó el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante

(EGFhr) puesto que se conoce que las células Vero expresan el receptor específico para esta proteína en su superficie (Copp J, Wiley S, Ward MW, van der Geer P

(2005) Hypertonic shock inhibits growth factor receptor signaling, induces caspase-3 activation, and causes reversible fragmentation of the mitochondríal network. Am J Physiol CeII Physiol. 288:C403 -15).

En Ia figura 19 se puede apreciar que Ia presencia del péptido HDIII2CL provoca un incremento en Ia cantidad de A2M y RAPR13 unidas a Ia superficie de las células mientras que no tiene efecto sobre Ia unión de EGFhr. Tampoco se obtiene variación en Ia unión de RAPR13 en presencia del péptido 3H5pept, empleado como control en el ensayo. Estos resultados indican que Ia influencia del péptido HDIII2CL es específica en Ia interacción de A2M y RAPR13 con su receptor en las

células. Sin embargo, el hecho de que el efecto obtenido sea de aumento de Ia unión de los ligandos sugiere que el péptido no se une al mismo sitio de estas moléculas. En ese caso el efecto obtenido se debería a que Ia unión del péptido induzca cambios conformacionales en el receptor que favorecen Ia unión de Ia A2M y RAPR13. La modulación de Ia interacción de un ligando por un efecto alostérico es posible considerando Ia estructura de múltiples dominios de unión a ligandos que presenta este receptor (Herz J, Strickland DK. (2001) LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor. J Clin Invest. 108:779-84). Este es el mecanismo que explica Ia inhibición de Ia unión y/o internalización que ejerce RAP sobre los ligandos de A2MR que se unen en regiones notablemente distantes en su estructura.

EJEMPLO 10

La inhibición de la infección por VD de Ia A2M activada es mediada por Ia interacción en solución con el virus.

Para obtener evidencias adicionales de Ia interacción de Ia A2M con el VD, se emplearon las dos variantes de la proteína /. e. activada y no activada, en ensayos de inhibición de infección de células Vero. En los ensayos se incubó Ia preparación viral con concentraciones de Ia A2M activada muy superiores a las que se alcanzan fisiológicamente para esta variante de Ia proteína. Como control en el ensayo se emplearon concentraciones equimolares de Ia variante no activada así como de una proteína no relacionada con el receptor A2MR.

En Ia figura 2OA se puede observar que Ia pre-incubación del virus con diferentes diluciones de Ia A2M activada bloquea Ia infección viral en un efecto dependiente de Ia concentración de Ia proteína. Un resultado muy interesante Io constituye que Ia concentración de A2M activada que inhibe el 50% de Ia infección viral corresponde con el valor de Ia afinidad de Ia interacción de esta proteína con Ia proteína DIIIE2J (10 ^"7 mol/L, ver Ejemplo 3 y Figura 6D). Este resultado sugiere que Ia inhibición de Ia infección es mediada por Ia interacción de Ia A2M activada con el virus y no por Ia competencia por el receptor en Ia superficie de las células. Este efecto de inhibición de Ia infección por A2M activada se obtuvo además para los serotipos 1 y 3 del virus

(Figura 20C).

Para corroborar este resultado, se realizó un experimento en el que se pre- incubaron las dos variantes de Ia proteína A2M con Ia preparación viral distintos tiempos antes de Ia incubación con las células. Como se muestra en Ia figura 2OB el efecto inhibitorio de Ia A2M activada depende del tiempo de incubación con Ia preparación viral, como corresponde a un efecto mediado por Ia interacción en solución de Ia proteína con Ia partícula viral. De forma muy interesante en este ensayo se obtiene que para los tiempos de incubación mayores de 30 minutos, Ia preparación de A2M no activada llega a aumentar Ia infección hasta un 50%. Este resultado indica que pequeñas concentraciones de proteína A2M que se pueden haber generado durante Ia pre-incubación con Ia preparación viral fueron capaces de aumentar Ia eficiencia de Ia infección. De hecho, esta situación puede reflejar mejor Ia situación fisiológica en Ia que tiene lugar Ia interacción del virus con Ia A2M ¡n vivo donde las cantidades de A2M activada circulantes son muy bajas dada Ia alta eficiencia del receptor A2MR en el aclaramiento de los complejos A2M-proteasa (L/ Y ₁ Lu W ₁ Marzolo MP ₁ Bu G (2001) Differential functions of members of the low density lipoprotein receptor family suggested by their distinct endocytosis rates. J Biol Chem. 276: 18000-18006; Verges M, Bensadoun A ₁ Herz J ₁ Belcher JD ₁ Havel RJ (2004) Endocytosis of hepatic Upase and lipoprotein Upase into rat liver hepatocytes in vivo is mediated by the low density lipoprotein receptor-related protein. J Biol Chem. 279: 9030-9036).

EJEMPLO 11

El receptor A2MR inhibe Ia infección del VD a células Vero Con el objetivo de obtener evidencias adicionales de Ia interacción directa del receptor A2MR con el VD, se realizó Ia purificación del receptor a partir de plasma de personas sanas. Las muestras de plasma de aproximadamente 300 rriL se pre- fraccionaron en una cromatografía de intercambio amónico empleando una matriz de DE-52 (Whatman, Reino Unido) equilibrada con tampón Tris 50 mM, 60 mM NaCI ₁ 1 mM EDTA pH 6. Para determinar Ia presencia del receptor A2MR en las distintas fracciones eluidas con concentraciones crecientes de NaCI se empleó un

ensayo en membrana de unión de ligandos biotinilados y detección con conjugado de streptavidina-peroxidasa.

Las fracciones positivas se dializaron contra tampón Tris 50 mM, 120 mM NaCI pH 7.4, 1 mM CaCI ₂ , 0.05 % Tween 20 y se aplicaron a una columna con A2M activada inmovilizada. Previo a Ia elución del receptor se realizó un lavado con el tampón de equilibrio pero conteniendo 0.5 M NaCI. Para Ia elución específica del receptor A2MR se aplicó a Ia columna tampón Tris 50 mM, 0.5 M NaCI pH 6, 10 mM EDTA, 0.05% Tween 20 (Figura 21A). Las distintas fracciones de Ia cromatografía de afinidad se dializaron contra tampón PBS y se esterilizaron por filtración en 0.2 μM. El análisis por SDS-PAGE de las fracciones eluidas de Ia cromatografía muestra un patrón diferencial de bandas de proteínas en ambas fracciones i.e. Ia fracción eluida con NaCI 0.5M y Ia fracción de elución específica del receptor empleando EDTA y pH 6. Esto evidencia que el lavado con NaCI 0.5 M empleado permitió eliminar otras proteínas adsorbidas a Ia matriz con A2M inmovilizada. La fracción de elución específica muestra una sola banda a una altura del gel correspondiente con Ia masa molecular de Ia cadena α del receptor A2MR (400-500 kDa).

Para demostrar Ia interacción del VD2 con el receptor A2MR, Ia fracción de elución específica se empleó en un ensayo de neutralización por reducción de placas realizado en células Vero. Con este fin, una preparación viral conteniendo aproximadamente 100 partículas virales infectivas se pre-incubó con las distintas fracciones de elución de Ia cromatografía a una concentración de proteína de 25 μg/mL, por 1 hora a 25 °C. Las mezclas virus-proteínas se añadieron a las células y se incubaron 45 min a 37 °C en atmósfera de 5 % de CO ₂ . Posteriormente, las monocapas de células se lavaron para eliminar el virus no unido y las células se incubaron con medio de alta densidad por 5 días a 37 ⁰ C en atmósfera de 5 % de CO ₂ .

Los resultados de este ensayo mostraron una potente neutralización viral (concentración nanomolar) con Ia muestra correspondiente a Ia elución específica (Figura 21C). Esta fracción también mostró un efecto protector significativo en un ensayo ensayo de protección en modelo de encefalitis en ratones Balb/C inducida por inoculación intracraneal de VD (Figura 21 D). De hecho, los niveles de protección

obtenidos para Ia preparación del A2MR purificado son similares a los obtenidos con el potente anticuerpo neutralizante 4G2 a una concentración de 25 μg/mL.

EJEMPLO 12 El péptido HDIII3CL protege de Ia encefalitis por dengue en modelo de ratón.

Se empleó el modelo de inducción de encefalitis letal en ratones Balb/C por inoculación de VD para investigar Ia capacidad protectora del péptido HDIII3CL. En el ensayo se emplearon grupo de 12 ratones que se inocularon con dosis letales del VD2 en combinación con diferentes dosis de 15 μg y 1.5 μg del péptido. Como control negativo se utilizó un péptido formado por un fragmento de 14 aminácidos de reconocida actividad de unión a los glicosaminoglicanos seguido de un fragmento de 16 aminoácidos de secuencia no relacionada con Ia proteína de Ia envoltura del VD. El péptido control negativo se empleó en Ia dosis más alta utilizada con el péptido HDIII3CL También se empleó como control positivo de protección el anticuerpo monoclonal neutralizante 4G2. En este caso Ia preparación viral se pre-incubó por 1 hora a 4 ⁰ C con una concentración el anticuerpo a una concentración de 25 μg/mL.

Como se observa en Ia figura 22 el péptido HDIII3CL protegió al 56% de los ratones en el grupo correspondiente a Ia dosis de 15 μg por animal. El grupo correspondiente a Ia dosis más baja tuvo un comportamiento muy similar al grupo inoculado con el péptido control negativo y no mostró diferencias significativas respecto al grupo inoculado solamente con Ia preparación viral. Es importante destacar que Ia protección se logra con el péptido de secuencia perteneciente al serotipo 3 mientras que el reto se realizó con VD2. Este experimento, además de demostrar Ia potente capacidad del péptido de bloquear Ia infección viral en un sistema in vivo, confirma que el péptido posee capacidad protectora ante la infección por VD de un serotipo heterologo.