L'invention se rapporte également, outre à un procédé de fabrication de l'ensemble selon l'invention, à des procédés permettant respectivement de réaliser le remplissage, le prélèvement ou la conservation de liquides dans une partie de l'ensemble selon l'invention.

ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE Les microsystèmes sont de plus en plus étudiés ces dernières années dans les domaines des capteurs mécaniques, optiques, biologiques, pour le diagnostique médical ou l'industrie agroalimentaire.

Ils permettent notamment la réalisation de micromoteurs, de capteurs, de puces à ADN, mais également de systèmes fluidiques plus complexes, tels que ceux réalisés dans les laboratoires intégrés sur une puce ou « lab on chip » en anglais.

Le silicium est un élément souvent utilisé pour construire des microsystèmes. En effet, le silicium est facilement structurable. Il permet ainsi

de réaliser des microsystèmes biologiques de petites dimensions, comme par exemple des microcanaux dans lesquels les fluides biologiques vont pouvoir se déplacer, ou des microchambres de réactions dans lesquelles on va pouvoir réaliser des réactions biologiques ou chimiques avec des volumes contrôlés.

Le silicium et les techniques de la microtechnologie permettent aussi d'associer à ces dispositifs miniaturisés des contacts électriques, des systèmes de chauffage intégrés ou des fonctions plus complexes comme des circuits microélectroniques.

On peut, grâce aux microtechnologies, réaliser des composants comprenant plusieurs milliers de microréacteurs par cm2, le volume de chaque microréacteur pouvant aller de quelques pL à plusieurs dizaines, voire centaines de nL.

Pour remplir ou transférer des liquides dans ces microréacteurs, on doit utiliser des microsystèmes obtenus par les techniques de la microtechnologie. Par exemple, les robots de dispense de produits permettent d'éjecter des gouttes de liquide de tout petit volume (quelques dizaines de pL) sur des supports plans, voire dans des microréacteurs si la dispense est effectuée par des têtes piezo électriques ou par un système de jet d'encre. Pour délivrer simultanément des gouttes sur un support, les robots sont équipés de multi têtes, chacune pouvant contenir un produit identique ou non. Mais de tels robots ne peuvent toutefois pas déposer simultanément plusieurs

centaines, voire plusieurs milliers de plots seulement séparés de quelques dizaines de micromètres.

Lorsque l'on désire prélever du liquide dans un microréacteur contenant quelques nL de liquide, il est possible d'utiliser un robot de dispense muni d'une pipette adaptée à la géométrie et au volume du microréacteur. Mais lorsque l'on désire réaliser cette opération sur des centaines de microréacteurs, aucun robot sur le marché ne peut le réaliser de manière collective.

Par ailleurs, pour certaines applications, notamment de type biologique, il est important de pouvoir dispenser et prélever rapidement le liquide dans le microréacteur, avant que celui-ci ne s'évapore.

Or, à l'échelle du nanolitre, l'évaporation se fait en quelques secondes. Cela exclut donc l'utilisation des robots actuellement disponibles sur le marché.

On connaît des microsystèmes multiplots tels que ceux utilisés pour l'injection de médicaments sous la peau (voir les documents [1] et [2] référencés à la fin de la description). Les aiguilles de ces microsystèmes servent à transférer à travers l'épiderme un produit contenu dans un réservoir, un gel ou un patch. Cependant, ses systèmes réalisés en silicium, en verre, en plastique ou en métal à l'aide de techniques de microtechnologie sont utilisés pour injecter un produit unique sous la peau : toutes les aiguilles ont la même fonction.

EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention concerne un dispositif de transfert monobloc permettant le transfert collectif et simultané de micro-quantités de liquide. Ce dispositif de transfert monobloc est constitué d'une plaque possédant une face avant et une face arrière, ladite plaque étant structurée de sorte que sa face arrière soit hérissée d'un ensemble de micropipettes, chaque micropipette étant percée d'un trou axial qui se prolonge au travers de la plaque.

Le dispositif de transfert est un ensemble monobloc dans lequel les micropipettes sont d'un seul tenant avec la plaque.

Le dispositif de transfert selon l'invention n'est pas un dispositif complexe : il ne nécessite pas la présence d'une pompe ou d'une chambre pressurisée pour aspirer les micro-quantités de liquides. Par micro-quantité de liquides, on entend quelques nanolitres à quelques dizaines, voir quelques centaines de picolitres de liquides.

Avantageusement, les micropipettes du dispositif sont agencées sur la face arrière de la plaque de manière régulière. On pourra ainsi avoir la configuration où chaque micropipette du dispositif est disposée à une distance constante ou pas de ses plus proches voisines. On peut également avoir la configuration dans laquelle le pas séparant les micropipettes est différent selon les deux directions du plan du dispositif.

Selon un mode de réalisation particulier, chaque micropipette est séparée de sa voisine par un

pas interpipette compris entre quelques dizaines de micromètres et plusieurs centaines de micromètres (pm).

Selon une première variante, le dispositif de transfert comprend entre plusieurs dizaines et plusieurs milliers de micropipettes.

Selon une deuxième variante, le dispositif de transfert comprend une densité de micropipettes comprise entre 1000 et 30000 micropipettes par cm de plaque.

Avantageusement, le dispositif de transfert comprend une densité de micropipettes d'environ 2000 micropipettes par cm2 de plaque. Par exemple, avec un pas interpipettes de 200 micromètres, on obtient une densité de micropipettes de 2000 par cm2.

Avantageusement, le dispositif de transfert comprend une densité de micropipettes d'environ 20000 micropipettes par cm2 de plaque. Par exemple, avec un pas interpipettes de 20 micromètres, on obtient une densité de micropipettes de 20000 par cm2.

Avantageusement, le dispositif de transfert selon l'invention est consommable. En d'autres mots, le dispositif de transfert peut être à usage unique. Il peut ainsi être jeté après avoir servi à réaliser le transfert des liquides qu'il contient. Cela évite par exemple d'avoir à nettoyer le dispositif de transfert après son utilisation et éviter les risques de contamination avec d'autres liquides d'échantillons. Le dispositif peut aussi être mis de côté et stocké de façon à conserver pendant une durée déterminée les échantillons intéressant de liquides qu'il contient.

Dans ce dernier cas, les micropipettes contenant les

échantillons à conserver peuvent être séparées (clivées) du dispositif et stockées.

L'invention concerne également un ensemble permettant le transfert collectif et simultané de micro-quantités de liquide, ledit ensemble comprenant : - un dispositif de transfert monobloc selon l'invention, - un microsystème constitué d'un substrat dont une face présente une pluralité de micro-réservoirs, chaque micro-réservoir n'étant apte à recevoir qu'une seule micropipette, la pluralité de micro-réservoirs étant répartie sur la face du substrat de façon à ce que les micropipettes puissent être reçues simultanément par un même nombre de micro-réservoirs.

Chaque micropipette est en regard du micro- réservoir dans lequel elle doit être introduite pour transférer une micro-quantité de liquide, c'est à dire selon le cas injecter ou prélever ladite micro-quantité de liquide. Les micropipettes sont ainsi disposées de sorte qu'elles s'emboîtent sans problème dans lesdits micro-réservoirs du microsystème. Par ailleurs, comme les micropipettes sont reçues simultanément par les micro-réservoirs, cela suppose qu'il y ait au moins autant de micro-réservoirs que de micropipettes. En d'autres termes, le nombre de micropipettes composant le dispositif sera au plus équivalent au nombre de micro-réservoirs du microsystème.

Un autre objet de l'invention concerne le procédé de fabrication du dispositif de transfert

monobloc selon l'invention. Ce procédé comprend plusieurs étapes. Tout d'abord, on doit fournir un substrat d'un premier matériau afin d'y réaliser le dispositif. Puis, on perce des trous dans l'épaisseur du substrat. Ensuite, on réalise une modification chimique du premier matériau afin que les faces du substrat ainsi que les parois des trous réalisés à l'étape précédente se transforment en un deuxième matériau. On choisit ensuite l'une des faces du substrat pour y réaliser la gravure du deuxième matériau ; on continue la gravure jusqu'à révéler le premier matériau du substrat. Enfin, on procède à la gravure du premier matériau révélé à l'étape précédente jusqu'à atteindre un niveau de gravure correspondant à la face arrière de la plaque du dispositif. Cette gravure ainsi réalisée va laisser subsister des tubes de deuxième matériau constituant les micropipettes.

Selon un mode de réalisation particulier, la modification chimique du premier matériau sera une oxydation.

Selon un cas particulier, le premier matériau est le silicium. Dans ce cas, l'épaisseur du substrat de silicium sera avantageusement comprise entre quelques dizaines de micromètres et 500 Am.

Avantageusement, si le premier matériau est le silicium et si on réalise une oxydation, le deuxième matériau sera l'oxyde de silicium. Au final, on obtient ainsi un dispositif comprenant un réseau de micropipettes en oxyde de silicium, ce qui a l'avantage d'être le plus proche possible de la structure des capillaires en verre.

Le procédé de fabrication selon l'invention permet d'obtenir des micropipettes transparentes (les micropipettes étant en oxyde de silicium), ce qui a pour intérêt que l'on peut visualiser le remplissage d'un liquide à l'intérieur desdites micropipettes et de s'assurer ainsi, par un simple contrôle visuel, qu'aucune pipette n'est bouchée.

Ce procédé de fabrication a également l'avantage de limiter le nombre d'étape de photolithographie et de gravure profonde du premier matériau à réaliser par rapport à un procédé permettant de réaliser des micropipettes en ledit premier matériau. Par exemple, un mode de réalisation de micropipettes en silicium selon l'art antérieur est décrit dans le document [3] référencé à la fin de cette description.

Avantageusement, les étapes de gravure sont effectuées à l'aide d'un laser ou d'une gravure plasma profonde.

Les micropipettes obtenues ont une hauteur qui est fonction de l'épaisseur du substrat de premier matériau dans lequel le dispositif est réalisé.

Le diamètre extérieur de chaque micropipette est inférieur au diamètre du micro- réservoir dans lequel elle doit être introduite pour réaliser le transfert d'un liquide. Notons que par transfert de liquide, on entend l'injection ou le prélèvement de liquide. Le diamètre extérieur de chaque micropipette sera avantageusement compris entre 50 fm et plusieurs centaines de pm.

Le diamètre intérieur de chaque micropipette dépend quant à lui de la quantité de liquide à transférer et de la hauteur du dispositif. En effet, le liquide à transférer par chaque micropipette est conservé uniquement dans l'espace constituant l'intérieur des micropipettes. Avantageusement, le diamètre intérieur de chaque micropipette sera de quelques dizaines de Fm à plusieurs centaines de Fm.

A partir de l'ensemble de transfert selon l'invention, on peut réaliser de nombreuses applications.

Une première application dudit ensemble concerne un procédé de remplissage collectif et simultané des micro-réservoirs du microsystème de l'ensemble. Ce procédé comprend plusieurs étapes. Tout d'abord, on remplit les micropipettes du dispositif de transfert en déposant une quantité déterminée de liquide sur la face avant du dispositif de transfert.

Le liquide va ainsi pénétrer dans les micropipettes.

Avantageusement, le remplissage des micropipettes peut être réalisé par capillarité. Puis, on élimine l'excès de liquide se trouvant sur la face avant du dispositif de transfert. On place les micropipettes dans les micro-réservoirs du microsystème qu'elles doivent remplir et on transfère le liquide compris dans les micropipettes dans les micro-réservoirs. On notera que le liquide destiné à remplir les micropipettes peut être introduit dans les micropipettes par la face avant du dispositif comme on vient de le voir, mais également par la face arrière du dispositif.

Avantageusement, le transfert du liquide compris dans les micropipettes se fera à l'aide d'une technique choisie parmi le soufflage, le trempage, la diffusion du liquide, le choquage ou l'application d'un champ électrique. Pour l'application d'un champ électrique, on pourra disposer une électrode à chaque extrémité des micropipettes.

L'utilisation de ce procédé permet de distribuer collectivement dans chaque micro-réservoir un volume de liquide très précis et identique sans risque de contamination inter micro-réservoirs.

Une deuxième application de l'ensemble selon l'invention consiste en un procédé de prélèvement simultané et collectif de micro-quantité de liquides, différents ou non, présents dans les micro-réservoirs du microsystème de l'ensemble, ledit prélèvement étant effectué à l'aide du dispositif de transfert de l'ensemble selon l'invention. Ce procédé comprend différentes étapes. La première étape consiste à placer les micropipettes du dispositif de transfert dans les micro-réservoirs du microsystème contenant les liquides à prélever. Puis, on effectue le remplissage des micropipettes. Au final, chaque micropipette récupère au moins une partie du liquide contenu dans le micro- réservoir dans lequel elle a été plongée.

Avantageusement, le remplissage des micropipettes se fera par capillarité.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de prélèvement comprend en outre les étapes consistant à déplacer le dispositif de transfert

monobloc de l'ensemble selon l'invention au-dessus d'un support de réception et d'injecter du liquide sur le nouveau support par soufflage, par trempage, par diffusion, par choquage ou par application d'un champ électrique. De même que précédemment, l'application d'un champ électrique pourra être réalisé en disposant une électrode à chaque extrémité des micropipettes.

Selon un premier cas, le support de réception sur lequel sont déposés les liquides prélevés sera un microsystème constitué d'un substrat dont une face présente une pluralité de micro-réservoirs, chaque micro-réservoir n'étant apte à recevoir qu'une seule micropipette, la pluralité de micro-réservoirs étant répartie sur la face du substrat de façon à ce que les micropipettes puissent être reçues simultanément par un même nombre de micro-réservoirs. Ce support pourra être un microsystème identique à celui compris dans l'ensemble selon l'invention. Il pourra également comprendre plus ou moins de micro-réservoirs que le microsystème de l'ensemble, l'important étant qu'il y ait suffisamment de micro-réservoirs pour recevoir simultanément toutes les micropipettes du dispositif de l'ensemble selon l'invention.

Selon un autre cas, le support de réception sera choisi parmi un gel, un buvard ou une membrane permettant d'absorber les liquides retenus dans les micropipettes.

Avantageusement, l'injection des liquides sur le support de réception sera effectuée par capillarité.

Une autre application de 1"ensemble selon l'invention est un procédé de conservation de micro- quantités de liquides. Ce procédé comprend une étape de prélèvement des micro-quantités de liquides à conserver selon le procédé de prélèvement vu précédemment, une étape de stockage, dans un milieu de conservation, du dispositif de transfert dont les micropipettes contiennent les liquides prélevés, et une étape de récupération, si besoin, du liquide contenu dans une ou plusieurs micropipettes.

Ce procédé de conservation est particulièrement intéressant car il permet de prélever puis de stocker une quantité de produit de réaction issue des micro-réservoirs d'un microsystème à différents stades de déroulement de ladite réaction.

On peut ainsi sélectionner et stocker l'ensemble des échantillons prélevés en conservant le dispositif de transfert dans son entier. Mais on peut également sélectionner et stocker un ou des échantillons spécifiques parmi les échantillons prélevés en sélectionnant la ou les micropipettes particulières contenant l'échantillon intéressant que l'on souhaite conserver, par exemple en clivant la ou les micropipettes en question.

En résumé, le dispositif de transfert, et en particulier l'ensemble comprenant le dispositif de transfert et le microsystème selon l'invention possède de nombreuses applications. Par exemple, il peut être utilisé à chaque fois qu'on doit faire des analyses ou des réactions qui nécessitent une alimentation multiple

et parallélisée d'un faible volume de liquide. De même, à chaque fois que l'on veut stocker, dupliquer ou transférer une partie des liquides contenus dans un système présentant des microcavités dans un autre système présentant des microcavités ou sur tous autres supports permettant la poursuite d'une réaction ou l'analyse de cette réaction. On entend par autre support une lame de verre, de silicium, de plastique etc..., ou un gel, une membrane ou un buvard, imbibé ou non d'un composé permettant la poursuite de la réaction ou de l'analyse de la réaction.

Les domaines d'utilisation de cet ensemble sont la chimie fine, la parfumerie, la pharmacologie, la biologie et la microfluidique. Cet ensemble pourra par exemple être utilisé pour la duplication d'une puce à ADN ou le dépôt d'échantillons ADN sur un support quelconque telle qu'une plaque de verre. Ledit ensemble pourra également être utilisé pour réaliser des puces à ADN ou des puces à substrats, et notamment pour réaliser une empreinte idiosyncrasique d'un échantillon enzymatique. Cet ensemble pourra également être utilisé dans le domaine des puces à protéines pour la distribution collective d'un partenaire protéique sur une puce à protéines dans le but de détecter une interaction protéine/protéine.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre

d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels : - la figure la est un schéma du dispositif de transfert de l'ensemble vu de côté selon l'axe de coupe XX de la figure lb, - la figure lb est un schéma du dispositif de transfert de l'ensemble vu de dessous, -les figures 2a à 2d illustrent les étapes du procédé de fabrication du dispositif de transfert, - la figure 3 illustre les étapes successives du procédé de remplissage collectif et simultané des micro-réservoirs du microsystème de l'ensemble, - la figure 4 illustre les étapes successives du procédé de prélèvement collectif et simultané de micro- quantité de liquides à l'aide de l'ensemble selon l'invention, - les figures 5a et 5b illustrent quant à elles les étapes du procédé de conservation de micro-quantités de liquides selon l'invention.

EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS D'après les figures la et lb, le dispositif de transfert 1 de l'ensemble selon l'invention possède une plaque qui a une face avant 2 et une face arrière 3, des micropipettes 4 qui sont hérissées sur la face arrière 3 de la plaque et chaque micropipette est percée d'un trou axial 5 qui se prolonge au travers de la plaque. Les micropipettes ont une hauteur 6, un diamètre extérieur 7 et un diamètre intérieur 8, ledit diamètre intérieur dépendant de la quantité de liquide à transférer par la micropipette et de la hauteur 9 du

dispositif. Les micropipettes sont disposées sur la face arrière de la plaque avec un pas interpipette 10 dans la direction de l'axe XX et avec un pas 11 différent selon la direction orthogonale à l'axe XX.

Comme exemple de réalisation, nous allons fabriquer un dispositif de transfert ayant des micropipettes en oxyde de silicium. Les différentes étapes de fabrication de ce dispositif de transfert sont illustrées dans les figures 2a à 2d. On commence par réaliser des trous 25 dans l'épaisseur d'un substrat de silicium 20 (figure 2a). Ces trous traversants 25 peuvent être réalisé à l'aide d'un laser, d'une gravure plasma profonde ou de toute autre technique similaire. Puis, on réalise l'oxydation du substrat de silicium 20 afin d'obtenir une couche d'oxyde de silicium 21 sur les parois des trous et sur les faces du substrat de silicium (figure 2b). Cette étape d'oxydation du substrat peut être réalisée dans un four d'oxydation. Puis on effectue la gravure chimique ou plasma d'une des faces du substrat afin d'opter la couche d'oxyde de silicium 21 formée à l'étape précédente sur ladite face (figure 2c). Enfin, on réalise la gravure chimique du silicium 20 révélé à l'étape précédente de façon à dégager des tubes qui vont constituer les micropipettes 24 (figure 2d). La gravure du silicium se prolonge jusqu'à ce qu'on atteigne une hauteur 26 de micropipette satisfaisante.

Au final, on obtient un dispositif ayant des micropipettes en oxyde de silicium.

Supposons que l'on veuille injecter simultanément et collectivement une quantité précise et constante de liquide dans les micro-réservoirs d'un microsystème afin d'étudier une réaction de dosage d'un produit chimique ou biologique. Avant de suivre les étapes de la figure 3, on commence par disposer dans les micro-réservoirs 31 d'un microsystème 30 des liquides de différentes concentrations ou des liquides différents, par exemple en utilisant le procédé de transfert qui sera décrit dans le prochain paragraphe.

Le microsystème 30 étant prêt, on suit les étapes de la figure 3. On commence par remplir les micropipettes 4 du dispositif de transfert 1 en déposant une goutte de liquide sur la face avant 2 de la plaque du dispositif de transfert. Au bout d'une durée déterminée, les micropipettes 4 se sont remplies de liquide (par exemple par capillarité), et on peut éliminer si besoin l'excès de liquide se trouvant sur la face avant 2 de la plaque du dispositif de transfert. On place ensuite les micropipettes dans les micro-réservoirs 31 du microsystème 30 qu'elles doivent remplir et on effectue le transfert du liquide compris dans les micropipettes dans les micro-réservoirs par soufflage.

La figure 4 présente le cas où l'on désire prélever des liquides différents présents dans les micro-réservoirs 31 du microsystème 30 de l'ensemble selon l'invention. On commence par placer les micropipettes 4 du dispositif 1 dans les micro- réservoirs 31 du microsystème 30 contenant les liquides à prélever. Le remplissage des micropipettes s'effectue

par capillarité. Chaque micropipette va récupérer au moins une partie du liquide contenu dans le micro- réservoir dans lequel elle va être plongée. Lorsque le dispositif 1 est retiré du microsystème'sur lequel il a été posé, on retrouve ainsi dans chaque micropipette un échantillon du liquide contenu dans le micro-réservoir dans lequel elle aura été trempée. Ainsi, une fois que les micropipettes sont remplies, le dispositif 1 peut être déplacé sur un autre support et le liquide contenu dans les micropipettes peut alors être injecté dans le nouveau support. On peut procéder ainsi pour remplir les micro-réservoirs du microsystème dans l'étape préliminaire de la figure 3.

Le transfert de liquides à l'aide du dispositif de transfert selon l'invention est un transfert discret dans le sens où le volume prélevé est limité par le volume d'échantillon que peut contenir chaque micropipette. Si l'on désire prélever une quantité plus importante de liquide, on devra repositionner les micropipettes du dispositif dans les micro-réservoirs du microsystème contenant les liquides à prélever puis effectuer le relarguage des liquides prélevés dans le nouveau support, et cela autant de fois que nécessaire.

Enfin, on peut effectuer, à l'aide du dispositif de transfert, des prélèvements de liquides présents dans les micro-réservoirs du microsystème de l'ensemble, lesdits liquides subissant une réaction déterminée, pour ensuite stocker ces dispositifs. Les prélèvements des liquides de réaction peuvent être effectués à différents moments de la réaction. On peut

ainsi stocker un ou plusieurs dispositifs dont les micropipettes sont remplies de liquides, pour ensuite pouvoir les récupérer et les étudier. Pour cela, on dispose différents liquides dans les micro-réservoirs du micro-système. Ces liquides peuvent être des liquides de différentes concentrations (ex : gamme de concentration d'un composé chimique rentrant dans la réaction étudiée, ou gamme de concentrations de « Primers » (amorces d'ADN par exemple) ou d'enzymes pour la réalisation d'un réaction PCR ( « Polymerase Chain Reaction » en anglais) ) ou des liquides différents (ex : comparaison de différents enzymes d'un procédé biologique, ou comparaison de différents oxydants chimiques pour une réaction chimique étudiée).

En début de réaction, on procède à un prélèvement des liquides présents dans les micro-réservoirs 31 du microsystème 30 à l'aide du dispositif de transfert 1 (figure 5a) et on stocke ledit dispositif 1. Ce dispositif pourra par exemple être stocké au congélateur. Notons que cette opération de prélèvement et de stockage pourra être renouvelée à différents stades de la réaction se déroulant dans les micro- réservoirs. A la fin de la réaction, on observe les liquides présents dans les micro-réservoirs 31 du microsystème et on détermine si une réaction intéressante a eu lieu et si oui, dans quel micro- réservoir. Il sera alors possible de retrouver le liquide ayant donné lieu à la réaction intéressante dans le micro-réservoir déterminé en ressortant le ou les dispositifs de transfert stockés et en récupérant la micropipette 4 contenant l'information intéressante

(figure 5b). Pour récupérer le liquide contenu dans ladite micropipette, on pourra par exemple séparer la micropipette contenant le liquide intéressant du dispositif ou bien utiliser un système soufflant (par exemple un capillaire) pour éjecter le liquide.

BIBLIOGRAPHIE [1] Microneedle array for transdermal bio-fluid sampling and drug delivery, E. MUKERJEE and al., Micro Total Analysis Systems, 379-380, (2001).

[2] Fluid injection through out of plane microneedles, B. STOBER, Prof. D. LIEPMANN.

[3] Three dimentional hollow microneedle and microtube arrays, D. V. McALLISTER and al., Transducters 99,1098/1101.