GÓMEZ ALVAREZ-ARENAS, Tomas (Instituto De Acustica, Serrano 144, Madrid, E-28006, ES)
FERNANDEZ LEDESMA, Luis José (Ikerlan, Pº J.Mª Arizmendiarrieta 2, Arrasate-Mondragon, E-20500, ES)
CARRATO MENA, Alfredo (Universidad Miguel Hernandez, Avda. de la Universidad s/n, Elche, E-03202, ES)
SOTO MARTINEZ, José Luis (Hospital General Universitario De Elche, Camino de la Almazara 11, Elche, E-03203, ES)
BERGANZO RUIZ, Javier (Ikerlan, Pº J.Mª Arizmendiarrieta 2, Arrasate - Mondragon, E-20500, ES)
IKERLAN (Pº J.Mª Arizmendiarrieta 2, Arrasate-Mondragon, E-20500, ES)
UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ (Avda. de la Universidad s/n, Elche, E-03202, ES)
HOSPITAL GENERAL UNIVERSITARIO DE ELCHE (Camino de la Almazara 11, Elche, E-03203, ES)
GONZÁLEZ GOMEZ, Maria Iciar (Instituto De Acustica, Serrano 144, Madrid, E-28006, ES)
GÓMEZ ALVAREZ-ARENAS, Tomas (Instituto De Acustica, Serrano 144, Madrid, E-28006, ES)
FERNANDEZ LEDESMA, Luis José (Ikerlan, Pº J.Mª Arizmendiarrieta 2, Arrasate-Mondragon, E-20500, ES)
CARRATO MENA, Alfredo (Universidad Miguel Hernandez, Avda. de la Universidad s/n, Elche, E-03202, ES)
SOTO MARTINEZ, José Luis (Hospital General Universitario De Elche, Camino de la Almazara 11, Elche, E-03203, ES)
BERGANZO RUIZ, Javier (Ikerlan, Pº J.Mª Arizmendiarrieta 2, Arrasate - Mondragon, E-20500, ES)
| REIVINDICACIONES
1.- Microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva de partículas en suspensiones polidispersas caracterizado porque comprende, integrados en un chip-sustrato de material acústicamente blando, los siguientes componentes: a) un sistema de microcanales de flujo de distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de salida desde el canal central de tratamiento (110) que comprende (ver Figura 1 ): i. un camino o lecho por el que fluye Ia suspensión de partida (150), que incluye un canal de entrada (160) para el suministro y otro de salida (170) por donde abandona el dispositivo, en paralelo con ii. un camino o lecho por el que fluye el fluido puro (124) al que se extraerán las partículas seleccionadas (al que se denomina lecho del fluido colector), incluyendo un canal de entrada o suministro (162) y otro de salida (180), que forman iii. un canal central de tratamiento (110) donde Ia suspensión de partida y el fluido puro están separados por una interfase frontera de líneas de corriente en régimen laminar definida por las dimensiones transversales del canal y que se bifurca al final de su recorrido (175) en dos canales de salida (170, 180), donde el ancho del canal (110) presenta una relación con Ia longitud de onda que conforma junto al ancho su sección transversal- es sensiblemente inferior a un cuarto de Ia longitud de onda acústica, y, b) un actuador o transductor ultrasónico en una de sus paredes laterales (190)
- externo y paralelo al canal central de tratamiento (110), que transmite Ia energía acústica al conjunto chip-canal conformando un sistema multicapa cuya resonancia permite establecer el nodo de presión en el interior del canal en el lugar adecuado, a una distancia de Ia pared reflectora en torno a 1/3 y 2/3 del ancho del canal (110), y cuya actuación incluye el canal (110) de tratamiento, así como también Ia zona de bifurcación hacia los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo Ia eficiencia de Ia separación selectiva y extracción.
2.- Microdispositivo según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque el ancho del canal (110) presenta una dimensión ligeramente mayor a un cuarto de Ia longitud de Ia onda acústica.
3.- Microdispositivo según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia profundidad del canal (110) presenta una dimensión sensiblemente inferior a un cuarto de Ia longitud de Ia onda acústica.
4.- Microdispositivo según Ia reivindicación 1 caracterizado porque el material acústicamente blando del chip-sustrato es un material cuya impedancia no supera en tres veces Ia impedancia de los medios líquidos, en un rango de variabilidad oscilante entre 0.8 MRayls y 2.6 MRayls.
5.- Microdispositivo según Ia reivindicación 4 caracterizado porque el material acústicamente blando del chip-sustrato es un material acrílico.
6.- Microdispositivo según Ia reivindicación 1 caracterizado porque el material acrílico es un epoxy de resina SU-8.
7.- Microdispositivo según Ia reivindicación 1 donde el transductor piezoeléctrico es una cerámica piezoeléctrica o un composite piezoeléctrico.
8.- Microdispositivo según Ia reivindicación 7, caracterizado porque el composite piezoeléctrico es de clase 1 -3.
9.- Procedimiento de fabricación del microdispositivo descrito en las reivindicaciones 1 a 8 mediante técnica de fotolitografía caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 1 ), b) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU- 8 sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente, c) Sellado de Ia oblea 1 y Ia oblea 2 enfrentado dichas obleas por Ia cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y d) Retirada de Ia oblea recubierta con material antiadherente.
10.- Procedimiento de fabricación del microdispositivo descrito en las reivindicaciones 1 a 8 mediante Ia técnica de estampación en caliente combinadas con un proceso de pegado posterior, que comprende las siguientes etapas: a) Preparación de un molde en el que se incluyen los diseños de canales deseados, b) Moldeado del sustrato a utilizar usando el molde obtenido en a), mediante Ia acción de presión y/o temperatura, y c) Sellado del sustrato mediante el pegado con otro material plástico bajo Ia acción de presión y/o temperatura y/o activación superficial por plasma de oxigeno.
11.- Uso del microdispositivo reinvindicado en las reivindicaciones 1 a 10 en un procedimiento de separación no invasiva selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en suspensiones polidispersas.
12.- Uso según Ia reivindicación 11 caracterizado porque las partículas se seleccionan entre:
- virus,
- priones, y - células
13.- Uso según Ia reivindicación 12, caracterizado porque las células son células procariotas.
14.- Uso según Ia reivindicación 13, caracterizado porque las células procariotas son bacterias.
15.- Uso según Ia reivindicación 13, caracterizado porque las células son células eucariotas.
16.- Uso según Ia reivindicación 15 caracterizado porque las células eucariotas se seleccionan entre:
- hongos,
- algas, y - células humanas
17.- Uso según Ia reivindicación 16, caracterizado porque las células humanas se seleccionan entre:
- células tumorales, - células sanguíneas, - células troncales, y
- células madre.
18.- Uso según Ia reivindicación 17, caracterizado porque las células madre son somáticas.
19.- Uso según Ia reivindicación 17, caracterizado porque las células madre son embrionarias.
20.- Uso según Ia reivindicación 16, caracterizado porque los hongos son levaduras.
21 .- Uso del microdispositivo reivindicado en las reivindicaciones 1 a
10 caracterizado porque el procedimiento de separación de células eucariotas se realiza en sangre, procesos de plasmaféresis, procesos de diálisis y análisis de laboratorio, así como en procedimientos de reciclado y/o lavado de sangre tras operaciones quirúrgicas.
22.- Uso del microdispositivo reivindicado en las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el procedimiento de separación de células eucariotas tiene por objeto Ia separación selectiva y extracción de células tumorales circulantes en sangre periférica (CTC) de pacientes oncológicos para el diagnóstico y pronóstico de cáncer en seres humanos para.
23.- Uso según Ia reivindicación anterior, caracterizado porque Ia separación selectiva y extracción se realiza sobre células de pacientes, las cuales pueden ser reparadas ex vivo y administradas de nuevo al paciente..
24.- Uso según Ia reivindicación 22, en el aislamiento de células madre humanas o animales provenientes de distintos tejidos o fluidos. |
MICRODISPOSITIVO Y MéTODO DE SEPARACIóN Y EXTRACCIóN
SELECTIVA Y NO INVASIVA DE PARTíCULAS EN SUSPENSIONES
POLIDISPERSAS, PROCEDIMIENTO DE FABRICACIóN Y SUS
APLICACIONES
SECTOR DE LA TéCNICA
La presente invención se refiere a un dispositivo en el que se combinan microtecnología y ondas ultrasónicas como método no invasivo para realizar separación selectiva y extracción de partículas en suspensiones polidispersas, conteniendo microelementos con diferentes características físicas (tamaño, densidad o compresiblidad) y para cualquier nivel de concentración, siendo sus aplicaciones principales en el campo biomédico y biotecnológico.
ESTADO DE LA TéCNICA
Durante Ia última década se han propuesto diversas técnicas para Ia manipulación o separación de partículas en suspensión en diversos campos de aplicación tecnológica, entre los cuales se destaca Ia biotecnología y Ia medicina. La separación de partículas es de especial interés en Ia actualidad médica para aplicaciones relacionadas con donaciones de sangre, procesos de diálisis y análisis de laboratorio, así como reciclado y/o lavado de sangre tras operaciones quirúrgicas. La aplicación de ondas acústicas estacionarias sobre suspensiones produce efectos de conducción de las partículas hacia determinadas zonas de equilibrio relacionadas con Ia distribución de nodos y máximos de presión acústica que establece Ia onda estacionaria generada en el medio. Sobre cada partícula se ejerce una fuerza de radiación primaria inducida acústicamente, cuya magnitud varía proporcionalmente a Ia frecuencia de
operación. El camino que debe recorrer una partícula sometida a esta fuerza para alcanzar Ia posición de equilibrio acústico más próxima es menor cuanto menor sea Ia distancia entre nodos y máximos de presión acústica. Estos están definidos por Ia longitud de onda, que es inversamente proporcional a Ia frecuencia acústica. Por ello, es más sencillo desde el punto de vista teórico concentrar partículas a frecuencias más elevadas.
Este mecanismo de conducción no invasiva es ampliamente conocido en Ia disciplina de los ultrasonidos y ha dado lugar durante Ia última década al desarrollo de un número de intentos para manipulación y/o separación de partículas. Se han propuesto diversas técnicas usando este fenómeno para separar partículas de un líquido u otro fluido. Típicamente el fluido circula a través de un conducto o canal en el que se establece una onda acústica estacionaria transversal a Ia longitud del canal. De acuerdo a ello, las partículas se desplazan para formar bandas de concentración a Io largo de las posiciones de equilibrio de Ia onda dentro de estos conductos.
En Ia reciente patente WO 2007/044642 A2, "DEVICE AND METHOD FOR COMBINED MICROFLUIDIC-MICROMAGNETIC SEPARATION OF MATERIAL IN CONTINUOUS FLOW" (Ingber Donald, Xia Shannon, Tom Hunt, Peter Westervelt), se presenta un dispositivo de separación celular en flujo continuo basado en Ia aplicación de campos magnéticos. El principio de operación es completamente diferente al de Ia presente invención, ya que no se basa en Ia aplicación de energía mecánica sino electromagnética y, a diferencia de Ia presente invención, es una tecnología invasiva que requiere Ia inserción de micropartículas inorgánicas ajenas a Ia suspensión a tratar. Estas, susceptibles al campo magnético, se adhieren y arrastran a determinadas células de Ia suspensión, conduciéndolas magnéticamente hacia los lugares de equilibrio pre-seleccionados. Por tratarse de un método invasivo, Ia
viabilidad de las células separadas se ve parcialmente alterada para Ia realización de estudios posteriores, una vez extraídas del medio. Estas dos características del dispositivo hacen Ia patente fuertemente diferente al de Ia presente invención, aunque ambas coincidan en Ia utilización de doble lecho de flujo en régimen laminar con una interfase.
En Ia publicación J. Statis. Mech.: "THEORY AND EXPERIMENTS, 2006, "CONTINUOUS PARTICLE SIZE SEPARATION AND SE SIZE SORTING USING ULTRASOUND IN A MICROCHANNEL" (Sergey Kapishnikov, Vasily Kantsler, Víctor Steingberg) se presentan dos dispositivos para Ia separación y clasificación de partículas y células en suspensión mediante ultrasonidos. El primero de ellos es un resonador conocido como "lamda medios" (siendo lamda Ia longitud de onda acústica), en el que se establece una onda estacionaria con un nodo de presión en el centro del canal, hacia donde las partículas son conducidas y concentradas durante Ia aplicación del campo acústico, y a Io largo del cual continúan su circulación hasta alcanzar Ia salida. De este modo, Ia suspensión enriquecida de partículas concentradas ultrasónicamente abandona el dispositivo a través de un canal central de salida, mientras el resto de Ia suspensión Io hace mayoritariamente por otros dos canales laterales de salida dispuestos simétricamente respecto al central. En el dispositivo no es posible realizar una separación absoluta de las partículas colectadas acústicamente respecto al resto de elementos presentes en Ia suspensión, los cuales circulan distribuidos uniformemente en todo el espacio que permite el canal. Al no estar afectados por el campo ultrasónico su disposición espacial no se ve alterada durante Ia aplicación acústica, de manera que abandonan el dispositivo por los tres canales de salida, aunque mayoritariamente Io hagan a través de los canales laterales. Esto se debe a que por el canal central se produce una salida masiva de las células concentradas ultrasónicamente. Para lograr una separación selectiva, denominada por los autores como "clasificación
celular", el artículo presenta también el desarrollo de un resonador "lamda cuartos" en el que el ancho del canal es aproximadamente un cuarto de Ia longitud de onda y el nodo de presión se establece junto a una de las paredes laterales del canal, hacia donde son conducidas y colectadas las células seleccionadas. A diferencia de Ia presente invención, este dispositivo requiere Ia utilización de dos transductores ultrasónicos colocados a ambos lados de Ia sección del canal de tratamiento, externos al mismo, paralelos y enfrentados, emitiendo trenes de onda temporales con un desfase variable. Este dispositivo, siendo el más parecido al de Ia presente invención, muestra importantes diferencias que, en su caso, provocan ciertas restricciones de actuación, tales como Ia imposibilidad de aplicación de onda continua, así como limitaciones físicas sobre Ia zona de actuación, determinadas por el espacio contenido entre las dos fuentes de emisión ultrasónica y por Ia disposición geométricamente simétrica de los canales de entrada y salida respecto al canal central de tratamiento, limitando fuertemente Ia zona de actuación ultrasónica. A diferencia de Ia presente invención, este dispositivo lamda cuartos trabaja en torno a f=4 MHz y presenta importantes restricciones tanto en el volumen de tratamiento, cuya sección es inversamente proporcional a Ia frecuencia (aproximadamente 4 veces inferiores a las de nuestra invención), como en Ia precisión exigida en las medidas del canal, como consecuencia de Io anterior.
En Ia patente WO/2002/072236) PARTICLE SEPARATION (ERYSAVE AB, JóNSSON Henrik, LAURELL Thomas, ALLERS Mats, PERSSON Hans), se describe un dispositivo para separar materia particulada (especialmente para tratamientos de soluciones de sangre) en un dispositivo resonante con un número elevado de nodos de presión acústica para Ia formación de múltiples bandas de concentración de partículas. Se trata de un dispositivo muy diferente al de Ia presente invención en cuanto al diseño y actuación. El campo acústico se ejerce
sobre una cámara de tratamiento bien diferente a los canales resonadores lamda medios o lamda cuartos, con dimensiones muy superiores a las de éstos para permitir el establecimiento de una onda estacionaria con distribución espacial de múltiples nodos y máximos de presión acústica. • En Ia patente europea EP1365849, también publicada como patente Americana U.S. Pat. US6929750, US2004069717 y WO02072235, "DEVICE AND METHOD FOR SEPARATION", (LAURELL Thomas, ALLERS Mats, JóNSSON Henrik, PERSSON Hans), se describe un dispositivo de microfluídica para separación ultrasónica en resonadores de media longitud de onda dispuestos en paralelo formando una estructura de distribución espacial conocida como "array". Cada uno de estos elementos contiene un canal resonador "lamda medios" en el que se procede a una conducción y colección acústica de ciertas células hacia el centro del mismo. Como en los demás resonadores de este tipo, al final del proceso se logra una suspensión enriquecida de las células afectadas acústicamente, pero no constituye un proceso de extracción de las mismas con respecto al resto de Ia suspensión, sino una recolección en alta concentración a través del canal central de salida. El dispositivo está realizado sobre un sustrato de Silicio, de elevado coste, habitual en este tipo de micro-dispositivos. La patente contempla un aumento del volumen de tratamiento acústico mediante Ia ubicación en paralelo de múltiples canales de actuación ultrasónica. Cada uno de estos elementos constituyentes del panel de dispositivos conformando Io que se conoce técnicamente como un "array" contiene una entrada única por Ia que se introduce Ia suspensión y tres canales de salida, uno central por el que desaloja Ia suspensión enriquecida de las partículas previamente colectadas (eritrocitos) y dos canales laterales dispuestos simétricamente, por los que circula el resto de Ia suspensión. Aquellos elementos no afectados por Ia fuerza de radiación permanecen distribuidos homogéneamente en Ia muestra y abandonan el dispositivo por cualquiera
de los tres canales de salida, incluyendo (aunque de forma minoritaria) el canal central por el que desalojan los eritrocitos de forma masiva.
En Ia patente WO 00/04978 CONCENTRARON OF PARTIóLES IN A FLUID WITHIN AN ACOUSTIC STANDING WAVE FIELD, (CEFAI Joseph BARROW; David Anthony; COAKLEY William Terence; HAWKES Jeremy John, se describe un dispositivo para manipulación de partículas suspendidas en un fluido. Contiene un conducto a Io largo del cual circula Ia suspensión, así como un transductor ultrasónico y un reflector para el establecimiento de una onda estacionaria perpendicular a Ia dirección de flujo en el canal. El dispositivo es un resonador "lamda medios", con Ia formación de una banda sencilla de partículas en el centro del conductor. La distancia entre el transductor y el reflector es inferior a 300 mieras, correspondiendo a una frecuencia de resonancia de Ia cámara de tratamiento y no a Ia del transductor ultrasónico. El dispositivo contempla una variación para esta distancia, y con ella, de Ia frecuencia de tratamiento, de acuerdo a las tolerancias de construcción del dispositivo y de Ia naturaleza de Ia suspensión a tratar. Las partículas de Ia suspensión son colectadas y conducidas a través del nodo de presión acústica hacia una salida del dispositivo ubicada en un canal lateral, por donde Ia suspensión enriquecida de éstas abandona el dispositivo. Mientras tanto, el resto Io hace a través de otro canal de salida dispuesto con otra orientación.
En WO 98/50133 (WO 1998/050133) PARTICLE MANIPULARON, (COAKLEY William Terence; HAWKES Jeremy John, BARROW David Anthony CEFAI Joseph) se describe un dispositivo para llevar a cabo Ia manipulación de partículas en suspensión, consistente en un conducto con dimensiones equivalentes a un número determinado de semi-longitudes de onda, por el que circula Ia suspensión y en el que se establece una onda estacionaria perpendicular a Ia dirección del flujo. En esta cámara de tratamiento se establece una onda estacionaria con múltiples nodos y
máximos de presión acústica para Ia formación de bandas de células colectadas acústicamente, paralelas, separadas media longitud de onda y perpendiculares a Ia dirección de circulación.
• En IBM, technical disclosure bulletin vol. 25, No. 1 , June 1982, page 192/193, se describe un separador de flujo continuo por ultrasonidos para plasmaféresis. El dispositivo consta de dos transductores montados ortogonalmente, cada uno con un reflector y un volumen de tratamiento entre ambos donde someter una suspensión diluida a una onda acústica estacionaria. Se trata de una cámara de tratamiento bien diferente a Ia de Ia presente invención, tanto en Ia forma de Ia transducción como en Ia cámara de tratamiento.
• En JP 06241977 A se describe un dispositivo para medición de partículas finas en base a Ia actuación de una onda ultrasónica estacionaria, inducida acústicamente mediante un haz ultrasónico en combinación con una fuerza electrostática para proceder a Ia concentración y separación de partículas de diferentes tamaños. En el centro de Ia cámara de tratamiento se genera un nodo de presión, hacia donde las partículas son conducidas y concentradas.
En EP0773055A2 (1996) (YASUDA K, SAITAMA H G, UMEMURA S, HUDRIOHI S) se describe un dispositivo y método para manipulación acústica de partículas basado en Ia interacción de varios haces ultrasónicos generados por diversos transductores ubicados estratégicamente. En una cámara se somete Ia suspensión a un proceso de levitación acústica mediante un campo ultrasónico generado por Ia interacción de varios haces generados por múltiples fuentes ultrasónicas dispuestas en contacto directo y/o indirecto con el medio.
• En WO 93/19367A2 se describe un método y dispositivo de aglomeración acústica consistente en un tubo conteniendo una muestra líquida y un transductor ultrasónico acoplado para generar una onda estacionaria perpendicular al tubo, concentrando así las partículas en
múltiples bandas transversales a Io largo de las cuales sedimentan tras Ia aplicación ultrasónica. El documento se basa en Ia patente Americana U.S. Pat. Nos. 5,665,605 y 5,912,182.
• En JP 07 047259A se describe un aparato para transportar pequeñas partículas en suspensión. El dispositivo contiene múltiples elementos generadores de ondas ultrasónicas dispuestos en un panel bidimensional de transductores sobre dos superficies planas, entre las cuales se deposita Ia solución a ser tratada.
DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN
Un aspecto de Ia invención Io constituye un microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva de partículas en suspensiones polidispersas, en adelante microdispositivo de Ia invención, caracterizado porque comprende, integrados en un chip-sustrato de material acústicamente blando, los siguientes componentes: a) un sistema de microcanales de flujo de distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de salida desde el canal central de tratamiento que comprende: i. un camino o lecho por el que fluye Ia suspensión de partida, que incluye un canal de entrada para el suministro y otro de salida por donde abandona el dispositivo, en paralelo con ii. un camino o lecho por el que fluye el fluido puro al que se extraerán las partículas seleccionadas (al que se denomina lecho del fluido colector), incluyendo un canal de entrada o suministro y otro de salida, que forman iii. un canal central de tratamiento donde Ia suspensión de partida y el fluido puro están separados por una interfase frontera de líneas de corriente en régimen laminar
definida por las dimensiones transversales del canal y que se bifurca al final de su recorrido en dos canales de salida mencionados, donde el ancho del canal resonador presenta una relación con Ia longitud de onda -inversamente 5 proporcional a Ia frecuencia acústica- ligeramente mayor a lambda cuartos, y donde Ia profundidad del canal de tratamiento (250 μm)- que conforma junto al ancho su sección transversal- es sensiblemente inferior a un cuarto de Ia longitud de onda acústica, i o y, b) un actuador o transductor ultrasónico en una de sus paredes laterales
- externo y paralelo al canal central de tratamiento, que transmite Ia energía acústica al conjunto chip-canal conformando un sistema multicapa
15 cuya resonancia permite establecer el nodo de presión en el interior del canal en el lugar adecuado, a una distancia de Ia pared reflectora de aproximadamente 1/3 y 2/3 del ancho del canal, respectivamente, y de producir un gradiente de presiones generado acústicamente en el interior del canal central con un efecto de conducción de ciertas partículas dentro
20 del mismo hacia Ia región de equilibrio acústico definida en el nodo, donde Ia fuerza de radiación se anula, y
- cuya actuación incluye no sólo el canal central de tratamiento sino también Ia zona de bifurcación hacia los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo Ia eficiencia de separación selectiva y
25 extracción.
Una realización particular de Ia invención Io constituye el microdispositivo de Ia invención, en el que los materiales constituyentes del chip-sustrato, preferentemente un epoxy de resina SU-8 sobre el que se realiza el canal y el sustrato acrílico PMMA "Polimetacrilato de Metilo",
30 presentan una impedancia acústica de 3.3 MRayls, y donde el transductor
ultrasónico b) puede ser una pequeña cerámica piezoeléctrica o un composite piezoeléctrico rectangular, preferentemente un composite piezolectrico de clase 1-3.
Otro aspecto de Ia invención Io constituye el proceso de fabricación del microdispositivo de Ia invención, en adelante proceso de fabricación del microdispositivo de Ia invención, basado en Ia técnica de fotolitografía de acuerdo al diseño descrito en Ia Figura 1 y que comprende las siguientes etapas: a) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 1 ), b) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-8 sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente, c) Sellado de Ia oblea 1 y Ia oblea 2 enfrentado dichas obleas por Ia cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y d) Retirada de Ia oblea recubierta con material antiadherente.
Así, otro aspecto de Ia invención Io constituye el uso del microdispositivo de Ia invención, en adelante uso de Ia invención, en un procedimiento, de separación no invasiva selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en suspensiones polidispersas.
Otro aspecto más particular de Ia invención Io constituye el uso de Ia invención en el que las partículas consisten en células pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: virus, priones, células procariotas (bacterias, levaduras, hongos, algas, etc.) y eucariotas.
Una realización más particular de Ia invención Io constituye el uso del microdispositivo de Ia invención para Ia separación y aislamiento selectivo de células eucariotas, preferentemente células humanas, y más preferentemente células tumorales, células sanguíneas (hematíes, plaquetas, macrófagos y linfocitos), células troncales o células madre, ya
sean somáticas o embrionarias, u de otro tipo presentes en fluidos corporales, como por ejemplo: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o presentes en otros tipos de muestras biológicas provenientes de biopsias.
Se ha desarrollado un microdispositivo para separación y extracción ultrasónica de partículas y células en suspensión mediante un resonador ultrasónico de tipo multicapa con canal lamda cuartos modificado con características singulares. En concreto, presenta una configuración geométrica peculiar, tanto en cuanto a las dimensiones del canal central de tratamiento, como a Ia distribución espacial asimétrica de los canales de flujo de entrada y de salida de las muestras con respecto al canal central de tratamiento. Los inventores también han encontrado Ia importancia de esta última característica, que refuerza Ia efectividad de separación, como se describirá más adelante.
La presente invención se basa en que los inventores han observado que Ia aplicación de una onda de activación generada por un transductor en paralelo con respecto a un canal central de tratamiento produce en el mismo una onda estacionaria perpendicular a Ia dirección del flujo, con un nodo de presión ubicado en una posición intermedia entre el centro del canal y Ia pared reflectora, en Ia zona ocupada por el lecho del fluido puro y que ocupa Ia longitud del canal de tratamiento afectada acústicamente.
El dispositivo es activado mediante un actuador o transductor ultrasónico, por ejemplo, una pequeña cerámica piezoeléctrica de área rectangular o un composite piezoeléctrico de clase 1-3 cuya variación en Ia amplitud de vibración en su superficie es muy baja, inferior a un 10% en los extremos y prácticamente nula en Ia zona central. Dicho composite piezoeléctrico está formado por fibras piezoléctricas embebidas en una matriz polimérica para constituir un composite por ejemplo de clase 1-3. De esta forma, el acoplamiento entre los modos laterales asociados a sus dimensiones se minimiza, y con él, Ia transmisión de los mismos a través del chip hasta el canal y en el interior de éste.
Una de las características de Ia invención es que Ia fuente de ultrasonidos está dispuesta en contacto con el chip, en uno de los bordes exteriores, paralelo al canal de tratamiento, para transmitir Ia energía acústica a través de su espesor en una dirección perpendicular a Ia longitud del canal de tratamiento. El elemento piezoeléctrico es pegado parcialmente en una de sus superficies metalizadas a uno de los cantos exteriores del chip del microdispositivo, en particular al canto más próximo al canal central de tratamiento realizado en el chip, y paralelo al mismo. De esta manera transmite Ia energía acústica a través de las sucesivas capas que conforman el sistema multicapa, estableciéndose una onda estacionaria con un nodo de presión en el interior del canal de tratamiento, perpendicular a Ia dirección del flujo.
La ubicación del canal de tratamiento respecto al conjunto del dispositivo es importante pero no decisiva, en concreto, los inventores han desarrollado dos configuraciones de chips con dos distancias del canal al borde del chip donde está ubicado el actuador ultrasónico para mejorar Ia estabilidad del nodo de presión dentro del mismo:
- una primera configuración con una distancia de 750 μm (que equivale a 3 octavos de lamda) entre el canal de tratamiento y el actuador ultrasónico
- una segunda configuración con una distancia de 500 μm (que equivale a lamda cuartos) entre el canal de tratamiento y el actuador ultrasónico.
En ambos dispositivos se logra un proceso de separación y extracción efectivo, aunque se aprecia cierta optimización de estabilidad del nodo en el canal para Ia segunda configuración. En Ia resonancia del sistema multicapa, todos y cada uno de los componentes (composite-chip-
canal-chip) están involucrados en el establecimiento del nodo dentro del canal.
Así, Ia onda estacionaria generada a través de las sucesivas capas del dispositivo, se redistribuye respecto a Ia primera configuaración, optimizando Ia localización del nodo de presión dentro del canal y permitiendo una optimización de Ia energía acústica en el dispositivo. A diferencia de nuestro dispositivo, Ia mayor parte de los desarrollos tecnológicos son simétricos y no admiten tal posibilidad, dado que Ia resonancia se conforma dentro del canal y las capas externas no son tan influyentes. La versatilidad de configuración de nuestro sistema multicapa aumenta considerablemente de los parámetros de actuación para posibles mejoras tecnológicas.
Entre las paredes laterales del canal se genera un gradiente de presión acústica, en torno al nodo ubicado en una posición intermedia entre el centro del canal de tratamiento y Ia pared reflectora, en Ia zona ocupada por el lecho del fluido puro a Io largo de toda Ia longitud del canal afectada acústicamente. Este nodo de presión se produce a una distancia de Ia pared reflectora de aproximadamente 1/3 del ancho del canal y a 2/3 de Ia pared opuesta, respectivamente. Así, Ia distribución de presiones establecida en esta dirección perpendicular al flujo de las muestras a Io largo del canal origina una fuerza de radiación que actúa de forma específica sobre cada partícula en suspensión, perpendicularmente a Ia dirección de flujo. Sin embargo, su efecto de conducción queda limitado solamente a aquellas partículas con cierto tamaño, densidad o compresibilidad que, susceptibles a las condiciones acústicas aplicadas y seleccionadas en cada caso según el tipo de aplicación concreta, son aceleradas por acción de dicha fuerza.
La ubicación estratégica de esta zona de equilibrio acústico que constituye el nodo de presión, en el lecho del fluido puro, obliga a las partículas arrastradas acústicamente a atravesar Ia interfase de
separación entre los dos medios fluyentes, abandonando así Ia suspensión para ser colectadas en el fluido puro, también denominado a partir de ahora fluido colector, desde donde son extraídas a través de uno de los canales de salida. Los inventores también destacan Ia gran importancia de esta ubicación estratégica del nodo, relativamente alejada de Ia pared reflectora, pues representa una innovación respecto a los resonadores "lamda cuartos", en los que dicho nodo se ubica junto a Ia pared reflectora. De esta forma se evitan problemas de adherencia de las partículas a dicha pared y se favorece su circulación concentrada hacia Ia salida del canal, evitando así problemas de atasco. Además, este nodo de presión ocupa una longitud a Io largo del canal similar a Ia del actuador ultrasónico (longitud ocupada por Ia cerámica piezoelétrica o el composite piezoeléctrico 1-3). Otra novedad que presenta Ia presente invención se refiere a Ia disposición asimétrica de los canales de entrada y salida desde el canal central de tratamiento, permitiendo al sistema de transducción ultrasónica ejercer su influencia a través del chip sobre una zona del canal más amplia de Ia habitualmente afectada en este tipo de separadores que incluye Ia bifurcación. Esta ordenación espacial estratégica amplía las posibilidades de ubicación de Ia fuente de ultrasonidos (área de pegado de Ia cerámica piezoeléctrica o del composite piezoeléctrico) sobre el chip-sustrato, y con ella Ia zona de actuación en el canal de tratamiento, incluyendo Ia zona de bifurcación hacia las dos ramas de salida. En esta región, de geometría diferente al resto del canal, Ia fuerza de radiación resultante está dirigida hacia Ia salida del canal por donde el fluido colector de partículas abandona el dispositivo, aumentando Ia eficiencia de separación selectiva.
Esta ampliación del área de actuación acústica asegura Ia salida de las partículas seleccionadas por el canal deseado, optimizando Ia eficacia
de separación y extracción de las mismas desde su medio inicial, Ia suspensión.
Otra característica de esta invención es Ia frecuencia de tratamiento ultrasónico, de 1 MHz, inferior a las habituales en este tipo de microdispositivos (normalmente trabajan a partir de 2 MHz, Ia mayoría por encima de este valor). Sin embargo, esta frecuencia puede variar, escalando oportunamente las dimensiones transversales del canal central de tratamiento, las cuales han de variar proporcionalmente a los cambios producidos en Ia longitud de onda (inversamente a Ia frecuencia acústica). De esta forma, frecuencias bajas permiten manejar mayores volúmenes de tratamiento. Sin embargo, para frecuencias inferiores a 500 kHz el umbral de cavitación acústica (consistente en Ia generación en el medio de microburbujas con fuertes y rápidos efectos de implosión) es también inferior al de frecuencias más elevadas. Por ello, el rango de variabilidad de Ia energía acústica para generar conducción ultrasónica sin provocar daños en los micro-elementos en suspensión está más restringido. Además, debe tenerse en cuenta que Ia fuerza de radiación aumenta linealmente con Ia frecuencia acústica, por Io que los beneficios de volumen que reporta Ia utilización de dispositivos resonantes a bajas frecuencias tienen como contrapartida un mayor gasto energético. Con el microdispositivo de esta invención se ha realizado una aplicación de ultrasonidos a una frecuencia inferior a las habituales, en concreto a 1 MHz, para Ia que, sin embargo, el umbral de cavitación acústica es elevado, poniendo de manifiesto su viabilidad y permitiendo un volumen de tratamiento al menos dos veces mayor que en los dispositivos pensados para resonar a 2 MHz. Así, Ia invención aporta dos ventajas relacionadas con este parámetro acústico respecto a los micro-dispositivos existentes resonantes a frecuencias más elevadas; éstas se refieren a un aumento del volumen de tratamiento, recién mencionado y, en consecuencia, a una
disminución en las restricciones asociadas a Ia precisión en el ajuste de las medidas (paredes de canalización fundamentalmente).
Otra novedad del microdispositivo de Ia invención es el material sobre el que está realizado, un chip integrado integrado por dos materiales acoplados en paralelo: PMMA (Polimetacrilato de Metilo) utilizado como sustrato base constituyente del fondo de los canales (con un espesor de aproximadamente 900 μm) y una lámina de epoxy fotodefinible SU-8, dispuesta sobre el sustrato anterior (con un espesor de 330 μm), en el que se realiza Ia canalización. En este sentido, no se han usado especiales reflectores o similares para las paredes del canal central de tratamiento y, por el contrario se ha confirmado un buen comportamiento del material SU-8, que en el microdispositivo constituye una parte importante del sistema multicapa resonante. Su impedancia acústica baja permite el acoplamiento de sus modos resonantes con los del canal, sin requerimientos especiales de reflectores o similares para las paredes del canal de tratamiento. Así pues, se ha validado experimentalmente el material polimérico SU-8 como elemento reflector para el establecimiento de Ia onda estacionaria en el interior del canal y Ia aplicabilidad ventajosa de estos materiales acrílicos acústicamente blandos. Además, se ha encontrado un buen comportamiento acústico del material que constituye Ia base de los canales, PMMA, como transmisor de Ia energía ultrasónica con características acústicas parecidas a las del SU-8 y buen acoplamiento mecánico-acústico al mismo. Se trata de dos materiales poliméricos de fácil manipulación y bajo coste. Ambos materiales presentan una impedancia acústica baja (no superior a tres veces Ia del agua y al menos 5 veces inferior a Ia de los metales) y permiten una fácil manipulación de los mismos para Ia elaboración de los canales, además de Ia evidente ventaja de abaratamiento frente a otros sustratos habituales en este tipo de microdispositivos, como es el Silicio, mucho más rígidos
desde el punto de vista acústico y más caros. En conjunto, aportan interesante ventajas económicas.
El modelo utilizado para Ia experimentación, que se describe en Ia segunda realización práctica, es un modelo de micropartículas de poliestireno de tamaños y densidades que por ejemplo podrían mimetizar las características físico-acústicas de dos tipos de células: eritrocitos y células tumorales exfoliadas en sangre periférica, fluyendo inicialmente juntas en un fluido asimilable al plasma sanguíneo, así como cualquier otra muestra que contenga microelementos de estas características. Se destaca Ia elevada eficacia de separación selectiva y extracción de las partículas de mayor diámetro obtenida en Ia experimentación realizada con el dispositivo de Ia invención. El comportamiento repetitivo se debe a Ia actuación individual de Ia fuerza de radiación acústica sobre cada partícula, independiente de su concentración en Ia suspensión. La eficacia de actuación es válida tanto para concentraciones elevadas como para el caso de suspensiones extremadamente diluidas, para las que otras técnicas de separación presentan fuertes caídas de sensibilidad y eficacia de actuación.
En resumen, de todas las novedades descritas, se destaca Ia sencillez y efectividad que presenta el microdispositivo: sencillez tanto por Ia fuente de ultrasonidos (consistente en una cerámica piezoeléctrica o un componente piezoeléctrico), como por Ia geometría del canal de tratamiento y sus bifurcaciones de entrada y salida, así como los materiales en los que se realiza el chip del dispositivo: materiales plásticos SU.8, (en los que se realiza Ia canalización) sobre sustrato de PMMA que constituye Ia base de los canales, así como por Ia eficacia de resultados.
Por Io tanto, un aspecto de Ia invención Io constituye un microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva de partículas en suspensiones polidispersas, en adelante microdispositivo de
Ia invención, caracterizado porque comprende, integrados en un chip- sustrato de material acústicamente blando, los siguientes componentes: a) un sistema de microcanales de flujo de distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de salida desde el canal central de tratamiento que comprende: i. un camino o lecho por el que fluye Ia suspensión de partida, que incluye un canal de entrada para el suministro y otro de salida por donde abandona el dispositivo, en paralelo con ii. un camino o lecho por el que fluye el fluido puro al que se extraerán las partículas seleccionadas (al que se denomina lecho del fluido colector), incluyendo un canal de entrada o suministro y otro de salida , que forman iii. un canal central de tratamiento donde Ia suspensión de partida y el fluido puro están separados por una interfase frontera de líneas de corriente en régimen laminar definida por las dimensiones transversales del canal y que se bifurca al final de su recorrido en dos canales de salida mencionados , donde el ancho del canal resonador presenta una relación con Ia longitud de onda
(inversamente proporcional a Ia frecuencia acústica), ligeramente mayor a lamda cuartos, y donde Ia profundidad del canal de tratamiento (por ejemplo, 250 μm) -que conforma junto al ancho su sección transversal- es sensiblemente inferior a un cuarto de Ia longitud de onda acústica, y. b) un actuador o transductor ultrasónico en una de sus paredes laterales
- externo y paralelo al canal de tratamiento, que transmite Ia energía acústica al conjunto chip-canal conformando un sistema multicapa cuya
resonancia permite establecer un nodo de presión en el interior del canal en el lugar adecuado, a una distancia de Ia pared reflectora de aproximadamente 1/3 y 2/3 del ancho del canal, respectivamente. Esto tiene un efecto de conducción de ciertas partículas más vulnerables al campo acústico dentro del mismo hacia Ia región de equilibrio acústico definida en el nodo, donde Ia fuerza de radiación se anula, y cuya actuación incluye no solo el canal de tratamiento, sino también Ia zona de bifurcación hacia los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo Ia eficiencia de separación selectiva y extracción. Tal como se utiliza en Ia presente invención el término partícula en
"suspensiones polidispersas" se refiere a una suspensión con partículas de diferentes características físicas (tamaño, densidad o compresibilidad, entre otras), comprendiendo microelementos inorgánicos u orgánicos, tales como células, preferentemente células eucariotas, más preferentemente humanas, microorganismos u otro tipo de microelementos presentes en fluidos biológicos con parámetros del mismo orden.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "chip de materiales acústicamente blandos" se refiere a materiales cuya impedancia es mucho menor a las que presentan otros materiales o medios como los metales o cristal (al menos, 5 veces inferior), y, fundamentalmente, que no supera en tres veces Ia impedancia de los medios líquidos (habitualmente delimitada en un rango de variabilidad oscilante generalmente, salvo excepciones, entre 0.8 MRayls y 2.6 MRayls). El concepto "blando" queda, pues, referido a Ia relación de impedancias entre el material que constituye las paredes del canal de tratamiento y los fluidos circulantes por el interior del mismo, pero con suficiente capacidad de producir reflexiones de Ia onda acústica para el establecimiento de ondas estacionarias.
Así, cualquier material blando, preferentemente un material acrílico, con propiedades acústicas parecidas al SU-8 o similar a otros elementos
plásticos, puede ser utilizado como material para Ia elaboración del chip- sustrato del microdispositivo de Ia invención en el que realizar Ia canalización, por su similitud en Ia transmisión de energía acústica a través del mismo y respuestas análogas de reflexión en las paredes del canal.
Una realización particular de Ia invención Io constituye el microdispositivo de Ia invención, en el que los materiales constituyentes del chip-sustrato, preferentemente un epoxy de resina SU-8 sobre el que se realiza el canal y el sustrato acrílico PMMA "Polimetacrilato de Metilo", presentan una impedancia acústica de 3.3 MRayls, y donde el transductor ultrasónico b) puede ser una pequeña cerámica piezoeléctrica, o un composite piezoeléctrico, preferentemente uno de clase 1-3.
Otro aspecto de Ia invención Io constituye el proceso de fabricación del microdispositivo de Ia invención, en adelante proceso de fabricación del microdispositivo de Ia invención, basado en Ia técnica de fotolitografía de acuerdo al diseño descrito en Ia Figura 1 y que comprende las siguientes etapas: a) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 1 ), b) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-8 sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente, c) Sellado de Ia oblea 1 y Ia oblea 2 enfrentado dichas obleas por Ia cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y d) Retirada de Ia oblea recubierta con material antiadherente.
La elaboración del presente microdispositivo es fácilmente ejecutable por un experto en Ia materia con el conocimiento y diseños indicados en Ia presente invención y con el estado de Ia técnica actual. Adicionalmente, es posible mejorar el diseño del microdispositivo de Ia invención con Ia introducción de canales vacíos adicionales ubicados
estratégicamente en torno al canal central para minimizar las perdidas de
Ia energía acústica transmitiéndose a través del sustrato PMMA del chip y del material SU-8. Estos elementos adicionales podrán ser fácilmente incorporados al diseño del dispositivo de Ia invención repitiendo los pasos b), c) y d) del procedimiento de elaboración del dispositivo y añadiendo dos canales cerrados con aire debajo del canal central y paralelo al mismo.
Existe un canal relleno de aire colocado tanto debajo como al lado del canal fluídico de tratamiento donde se produce Ia separación. De esta manera Ia señal de ultrasonidos utilizada para Ia separación queda confinada en el lugar deseado, minimizando las perdidas. También se puede mejorar Ia configuración del canal central mediante:
- una variación de su ubicación respecto al conjunto del microdispositivo para mejorar Ia estabilidad del nodo de presión dentro del canal. En concreto, variando Ia distancia entre el canal y Ia pared exterior del chip junto al actuador ultrasónico se puede reducir Ia distancia hasta un cuarto de Ia longitud de onda en dicho medio (para el cual Ia transmisión de energía acústica es máxima a Ia frecuencia seleccionada). Así, Ia estabilidad del nodo de presión dentro del canal (hacia el cual los microelementos son conducidos y colectados acústicamente) se ve favorecida.
- Ia reducción de Ia longitud del canal de tratamiento a Ia mitad y, con él, de todo el dispositivo en Ia misma proporción. El acortamiento del recorrido de las dos muestras que fluyen en paralelo dentro del canal de tratamiento provoca una disminución de su interfase en Ia misma proporción. En consecuencia, se produce un acusado acortamiento del recorrido de difusión. De hecho, en fluidos no newtonianos, como por ejemplo Ia sangre (cuya viscosidad varía dependiendo de ciertos parámetros), el acortamiento del canal es imprescindible para evitar Ia ruptura de Ia interfase y con ella evitar su invasión a todo el canal. Por otro lado, el acortamiento del canal implica un menor tiempo de residencia del
fluido en el mismo, y por Io tanto, de tratamiento acústico, además de una mayor manejabilidad.
Además, puede mejorarse Ia actuación del microdispositivo mediante pequeñas modificaciones de Ia frecuencia de actuación ya que el sistema muestra capacidades de micro-manipulación bien diferenciadas mediante ligeras variaciones de Ia frecuencia entorno a Ia frecuencia central de trabajo para Ia que fue diseñado. Incrementos de Ia frecuencia inferiores al 12% de su valor central permiten modificar Ia posición de equilibrio y colección de los microelementos en el interior del canal hacia Ia ubicación que según Ia aplicación a desarrollar nos interese. Esta característica Ie otorga al microdispositivo una gran versatilidad de aplicación muy amplia.
Por otro lado, puede mejorarse Ia actuación del microdispositivo ampliando el rango de frecuencias de actuación ya que el sistema muestra capacidades de micro-manipulación mediante ligeras variaciones de Ia frecuencia entorno a Ia frecuencia central de trabajo para Ia que fue diseñado. Incrementos de este parámetro inferiores al 12% de su valor central permiten modificar Ia posición de equilibrio y colección de los microelementos en el interior del canal hacia Ia ubicación que según Ia aplicación a desarrollar nos interese. Esta característica Ie otorga al microdispositivo una gran versatilidad de aplicación muy amplia.
Por otro lado, el microdispositivo de Ia invención también puede ser fabricado mediante técnicas de estampación en caliente combinadas con un proceso de pegado posterior, de Ia forma siguiente: a) Preparación de un molde en el que se incluyen los diseños de canales deseados, b) Moldeado del sustrato a utilizar usando el molde obtenido en a), mediante Ia acción de presión y/o temperatura, y
c) Sellado del sustrato mediante el pegado con otro material plástico bajo Ia acción de presión y/o temperatura y/o activación superficial por plasma de oxigeno.
Por otro lado, el rango de frecuencia aplicable al microdispositivo de Ia invención tanto para suspensiones orgánicas como inorgánicas es amplio, aunque deben tenerse en cuenta ciertas consideraciones para las suspensiones orgánicas, como se explica a continuación. Una variación en Ia frecuencia ultrasónica implica un proceso de escalamiento en las dimensiones del dispositivo. Dado que el funcionamiento del microdispositivo se basa en el modelo de resonador acústico en Ia dirección del ancho del canal, las características espaciales asociadas a esta dimensión lateral del microcanal de tratamiento han de ser variadas inversamente proporcional a Ia variación de Ia frecuencia acústica. Aunque Ia fuerza de radiación inducida sobre cada microelemento de Ia suspensión es directamente proporcional a Ia frecuencia, debe tenerse en cuenta Ia disminución del umbral energético de cavitación acústica en el caso de suspensiones orgánicas a bajas frecuencias (del orden de los kHz), con el fin de evitar daños celulares. Este fenómeno no deseado se ve favorecido a frecuencias bajas, por Io que habría limitaciones de aplicación de Ia invención por debajo de los 500 kHz. Por el contrario, el incremento de Ia frecuencia aumenta linealmente Ia magnitud de Ia fuerza de radiación y permite una disminución de los niveles de energía acústica necesarios para generar conducción selectiva por ultrasonidos. Por esta razón, casi todos los dispositivos desarrollados hasta el momento trabajan entre 2 MHz y 5 MHz. Como contrapartida, el aumento hasta estas frecuencias implica una disminución escalada de las dimensiones laterales del canal de tratamiento, que ha de variar proporcionalmente a los cambios inducidos en Ia longitud de onda acústica, encareciendo los procesos de realización de estos dispositivos por el compromiso con Ia precisión de los mismos.
Los resultados obtenidos con este modelo permiten aplicar el dispositivo en el ámbito de Ia separación y aislamiento de partículas, con importante aplicaciones en agrobiotecnología, biotecnología aplicada a Ia salud humana y animal, como por ejemplo, Ia separación y aislamiento de células, preferentemente humanas, en procedimientos de diagnóstico y tratamiento, por ejemplo, tratamiento celular o de terapia génica, de enfermedades en mamíferos, preferentemente seres humanos.
Así, otro aspecto de Ia invención Io constituye el uso del microdispositivo de Ia invención, en adelante uso de Ia invención, en un procedimiento, de separación no invasiva selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en suspensiones polidispersas.
Otro aspecto más particular de Ia invención Io constituye el uso de Ia invención en el que las partículas consisten en células pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: virus, priones, células tanto procariotas (bacterias, entre otras) como eucariotas.
Una realización más particular de Ia invención Io constituye el uso del microdispositivo de Ia invención para Ia separación y aislamiento selectivo de células eucariotas, (tales como algas, hongos -incluidas las levaduras-), preferentemente células humanas, y más preferentemente células tumorales, células sanguíneas, células troncales o células madre, ya sean somáticas o embrionarias, u de otro tipo presentes en fluidos corporales, como por ejemplo: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o presentes en otros tipos de muestras biológicas provenientes de biopsias. Procedimientos o aplicaciones concretas biomédicas, ya sean en su vertiente de diagnóstico o de tratamiento, donde se puede utilizar el microdispositivo de Ia invención se relaciona con donaciones de sangre, plasmaféresis, procesos de diálisis y análisis de laboratorio, así como reciclado y/o lavado de sangre tras operaciones quirúrgicas, donde se
precisan la separación y concentración de determinados tipos de células, por ejemplo hematíes y plaquetas.
Otro ejemplo Io constituye el uso del microdispositivo de Ia invención en un procedimiento de diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades humanas para Ia separación selectiva y extracción de células dañadas o alteradas de pacientes, las cuales pueden ser reparadas ex vivo y administradas de nuevo al paciente.
Un campo concreto de aplicación biomédica es Ia oncología, donde se puede utilizar como una herramienta de valor diagnóstico y pronóstico para reproducir Ia separación selectiva y extracción de células tumorales circulantes en sangre periférica (CTC) de pacientes oncológicos con tumores sólidos con diferente origen tisular y en diferentes estadios de Ia enfermedad.
La utilidad clínica demostrada hasta Ia fecha de Ia cuantificación del número de células tumorales circulantes en sangre periférica se centra en los siguientes aspectos:
• Factor pronóstico independiente en cáncer de mama y de próstata metastático (Crístofanilli M, Budd GT, EIHs MJ, Stopeck A, Matera J, Millar MC, Reuben JM, Doyle GV, Aliará WJ, Terstappen LW, Hayes DF. Circulating tumor cells, disease progresión, and survival in metastatic breast cáncer N Engl J Med 351:8, 2004) (Moreno JG, MiIeIr MC, Gross S, Allard WJ, Gomella LG, Terstappen LW. Circulating tumor cells predict survival in patients with metastatic prostate cáncer. Urology; 65(4) ; 713-718; 2005) .
• Seguimiento de Ia respuesta a los tratamientos quimioterápicos en pacientes oncológicos con enfermedad avanzada (Crístofanilli M, Mendelsohn J, et al. Circulating tumor cells in breast cáncer: advanced tools for tailored
therapy. Proc Nati Acad Sci USA 103(46):17073-17074; 2006).
Los sistemas de análisis utilizados en estos estudios se basan en Ia separación inmunomagnética positiva con anticuerpos monoclonales y posterior análisis por microscopía de fluorescencia. Estas aplicaciones han obtenido Ia aprobación de Ia Food and Drug Administration (FDA) para su uso en Ia práctica clínica en EEUU.
La generalización de ambas aplicaciones a otros tipos de tumores está actualmente en pleno desarrollo. Asimismo, existen estudios preliminares que indican Ia potencial utilidad del análisis del número de
CTC como marcador temprano de recidivas en cáncer colorrectal (Soto JL,
Garrígos N, Gallego J, Guaraz P, Garda-Bautista M, Castillejo A, Gómez
A, Casado-Llavona C, Rodríguez-Lescure A, Carrato A. Toward a circulating tumor cell analysis as an early marker for relapse in stage Il and /// colorectal cáncer patients. Eur J Cáncer Supplements. 3(2):187; 2005).
Una de las grandes ventajas que presenta el dispositivo motivo de Ia presente actuación, es Ia posibilidad real, no solo de separar eficazmente las CTC; Io cual permite su fácil contaje; sino el hecho de poder disponer de dicha población celular aislada y en estado viable para ulteriores análisis; tanto descriptivos a nivel genético y de perfiles de expresión génica; como de estudios de comportamiento funcional ex vivo. Hasta Ia fecha, este es el único dispositivo conocido capaz de ofrecer dicha posibilidad con tan elevada eficacia.
El concepto de las CTC como biopsia asequible y no invasiva del tumor, presenta aquí el valor añadido de Ia posibilidad de caracterizar funcionalmente el comportamiento de dichas células con respecto a su sensibilidad/resistencia al arsenal terapéutico disponible como sistema de selección personalizada de los tratamientos más eficaces para cada paciente.
La utilidad clínica real y potencial del dispositivo es por tanto de una gran trascendencia dentro de Ia práctica clínica ofreciendo una información muy valiosa para un mejor manejo de un paciente con distintas enfermedades.
DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Muestra un esquema en perspectiva (2D) de los elementos y forma de actuación-conducción sobre las partículas en suspensión del microdispositivo de Ia invención.
Figura 2.- Muestra Ia configuración del dispositivo de Ia invención en sistema multicapa.
Figura 3.- Muestra una imagen del prototipo dispositivo con el chip y
Ia cerámica piezoeléctrica transductora integrados en una pieza de montaje para Ia inserción-extracción de los fluidos.
Figura 4.- Muestra una fotografía del prototipo del dispositivo con el chip y el composite piezoeléctrico transductor, integrados en una pieza de montaje para Ia inserción-extracción de los fluidos.
Figura 5.- Imagen y esquema del chip de PMMA.
Figura 6.- Imágenes microscópicas del interior del canal.
Figura 7.- Imagen microscópica del comportamiento de conducción individual de cada partícula de 20 m hacia el nodo de presión acústica en el interior del canal.
Figura 8.- Imagen de partículas de 20 μm.
Figura 9.- Filmación de Ia separación-extracción de las partículas.
Figura 10.- Proceso de extracción de las partículas de 20 m a través del canal de salida.
Figura 11.- Esquema del proceso de fabricación del microdispositivo de Ia invención usando un material fotodefinible como material estructural.
Figura 12.- Diseño del microdispositivo de Ia invención donde canales cerrados en sus extremos y rellenos de aire son dispuestos estratégicamente respecto al canal central para minimizar Ia pérdida de energía en el proceso de transmisión a través del sustrato, a) Chip visto desde arriba, b) Sección transversal del chip.
Figura 13.- Esquema del proceso de fabricación de microdispositivo de Ia invención usando Ia técnica de estampación caliente.
Figura 14.- Muestra Ia capacidad de acción y control del microdispositivo en su actuación acústica sobre los microelementos dentro del canal, mediante pequeñas variaciones de frecuencia de su valor central que permiten modificar Ia posición de equilibrio y colección de microelementos en el interior del canal (93OkHz) hasta Ia pared reflectora (1.1 MHz) hacia Ia ubicación que según Ia aplicación a desarrollar nos interese.
REALIZACIONES PRáCTICAS DE LA INVENCIóN
La primera realización práctica describe una primer prototipo del microdispositivo de Ia invención.
En el prototipo presentado en Ia Figura 4, el material estructural utilizado para Ia realización de los canales fluídicos ha sido el polímero fotodefinible SU-8, acoplado mecánicamente a un sustrato de PMMA, que constituye el fondo de los canales del dispositivo. Este material presenta propiedades muy convenientes para Ia fabricación de dispositivos debido a su alta definición (dentro del orden del micrometro), verticalidad en las paredes reveladas [ref2], biocompatibilidad [ref3], ancho rango de espesores [refl] y posibilidad de pegado de varias capas consecutivas [ref4]. El procedimiento de fabricación de este prototipo del dispositivo de Ia invención utilizado y de acuerdo con el diseño de Ia Figura 1 es el siguiente (ver Figura 10): a) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 1 ), b) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-
8 sobre Ia superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente, c) Sellado de Ia oblea 1 y Ia oblea 2 enfrentado dichas obleas por
Ia cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y d) Retirada de Ia oblea recubierta con material antiadherente.
El prototipo del microdispositivo se ha diseñado y fabricado de tal forma que comprende un chip (100) con un sistema integrado de 4 microcanales (160, 162, 170 y 180), centrados en torno a un canal central de tratamiento (110), dos de ellos en cada extremo del mismo, situados de forma no simétrica, tanto para Ia entrada como para Ia salida de dos medios que circulan en paralelo en régimen laminar a Io largo del canal (110) (ver Figuras 1 , 2, y 3). Uno de estos medios es Ia suspensión (150) de Ia que se van a extraer ciertas partículas (101 ) y el otro es un líquido puro (124) que actuará como colector ultrasónico de las partículas (101 ).
Como se aprecia en Ia figura 2, un transductor ultrasónico (190) pegado un una de sus superficies metalizadas al canto del chip, incluye dos materiales poliméricos (uno con Ia canalización y otro que constituye el sustrato sobre el que se asienta acoplado mecánicamente) y genera una onda de ultrasonidos y Ia transmite a través del chip acrílico al canal de tratamiento. El ancho del canal "w" es aproximadamente un cuarto de Ia longitud de onda acústica y permite el establecimiento de una onda estacionaria en dicha dirección dentro del canal con un nodo de presión ubicado a una distancia de aproximadamente w/3 respecto a una de sus paredes laterales, Ia cual actúa como reflector.
La imagen 3.a muestra el dispositivo desde arriba y Ia imagen 3.b muestra de canto Ia estructura del chip, con los dos materiales poliméricos acoplados mecánicamente.
Como se observa en Ia fotografía de Ia Figura 4, el dispositivo lleva integrado en uno de sus laterales un actuador o transductor ultrasónico (190), que puede consistir en una pequeña cerámica piezoeléctrica de área rectangular de PZ26 resonante en su modo "thickness" (espesor) a 1 MHz, o un composite piezoelectrico de clase 1-3, parcialmente pegado en una de sus superficies metalizadas al espesor del chip constituido por SU- 8 y el sustrato PMMA en uno de sus bordes laterales y ocupando parcialmente su espesor y dispuesta paralelo al canal de tratamiento. La fuente de ultrasonidos está dispuesta en contacto perpendicular con el chip, transmitiendo Ia energía ultrasónica en una dirección perpendicular al mismo, de manera que Ia transmisión de Ia energía acústica al medio dentro del canal se produce perpendicularmente a Ia dirección del flujo.
Más concretamente, el ancho del canal es de 390 ± 4,6 μm (1 ,06 veces el cuarto de Ia longitud de onda para 1 MHz). El nodo de presión se encuentra localizado a una distancia de 117 ± 4,6 μm de Ia pared reflectora, en Ia zona ocupada por el lecho del fluido puro, ajeno a Ia suspensión. Así, el canal tiene una sección transversal de 0,0975 mm 2 y
una longitud que puede variar libremente, aunque en el ejemplo concreto de Ia invención es de 1 cm. De esta forma, el volumen del canal es de 0,975 mm 3 .
En Ia figura 10 se observa Ia extracción de las partículas por el canal de salida de Ia derecha tras Ia conducción ultrasónica individual para una velocidad de circulación extremadamente baja, de aproximadamente 0.06mm/s, que permite una visualización clara y cuantificación de su comportamiento acústico. En los fotogramas consecutivos (10.a) a (10.d) se aprecia claramente Ia eficacia del tratamiento ultrasónico de separación selectiva, en el que todas las partículas con diámetros de 20 μm abandonan el dispositivo a través del canal de salida del fluido puro colector, mientras que el resto de las suspensión, conteniendo las pequeñas partículas de 6 μm, circulando por su "cauce" izquierdo, sale a través del canal correspondiente. En Ia figura 11 se muestra un esquema del proceso de fabricación del microdispositivo de Ia invención usando un material fotodefinible como material estructural. a) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible sobre Ia superficie de un sustrato independiente, b) Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible sobre Ia superficie de un sustrato independiente recubierto con un material antiadherente, c) Sellado de Ia oblea 1 y Ia oblea 2, y d) Retirada de Ia oblea recubierta con material antiadherente.
En Ia figura 12 se aprecia el diseño del microdispositivo de Ia invención donde canales cerrados en sus extremos y rellenos de aire son dispuestos estratégicamente respecto al canal para minimizar Ia pérdida de energía en el proceso de transmisión a través del sustrato, a) Chip visto desde arriba, b) Sección transversal del chip.
La figura 13 ilustra el esquema del proceso de fabricación de microdispositivo de Ia invención usando Ia técnica de estampación caliente. a) Preparación de un molde en el que se incluyen los diseños de canales deseados, b) Moldeado del sustrato a utilizar usando el molde obtenido en a), mediante Ia acción de presión y/o temperatura, y c) Sellado del sustrato mediante el pegado con otro material plástico bajo Ia acción de presión y/o temperatura y/o activación superficial por plasma de oxigeno. En Ia figura 14 se muestran imágenes donde se muestra Ia capacidad de acción y control del microdispositivo en su actuación acústica sobre los microelementos dentro del canal, mediante pequeñas variaciones de frecuencia de su valor que permiten modificar Ia posición de equilibrio y colección de microelementos en el interior del canal (93OkHz) hasta Ia pared reflectora (1.1 MHz) hacia Ia ubicación que según Ia aplicación a desarrollar nos interese.
En Ia segunda realización, se describe el uso del microdispositivo de Ia invención para Ia separación de micropartículas que mimetizan células.
Para el control microfluídico del microdispositivo de Ia invención se usó una bomba de inyección de presión constante con capacidad de aplicación simultánea sobre tres jeringuillas de diferentes volúmenes (entre 10 μl_ y 11OmL) para controlar el flujo de ambos medios en cada una de las entradas (160 y 162). La suspensión (150) y el fluido colector (124) fueron inyectados simultáneamente con Ia misma presión mediante jeringuillas del mismo volumen (5mL cada una) a través de estas entradas (160 y 162), respectivamente.
La separación ultrasónica de las partículas seleccionadas y su conducción al nodo de presión, en el lecho del fluido colector (124), fueron monitorizadas en tiempo real usando filmaciones de resolución microscópica con una cámara CCD acoplada a un conjunto de lentes ópticas con una resolución de 1 ,17 μm por pixel digital. El ancho del lecho de flujo ocupado por Ia suspensión se mantuvo en torno a 1/2 del ancho del canal (110).
El modelo utilizado para Ia experimentación en este ejemplo es un modelo de micropartículas de poliestireno de tamaños y densidades que mimetizan las características físico-acústicas de dos tipos de células: eritrocitos y células tumorales exfoliadas en sangre periférica, fluyendo inicialmente juntas en un fluido asimilable al plasma sanguíneo.
Las características físico-acústicas de este fluido, tales como su densidad y velocidad de propagación acústica, son descritas en Ia literatura (Cousins CM, Holownia P, Hawkes JJ, Limaye MS, Price CP, Keay P, Coakley WT, Plasma preparation from whole blood using ultrasound. Ultrasound Med Biol 26:881-888, 2000), así como las de los eritrocitos (Duck F A, Physical properties of tissue: a comprehensive referente book, Academia London, 1990,Haider L, Snabre P, Boynard M, Rheology and ultrasound scattering from aggregated red cell suspensions in shear flow, Biophysical Journal, VoI. 87, 2322-2334, 2004). Por el contrario, Ia inexistencia de referencias bibliográficas sobre estas propiedades para las células tumorales circulantes en sangre periférica, obligó a determinar dichos datos de forma indirecta mediante el desarrollo de un modelo experimental de inducción. Para ello, se recurrió a Ia caracterización acústica de dos medios líquidos utilizados habitualmente en laboratorios oncológicos para separación celular por centrifugación y gradiente de densidad: Ficoll® y otro medio líquido no definido técnicamente pero utilizado en un dispositivo experimental denominado Oncoquick®, muy eficaz en Ia separación de células tumorales por su
densidad, sobre el cual las células tumorales exfoliadas en sangre periférica permanecen flotando [Rosenberg R, Gertler R, Friedrichs J, Fuehrer K, Dahm M, Phelps R, Trovan S, Nekarda H, Siewert JR. Comparision of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood. Cytometry 49; 150-158. 2002].
A partir de las medidas de densidad y velocidad de propagación del sonido en ambos medios líquidos se derivó el margen de variabilidad posible para Ia densidad de las células tumorales: 1 ,030 gr/cm 3 < p(células tumorales) < 1 ,055 gr/cm 3 , con un grado de incertidumbre inferior a un 5% del valor mínimo. A partir de estos datos, y teniendo en cuenta Ia dependencia aproximadamente lineal para microelementos biológicos, se pudo realizar una estimación de su compresibilidad, seleccionando, para este ejemplo, partículas con una densidad de 1 ,05 gr/cm 3 , como representativas de las células tumorales.
Una vez caracterizadas las células tumorales con este modelo experimental, fueron mimetizadas por partículas de poliestireno con diámetros seleccionados de 20 μm. Aunque el rango de variabilidad de estas células es muy amplio (se puede definir entre 10 y 40 μm) se eligió este tamaño como un valor standard.
Así, se procedió a Ia introducción y análisis de suspensiones acuosas "bi-dispersas", es decir, conteniendo dos poblaciones de partículas, de 6 y 20 mieras de diámetro respectivamente en diferentes concentraciones y sometidas a los ultrasonidos en el dispositivo. Los resultados de separación selectiva y extracción de las partículas grandes pueden verse claramente en Ia Figuras 6, 7, 8 y 9.
De acuerdo con Ia figura 6, en el interior del canal se aprecia Ia ocupación de los dos medios en el mismo, Ia suspensión circulando por Ia sección izquierda del canal y agua en Ia mitad derecha, en ausencia de Ia aplicación ultrasónica. La suspensión está constituida mayoritariamente
por pequeñas partículas de poliestireno con diámetros de 6 mieras en alta concentración y algunas más grandes con diámetros de 20 mieras circulando en muy baja concentración (Cv < 1 %). En Ia fotografía de Ia Figura 6.a) se observa Ia distribución transversal de los medios para bajas velocidades de circulación, permitiendo Ia visualización parcial de partículas de 6 um. La resolución de las imágenes es de 1.17 μm/píxel. Por el contrario, Ia imagen de Ia Figura 6.b), correspondiente a una velocidad de circulación mayor, no permite dicha distinción, pero muestra una diferencia de tonalidad en el contraste luminoso de ambos medios. De acuerdo con Ia figura 7, Ia partícula situada en Ia parte superior del canal se encuentra en el principio de Ia zona del canal afectada por el actuador ultrasónico y experimenta un desplazamiento lateral, perpendicular a Ia dirección del flujo, menos intenso que Ia partícula ubicada en Ia parte inferior de Ia fotografía, plenamente afectada por el campo acústico y, por ello, arrastrada más intensamente. Por esta razón, dicha partícula se encuentra ubicada en Ia posición del nodo de presión mientras que Ia partícula superior todavía no Io ha alcanzado en el tiempo de adquisición del fotograma.
La figura 8 muestra una imagen correspondiente a un fotograma de dos partículas de 20 μm circulando muy lentamente a Io largo del canal en el nodo de presión, posicionadas en el nodo de presión acústica, separado de Ia pared reflectora.
La figura 9 muestra resultados experimentales en una filmación del proceso de separación-extracción de las partículas seleccionadas a través de las canalizaciones de salida. El primer fotograma (9.a) muestra en ausencia de ultrasonidos Ia salida natural de las partículas de 20 m junto al resto de Ia suspensión por el ramal izquierdo a partir del canal, siguiendo el lecho de flujo por el que circulaba. Los fotogramas de (9.b), (9.c) y (9.d) muestran Ia salida selectiva de estas partículas, separadas de Ia suspensión, por el canal de salida del fluido puro-agua, una vez
conducidas y colectadas acústicamente en el nodo de presión, ubicado en el lecho del fluido puro (semi-sección derecha), a Io largo del cual continúan su circulación hasta abandonar el canal de tratamiento. Todos estos fotogramas corresponden a una misma película. La velocidad de circulación de las partículas en estas secuencias es de 2.4mm/s a Io largo del canal.
Los resultados de separación selectiva de las partículas de 20 μm fueron positivos para todas las pruebas realizadas, para diversas velocidades de flujo de las muestras inyectadas a través del canal central de tratamiento (en un rango de variabilidad entre y 0,06mm/s y 1 ,4 mm/s), siempre dentro del régimen laminar requerido en Ia microfluídica. Se usaron suspensiones acuosas bidispersas: con diferentes concentraciones volumétricas de partículas pequeñas (6 μm), no cuantificadas, de partículas grandes con diámetros de 20 μm en muy baja concentración, siempre inferior al 1 %. Todos los experimentos se realizaron a Ia frecuencia determinada por el ancho del canal, estratégicamente determinado en función de Ia frecuencia resonante de Ia cerámica piezoeléctrica PZ26, de 1 MHz. Como fluido puro se utilizó siempre agua desionizada.
Más concretamente, en el canal central se introdujeron en paralelo los dos medios: una suspensión (150) de Ia que extraer partículas de ciertas características (101 ) (concretamente, partículas de diámetro de 20 μm y densidad de 1 ,05 gr/cm 3 ) y un fluido líquido (agua desionizada) (124), a través de dos canales (160 y 162), ambos con Ia misma sección (0,049 mm 2 ) e integrados en el chip de Ia invención, cada uno de los cuales ocupa Ia mitad de Ia sección del canal central(110). Los dos medios fluyen a Io largo del canal (110) en paralelo y en régimen laminar en sus lechos correspondientes: el fluido puro que colectará las partículas (101 ) en un lecho de flujo (124) y Ia suspensión en el lecho (122) que ocupa Ia otra
parte de Ia sección del canal (110), manteniendo estable Ia interfase que los separa (120). Este comportamiento se observa en las imágenes de Ia Figura 5 para dos velocidades de flujo continuo (0,06 mm/s y 1 ,4 mm/s respectivamente). La imagen 5.a muestra los micro-canales realizados y Ia ubicación de Ia cerámica piezoeléctrica pegada en el canto del chip. La figura 5.b muestra un esquema de Ia sección transversal del chip, constituido por dos materiales poliméricos SU-8 y PMMA. Tras recorrer Ia longitud del canal (110) ambos medios se separan en el punto de bifurcación (175) hacia dos canales de salida (170 y 180), por los que abandonan el dispositivo. Cuando Ia suspensión (150) fluye por su lecho (122) dentro del canal (110), aquellas partículas de un determinado tamaño y densidad (101 ) contenidas en Ia misma experimentan una fuerza de radiación debido al establecimiento de una onda estacionaria generada en el canal (110) por el transductor piezoeléctrico (190) ubicado externamente.
Para voltajes de alimentación 15 volts aplicados al transductor ultrasónico desde un generador de señal continua, las partículas de 20 μm (101 ) experimentan una fuerza de radiación y son rápidamente conducidas perpendicular al flujo continuo de Ia suspensión a Io largo del canal (110) por Ia acción del los ultrasonidos hacia el nodo de presión, ubicado en Ia zona ocupada por el fluido puro (agua) (124) (Figura 6), a Io largo del cual continuaron su circulación hacia el final del canal (Figura 7), abandonando de forma diferenciada el dispositivo por el canal de salida (180) inmersas en dicho fluido (124) y separadas del resto de Ia suspensión en Ia que se encontraban antes de Ia aplicación ultrasónica.
Por el contrario, las partículas pequeñas de 6 μm contenidas en Ia suspensión (107) en alta concentración, no son afectadas por el campo acústico y no experimentan ningún arrastre acústico, dado que Ia fuerza de radiación ejercida sobre ellas es mucho menor por ser proporcional a Ia potencia cúbica del radio, tres veces inferior al de las grandes (101 ). De
esta manera, las partículas se mantienen circulando en Ia suspensión por su lecho inicial de flujo sin desviar sus trayectorias. Finalmente, abandonan el dispositivo por el canal de salida de Ia suspensión.
Las Figuras 8 y 9 presentan dos colecciones de fotogramas consecutivos en los que se aprecia claramente Ia circulación de las partículas de 20 m una vez extraídas ultrasónicamente de su suspensión y arrastradas y colectadas en el fluido colector hacia el punto de bifurcación del canal central, desde donde abandonan el dispositivo a través del canal (180), separadas de su medio inicial. Dada Ia anchura del canal (110), algo mayor a un cuarto de Ia longitud de Ia onda acústica establecida en su interior, Ia formación del nodo de presión acústica se produce en una posición intermedia entre Ia pared del reflector y Ia interfase (120), aproximadamente en una posición correspondiente a 1/3 - 2/3 de Ia anchura del canal (110) respectivamente. Las partículas (101 ) tenderán a concentrarse en Ia posición nodal de Ia onda estacionaria desde el momento en que durante su circulación a Io largo del canal (110) entran en Ia zona activa del campo acústico.
El resto de componentes de Ia suspensión (150) no son afectados por el campo acústico, no cruzarán Ia interfase (120) entre los dos medios (150 y 130) y mantienen su circulación fluyendo en su lecho correspondiente (122) a Io largo del canal microfluídico (110), hasta alcanzar el punto de bifurcación (175), a partir del cual abandonan el dispositivo a través del canal-ramal de salida (170).
Se destaca Ia elevada eficacia de separación selectiva y extracción de las partículas grandes de 20μm obtenida en Ia experimentación realizada con el dispositivo de Ia invención.
Como ejemplo, en experimentos en los que las muestras eran inyectadas en el canal de tratamiento mediante jeringuillas de 5 mL y una velocidad de circulación de las mismas en el canal de 1 ,4 mm/s (12 minutos para el vaciado de 1 mL) no se encontraron resultados negativos
de actuación, en los que partículas grandes de 20 m desalojasen el dispositivo por el canal de salida de Ia suspensión, sino que eran continuamente conducidas hacia el fluido colector, por cuyo canal de salida desalojaban. Un análisis cualitativo de visualización de las muestras recogidas a
Ia salida de los dos canales (170) y (180) confirma Ia eficacia de separación selectiva y extracción de las partículas de 20 μm de Ia suspensión en Ia que se hallaban inmersas antes del tratamiento ultrasónico. El líquido recogido durante 1 minuto del canal por el que desaloja Ia suspensión (170) sometida a Ia onda acústica no contiene partículas de 20 μm y, sin embargo, presenta una presencia muy elevada de partículas más pequeñas, con diámetros de 6 μm. Por el contrario, el líquido recogido a Ia salida del canal (180) contiene partículas de poliestireno de 20 μm que, como se observa previamente en el canal central(110) y en Ia zona de bifurcación (175) son separadas acústicamente de su suspensión inicial y extraídas al fluido colector (124), abandonando el dispositivo por el canal (180).
Estos experimentos se realizaron en condiciones de muy baja concentración para las partículas de 20 m, muy inferior al 1 % de su concentración volumétrica, simulando situaciones reales de células tumorales exfoliadas en sangre. Este comportamiento repetitivo encontrado en esta población de partículas para diferentes concentraciones (siempre por debajo del 10%) se debe y se explica por Ia actuación individual de Ia fuerza de radiación acústica sobre cada partícula, independiente de su concentración en Ia suspensión. La eficacia de actuación es válida tanto para concentraciones elevadas como para el caso de suspensiones extremadamente diluidas, para las que otras técnicas de separación presentan fuertes caídas de sensibilidad y eficacia de actuación.