本发明涉及一种基于微流体芯片的微生物检测 仪器及其 SPR检测方法，属于工业测 试和环境监测领域。

背景技术

目前， 我们日常的饮用水及食物如被微生物所污染， 这些被污染的水和食物经过口 腔进入肠道，会在肠道内繁殖且散发毒素，破 坏肠粘膜组织， 引起肠道功能紊乱和损害， 严重影响身体健康。 人体一旦被感染， 微生物虫卵由患者粪便排出将再次感染他人， 从 而导致更大规模传染疾病的爆发。 传统的微生物检测方法主要包括平板计数方法 、 免疫 分析方法和 PCR方法等， 平板计数方法将稀释的微生物与培养基混合后 生长繁殖为多个 菌落， 通过对菌落计数确定微生物浓度； 免疫分析方法通过探测微生物抗体和抗原之间 的特异性结合反应来实现检测； PCR方法对微生物进行裂解从而提取纯化 DNA， 设计 引物作用于寄生虫卵特定编码区域并对其进行 扩增， 从而实现微生物的鉴别和数目检 测。 这几种方法的共同缺点是耗时长、 涉及繁琐的生物化学反应过程、 需要多种化学试 剂和专业人员参与， 无法满足快速准确的微生物检测需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的 缺陷，提供一种基于微流体芯片的微 生物检测仪器， 它将微流体芯片和透镜高度集成在一起， 可一次检测大量样品的微生物 种类及其所含不同成分的浓度， 样品无需标记， 检测速度快， 检测精度高。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案是 ： 一种基于微流体芯片的微生物检测仪器， 包括入射光源、 光纤准直镜、 多通道准直镜和多通道光谱仪， 还包括透镜和具有表面等 离子体共振响应特性的微流体芯片，微流体芯 片上开有带流体进口和流体出口的流体微 通道， 微流体芯片内设置有金属膜阵列层， 并且金属膜阵列层位于流体微通道的下表面 上， 金属膜阵列层上固定有多种微生物抗体层， 透镜紧贴在微流体芯片上位于金属膜阵 列层的一侧， 所述入射光源发出的光依次通过光纤准直镜和 透镜后照射至金属膜阵列 层， 然后再通过透镜反射至多通道准直镜后射入多 通道光谱仪。

进一步， 所述微流体芯片的基体和透镜均采用聚二甲基 硅氧烷材料制成。

进一歩，所述的金属膜阵列层和微生物抗体层 之间由里向外还依次设置有自组装单 分子层和蛋白 G层。 进一步， 所述的透镜为三棱透镜。

更进一步， 所述的金属膜阵列层为金膜阵列层。

本发明还提供了一种基于微流体芯片的微生物 检测仪器的 SPR检测方法，该方法的 步骤如下：

1 ) 将带有微生物的待检测液样通过过滤器过滤后 ， 从流体进口进入流体微通道， 当待检测液样中的某种微生物流经金属膜阵列 层时， 金属膜阵列层上的该种微生物抗体 层与待检测液样中的该种微生物的抗原结合， 其余液样则从流体出口流出；

2) 启动入射光源， 入射光源发出入射光经过光纤准直镜准直后， 通过透镜平行地 投射至金属膜阵列层上并在透镜和金属膜阵列 层的交界面发生全内反射， 反射光通过透 镜射入多通道准直镜后进入多通道光谱仪；

3 ) 通过分析多通道光谱仪测量得到的某种微生物 的抗原和抗体结合前后的反射光 强 /波长曲线上共振峰位置的变化， 即可得知待检测液样中微生物的类型和浓度。

进一步， 所述微流体芯片的制作方法如下-

1 ) 在固化后的第一微流体芯片基体上涂上 AZ光刻胶， 经过光刻和显影工序后， 将掩膜板上的图形转移到 A 光刻胶上；

2)采用电子束蒸镀工艺在 AZ光刻胶上镀上金属膜，然后采用剥离工艺除� �� AZ光 刻胶及其上的金属层， 从而在第一微流体芯片基体上获得金属膜阵列 层；

3 )在硅衬底上涂 SU-8光刻胶， 通过光刻和显影工序， 在硅衬底上获得流体微通道 模板；

4)将聚二甲基硅氧垸（PDMS )材料倒在流体微通道模板上， 经过固化后将流体微 通道转移到第二微流体芯片基体上；

5) 采用氧等离子体处理含有金属膜阵列层的第一 微流体芯片基体和含有流体微通 道的第二微流体芯片基体表面， 并粘合绑定在一起， 即得到需要的微流体芯片。

更进一步， 第一微流体芯片基体和第二微流体芯片基体均 采用 PDMS材料制成。 采用了上述技术方案后， 入射光会在透镜和金属膜阵列层交界面发生全 内反射， 当 产生的倏失波和金属内的表面等离子体波具有 相同的波矢时， 会形成表面等离子体共 振， 共振时， 界面处的全反射条件被破坏， 反射率出现最小值， 出现最小位置的点即为 共振角或者共振波长，微流体芯片的共振波长 位置对金属膜阵列层另一侧电解质的折射 率非常敏感， 测量时， 将具有特异结合和识别属性的抗体固定于金属 膜阵列层表面， 当 流样中某种微生物流经金属膜阵列层表面， 若该微生物上具有与此抗体对应的抗原， 抗 原和抗体结合，将改变金属膜阵列层表面的液 样的折射率，从而会引起共振波长的变化， 不同种类微生物上的抗原和对应抗体结合， 引起的折射率变化量不同， 因而产生不同的 共振波长变化。 即使同一种微生物， 其浓度不同， 也会产生不同的共振波长变化， 通过 这种变化就可以得到微生物的种类和浓度。 本发明将微流体芯片和透镜高度集成在一 起， 可一次检测大量样品的微生物种类及其所含不 同成分的浓度， 样品无需标记， 检测 速度快， 检测精度高。

附图说明

图 1为本发明的基于微流体芯片的微生物检测仪� �的结构示意图；

图 2为本发明中不同折射率下微流体芯片的共振� �线；

图 3为本发明中微流体芯片的共振波长偏移量随� �肠杆菌浓度变化曲线； 图 4为金属膜阵列层表面抗原抗体结合原理图；

图 5为微流体芯片的加工流程图。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解， 下面根据具体实施例并结合附图， 对本 发明作进一步详细的说明。

如图 1~5所示， 一种基于微流体芯片的微生物检测仪器， 包括入射光源 6、 光纤准 直镜 7、 多通道准直镜 4和多通道光谱仪 5， 还包括透镜 3和具有表面等离子体共振响 应特性的微流体芯片 2， 微流体芯片 2上开有带流体进口和流体出口的流体微通道 2-4， 微流体芯片 2 内设置有金属膜阵列层 2-1， 并且金属膜阵列层 2-1位于流体微通道 2-4 的下表面上， 金属膜阵列层 2-1上固定有多种微生物抗体层 9， 透镜 3紧贴在微流体芯 片 2上位于金属膜阵列层 2-1的一侧， 入射光源 6发出的光依次通过光纤准直镜 7和透 镜 3后照射至金属膜阵列层 2-1， 然后再通过透镜 3反射至多通道准直镜 4后射入多通 道光谱仪 5。

微流体芯片 2的基体和透镜 3均采用 PDMS材料制成。本发明采用同样材质的微流 体芯片 2和透镜 3高度集成在一起， 采用 PDMS材料， 无需使用折射率匹配油， 透镜易 于和微流体芯片无缝集成， 且成本更低。

为了提高表面等离子体共振仪的检测灵敏度， 需要对固定在金属膜阵列层 2-1上的 微生物抗体层 9的方向进行控制。

为了使得某些微生物抗体层 9 (例如： 大肠杆菌抗体） 与金属膜阵列层 2-1紧密连 接， 需要基质层物质将微生物抗体层 9与金属膜阵列层 2-1偶联起来。 如图 4所示， 金 属膜阵列层 2-1和微生物抗体层 9之间由里向外还依次设置有自组装单分子层 11和蛋 白 G层 10。 首先用异丙醇清洗金属膜阵列层 2-1表面， 以除掉上面杂质， 然后将金属 膜阵列层 2-1浸入含有 11-巯基十一烷酸的丙三醇和乙醇混合液中， 放置 12小时以上， 11-巯基十一垸酸中的巯基与金属原子结合形成 牢固的共价键， 从而在金属膜阵列层 2-1 表面形成自组装单分子层 11，紧接着将金属膜阵列层 2-1置于含有二氯乙烷的水和乙醇 混合溶液 2个小时以上，以活化 11-巯基十一烷酸的羧基。将含有 10mg/L蛋白 G、0.14M/1 氯化钠和 0.02%硫汞撒 PBS的 PBS磷酸盐缓冲液滴在金属膜阵列层 2-1表面， 反应 2 小时以上， 在自组装单分子层 11上形成蛋白 G层 10， 然后将含有微生物抗体的 PBS 缓冲液滴在蛋白 G层 10上。 2小时后， 用 PBS缓冲液清洗膜层表面， 并在含有 0.1 %多 聚甲醛 -吐温 20溶液的 PBS缓冲液中培育 20分钟， 使得微生物的抗原易于和金属膜阵列 层 2-1上的抗体结合。

如图 1所示， 透镜 3为三棱透镜。

金属膜阵列层 2-1为金膜阵列层。

图 3可以看出， 大肠杆菌浓度越高， 共振波长变换量越大， 两者基本上成线性关系 实际测量时， 实现通过标定得到变化曲线， 然后通过测量共振波长变换量即可反演得到 大肠杆菌的浓度， 其他微生物的浓度的推演方法也与其类似。

基于微流体芯片的微生物检测仪器的表面等离 子体共振微生物检测方法， 该方法的 步骤如下：

1 ) 将带有微生物的待检测液样通过过滤器 1 过滤后， 从流体进口进入流体微通道 2-4， 当待检测液样中的某种微生物流经金属膜阵列 层 2-1时， 金属膜阵列层 2-1上的该 种微生物抗体层 9与待检测液样中的该种微生物的抗原结合， 其余液样则从流体出口流 出；

2) 启动入射光源 6， 入射光源发出入射光经过光纤准直镜 7准直后， 通过透镜 3 平行地投射至金属膜阵列层 2-1上并在透镜 3和金属膜阵列层 2-1的交界面发生全内反 射， 反射光通过透镜 3射入多通道准直镜 4后进入多通道光谱仪 5 ;

3 ) 通过分析多通道光谱仪 5测量得到的某种微生物的抗原和抗体结合前� �的反射 光强 /波长曲线上共振峰位置的变化， 即可得知待检测液样中微生物的类型和浓度。

微流体芯片 2的制作方法如下：

1 ) 在固化后的第一微流体芯片基体 2-2上涂上 AZ光刻胶 13， 经过光刻和显影工 序后， 将掩膜板 12上的图形转移到 AZ光刻胶 13上；

2) 采用电子束蒸镀工艺在 AZ 光刻胶 13 上镀上金属膜， 然后采用剥离工艺除掉 AZ光刻胶 13及其上的金属膜，从而在第一微流体芯片基� �� 2-2上获得金属膜阵列层 2-1；

3 ) 在硅衬底 15上涂 SU-8光刻胶 14， 通过光刻和显影工序， 在硅衬底 15上获得 流体微通道模板 14;

4)将 PDMS材料倒在流体微通道模板 14上， 经过固化后将流体微通道 2-4转移到 第二微流体芯片基体 2-3上； 5 )采用氧等离子体处理含有金属膜阵列层 2-1的第一微流体芯片基体 2-2和含有流 体微通道 2-4的第二微流体芯片基体 2-3表面， 从而粘合在一起， 即得到需要的微流体 芯片 2。

第一微流体芯片基体 2-2和第二微流体芯片基体 2-3均采用 PDMS材料制成。

SPR指的是表面等离子体共振。

本发明的工作原理如下：

启动入射光源后， 入射光会在透镜 3和金属膜阵列层 2-1交界面发生全内反射， 当 产生的倏失波和金属内的表面等离子体波具有 相同的波矢时， 会形成表面等离子体共 振， 共振时， 界面处的全反射条件被破坏， 反射率出现最小值， 出现最小位置的点即为 共振角或者共振波长， 微流体芯片的共振波长位置对金属膜阵列层 2-1另一侧电解质的 折射率非常敏感， 测量时， 将具有特异结合和识别属性的抗体固定于金属 膜阵列层 2-1 表面， 当流样中某种微生物流经金属膜阵列层 2-1表面， 若该微生物上具有与此抗体对 应的抗原， 抗原和抗体结合， 将改变金属膜阵列层 2-1表面的液样的折射率， 从而会引 起共振波长的变化， 不同种类微生物上的抗原和对应抗体结合， 引起的折射率变化量不 同， 因而产生不同的共振波长变化。 即使同一种微生物， 其浓度不同， 也会产生不同的 共振波长变化， 通过这种变化就可以得到微生物的种类和浓度 。 本发明将微流体芯片 2 和透镜 3高度集成在一起，可一次检测大量样品的微� �物种类及其所含不同成分的浓度， 样品无需标记， 检测速度快， 检测精度高。

以上所述的具体实施例， 对本发明解决的技术问题、 技术方案和有益效果进行了进 一步详细说明， 所应理解的是， 以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制 本发明， 凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包 含在本发明的保护范围之内。