Y SU USO COMO PROBIÓTICO

La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie Bifidobacterium breve que ha sido aislado de leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna. También se refiere al uso de dicho microorganismo como material probiótico y a una composición que comprende dicho microorganismo.

Antecedentes de la invención

Las bifidobacterias forman parte de la microbiota intestinal humana considerada como beneficiosa para la salud. Algunas cepas de este género se emplean como microorganismos probióticos en productos alimentarios por quedar demostrada su eficacia en el equilibrio de la microbiota intestinal saludable, así como su eficacia en la inhibición o retraso del crecimiento de bacterias potencialmente patógenas.

Una propiedad fundamental para que los microorganismos probióticos puedan llevar a cabo su efecto beneficioso es que los mismos, una vez ingeridos, puedan alcanzar la mucosa intestinal en tal número y con tal vitalidad que sean capaces de persistir y/o colonizar el intestino. Por este motivo, es necesario que estos microorganismos probióticos resistan el pH bajo del estómago y las sales biliares del intestino.

La selección de microorganismos probióticos se realiza habitualmente mediante estudios in vitro de supervivencia a las condiciones gastrointestinales. De este modo, se obtiene información acerca de la capacidad de las bacterias de resistir el bajo pH del estómago y la presencia de sales biliares. Sin embargo, dichos estudios no aseguran la capacidad in vivo de los microorganismos seleccionados de resistir al tránsito gastrointestinal.

La leche materna se describe como el origen de las bifidobacterias que colonizan el intestino del recién nacido lactante, por lo que la obtención de aislados procedentes de esta fuente es particularmente interesante para obtener material probiótico susceptible de ser empleado en productos lácteos y con buenas probabilidades de resistir in vivo el tránsito gastrointestinal. Sin embargo, la obtención de cepas de bifidobacterias aisladas de leche materna es muy escasa debido a la dificultad de obtención de dichos aislados (Martín et al. 2009; Solis et al. 2010). Por otro lado, es conocido que la viabilidad de las bifidobacterias en los productos lácteos que las contienen es limitada, así como el número y diversidad de cepas disponibles comercialmente. En efecto, son numerosos los estudios que demuestran que las bifidobacterias presentan características tecnológicas inferiores a las bacterias lácticas tradicionalmente usadas en productos lácteos. De hecho, existe un consenso generalizado sobre la falta de capacidad de las cepas de bifidobacterias para crecer en leche (Prasanna et al. 2012). En particular, se ha comprobado que muchas cepas de bifidobacterias poseen un crecimiento muy lento en leche debido a una reducida actividad proteolítica, lo que dificulta enormemente su aplicación en productos lácteos fermentados (Yonezawa et al. 2010). Además, el cultivo de bifidobacterias en leche requiere tiempos muy largos de incubación, condiciones anaerobias, bajo potencial redox y promotores de crecimiento tales como hidrolizados de leche (Gomes et al. 1998), caseinomacropéptidos (Janer et al. 2004) o extracto de levadura (Zacarías et al. 201 1). Sin embargo, la adición de factores de crecimiento en la leche puede repercutir en un deterioro de la calidad del producto fermentado por la producción de ácido acético o por el aporte de sabores no deseados.

A la vista de lo expuesto, se considera relevante el aislamiento y caracterización de nuevas cepas de microorganismos probióticos del grupo de las bifidobacterias con buenas propiedades tecnológicas para su empleo en la industria alimentaria, en particular, para su empleo en la elaboración y preparación de productos lácteos y sus derivados.

Para su uso en la industria alimentaria, en particular, la industria láctea, sería deseable que las nuevas cepas aisladas fueran cultivables, así como conservables en condiciones de refrigeración y congelación hasta su consumo. Además, sería deseable que su capacidad de crecimiento en leche permitiera la obtención de biomasa para uso industrial. Por otro lado, las cepas aisladas no deberían producir un deterioro de la percepción de calidad esperada en el producto final.

Descripción resumida de la invención

Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar un microorganismo aislado de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna, capaz de transmitirse de la leche al intestino, y que consiste en una cepa de la especie Bifidobacterium breve, depositada con el número CECT 8178 en la "Colección Española de Cultivos Tipo" de Valencia, España. El depósito ha sido efectuado por el solicitante de la presente solicitud de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes.

Un segundo objetivo de la presente invención consiste en el uso de dicho microorganismo como material probiótico, preferiblemente, como material probiótico en la elaboración y/o preparación de productos lácteos y sus derivados. Un tercer objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que comprende dicho microorganismo, preferiblemente, una composición que comprende dicho microorganismo y por lo menos un producto para ingerir, preferiblemente un producto alimentario.

Ventajosamente, dicho producto alimentario es un producto seleccionado de un grupo que comprende leche y productos derivados de la leche, como por ejemplo, leches de fórmula infantil o leches maternizadas.

La cepa de la presente invención puede aplicarse en preparados alimenticios que incluyan, en lugar de leche y productos lácteos, otros productos alimentarios como cereales y derivados, sopas y otros productos comercializados en forma de deshidratados; carnes fermentadas, zumos, bebidas o derivados de frutas, y/o alimentos para usos nutricionales específicos. Además, también podría formar parte de preparados farmacéuticos en los que se ingiriera en la forma de cápsulas, pastillas o en polvo, para emplear en dietas, en suplementos alimenticios, o fórmulas para nutrición oral o enteral.

La nueva cepa reivindicada presenta la ventaja de que combina unas buenas propiedades probióticas con unas buenas propiedades tecnológicas para su empleo en la industria alimentaria, en particular, para su empleo en la elaboración y preparación de productos lácteos y sus derivados.

Por lo que se refiere a las propiedades probióticas, los experimentos realizados confirman las siguientes características:

capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de sobrevivir a las condiciones gastrointestinales in vitro. capacidad moderada de la cepa CECT 8178 para formar exopolisacáridos. capacidad de la cepa CECT 8178 de formar biofilms en presencia de sales biliares (Oxgall). capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de retrasar el crecimiento de microorganismos patógenos del género Salmonella y Cronobacter.

Por lo que se refiere a las propiedades tecnológicas, los experimentos realizados confirman las siguientes características: capacidad de la cepa CECT 8178 de crecer en leche sin factores de crecimiento. capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de resistir la conservación en condiciones de refrigeración. - capacidad de la cepa CECT 8178 de resistir a la conservación en condiciones de congelación. capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de sobrevivir a la liofilización.

Otra ventaja importante de la cepa de la presente invención radica en el hecho de que ha sido aislada de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna. En particular, la nueva cepa CECT 8178 es de origen humano y presenta la ventaja de que ha sido aislada de la leche materna de una madre y de las heces de su respectivo hijo lactante, ambos individuos sanos, habiendo sido confirmada la identidad de los aislados a nivel de cepa mediante la técnica de electroforesis PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis). Esta característica permite confirmar la capacidad de la nueva cepa CECT 8178 de transmitirse a través de la leche, así como su capacidad in vivo de sobrevivir al tracto intestinal humano.

La nueva cepa CECT 8178 puede presentarse en forma de cultivo biológicamente puro, en forma de células viables o en forma de células no viables.

Aislamiento e identificación

El aislamiento de la cepa CECT 8178 se realizó a partir de un ensayo de quince muestras de leche materna y heces de bebés lactantes de quince pares madre-hijo. Las muestras fueron sembradas directamente en placas con medio de cultivo RCA (Reinforced Clostridial

Agar en g/l: extracto de levadura 3,0; extracto de carne 10,0; triptona 10,0; glucosa 5,0; almidón soluble 1 ,0; cloruro sódico 5,0; acetato de sodio 3,0; L- cisteína HCI 0,5; agar 15,0) y suplementadas con 0,3 g/l de azul de anilina, sin la adición de antibióticos, lo que permitió la recuperación y el crecimiento diferencial de bifidobacterias. Se seleccionaron colonias que representaban distintas morfologías típicas de bifidobacterias. Los aislados purificados se mantuvieron a una temperatura de -80° C con 5% de glicerol.

La identificación de Bifidobacterium a nivel de especie y subespecie se realizó mediante la amplificación directa por PCR del gen del 16S rRNA, secuenciación parcial del mismo (con lecturas en las 2 direcciones) y análisis de las secuencias por el servicio de identificación de cepas bacterianas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).

Los aislados que presentaron la misma identificación a nivel de especie de cada par madre- hijo se diferenciaron a nivel de cepa mediante la técnica de electroforesis PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) con las enzimas de restricción Spel y Xba\. La citada electroforesis se realizó con un equipo de la marca CHEF DRII y los perfiles de bandas generados se analizaron mediante el programa Diversity Datábase Software (Bio-Rad Laboratories) y se agruparon según el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages). Un perfil de PFGE se consideró único cuando una o más bandas son diferentes de otro perfil de PFGE (Tenover et al. 1995). El ensayo realizado permitió detectar cuatro cepas en 4 pares madre-hijo. Una de estas cepas es la cepa CECT 8178 de la presente invención. En la Figura 1 se observan los perfiles de bandas generados mediante PFGE con las enzimas Spel y Xba\ a partir de diversos aislados. La calle 1 muestra el perfil obtenido con la cepa de referencia Bifidobacterium animalis Bb12. Las calles 2 y 3 muestran los perfiles, que son idénticos, de la cepa de la presente invención, obtenidos a partir de los aislamientos de heces del bebé lactante (calle 2) y de leche materna de su madre (calle 3) con ambas enzimas. Del mismo modo se muestran los perfiles, también idénticos, de los aislados de heces (calle 4) y leche materna (calle 5) de otro par madre-hijo. La identificación de la cepa se completó con la caracterización fenotípica mediante la fermentación de carbohidratos de las galerías de identificación de API 50CH del sistema de la marca Biomerieux (ver Tablal). Los resultados de esta caracterización demuestran que el perfil de fermentación de la nueva cepa es amplio, lo que favorece la posibilidad de utilizar dicha cepa en la fermentación de distintos sustratos. Resistencia a antibióticos

Se llevó a cabo un antibiograma de la nueva cepa CECT 8178 empleando discos de difusión de antibióticos de la marca Oxoid. Para ello, se extendieron 100 μΙ de cultivo (aproximadamente 7 log ufc/ml) sobre la superficie de placas con cultivo RCA y se depositaron discos con los siguientes antibióticos: tetraciclina (10 μg), cloranfenicol (10 μg), kanamicina (15 μg), eritromicina (15 μg), rifampicina (30 μg) y vancomicina (30 μg). Las placas se incubaron 48 h, en condiciones de anaerobiosis, a 37° C, y se midieron los halos de inhibición generados alrededor de los discos.

Tabla 1. Caracterización fenotípica mediante fermentación de carbohidratos.

^" SUSTRATO API 50CH B. breve CECT 8178

CONTROL GLICEROL

ERITRITOL

D-ARABINOSA

L-ARABINOSA

RIBOSA +

D-XILOSA -

L-XILOSA -

ADONITOL - β-METIL-D-XILOSIDO -

GALACTOSA +

GLUCOSA +

FRUCTOSA +

MAÑOSA +

SORBOSA -

RAMNOSA -

DULCITOL -

INOSITOL -

MANITOL -

SORBITOL -

METIL-D-MANÓSIDO -

METIL-D-GLUCÓSIDO +

N ACETIL GLUCOSAMINA +

AMIGDALINA +

ARBUTINA -

ESCULINA +

SALICILINA +

CELOBIOSA +

MALTOSA +

LACTOSA +

MELIBIOSA +

SACAROSA +

TREHALOSA +

INULINA -

MELICITOSA +

RAFINOSA +

ALMIDÓN +

GLICÓGENO +

XILITOL +

GENTIBIOSA +

D-TURANOSA +

D-LIXOSA +

D-TAGATOSA +

L-FUCOSA -

D-FUCOSA +

D-ARABITOL -

L-ARABITOL -

GLUCONATO -

2-CETO-GLUCONATO -

5-CETO-GLUCONATO -

Los resultados se interpretaron según los niveles de corte propuestos por Charteris et al. (1998) y demostraron que la nueva cepa CECT 8178 es sensible a la mayoría de los antibióticos de interés clínico al igual que otras dos cepas comerciales de referencia ensayadas en el mismo antibiograma (ver Tabla 2 adjunta).

El ensayo se llevó a cabo con la cepa de la presente invención y con dos cepas comerciales de referencia. Se trata de las cepas comerciales Bifidobacterium animalis Bb12 registrada por Chr Hansen A/S y Bifidobacterium longum BB536 registrada por Morinaga Milk Industry Co. LTD. Estas cepas fueron aisladas de cápsulas comercializadas por Morinaga Milk Industry Co. LTD con la marca Morinaga que contenían la cepa de forma deshidratada en el caso de Bifidobacterium longum BB536, y de leche fermentada con Bifidus activo de la marca Hacendado en el caso de Bifidobacterium animalis Bb12. Su aislamiento e identificación se realizó según el mismo procedimiento descrito en el apartado anterior para la cepa CECT 8178.

Tabla 2.- Sensibilidad a antibióticos de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 y las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales. En esta tabla; Tetra es tetraciclina (10 μg), Clor es cloranfenicol (10 μg), Kan es kanamicina (15 μg), Eri es eritromicina (15 μg), Rif es rifampicina (30 μg) y Van es vancomicina (3 μg).

Antibióticos

Cepa Origen Tetra Clor Kan Eri Rif Van

B. breve CECT 8178 Leche materna + + + + +

R animalis Bb12 comercial - + + + +

R longum BB536 comercial + + + + +

Descripción detallada de la invención

Tal y como se ha comentado en el apartado anterior, se ha observado que la CECT 8178 combina unas buenas propiedades probióticas junto con unas buenas propiedades tecnológicas que la hacen especialmente apta para ser empleada como material probiótico en la elaboración y/o preparación de productos lácteos y sus derivados.

En particular, por lo que se refiere a sus propiedades tecnológicas, se ha observado que la cepa CECT 8178 es capaz de crecer en leche sin necesidad de aditivos o promotores de crecimiento, siendo su nivel de crecimiento similar al de las cepas comerciales de referencia Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536. Además, la cepa presenta olores agradables al cultivarse en leche y en yogures fabricados con fermentos comerciales.

Los ensayos realizados también han permitido demostrar que la cepa CECT 8178 es resistente a la conservación en condiciones de refrigeración, congelación y liofilización. En concreto, por un lado, se ha observado que la cepa es capa de capaz de resistir a la conservación en frío a 4 ^o C, inoculada en leche y en presencia de oxígeno durante un período superior a 20 días. Por otro lado, se ha observado que la cepa es capaz de resistir a la congelación a -80° C inoculada en caldo RCM (Reinforced Clostridial Médium en g/l: extracto de levadura 3,0; extracto de carne 10,0; triptona 10,0; glucosa 5,0; almidón soluble 1 ,0; cloruro sódico 5,0; acetato de sodio 3,0; L- cisteína HCI 0,5; agar 5,0), durante un periodo también superior a 20 d. Finalmente, también se ha demostrado que la cepa es capaz de sobrevivir a la liofilización inoculada en leche y al almacenamiento del liófilo por periodos superiores a 20 d.

Gracias a su buena capacidad de crecimiento en leche, según una realización, dicha cepa CECT 8178 puede ser empleada como cultivo adjunto al fermento.

El cultivo adjunto al fermento es un cultivo que no es necesario para que el producto fermentado se obtenga, aunque conferirá al producto un valor añadido de carácter probiótico. La cepa de la presente invención presenta unas características tecnológicas adecuadas que favorecen su viabilidad, su competitividad y su supervivencia en niveles adecuados en productos lácteos o derivados fermentados, constituyendo una alternativa viable a las cepas comerciales probióticas de referencia anteriormente mencionadas.

De igual modo, gracias a la capacidad de resistir a las condiciones de refrigeración, congelación y liofilización, ventajosamente, dicha cepa CECT 8178 puede ser empleada como material probiótico en productos lácteos o derivados de productos lácteos refrigerados, congelados o liofilizados. Por lo que se refiere a sus propiedades probióticas, se ha observado que la cepa CECT 8178 es capaz de retrasar el crecimiento de microorganismos patógenos del género Salmonella y Cronobacter. Gracias a ello, según una realización, dicha cepa puede ser incluida en una composición que comprenda un producto alimentario, como por ejemplo, una leche de fórmula infantil, preferiblemente, una leche maternizada.

En la presente invención por material probiótico se entenderá el material que define la FAO/WHO como probiótico, es decir, microorganismos vivos que administrados en condiciones adecuadas confieren beneficios al hospedador.

Por producto lácteo se entenderá un producto que incluye leche o un producto derivado de la leche.

Por producto lácteo refrigerado se entenderá un producto lácteo conservado a una temperatura sustancialmente igual o inferior a 5°C durante un periodo igual o inferior al de consumo preferente de dicho producto.

Por producto lácteo congelado se entenderá un producto lácteo conservado a una temperatura sustancialmente igual o inferior a - 18°C.

Por producto lácteo liofilizado se entenderá un producto lácteo que ha sido sometido a un proceso de congelación y posterior deshidratación.

Por producto lácteo fermentado se entenderá un producto lácteo que ha sido sometido a un proceso de fermentación láctica, como por ejemplo, un yogur o un queso. Breve descripción de las figuras

Para mejor comprensión de cuanto se ha expuesto se acompañan unos dibujos en los que, esquemáticamente y tan sólo a título de ejemplo no limitativo, se representa un caso práctico de realización.

En dichos dibujos;

La Figura 1 muestra los distintos perfiles de PFGE obtenidos con las enzimas Spel (a) y Xba\ (b) de la cepa de la presente invención y la cepa comercial Bifidobacterium animalis Bb12 a partir de los aislados de heces de un bebé lactante y de la leche materna de su respectiva madre (calles 2 y 3). La Figura 2 es una representación gráfica que muestra el porcentaje de formación de biofilms de la cepa de la presente invención y de las cepas comerciales de referencia Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 respecto de la cepa Lactobacillus rhamnosus GG que actúa de control positivo. La representación incluye los resultados del ensayo efectuado en un medio TSBm en presencia de sales biliares (oxgall) y en un medio TSBm en ausencia de sales biliares.

Descripción de ensayos A continuación se exponen distintos ensayos los cuales deben interpretarse como un medio auxiliar para la mejor comprensión de la invención y no como limitaciones al objeto de la misma.

En estos ensayos se han empleado como cepas de referencia las cepas comerciales Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536, obtenidos a partir de productos comerciales de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente.

Los ensayos que se presentan a continuación demuestran la capacidad in vitro de la nueva cepa de sobrevivir el paso por el tracto gastrointestinal humano en el bebé, así como el potencial probiótico de la cepa de interferir sobre el crecimiento de bacterias patógenas. En los mismos ensayos se demuestra la capacidad de la cepa de sobrevivir en leche en ausencia de factores de crecimiento y de crecer al nivel de las cepas de referencia empleadas en la industria láctea. Por otro lado, los ensayos demuestran la resistencia de la nueva cepa a las condiciones de refrigeración y congelación, así como su total supervivencia tras la liofilización en leche. Todas estas características confirman la nueva cepa como una cepa con aptitudes tecnológicas de alto interés en la industria láctea.

Ensayo de crecimiento en leche

Se estudió el crecimiento en leche de la nueva cepa sin la adición de factores o promotores de crecimiento.

Para llevar a cabo este ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo RCA. Las células obtenidas se resuspendieron en leche y se inocularon en leche desnatada en polvo reconstituida al 10%. A continuación, se incubaron a 37°C, durante 24 h, en condiciones de anaerobiosis.

Tal y como se muestra en la Tabla 3 adjunta, la nueva cepa CECT 8178 fue capaz de crecer en leche sin necesidad de factores de crecimiento. El nivel de crecimiento fue similar al de las cepas comerciales de referencia, en particular, prácticamente idéntico al de la cepa Bifidobacterium animalis Bb 12 aislado a partir de un producto probiótico comercial de la marca Hacendado.

Tabla 3. Crecimiento de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 inoculada en leche a 37°C durante 24 h en condiciones de anaerobiosis. El crecimiento se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales se incluyen como cepas de referencia.

Ensayo de estabilidad a la conservación en condiciones de refrigeración

Se estudió la estabilidad de la cepa durante el almacenamiento en leche a 4°C en condiciones aerobias.

Para llevar a cabo el ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo RCA y las células obtenidas se resuspendieron en leche y se incubaron a 37°C, durante 24 h, en condiciones de anaerobiosis. Los cultivos crecidos se conservaron a 4°C durante 28 días (28 d). Tal y como puede verse en la Tabla 4 adjunta, tras 14 días (14 d) de conservación en frío, la población de la nueva cepa CECT 8178 se redujo en menor medida (0,69 unidades logarítmicas decimales) que la de las cepas comerciales de referencia (1 , 13 y 1 , 17 unidades logarítmicas decimales). Al cabo de 28 días de incubación, la población de la nueva cepa se redujo de modo similar al de la cepa de referencia Bifidobacterium longum BB536, de la marca Morinaga. Tabla 4. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 inoculada en leche en presencia de oxígeno y conservada a 4°C. Medidas efectuadas a los 14 días y 28 días de conservación. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia. log ufc/ml (media ± DS)

Cepa Origen 0 h 14 d 28 d

B. breve CECT 178 Leche materna 6,89±0,21 6,20±0, 13 5,05±0, 18

R animalis Bb12 comercial 7,69±0, 10 6,56±0,04 6,74±0,08

R longum BB536 comercial 7,42±0,04 6,25±0,05 5,02±0,07

Ensayo de estabilidad a la conservación en condiciones de congelación

Se estudió la estabilidad de la cepa durante la congelación a -80°C en caldo RCM.

Para llevar a cabo el ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo a 37°C y durante 48 h, en condiciones de anaerobiosis. Las células obtenidas se resuspendieron en RCM con 5% de glicerol. Las suspensiones celulares se almacenaron a -80°C durante 21 días.

Tal y como puede verse en la Tabla 5 adjunta, la estabilidad de las tres cepas ensayadas fue buena, con descensos en todos los casos inferiores a una unidad logarítmica después de 21 días de conservación a -80° C.

Tabla 5. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 inoculada en caldo RCM con 5% de glicerol y conservada a -80°C. Medidas efectuadas a los 21 días de conservación. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia. log ufc/ml (media ± DS) Cepa Origen O h 21 d

B. breve CECT 8178 Leche materna 7, 19±0, 12 6,25±0, 1 1 B. animalis Bb12 comercial 9, 14±0,03 9,01 ±0,06 B. longum BB536 comercial 5,37±0,32 4,84±0,30

Ensayo de supervivencia a la liofilización y estabilidad a la conservación en condiciones de refrigeración Se estudió la estabilidad de la cepa a la liofilización en leche y a su conservación a 6 ^o C de temperatura, en condiciones aerobias.

Para llevar a cabo el ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo RCA, y las células obtenidas se resuspendieron en leche desnatada, se congelaron a -80° C y se liofilizaron durante 24 h en un liofilizador de Cryodos de la marca Telstar. Los cultivos liofilizados se conservaron a 6°C de temperatura durante 21 días.

Tal y como se desprende de los resultados de la tabla 6, el proceso de liofilización no afectó la viabilidad de la nueva cepa que mantuvo estables los niveles iniciales. Los recuentos del cultivo liofilizado se mantuvieron constantes después del almacenamiento del liófilo durante 21 días a 6°C. Tabla 6. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 en leche tras liofilización y conservación a 6°C. Medidas efectuadas a los 21 días de conservación. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia.

Ensayo de evaluación del olor en leche y en yogur elaborado con fermentos comerciales

Se evaluó el olor de la nueva cepa en leche en polvo reconstituida al 10%, incubada a 37°C durante 24 h, en condiciones de anaerobiosis. También se evaluó el olor de la nueva cepa en yogur elaborado conjuntamente con la cepa y fermentos comerciales, a las 24 h de su elaboración. La evaluación del olor de la leche fermentada y los yogures se llevó a cabo por un panel de catadores empleando una escala hedónica. Los yogures se elaboraron con los fermentos Ύο-Flex X16" de la marca CHR HANSEN según el protocolo descrito para las fabricaciones a pequeña escala para estos fermentos. Los fermentos de la citada marca incluyen cepas de bacterias de las especies Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La nueva cepa probiótica se hizo crecer en leche y se inoculó a 6 log ufc/ml al mismo tiempo que los fermentos comerciales. Se elaboraron simultáneamente yogures controles sin probiótico y con la cepa comercial probiótica Bifidobacterium animalis Bb12 aislada de un producto comercial probiótico de la marca Hacendado.

A la vista de los resultados del ensayo, la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 presentó olores agradables al cultivarse en leche y en yogures fabricados con fermentos comerciales. Se observó un descenso moderado (0,6 unidades logarítmicas decimales) de Streptococcus thermophilus en yogur elaborado con la nueva cepa como cultivo adjunto, aunque sus niveles permanecieron muy por encima del mínimo de 7 log ufc/ml establecido en la Norma de Calidad para el yogur por el Real Decreto 179/2003 (ver Tabla 7).

Tabla 7. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 empleada como adjunta al fermento en la elaboración de yogur. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). a) Recuento de CECT 8178 al finalizar la fermentación; b) Recuento de las bacterias del fermento comercial sin y con la cepa CECT 8178. a) log ufc/ml (media ± DS)

B. breve CECT 8178 al final de la fermentación 0 h 5 h

6,85±0,05 4,91 ±0,35 b) log ufc/ml (media ± DS)

Cepas del fermento comercial sin y con CECT 8178 0 h 5 h

L. bulgaricus 2,92±0,31 4,76±0,03

L. bulgarícus+B. breve CECT 8178 4,65±0, 16

S. thermophilus 7,34±0,35 9, 14±0,09

S. thermophilus+B. breve CECT 8178 8,55±0,24

Ensayo de superviviencia a la digestión simulada

Se estudió la capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche para sobrevivir al paso por el tracto gastrointestinal, simulado mediante la exposición consecutiva del cultivo de la cepa en leche al paso por el estómago y posteriormente por el intestino. El paso por el estómago se simuló mediante la inoculación al 1 % del cultivo en leche a tampón PBS (Phosphate-Buffered Saline pH 7,4, en mM: NaCI 137; KCI 2,7, Na ₂ HP0 ₄ 8; KH ₂ P0 ₄ 2), ajustado a pH 3, e incubado a 37°C durante 1 hora y, a continuación, esta suspensión se reinoculó (al 1 %) en tampón PBS con sales biliares (oxgall) al 0, 15%, ajustado a pH 8 y se incubó a 37°C durante 1 hora.

Tal y como se desprende de los resultados de la Tabla 8 adjunta, la nueva cepa CECT 8178 sobrevivió al paso por el tracto gastrointestinal in vitro al 100% al igual que la cepa comercial Bifidobacterium animalis Bb12. La cepa comercial Bifidobacterium longum BB536 presentó, sin embargo, en las condiciones empleadas en este ensayo, un fuerte descenso en sus niveles tras el proceso simulado.

Este ensayo confirma in vitro la capacidad in vivo de la cepa objeto de patente, atribuida de forma natural por su origen (par madre-hijo) para sobrevivir el paso por el tracto gastrointestinal humano.

Tabla 8. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 tras la digestión simulada como exposición consecutiva a PBS a pH 3 (37°C/1 h) y PBS con oxgall al 0, 15% a pH 8 (37°C/1 h). La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia.

Recuento de viables (media ± DS)

Cepa Origen 0 h 2 h

B. breve CECT 8178 Leche materna 8,70±0, 18 8,71 ±0,20

R animalis Bb12 comercial 9,36±0, 10 9,34±0,06

R longum BB536 comercial 9,25±0,08 4,06±0,37

Ensayo de inhibición del crecimiento de patógenos

Se estudió el efecto de la nueva cepa CECT 8178 sobre la supervivencia de Salmonella entérica serovar Enteritidis CECT 4300 o Cronobacter sakazakii CECT 585, en leche. Para llevar a cabo el ensayo, se creció la nueva cepa al 1 % en la leche durante 24 h a 37°C, en condiciones de anaerobiosis. A continuación, se añadió el patógeno en estudio a aproximadamente 3 log ufc/ml. Los cocultivos se incubaron 24 h, en condiciones de anaerobiosis, a 37°C. Los recuentos de los patógenos y de la nueva cepa se realizaron a las 0 h y 24 h, en medio TSA (Tryptic Soy Agar en g/l: digerido pancreático de caseína 15,0 _s digerido papaico de harina de soja 5,0; cloruro sódico 5,0; agar 15,0) y RCA, respectivamente.

Tal y como se desprende de la Tabla 9 adjunta, a las 24 h de cocultivo a 37°C, se registró un descenso significativo del crecimiento de las cepas patógenas en la leche adicionada con las bifidobacterias. La nueva cepa CECT 8178 dio lugar a una disminución del crecimiento de los patógenos entéricos Salmonella Enteritidis y Cronobacter sakazakii por lo que podría actuar como un sistema de barrera adicional en el intestino ante la presencia eventual de dichos patógenos.

Los niveles de las bifidobacterias en leche tras su cultivo durante 24 h a 37°C fueron de 6,68±1 ,65 log ufc/ml para la cepa CECT 8178, 7,46±0,02 log ufc/ml para Bifidobacterium animalis Bb12 y 7,88±0, 17 log ufc/ml para Bifidobacterium longum BB536.

Tabla 9. Crecimiento en leche de Salmonella Enteritidis CECT 4300 y Cronobacter sakazakii CECT 858 en cocultivo con la nueva cepa CECT 8178. El crecimiento se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). a) Recuento de Salmonella Enteritidis y b) Recuento de Cronobacter sakazakii. Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia. a) Recuento de S. Enteritidis (log ufc/ml) log ufc/ml (media ±DS)

Cepa 0 h 24 h

S. Enteritidis 3, 14±0,36 8,63±0,40

S. Enteritidis+ B. breve CECT 8178 6,30±1 ,42

S. Enteritidis + B. animalis Bb12 5,86±1 ,43

S. Enteritidis + B. longum BB536 4,31 ±1 ,01 b) Recuento de C. sakazakii (log ufc/ml) log ufc/ml (media ±DS)

Cepa 0 h 24 h

C. sakazakii 3,32±0,36 9,21 ±0,39

C. sakazakii + B. breve CECT 8178 6,94±1 ,57

C. sakazakii + B. animalis Bb12 4,58±0,85

C. sakazakii + B. longum BB536 3,88±0,44 Ensayo de formación de biofilms

La formación de biofilms por comunidades bacterianas simbióticas en el mucus del epitelio intestinal proporciona múltiples beneficios al organismo, tales como promover la digestión de los contenidos alimentarios del lumen o el fortalecimiento de las defensas del huésped (Bollinger et al. 2007).

En este ensayo se evaluó la capacidad de la nueva cepa probiótica para formar biofilms en placas de microtiter. La cepa se creció por duplicado en placas de agar RCA que se incubaron en condiciones de anaerobiosis a 37°C, durante 48 h. Las bacterias crecidas se resuspendieron en 1 mi de TSB (Tryptic Soy Broth en g/l: digerido pancreático de caseína 15,0 _s digerido papaico de harina de soja 5,0; Cloruro sódico 5,0) suplementado con 20 g/l de proteosa-peptona (TSBm), y en 1 mi de TSBm suplementado con 0,2% de sales biliares (oxgall). A partir de estas suspensiones se inocularon 8 réplicas en pocilios de las placas de microtiter con 200 microlitros.

Paralelamente, se estudió la capacidad de formación de biofilms de las cepas probióticas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente. Lactobacillus rhamnosus GG, marca registrada por Valió Ltd y aislada a partir de leche fermentada Kaiku Actif de la marca Kaiku, Corporación Alimentaria, S.L, se incluyó como control positivo de formación de biofilms y la cepa Bifidobacterium pseudolongum INIA P2, perteneciente a la colección de cultivos bacterianos del Dpto. de Tecnología de Alimentos del INIA, como control negativo. Las placas se incubaron a 37°C, en condiciones de anaerobiosis durante 48 h, y se cuantificó la capacidad para formar biofilms mediante tinción con cristal violeta y medición posterior de la densidad óptica en los pocilios a 570 nm.

En la Figura 2 se muestran los porcentajes de formación de biofilms respecto de la cepa empleada como control positivo (100%). En ausencia de sales biliares (oxgall), sólo la cepa probiótica Lactobacillus rhamnosus GG (control positivo) y Bifidobacterium animalis Bb12 formaron biofilms. En presencia de sales biliares (oxgall), se observó un incremento importante en la formación de biofilms en todas las cepas ensayadas, y sobre todo en la cepa objeto de patente donde se observó una capacidad superior a la de las bifidobacterias comerciales ensayadas.

Este ensayo confirma la capacidad de la cepa reivindicada para formar biofilms in vitro en presencia de sales biliares, presentes en el intestino en las cantidades empleadas en el estudio (0,2%), por lo que, potencialmente, este hecho posibilitaría su implantación o su supervivencia prolongada en el intestino. Ensayo de producción de exopolisacáridos La producción de exopolisacáridos es una propiedad de interés en bacterias probióticas ya que se asocia con la capacidad de interferir con patógenos en la adhesión al mucus intestinal humano y con la actividad inmunomoduladora. Por otra parte, la producción de exopolisacáridos podría contribuir a la protección celular y por tanto a una mejor supervivencia bacteriana a los procesos tecnológicos o a la digestión.

En este ensayo se llevó a cabo una observación macroscópica de la producción de exopolisacáridos, evaluándose la capacidad de formar exopolisacáridos como "carácter ropy" al crecer en medios sólidos suplementados con azúcares (por carácter o fenotipo "ropy" se define la capacidad de las cepas para formar hilos al levantar la masa celular crecida sobre un medio de cultivo sólido con un asa de siembra). Para ello, se hizo crecer la nueva cepa en agar MRS (Man Rogosa Sharpe en g/l: proteosa peptona n° 3 10,0; extracto de carne 8,0; extracto de levadura 4,0; glucosa 20,0; monoleato de sorbitán 1 mi; fosfato dipotásico 2,0; acetato de sodio 5,0; citrato de amonio 2,0; sulfato de magnesio 0,2; sulfato de manganeso 0,05; agar 13,0; pH final 6,4) y TSA (Tryptic Soy Agar en g/l: digerido pancreático de caseína 15,0; digerido papaico de harina de soja 5,0; cloruro sódico 5,0; agar 15,0) con 20 g/l de proteosa-peptona, suplementados con sacarosa al 5% o lactosa al 5%.

De la observación, se desprende que la nueva cepa, al igual que la cepa comercial Bifidobacterium animalis Bb12, es mucosa. Se observa en ambas una capacidad moderada para formar exopolisacáridos (fenotipo "ropy") que es más marcada en presencia de sacarosa que con lactosa. La cepa comercial Bifidobacterium longum BB536 no presentó este carácter en los medios y condiciones estudiados.

La capacidad para producir polisacáridos favorecería la permanencia de la nueva cepa en el intestino.

A pesar de que se ha hecho referencia a una realización concreta de la invención, es evidente que el experto en la materia podrá introducir variantes o modificaciones, o substituir los detalles mencionados por otros técnicamente equivalentes, sin apartarse del ámbito de protección definido por las reivindicaciones adjuntas.

Referencias:

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