〔融合タンパク質の調製〕
 融合タンパク質を発現させる宿主として、� ��腸菌 Escherichia   coli  XL1-Blue を用い、この大腸菌をLB(Luria-Bertani)� ��地又はLB寒天培地にて37℃で培養した。

 (ベクターの構築)
 微生物の表面とデンプンに結合可能な融合� ��プチド(融合タンパク質)を発現させるため� �T5プロモーターを持つベクターpQE31(Qiagen社)� �、 Lactococcus   lactis  IL1403株(Agricultural Research Service Culture Collec tion、NRRL)のペプチドグリカン加水分解酵素(EM BL:AE006264)のペプチドグリカン結合ドメイン(CP H)をコードする遺伝子と、 Streptococcus   bovis  148株のα-アミラーゼのリンカー配列および� ��ンプン結合ドメインをコードする遺伝子を� ��入した。

 融合タンパク質発現のためのベクターは次� ��3つのステップにより構築した。まず、 Lc.   lactis  IL1403の染色体DNAからCPH遺伝子をpQE31に組み� �んだpQCPHを構築した(図1参照)。次にそれに Streptococcus   bovis  148株のα-アミラーゼ(EMBL:AB000830)のリンカー� ��列およびデンプン結合ドメインをコードす� ��遺伝子を組み込んだpQCAを構築した(図2参照) 。そして、pQCAから最終目的である融合タン� �ク質を発現させるための遺伝子カセット(図4 )を組み込んだ発現ベクターpQCLSを構築した(� �3参照)。

 1.pQCPHの構築
 ゲノム情報が公開されている Lc .  lactis  IL1403株の染色体DNAをテンプレートとして、5 '-tgcgcgccatgggtacttctaattccggtggttcaacagcの塩基配列で 示されるcph-F(フォワード:配列番号1)及び5'-gcg gatccttatttaatacgaagatattgaccの塩基配列で示されるc ph-R(リバース:配列番号2)をプライマーとするP CRにより、CPHをコードするDNA断片を調製した� �� Nco Iと Bam HIで消化した、この断片を、同じく Nco Iと Bam HI で消化したpQE31(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)に クローニングし、pQCPHを構築した。

 2.pQCAの構築
 5'-tctctcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcgの塩基配� �で示されるpch-NF(フォワード:配列番号3)と5'-a a ggatcc cctttaatacgaagatattgaccaattaaaatggの塩基配列で示さ� �るcph-NR(リバース:配列番号4)をプライマーと� ��るPCRにより、pQCPHのT5プロモーター中にある Xho IサイトからCPH遺伝子の3´末端までを増幅し� � Xho Iと Bam HIで消化した。pQE31に Streptococcus   bovis  148株のα-アミラーゼがクローニングされたp QEAmy31(東京農業大学 佐藤英一博士から提供:D irect Production of Ethanol from Raw Corn Starch via  Fermentation by Use of a Novel Surface-engineered Y east Strain Codisplaying Glucoamylase and α-Amylase,  Hasayori Shigechi, Eiichi Satoh et al., Applied and  Environmental Microbiology, Vol.70, No.8, 5037-5040 (20 04) 参照)を Xho Iと Bam HIで消化し、PCRで得た断片を連結した。なお� ��3´末端側のプライマーは、CPH遺伝子の終始� ��ドンが取り除かれ、α-アミラーゼ遺伝子に Bam HIサイトを介して接続した時、フレームが合� ��ように作製した。

 3.pQCLSの構築
 pQE31Amyを鋳型として、5'-aa ggatcc gggccaagctagccaagcagctcの塩基配列で示されるプラ� ��マーLink-F(フォワード:配列番号5)と5'-gcg cca attatc tgg gttttggの塩基配列で示されるプライマーLink-R(� ��バース:配列番号6)を用い、α-アミラーゼの� ��媒ドメインとデンプン結合ドメイン(以下、 SBD)の間のリンカー配列部分をコードする遺� �子をPCRによって調製した。pQCAを Bam HIと Bst XIで消化してCD領域とリンカー配列部分をコ� �ドする遺伝子を除去し、代わりにpQE31Amyを鋳 型としてPCRで調製したリンカー配列部分をコ ードする断片を挿入し、pQCLSを構築した。融� ��タンパク質を発現させるための遺伝子カセ� ��トの塩基配列を配列番号7に示す。

 pQCLSが導入された大腸菌は、100μg/mlのアン� �シリン及び15μg/mlのテトラサイクリンを加え たLB培地にて37℃で一晩、培養し、遠心分離� �より集菌した。次に、抗生物質を含む新鮮� �前記LB培地に菌体を移し、660nmにおける濁度( OD ₆₆₀ )が0.5となるまで37℃で培養した。その後、イ ソプロピル-β-D-チオガラクトシドを1mMとなる ように前記培地に加え、融合タンパク質の発 現を誘導した。プラスミドの維持のために、 培地には最終濃度400μg/mlのアンピシリンを添 加した。4時間以上、培養した後、集菌した� �

 〔融合タンパク質の精製〕
 融合タンパク質のN末端のヒスチジンタグと ニッケルキレートカラム(Ni-NTA superflow column� �(1.5ml), Qiagen社)との相互作用を利用した、金 属アフィニティクロマトグラフィにより、融 合タンパク質を精製した。上記培養培地100ml� ��ら集めた大腸菌の菌体を、結合用緩衝液(50m M NaH ₂ PO ₄ (pH8),   300mM NaCl, 10mM imidazole)に懸濁し、終濃度が1mg /mlとなるようにリゾチームを添加して、1時� �、氷上でインキュベートした。

 細胞を超音波によって破砕し、遠心分離し� ��上澄液を、前記結合用緩衝液によって平衡� ��したNi-NTAカラムにアプライした。カラムを� ��合用緩衝液(50mM NaH ₂ PO ₄ (pH8),   300mM NaCl, 20mM imidazole)で洗浄した後、溶出用 緩衝液(250mM NaH ₂ PO ₄  (pH8),   300mM NaCl, 20mM imidazole)で吸着したタンパク質 を溶出した。溶出液は限外濾過により20mM Tri s-HCl緩衝液(pH8.0)に置換し、20mM Tris-HCl緩衝液( pH8.0)で平衡化した陰イオン交換樹脂Super Q 5P Wにアプライし、0~1M NaClの直線濃度勾配によ� ��て溶出させた。融合タンパク質が含まれる� ��分を集めて限外濾過によって濃縮し、脱塩� ��た。精製された融合タンパク質の純度は12%� �SDS-PAGEを行い、Coomasie Brilliant Blue R250で染� �して確認した。

 (細胞表面との付着アッセイ)
 得られた融合タンパク質と細胞の付着(結合 )を確認すべく次のアッセイを行った。 Lactobacillus   casei  NRRL B-441 を、MRS培地(Difco Laboratories, Detroit , MI, USA)にて37℃で、OD ₆₆₀ が1となるまで培養した。細胞を遠心分離に� �り集菌し、OD ₆₆₀ が1.5となるよう、0.12mg/mlの前記融合タンパク 質を含むMRS培地に懸濁し、37℃で2時間、穏や かに振とうした。細胞を0.1 Mのリン酸ナトリ ウム緩衝液(pH 7.0)(PB)で洗浄した後、SDS-PAGE用 緩衝液(20%(w/v) glycerol, 125mM Tris-HCl (pH 6.8),  4% SDS, 5%(v/v) β-mercaptoethanol, 0.01% bromophenol  blue)に分散させ、5分間、煮沸した。細胞に結 合した融合タンパク質は、前記と同様の方法 にてSDS-PAGE法にて検出した。

 (デンプンとの結合アッセイ)
 また、得られた融合タンパク質とデンプン� ��結合を確認すべく次のアッセイを行った。N i-NTAカラムによって精製した融合タンパク質� ��液(0.06mg/ml in PB) 200μlを、等量のデンプン� ��粒懸濁液(10mg/ml in PB)と混合し、37℃で3時� �、穏やかに振とうした。遠心分離した後、SD S-PAGEにより上澄液中の未結合の融合タンパク 質を検出した。

 〔複合体の形成とマイクロカプセル化〕
 次に、乳酸菌と融合タンパク質とデンプン� ��の複合体を形成させた。複合体の形成は、� ��ず、乳酸菌と融合タンパク質を上記付着ア� ��セイと同じ条件にて付着させ、その後、デ� ��プン懸濁液と混合してデンプンと結合させ� ��。すなわち、MRS培地にてOD ₆₆₀ が1となるまで培養した乳酸菌培養液の1.5 ml� ��遠心分離して、得られた菌体を0.12mg/mlの融� ��タンパク質を含むMRS培地に懸濁し、30℃で2� ��間、インキュベートした。遠心分離した後� ��PBを加えて懸濁する操作を2回、繰り返して� ��浄し、未付着の融合タンパク質を除去した� ��そして、細胞濃度が1×10 ⁹  cells/ml(OD ₆₀₀ =1)となるようにPBに懸濁した。

 等量の前記細胞懸濁液とPBに分散したデ� �プン粒子懸濁液を混合し、室温で30分間、穏 やかに撹拌してから1時間、放置した。対照� �して、デンプンを添加しない場合、および� �記細胞懸濁液を添加しない場合でも実験し� �。複合体の形成は、肉眼と位相差顕微鏡に� �る観察により確認した。また、デンプンへ� �細胞結合率を、Crittendenらの方法(Crittenden, R. , et al., Adhesion of bifidobacteria to granular sta rch and its implications in probiotic technologies. A pplied and Environmental Microbiology, Vol.67, No.8, 3 469-3475 (2001) 参照)により計測した。

 アミロースによるコーティング(マイクロ カプセル化)は、複合体を1%の馬鈴薯由来のア ミロース溶液(アミロースはシグマ社製)を用� ��て行った。即ち、10mg/mlのアミロース懸濁液 を、耐圧容器に入れて180℃で1時間、加熱し� �室温まで放冷することによりアミロースを� �解し、この溶液の0.5mlを複合体と緩やかに混 合し、4℃で一晩、ゲル化させることにより� �った。

 〔人工胃液中における細胞の生存率の測定� ��
 ペプシンを0.5%の生理食塩水に3mg/mlとなるよ うに溶解し、12M HClでpHを2.0又は3.0に調整し� �人工胃液を調製した。人工胃液は濾過した� �、滅菌した。微生物複合体(5×10 ⁷ cells)を1mlの人工胃液に混合し、37℃でインキ� ��ベートした。一定時間の間隔で、遠心分離� ��より人工胃液を除去して、複合体をPBで洗� �し、さらに生理食塩水で2回、洗浄した。そ� ��て、複合体を30units/mlのα-アミラーゼ(Megazyme , Bray, Ireland)を含むPBに懸濁し、40℃で20分間 、インキュベートして複合体から細胞を放出 させた。生菌数は、MRS寒天培地上にて37℃で� ��24時間、培養して計測した。

 〔結果及び考察〕
 (融合タンパク質の発現とその精製)
 大腸菌の培養液の1Lから融合タンパク質の� �0.3gが得られ、その75%は可溶性画分に存在し� ��。SDS-PAGEで測定した分子サイズは、56kDaであ り、理論値と一致した。なお、アフィニティ クロマトグラフィにより精製した試料には、 56kDa以外にも、71kDaおよび73kDaのタンパク質も 含まれていた(図5、レーン1)。また、融合タ� �パク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。

 トウモロコシ由来のデンプンとの結合実� ��では、目的の融合タンパク質に加えて、こ� ��らの2つのタンパク質も、ある程度、デンプ ンに結合した(図5、レーン2)。目的の融合タ� �パク質のみを得るために、上記のとおり陰� �オンクロマトグラフィを用いた(図5、レーン 4)。陰イオンクロマトグラフィにより精製し� ��融合タンパク質は、デンプンと結合したの� ��(図5、レーン2)、デンプンと結合能を有する 活性体であることがわかった。また、図示は しないが、精製した融合タンパク質は、トウ モロコシデンプンだけでなく、馬鈴薯デンプ ンにも結合することを確認した。

 (融合タンパク質と細胞の付着)
  Lb .  casei  NRRL B-441株の細胞を精製した融合タンパク� �とインキュベートし、その上清に残存する� �合タンパク質をSDS-PAGEによって確認した(図6) 。融合タンパク質は、細胞に付着しているこ とが確認され、Crittendenらの方法によれば、� �細胞に6×10 ⁴ 分子の融合タンパク質が付着していた。

 (複合体の形成)
 融合タンパク質を付着させた細胞の一定量� ��対し、デンプンの濃度を変えて、デンプン� ��の結合を調べた。凝集体の大きさを目視で� ��照と比較した結果を表1に示す。融合タンパ ク質を結合させていない細胞を用いた場合の 凝集の程度は、デンプンのみを用いた対照と 同程度であった。これに対して、細胞に融合 タンパク質を付着させた細胞を用いた場合、 デンプン濃度が2mg/mlでの凝集の程度は対照よ りも強くなり、5mg/mlでは明らかに対照よりも 強くなった。このときの細胞のデンプンへの 結合率は、融合タンパク質を添加しない場合 は4.4%であったのに対し、添加した場合は32%� �あった。融合タンパク質を添加した場合の� �酸菌とデンプンの凝集物の顕微鏡写真を図7� ��示す。

 (人工胃液中における細胞の生存率)
  Lb.   casei  NRRL B-441株の細胞を融合タンパク質によっ� �デンプンと結合させ、さらにアミロースで� �ーティングした複合体を人工胃液で処理し� �時の生存率を表2及び図8に示す。遊離の細胞 をpH2.0と3.0で1時間処理した場合の生残率は、 それぞれ0.002%と0.74%であったのに対して、融� ��タンパク質によってデンプンと結合させア� ��ロースでコーティングした場合、pH2.0と3.0� �1時間処理した場合の生残率は、それぞれ6%� �64%に上昇した。また、表2に示すように、ア� ��ロースによるコーティングを行わない場合� ��pH3.0の人工胃液で1時間処理した場合の生存� ��は11%であった。

 以上のように、融合タンパク質を用いて乳� ��菌にデンプンとの複合体(凝集体)を形成さ� �れば、人工胃液における生存率を著しく上� �させることが確認できた。また、表2では、� ��合タンパク質を添加せずとも生存率が上昇� ��ているが、このことは、すでにWang et al.,� �が報告しているように、低pHの環境下におい てデンプンが存在していること、およびデン プン顆粒と混在していることによるものと考 えられる。また、融合タンパク質を用いずに デンプンとの複合体をアミロースでコーティ ングした場合にも、生存率が上昇しているが 、 Lb.   casei  NRRL B-441株が元々、ある程度、デンプンお� �びアミロースに結合する能力をもっている� �めであると考えられる。